JP2016121154A - Gi症候群及び移植片対宿主病を治療及び予防する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】治療有効量の抗セラミド抗体又はその生物学的活性断片を投与することを含む、移植片対宿主病を予防又は治療する方法。抗体がヒト化されている。抗体が、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体が2A2 IgMである。スタチンをさらに含む。イミプラミンをさらに含む。患者が放射線を受ける前に投与されるか、又は患者が骨髄移植を受ける前に投与される。
【選択図】図20
Description
本願出願は、2007年5月6日に出願された仮出願第60/916,007号の利益を主張しており、合衆国法典第35巻第119条(e)に基づいて、その全ての内容は、本明細書内に完全に説明されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所の助成金CA85704の下での政府の支援と共になされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
1.発明の分野
本発明は、GI症候群及び移植片対宿主病を治療及び予防する方法の分野におけるものである。
放射線療法は、依然として、様々な悪性細胞に対する最も効果的な治療法の一つである;しかしながら、骨髄、毛包、表皮及び消化管の正常細胞は、放射線誘導細胞死に対して極めて感受性であり、癌治療のための本治療法の効果的な利用を限定している。骨髄移植は進行性の癌を治療するための別の方法であるが、臓器移植は、宿主における種々の免疫応答をしばしば引き起こし、これは移植片の拒絶及び移植片対宿主病(以下、「GVHD」と言う)をもたらす。骨髄移植は、急性及び慢性白血病、骨髄腫、固形腫瘍(R. J. Jones, Curr Opin Oncol 3 (2), 234(1991); G. L. Phillips, Prog Clin Biol Res 354B, 171(1990))、再生不良性貧血及び重症免疫不全症の(immunodeficiency's)(R. P. Gale, R. E. Champlin, S. A. Feigら、Ann Intern Med 95(4), 477(1981); G. M. Silber, J. A. Winkelstein, R. C. Moenら、Clin Immunol Immunopathol 44(3), 317(1987))を
含む、多くの悪性及び非悪性疾患を治療するために現在用いられている。移植の前に必要とされるコンディショニング(移植前処置)のレジメンは、患者の免疫系を除去又は抑制するのを目的としており、患者を腫瘍の再発又は感染症にかかりやすくする。最近の、非血縁且つHLA非同一のドナーの使用は、残念ながらGvHDの発生率を増加させた。ドナーの骨髄移植片からのT細胞の除去はGvHDを改善するが、このストラテジーは生着不全率を増加させ、治療に有益な移植片対腫瘍効果を顕著に減少させる。そのため、生存全体は改善しない。さらには、強力な前臨床データにも関わらず、コルチコステロイドにTNFアンタゴニストを添加して炎症性サイトカインの作用を減少させることによりGvHDの転帰の改善を試みる、急性GvHDケアの標準が提供する治療的有用性は限られている。したがって、臨床的に最適化され得るのであれば、GI症候群及びGvHDの発生率及び重症度を減少させるための代替的なストラテジーに対する緊急の必要性が存在している。
ASMase − 酸性スフィンゴミエリナーゼ
BMT − 骨髄移植
CTL − 細胞傷害性Tリンパ球
ERK − 細胞外シグナル関連キナーゼ
FADD − Fas関連デスドメイン
FcRγII − FcレセプターγII
FITC − フルオレセインイソチオシアネート
GVHD − 移植片対宿主病
GVT − 移植片対腫瘍
IL − インターロイキン
JNK − c−Jun N末端キナーゼ
mHAg − 副組織適合(histocompatability)抗原
MHC − 主要組織適合(histocompatability)複合体
MLR − 混合リンパ球反応
SDS-PAGE − ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
TCR − T細胞レセプター
TNF − 腫瘍壊死因子
TUNEL − 末端dUTPニック末端標識
我々は、抗セラミド抗体の投与が、放射線誘導GI症候群、移植片対宿主病、炎症性疾患及び自己免疫疾患(本明細書内に列挙された疾患)を含む、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導死及び内皮微小血管(microvasculture)への損傷により介在される数々の疾
患を治療及び予防する事を発見した。我々はまた、新規抗セラミドモノクローナル抗体2
A2及び以下に記載されるその他のものを発見し、これらは、列挙された疾患を治療又は予防するための、好ましくはヒト化形態での治療用途を有する。本発明の他の実施形態は、1以上のスタチン;又はイミプラミンもしくは他のASMase阻害剤又はBax阻害剤と共に抗セラミド抗体を投与することにより、上に列挙された疾患を治療又は予防する併用療法を対象とする。さらに、他の実施形態は、ASMase、Bax及びBakの発現を低下させるか、さもなければ列挙した疾患のいずれかの症状を低減又は改善する量のアンチセンスヌクレオチド又は低分子干渉RNAを投与することを含む。最後に、特定の実施形態は、抗セラミド抗体及び1以上のスタチン又はイミプラミンを含む、列挙された疾患を治療又は予防における治療的使用のための組成物を対象とする。
トは、周囲の膜とはタンパク質及び脂質組成が異なり、多数のグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)−アンカータンパク質、Srcファミリーの二重にアシル化されたチロシンキナーゼ及び膜貫通タンパク質を含む、シグナル分子を収容する。さらに、ラフトは、抗原に遭遇した際のB細胞レセプター(BCR)を含め多数のレセプターが、活性化の際に内又は外に移行する部位としての役割を果たす。最近の証拠は、これらの移行の事象が、多数のシグナル伝達カスケードのために極めて重要であることを示している。
内に組み込まれる)。これらの研究において、我々は、in vitro及びin vivoにおいて、
CD95に誘導されてASMaseが原形質膜外表面へ移行すると放出される、細胞外に配向されたセラミドが、スフィンゴ脂質リッチ膜ラフトにおけるCD95のクラスタリン
グを可能にし、並びにJerkat細胞におけるアポトーシスを誘導することを示した。ASMaseの欠損、ラフトの破壊又は表面セラミドの中和は、CD95のクラスタリング及びアポトーシスを妨げたが、天然セラミドは、ASMase欠損細胞をレスキューした。データは、セラミドによるCD95介在性クラスタリングが、シグナル伝達及びアポトーシス細胞死についての必要条件であることを示した。Jurkat細胞は、ヒトT細胞白血病細胞株である。
これは、参照によって本明細書内に組み込まれる)。
Ehleiterら、J Exp Med 180(2), 525(1994))。ASMase活性における遺伝的欠損を特徴とする遺伝病である、ニーマン・ピック患者由来のリンパ芽球は、遺伝学的モデルにおいて、ASMase介在性のセラミド産生が放射線誘導アポトーシスに必要であることを証明し、ASMase欠損マウスの開発は、セラミドについての細胞型特異的な役割の同定を可能にした(J. Lozano, S. Menendez, A. Moralesら、J Biol Chem 276(1), 442(2001); P. Santana, L. A. Pena, A. Haimovitz-Freidmanら、Cell 86(2), 189(1996))
。セラミド産生はその後、多数のサイトカイン、ウイルス/病原体、環境ストレス、及び化学療法誘導アポトーシス事象のための必要条件として同定されてきた。Verheij Mら。Requirement for ceramide-initiated SAPK/JNK signaling in stress-induced apoptosis。Nature. 1996 Mar 7; 380(6569): 75-9; Riethmuller Jら。Membrane rafts in host-pathogen interactinons、Biochim Biophys Acta. 2006 Dec: 1758(12): 2139-47(これらは参照によって本明細書内に取り込まれる)。
K. Kwiatkowska、及び A. Sobota, J Biol Chem 279 (35) 36778 (2004); H. Grassme, V. Jendrossek, J. Bockら、J Zmmunol 168 (1), 298 (2002); M. S. Cragg, S. M. Morgan, H. T. Chanら、Blood 101 (3), 1045 (2003);6 D. Scheel-Toellner, K. Wang, L. K. Assi ら、Biochem Soc Trans 32 (Pt 5), 679 (2004).; D. Delmas, C. Rebe, S. Laco
urら、J Biol Chem 278 (42), 41482 (2003).;及び C. Bezombes, S. Grazide, C. Garret ら、Blood 104 (4), 1166 (2004)。
自然免疫応答の活性化、Daudi及びRLリンパ腫細胞におけるリツキシマブ誘導CD20クラスタリング及びERKリン酸化反応、U937ヒト単球細胞におけるFcRγIIクラスタリング及びリン酸化反応、並びに、HT29ヒト結腸癌細胞及び好中球におけるレスベラトロル、シスプラチン、及び活性酸素種誘導アポトーシスのためのシグナルを送る。ASMaseの移行及び活性化の下流の効果についての更なる研究にも関わらず、ASMaseシグナル伝達を開始させるカプセース(capsase)非依存の経路があること
を我々が示すまで、原形質外膜上へのその移行を介在する起因事象についてはほとんど分かっていなかった。J.A. Rotolo ら、J. Biol. Chem. Vol 280, No. 29, Issue of July 15,26425-34 (2005)(これは、参照によって本明細書内に組み込まれる)。
、ASMaseにより産生されるセラミドの阻害又は隔離は、放射線誘導損傷を低減し、並びにGI症候群及びGvHDを治療又は予防するために訴えられ(be sued to)得ることを発見した。本発明の特定の実施形態は、(例えば、イミプラミンもしくはアンチセンス核酸で)ASMaseを阻害すること又は(例えば、抗セラミド抗体単独もしくはスタチンと共に)細胞表面セラミドを不活性化することにより、GVHD及びGI症候群並びに自己免疫疾患を含む他のT細胞介在性の疾患を治療又は予防する薬理学的方法を対象にする。
と呼ばれる未確定の前駆細胞クロノゲンからなる。この群の細胞は、絶え間なく増殖及び分化し、腸細胞の生理学的損失及び絨毛の先端から分化した他の上皮細胞を補充し、したがって、粘膜の解剖学的及び機能的完全性を維持する。この区画の完全な除去は、陰窩−絨毛ユニットを恒久的に破壊するために必要であるようであるが、たとえ陰窩ごとに1つであったとしても、生存している幹細胞クロノゲンは、完全に機能的な陰窩を再生可能である。
よりシグナルされているらしい、S期後期チェックポイント及び核分裂停止を経る進行における一時的な線量依存的遅延である。哺乳類細胞において、DNA二本鎖切断は、DNA損傷の認識及び修復の経路、並びに細胞周期チェックポイント活性の協調的な制御を活性化する。腸幹細胞の核分裂停止は、この経路における制御された事象を表すように思われる。この考えと一致して、腸の周囲あたりの陰窩数における有意な変化はこのステージでは見られないが、陰窩の大きさは、陰窩通過の継続的な通常の移動及び分化した細胞の陰窩から絨毛の上皮層への通常の移動によって徐々に減少する。36−48時間での核分裂活性の再開は、陰窩幹細胞クロノゲンの迅速な枯渇及び周囲あたりの陰窩数の減少に関連する。幹細胞枯渇の機序は、完全には確立されていない。
CH−11)誘導アポトーシスに対するより強い保護が得られたことを示した。H. Grassme, H. Schwarz及び E. Gulbins, Biochem Biophys Res Commun 284 (4), 1016 (2001)(これは、参照によって本明細書内に組み込まれる)。これらの研究において、我々は、ナイスタチンとの併用での抗セラミド抗体とのJurkat細胞の予備培養が、50J/m2 UV−C又は50ng/ml 抗Fas刺激後1分でのラフトクラスタリングを阻
害したことを示した。さらに、抗セラミドとナイスタチンとの併用処理によるラフトクラスタリングの阻害は、刺激後4時間でのUV−C(5−50J/m2)及び抗Fas(1−50ng/ml CH−11)誘導アポトーシスを弱め(図2d)、50J/m2 UV−C又は50ng 抗Fasでの刺激後7日で、細胞生存率をそれぞれ2.46及び2.42倍増強した。重要なことには、我々はまた、抗セラミド及びナイスタチン前処理が、5−50J/m2 UV−C又は抗Fas刺激後のビヒクル対照と比較して、クローン原性細胞の生存率における約1logの増加を生み出したことを観察した。単一ヒット多標的モデルによるこれらのクローン原性生存データのプロットは、抗セラミド及びナイスタチンでの前処理が用量応答曲線のD0を、1.6±0.7J/m2から3.6±1.1J/m2へ増加させたことを明らかにし、これは、10%の生存レベルでの2.32の線量修正値と共に、再現的な様式のUV誘導細胞死に対する有意な(p<0.05)保護を示す。総合すると、これらの結果は、Jurkat細胞の表面でのセラミド介在性のラフトクラスタリングがUV−Cにより誘導されるアポトーシスの膜透過型シグナル伝達に必須であること、及びそのような保護はクローン原性生存の改善により明らかなように、生物学的に意義があることを示した。
れ、膜透過型のアポトーシスシグナルの伝達が連係されている。内皮細胞は、体内の他の細胞と比較して、分泌型ASMaseに20倍富んでおり、この細胞型は、in vitro及びin vivoでの放射線誘導アポトーシスに特に感受性である。SV129/C57BL/6
マウスにおけるASMaseの遺伝子不活性化、又は全身照射(TBI)前の内皮細胞生存因子bFGFでのC57BL/6マウスの静脈注射処理は、腸微小血管系の放射線誘導内皮アポトーシスを弱め、陰窩幹細胞クロノゲンを保存し、GI症候群による死亡からマウスを保護した(F. Paris, Z. Fuks, A. Kangら、 Science 293 (5528), 293 (2001))
。陰窩上皮細胞ではなく腸内皮細胞が照射の前又は後にbFGFレセプター転写物を発現することから、血管機能障害は放射線誘導GI損傷にとって重要であるように思われる。
ウスにおいて評価した。この系統でのasmase+/+及びasmase−/−遺伝子型における放射線に対する内皮応答のパターンの典型的な組織学的例を示す(図1)。SV129/C57BL/6マウスにおける公表された観察と一致して、野生型C57BL/6マウスは、15Gy TBIから4時間後に、大規模な内皮アポトーシスを示し(絨毛固有層における12のアポトーシス内皮核;図1第2パネル)、asmase−/−及びBax−/−検体においては、それぞれ3つのアポトーシス核に減少させた(図1、それぞれ第3及び第4パネル)。非照射の対照asmase+/+(図1、第1パネル)、asmase−/−又はBax−/−(非掲載)の固有層においては、たまにのみ(1−3)アポトーシス核が観察された。内皮細胞アポトーシスは、15Gyへの曝露から早ければ3時間で野生型粘膜において検出され、4時間で最大に到達した(非掲載)。図2Aは、漸増した線量のTBIへの曝露から4時間後のC57BL/6マウスの腸固有層におけるアポトーシス核の頻度ヒストグラムを表示している。最大の効果は15Gyでのasmase+/+粘膜において観察され、対照非照射マウスにおいて観察された3以下のアポトーシス核/絨毛(p<0.001;n=各データポイントのために計数した2動物由来の200の絨毛)と比較して、92%の絨毛が3より多くのアポトーシス核/絨毛を示し、52%が大規模なアポトーシス(10より多くのアポトーシス核/絨毛)を示した。ASMase欠損は、アポトーシス応答全体(3より多くのアポトーシス核/絨毛)を38%にまで、並びに大規模なアポトーシスの頻度を総絨毛の20%にまで有意に低減させた(それぞれ、野生型同腹子と比較してp<0.001;n=各データポイントのために計数した2動物由来の200の絨毛)。したがって、アポトーシス応答のピークの出現は、SV129/C57BL/6系統よりも1時間遅く起こったが、C57BL/6系統における、放射線誘導内皮細胞アポトーシスの速度及び線量依存性、並びにASMaseの必要性は、SV129/C57BL/6マウス系統1におけるものと定性的及び定量的に類似していた。
A. Haimovitz-Friedmanら、Cancer Res 63, 4338 (2003))、内皮アポトーシスは、TBI後の陰窩幹細胞クロノゲンの生存と密接に相関した。図2bは、15Gy TBIに曝露後3.5日でのC57BL/6マウスの近位空腸の典型的な横断面を示す。非照射の場合、この系統における陰窩/腸周囲の数は155±1.1だった。15Gyに曝露後、示したC57BL/6asmase+/+マウス由来の検体は、C57BL/6asmase−/−同腹子から得られた検体における27と比較して、生存再生陰窩を3つしか含まなかった。ASMase欠損は、10−15Gyの範囲内の各線量において、陰窩生存比率を有意に増加させた(p<0.05)。15Gy TBIに曝露後3.5日の野生型マウスは、機能的な近位空腸陰窩をほぼ完全に枯渇している(図2b、中段パネル)。暗紫染色された、再生、過色素性陰窩の発現の増加により明らかなように、ASMaseの遺伝子不活性化は、陰窩生存率を増強した(図2b、下段パネル)。10%の陰窩生存率の等効果を与えるために必要な線量(D10)は、野生型に対しては14.6±0.9Gy、ASMase欠損マウスに対しては16.8±1.8Gyであり(p<0.01)、asmase−/−遺伝子型については1.15±0.14の線量修正係数(DMF)を示した。この値は、bFGFによる照射C57BL/6陰窩幹細胞クロノゲンの保護について報告されたDMFとは大きくは異なっていなかった7。
中段左及び右パネル)を伴う、GI症候群に典型的な腸損傷(ほとんど全ての陰窩及び絨毛の大規模な露出)を明らかにした。胸腺及びリンパ組織、並びに直接の死因とは思われない種々の臓器における時折の微小腫瘍又は局所出血を除いて、他の臓器に損傷は見られなかった。これに対して、C57BL/6asmase−/−マウスは、7.75±0.12日で死亡した(C57BL/6asmase+/+マウスと比較した場合、p<0.001)。剖検は骨髄死の典型的な特徴を明らかにした(造血因子の完全な枯渇を伴う、大規模な出血及びマトリックスの大規模な壊死;図2c、右下パネル)。さらに、C57BL/6asmase+/+マウスにおける陰窩/絨毛ネットワークの完全な崩壊とは対照的に、C57BL/6asmase−/−同腹子の腸粘膜は、腸表面のほとんどを覆う増殖性、好色素性の陰窩を伴う大規模な再生活性を示した(図2c、左下パネル)。
TBI後3.5日での野生型C57BL/6マウスにおける生存陰窩は、非照射の腸周囲における152±3から、それぞれ、20.5±1.3、10.8±0.6及び2.3±0.3に減少した(それぞれ13.4±0.9%、7.0±0.4%及び1.47±0.2%の生存率、n=ポイントあたりそれぞれ4動物由来の10−20の周囲)。Bax欠損は、野生型対照に比べて13、14及び15Gy TBI後の生存陰窩の数を、それぞれ42.3.7±2.0、27.6±1.6及び18.2±1.3に増加させた(それぞれ27.8±1.4%、18.2±1.1%及び12.0±0.9%の生存率、野生型C57BL/6に対してp<0.001、図3b)。13−15Gy後のC57BL/6Bax−/−マウスにおける生存陰窩の率は、12Gy単独で処理した野生型C57Bl/6マウスにおける粘膜の回復の支持及びGI死の予防に必要と報告された8.5±0.1%の生存陰窩62、71を上回った。これらのデータは、放射線曝露後の内皮アポトーシスと陰窩幹細胞クロノゲンの生存率との間の関連性という概念と一致する。J.A. Rotolo,ら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.., Vol. 70, No. 3, 804-815(2008)(これは、参照によって本明細書内に組み込まれる)。
し(図5c、表1)、剖検は、腸粘膜の再生の進行及びBM死の典型的な変化を示す腸表面のほとんどを覆う増殖性、好色素性の陰窩を示した。これらの発見は、上で報告したC57Bl/6Bax−/−マウスにおける陰窩幹細胞クロノゲン生存率のレベルに一致し(図3b)、腸粘膜の再生の観察は、恐らくこれらのマウスの生存の延長に関係し(8.4±0.5日;表1)、これは粘膜回復の開始を可能にしたと推定される。自家BMTは、14Gy TBIに曝露したC57Bl/6Bax−/−マウスの60%を恒久的にレスキューしたが(図3c;p<0.05)、残りの動物は、移植に失敗したり、骨髄形成不全に陥った(表1)。線量を15Gy TBIに上げた場合、C57Bl/6Bax+/+マウスは、剖検が証明するところでは、混合GI及びBM死との混合により5.5±0.4日で死亡し(表1)、胃腸粘膜の回復の成功ために必要とされるような、十分な数の生存陰窩が利用可能であるように思われたにも関わらず(図3b)、Bax欠損は、当該動物をレスキューしなかった。後者の現象は、粘膜再生が明らかになる前に起こる、不
確定の理由に起因した、BM形成不全及びBM死の進行の加速に由来すると思われる。この概念と一致して、15Gy TBIで処置したC57Bl/6Bax−/−マウスへの自家BMTは、マウスの生存を9.0±0.0日に延長し(図3c;p<0.05)、また、移植のレベルはBMマトリックス壊死及び造血因子の完全な欠失からマウスをレスキューするには十分でなかったが(表1及び非掲載)、腸粘膜は、活発に再生する陰窩の複数の領域を示した。これらのデータは、Bax欠損がASMase欠損によりもたらされたGI致死性に対する保護をミミックすることを示す。留意すべきは、Bax及びBak欠損は、陰窩位置4−5における、p53介在性の上皮アポトーシスに影響を与えなかったことである。さらに、Bax及びBakは、腸微小血管系において機能的に重複しない。さらなるサポートは、J.A. Rotoloら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys..,Vol. 70, No. 3, 804-815(2008)(これは、参照によって本明細書内に組み込まれる)に見られ得る。
配列番号:8、又はBak 配列番号:9の転写を阻害する、各ゲノムDNAの様々な領域を対象にする。患者は、ASMase(タンパク質配列 配列番号:1)もしくはBax(タンパク質配列 配列番号:3);又はBak(タンパク質配列 配列番号:5)の発現を低減するために、同日又は異なる日に投与される、単一の製剤又は異なる製剤中のこれらのアンチセンス核酸の組み合わせにより治療され得るであろう。あるいは、治療
は、1以上の標的タンパク質ASMase、Bax又はBakの発現を低減させるために適切なsiRNAを投与することにより達成され得るであろう。アンチセンス技術に関するさらなる詳細は、以下に説明する。
のマウス抗セラミド抗体MID 15B4又はアイソタイプ対照IgMを、C57BL/6マウスに15Gy TBIの30分前に静脈投与した。抗セラミド注入は、15Gyから4時間後の内皮アポトーシスを無効にし、大規模なアポトーシス(10より多いアポトーシス細胞/絨毛)の出現を、IgM処理対象における56.9%から13.7%に減少させ(図5B及びD)、ASMaseの遺伝子不活性化により与えられる保護を薬理学的に再現した(14.9%)。これらの発見は、内皮の抗セラミド介在性の保護が、GI幹細胞致死率に影響を与え、これによって動物の全体的な生存を増強することを示した。内皮アポトーシスの拮抗作用は、陰窩幹細胞クロノゲンの生存を増進し、これは、15Gy照射後3.5日の生存陰窩の出現の増加により実証される。抗セラミドは、asmase−/−表現型を薬理学的に再現して、内皮アポトーシスを弱めるため、我々は陰窩生存に対する影響を試験した。15Gy TBI前の抗セラミドでのC57BL/6マウスの前処理は、15Gy TBI前に無関連のIgMで処理した同腹子により示された9.3x10−3生存率に対して、1 logの保護を上回る1.3x10−1の陰窩生存率をもたらした(図5A)。無関連のIgM抗体は、非処理C57BL/6対照と比較して陰窩生存率に影響を与えなかった。抗セラミド抗体は、ASMaseの遺伝的阻害と同様のレベル(1.2x10−1)まで陰窩生存を増加させ、セラミドシグナル伝達の薬理学的阻害が、in vivoでの陰窩クロノゲン致死率に対してASMaseの遺伝子不活性化により
与えられる保護をミミックすることを実証した。留意すべきは、Bax及びBak欠損は、陰窩位置4−5におけるp53介在性の上皮アポトーシスに影響を与えなかったことである。さらに、Bax及びBakは、腸微小血管系において機能的に重複しない。さらなるサポートは、J.A. Rotoloら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.., Vol. 70, No. 3, 804-815(2008)(これは、参照によって本明細書内に組み込まれる)において見い
だされ得る。
。剖検は、対照IgMを受けたマウスが、骨髄への部分的損傷のみを伴う、完全に露出し
た陰窩及び絨毛を含む、大規模な腸損傷で死亡したことを明らかにした(非掲載)。これらの発見は、GI症候群による死と一致する。反対に、抗セラミド前処理後に死亡したマウスの剖検は、大規模な出血及びほぼ完全な造血因子の枯渇を含む骨髄死の典型的特徴を明らかにした(非掲載)。これらのマウスは、腸表面のほとんどを覆う、増殖性、好色素性陰窩を含む、再生状態にある腸粘膜を示した。図5Dは、TUNELによって染色された15Gy照射後4時間に採取された小腸の顕微鏡写真を示す。アポトーシス細胞は、茶色に染色された核によって表される。データ(平均±標準誤差)は、2つの独立した実験由来の最も少なくて150の絨毛から得られた。これらのデータは、抗セラミド抗体が、in vivoでのセラミドシグナル伝達を効果的に中和し、asmase−/−表現型を薬理
学的に再現し、並びに放射線誘導疾患及びGI症候群から保護することを実証している。
チャートを図6に示す。抗体を作成するために、我々はまず予防接種された宿主から強い抗体応答を生み出すのに十分な免疫原性である抗原の開発を必要とした。スフィンゴイド塩基上にBSA結合C16脂肪酸を合成することにより、BSA結合セラミドを合成した。図7)挿入図。抗体スクリーニングのための抗原の検証は、ELISAアッセイにより行い、これはプレートに固定された抗原の量を減少させた。各ウェルをブロックした後、次いで、Axxora LLC、San Diego CAより市販の抗セラミドMID15B4抗体(1:100)続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgMと共にプレートをインキュベートした。HRP基質の投与後、ODを650nmで評価した。BSAセラミドELISAは、カポジ肉腫細胞での免疫後の上清#3673における結合活性の増大を明らかにした。図8。免疫したマウスから採取された血漿試料の1:100希尺でのELISAによる結合は、試料#3673対#3674によるセラミドのより強い結合を明らかにした。結合活性は、抗体産生B細胞(sn73−I−C6)の固定化後
も保たれ、抗セラミド結合活性を伴うモノクローナル2A2 IgMの単離を可能にした(非掲載)。カルポジ(Karposi)免疫は、一群の抗体産生B細胞の形成をもたらす強い
免疫応答を生み出すことを意図されていた。これらのB細胞から産生されたハイブリドーマ由来の抗体含有上清は、次いで、BSAセラミドELISAに対して検査された。アッセイにおいて陽性と試験された上清を単離し、これが最終的にクローン2A2の精製をもたらす。さらなる詳細は、実施例4に説明される。
ことを示す。抗体及びその他をヒト化する方法は、実施例1に説明される。
vitroでの放射線誘導アポトーシスを中和した。2A2モノクローナル抗セラミド抗体(25−100μg/mL)とのJurkat細胞の予備培養は、8Gy誘導アポトーシスを阻害した。図10;図4Bにおけるように定量化した。アポトーシス阻害の計算は、8Gy前の無処理Jurkat細胞の平均アポトーシスに対して行われた。C16セラミドでのマウスの免疫により産生された、他の抗セラミド抗体1H4、15D9及び5H9は、当該技術分野に公知の技術を用いてヒト化され得、並びに、GI症候群、及び同様にGvHD、自己免疫疾患及び以下で議論される炎症の治療又は予防について本発明の範囲内となる。
めたことを示した。増加用量の2A2抗セラミド(0−750μg)でのC57BL/6マウスの前処理は、15Gy TBI後の重要な3.5日の時点での陰窩生存率を改善した。図11(A)。2A2抗セラミド抗体は、8−15Gy全身照射後の陰窩生存率を1.2の線量修飾係数(DMF)で増加させた。図11(B)。陰窩生存率を図5Cにあるように測定した。我々の動物実験において、我々はマウス35gあたり750μgの抗体を用いた。この標的タンパク質は抗体に接近しやすいため、活性化T細胞の表面上のセラミドの配置は、抗体療法を用いて列挙された疾患のいずれかを治療又は予防するために特に重要である。
smase−/−表現型を再現することを見出した。図13において行われた生存率研究で瀕死になった時に屠殺されたマウスの剖検結果。近位空腸検体が90%より多くの陰窩−絨毛ユニットの露出を見せ、並びに陰窩の再生がない場合にGI死と判定した。脱灰大腿骨部分が造血因子の枯渇及び大量出血を示す場合に骨髄(BM)死と判定した。
るように抗体断片又は変異体を包含することを意味する。特定の他の実施形態は、抗セラミド抗体、好ましくはヒト化、さらに好ましくは2A2、並びに循環コレステロールレベルを減少させ、それによって抗セラミド抗体の効果を増加させる量のスタチンを含む組成物を対象とする。別の実施形態は、イミプラミン並びに、単独又は抗セラミド抗体及び/もしくはスタチンとの組み合わせのいずれかで、抗精神病薬剤として現在用いられるASMase阻害剤を投与することによる、放射線損傷又はGI症候群の治療又は予防を対象とする。別の実施形態は、2A2抗体及びイミプラミン、又はASMaseもしくはBakを標的とするアンチセンスもしくはsiRNAを含む組成物である。
る宿主マウスの免疫が、例えば2A2抗体で示されるように、劇的な治療作用を伴う効果的な抗セラミドモノクローナル抗体を産生したことである。我々は、免疫のためにKS細胞を選択したが、それは、セラミドリッチであることを我々が示した活性化内皮をKS細胞が再現するからである。純粋なセラミド抗原だけでなく、活性化細胞で免疫したために、我々が作成したモノクローナルは、セラミド以外の他のタンパク質と交差反応し得る。本出願では、交差反応とは、モノクローナルがセラミド以外の他のタンパク質又はタンパク質複合体と反応し得ることを意味する。例えば、これらのモノクローナル抗体が反応する(即ち、親和性を有する)セラミド上のエピトープは、他の細胞表面タンパク質と共有され得る。あるいは、他のタンパク質は、抗原部位において類似の構造を有し得るか、あるいは、該エピトープは、セラミドを提示する複合体の一部であり得る。したがって、本発明の特定の他の実施形態は、セラミドと交差反応するモノクローナル抗体を広く対象にし、ここで該抗体は、全細胞での宿主の免疫によって得られる。断片を含むヒト化モノクローナルが、好ましい実施形態である。免疫グロブリンのサブタイプは任意のサブタイプであり得、IgG、IgMが好ましいが、IgA、IgE等もまた効果的であり得る。
T細胞の分化及び活性化に起因する特有の自己免疫様疾患である。急性GvHDにおいて、ドナーT細胞による宿主のアロ抗原の認識(メジャー又はマイナーミスマッチ)は、宿主組織に対する初期損傷及びI型サイトカイン(INF−γ及びIL−2)産生を含む適応免疫応答を開始させる。これが、CTLクローンの増殖及び活性化をもたらし、それが炎症性サイトカイン(TNF−α及びIL−1β)から成るマクロファージ依存性「サイトカインストーム」の発生と共に(D. A. Wall及び K. C. Sheehan, Transplantation 57
(2), 273 (1994); G. R. Hill, W. Krenger、及びJ. L. Ferrara, Cytokines Cell Mol Ther 3 (4), 257 (1997); J. L. Ferrara, Bone Marrow Transplant 21 Suppl 3, S13 (1998))、選ばれた一連の標的細胞におけるアポトーシスを誘導し(A. C. Gilliam, D. Whitaker-Menezes, R. Korngold ら、J Invest Dematol 107 (3), 377 (1996))、並びに関連する標的臓器(肝臓、腸及び皮膚)に結果として損傷を与えるD. A. Wall、上記を参照; G. F. Murphy, D. Whitaker, J. Sprentら、Am J Pathol 138 (4), 983 (1991))。急
性GvHDの一般的な症状としては、深刻な体重減少、下痢、肝疾患、発疹及び黄疸が挙げられる。図14は、GvHDの免疫病理学の図解である。
NFスーパーファミリーレセプターシグナル伝達の阻害は、概して、マウス同種異系BMTのメジャー及びマイナーミスマッチモデルにおいて急性GvHD関連死亡率を弱め、それはドナーT細胞FasリガンドもしくはTNF−αの遺伝子不活性化、又はこれらの同種レセプターであるCD95/Fas及びTNFRの抗体介在性中和のいずれかによるものであった。これらの研究は、急性GvHDの発症におけるドナーCTL機能におけるデスレセプターシグナル伝達の不可欠な役割を確立し、TNFスーパーファミリーシグナル伝達の無差別阻害がGvH関連病変からの強い保護を提供する可能性があることを示唆した。
免疫マウスモデルを無効にし、その際リンパ球におけるFasLの誘導がFasを発現する肝細胞の選択的殺傷及び抗CD4抗体によるHIVレセプターgp120の活性化をもたらし、CD4+T細胞の枯渇が、これらの細胞におけるFas及びFasLのアップレギュレーションによって起こる。さらに、証拠は、細胞膜の原形質外(exoplasmic)層におけるセラミド産生が、虚血再かん流傷害の過程(L. Llacuna, M. Mari, C. Garcia-Ruizら、Hepatology 44 (3), 561 (2006))並びに肝硬変93及び放射線誘導GI毒性につながるTNF誘導肝細胞アポトーシスの過程(これらの疾患単位について標準化された動物モデルを用いることが既に議論されている)において急激に起こることを示す。
CTL増殖の不全、及びGvHDを有するこれらのBMTレシピエントにおける血清炎症性サイトカインレベルの減弱に対する生物学的に関連する結果を示した。したがって、in
vivoデータは、GvHに関連する疾病率、死亡及び標的臓器損傷におけるASMase
の役割を確認する。宿主のASMase欠損の影響は、T細胞殺傷の不活性化によってではなく、主に全身性因子(即ち、サイトカイン、循環するT細胞の数)の変換によって、GvHDの病態生理学に作用する。
L誘導アポトーシスに対する抵抗性を直接標的細胞に与えるかどうかを調べるために、活性GvHD及びナイーブC57BL/6肝細胞を示すマウスから新たに単離された同種活性化脾臓CTLエフェクターを用いて2細胞ex vivoモデルにおいて、GvHD介在性の
標的細胞融解を脱構築(deconstructed)した。本アッセイにおける標的細胞として肝細胞
を選択したが、それは、肝細胞がGvHDの重要な標的であり、アポトーシスのためにスフィンゴミエリン経路を利用するためである。我々のアッセイ条件下では、0.5x106の肝細胞を、LP/J BM+T細胞→B6レシピエントから単離した0−2x106の同種活性脾臓T細胞と共培養した。共培養は、核の形態変化によって検出されたように、16時間で4.7±0.7%ベースラインから33.8±1.9%への肝細胞アポトーシスの増加を誘導した(図16A)。多くのin vivo研究からのデータと一致して、機能
的Fasレセプターを欠くB6.MRL.lpr肝細胞は、この様式のCTL誘導アポトーシスに対して抵抗性であり(図16A、左パネル)、一方、100ng/ml CMAとの2時間のインキュベーションによる、顆粒エキソサイトーシス介在性細胞溶解経路の選択的阻害は、肝細胞アポトーシスに対する効果を有しなかった(図16A、右パネル)。これらの研究は、本モデルにおけるCTL介在性肝細胞アポトーシスが、パーフォリン/グランザイムシグナル伝達ではなくFasシグナル伝達を必要とすることを示す。先行研究は、Fasレベルはasmase−/−肝細胞において変わらないことを示したが、それにも関わらず、asmase−/−肝細胞は、ex vivoでのGvHDモデルにおいて
同種異系エフェクターT細胞の0.1−2x106からの全用量で(図16B)、且つ4−48時間からの全ての時間で(データ非掲載)、アポトーシスに抵抗性であった。
て、CTL誘導プラットフォーム生成をasmase+/+及びasmase−/−肝細胞において評価した。同種活性化T細胞は、共培養後10分で標的肝細胞表面におけるセラミドリッチプラットフォームの迅速な生成を誘導した(図16C)。プラットフォームの生成は、1分以内で増加し、10分でピークを迎え、60分間を超えて持続した(図16D)。この系でのアポトーシスに必要とされるFasを、共焦点顕微鏡法による決定で、セラミドリッチプラットフォーム内に濃縮した。反対に、asmase−/−肝細胞は、セラミドリッチプラットフォームの形成(図16C、及び図16Dにおいて定量化されている)、並びにその中でのFasの濃縮に対して完全に抵抗性であり、肝細胞における
CTL誘導プラットフォーム生成がASMase依存性であることを実証した。それに付随して、CTLは、asmase+/+肝細胞における1ピクセル当りの平均蛍光強度による決定で、セラミドシグナルの全体として1.5±0.1倍の全体としての増加を誘導した(刺激していない対照と比較してp<0.005)、これはasmase−/−肝細胞では起こらず、図16Cの下パネルに対する上パネルにおけるセラミド染色の強度の差異を説明する。
満の外因性C16セラミド(500nMまで)を、asmase−/−肝細胞に添加した。低用量の長鎖天然セラミドによる、ヒトasmase−/−リンパ球におけるプラットフォーム生成の回復に一致して、亜致死用量の外因性C16セラミド(200nM以下)は、CTL処理asmase−/−肝細胞において46.3±1.3%の細胞までプラットフォーム形成を回復させ、ASMase介在性セラミド生成はプラットフォーム形成を促進することを実証した。C16セラミドは、asmase−/−肝細胞に対するCTL誘導アポトーシスをほぼ完全に回復し(図16E)、標的細胞ASMaseの必要性を回避する。反対に、C16セラミドの生物学的不活性アナログであるC16ジヒドロセラミドは、CTL誘導プラットフォーム生成(非掲載)又は肝細胞アポトーシス(図16E)を回復しなかった。これらのデータは、ex vivoでのCTL誘導肝細胞アポトーシスが、
効率的な細胞死誘導のために標的細胞のセラミド生成を必要とすることを明らかに実証し、これはasmase−/−マウスにおいて観察された急性GvHDからのin vivoでの
保護と一致する。さらに、コレステロールキレート剤ナイスタチンを用いたスフィンゴミエリン濃縮の部位である細胞表面ラフトの薬理学的崩壊は、CTL誘導性のセラミドリッチプラットフォームの生成を無効化し(非掲載)、並びに2x106の同種活性化CTL誘導肝細胞アポトーシスを完全に阻害した(図16F)。外因性C16セラミドは、コレステロールキレート化を克服することができず(図16F)、セラミドリッチプラットフォームの形成は、シグナル伝達のためにアポトーシス機構が予め集合するための場所として働き得る、機能的ラフトを必要とすることを示唆した。
ターT細胞を刺激し、その後、48時間の10□g/ml conAでの刺激により調製したasmase+/+又はasmase−/−標的C57BL/6脾細胞と共培養した。検出のためにミトトラッカーレッドで標識したasmase+/+標的脾細胞とのエフェクターT細胞の共培養は、標的細胞上でのセラミドリッチプラットフォームの迅速な生成をもたらした。共培養の5分以内で、標的asmase+/+脾細胞上のプラットフォームの出現は、4.7±2.1から25.8±6.6%に増加した(p<0.01;図19A)。Fasは、これらのセラミドリッチプラットフォーム内に共局在した(データ非掲載)。プラットフォーム生成は、asmase−/−脾細胞にはなく、刺激後10分での集団のわずか5.9±3.5%で見られた。さらに、MLR感作CTLは、50:1のエフェクター:標的の割合において43.2±6.5%のasmase+/+脾細胞溶解を誘導し(図19B)、51Cr放出アッセイによる定量で、asmase−/−標的細胞における溶解を7.3±2.5%まで弱めた。亜致死の外因性の500nM C16セラミドは、プラットフォーム生成及びasmase−/−標的脾細胞のCTL誘導溶解の両方を回復したが、一方で、C16ジヒドロセラミドは、両方の事象において作用しなかった(非掲載及び図19C)。これらのデータは、conAブラストのin vitro 感作C
TL溶解が、ASMaseに依存して標的細胞のプラットフォーム生成を活性化すること、並びにプラットフォームがこれらのモデルにおける標的細胞の効率的な溶解に必要であることを示す。
を提供する。
ase−/−表現型を部分的に再現することを実証する。C57BL/6asmase+/+又はC57BL/6asmase−/−を、分割線量の1100cGy TBIで致死的に照射した。2A2抗体を受けたC57BL/6asmase+/+群は、分割線量TBIの前半の15分前に750μgの抗体を受けた。その後、全てのマウスに、脾臓T細胞(3x106)と共にマイナー抗原不適合であるLP TCD−BM細胞(5x106)を静脈内注射した。生存率を毎日モニタリングし、結果をカプラン−マイヤー生存率解析により表した。2A2の投与は、移植後100日の動物生存率を12.5%から60%に増加させた(図20)。
CTL介在性の死を妨げることを示した。モノクローナル抗セラミド抗体での治療は、胃腸の放射線毒性における病態生理学的応答の複数の側面を劇的に低減させ、並びにGvHDのメジャー及びマイナーミスマッチモデルを標準化した。
でのT細胞介在性自己免疫症候群に必要である。ASMaseは急性T細胞介在性の自己攻撃的肝疾患のモデルである、フィトヘマグリチン(phytohemagglutin)(PHA)誘導肝炎における肝細胞アポトーシスを制御することが示されている(S. Kirschnek, F. Paris, M. Wellerら、J Biol Chem 275(35), 27316 (2000))。PHAは、リンパ球でのFasL誘導を刺激し、肝臓へのそれらの移動の際に、肝細胞はアポトーシスにより殺され、肝炎を促す(K. Seino, N. Kayagaki, K. Takedaら、Gastroenterology 113(4), 1315(1997))。リンパ球FasLの正常アップレギュレーションにもかかわらず、ASMase
欠損は、アポトーシスから肝細胞を保護した。CD4活性化T細胞誘導細胞溶解におけるASMaseの役割が報告されている(Z. Q. Wang, A. Dudhane, T. Orlikowskyら、Eur
J Immunol 24(7), 1549(1994))。HIVレセプター分子gp120又はアゴニストの抗CD4抗体によるCD4活性化は、Fas/FasL系を活性化し、アポトーシスを開始させる一方、ASMaseにおけるCD4+T細胞欠損は、抗CD4抗体のin vivoでの
接種においてアポトーシスを遂げることができなかった(S. Kirschnek, F. Paris, M. Wellerら、J Biol Chem 275(35), 27316(2000))。我々はここに、ASMase産生セラ
ミドがサイトカイン介在性T細胞誘導アポトーシス、及びGI症候群の病理学の根底にある内皮微小血管のアポトーシスの阻止において普遍的に必要であることを示してきた)。我々はまた、抗セラミド抗体でのASMase産生セラミドの阻害は、血清炎症性サイトカインの発現を減少させることも示した。したがって、Fas/FasL及びTNF/TNFR相互関作用を含むTNFスーパーファミリーレセプターシグナル伝達を介して働く任意の疾患は、ASMase産生セラミドに結合する治療量の抗体を投与することにより、又はASMaseもしくはBaxの阻害により治療又は予防され得る。
。一般には、Fundamental Immunology Ch. 7(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))(全ての目的のために参照によってその全体が組み込まれる)を参照された
い。各軽/重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが2つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。免疫グロブリン鎖は、相補的決定領域又はCDRとも呼ばれる、3つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同一の一般的構造を示す。各対の2つの鎖由来のCDRは、フレームワーク領域により整列し、特異的エピトープへの結合を可能にする。N末端からC末端へ、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interestの定義(国立衛生研究所、Bethesda, Md. (1987及び1991))又はChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Chothia ら、Nature 342:878 883 (1989)に従う。
二価の二重特異性の抗体であり、VH及びVLドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の2つのドメインの間でペアになるのを可能にするには短かすぎるリンカーを用いることにより、当該ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対にならざるを得ず、2つの抗原結合部位を作る(例えばHolliger, P., ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448, 1993,及びPoljak, R. J.ら、Structure 2: 1121 1123, 1994を参照)。1以上のCDRが、共有又は非共有結合的のいずれかで分子内に組み込まれてそれをイムノアドヘシンとしてもよい。イムノアドヘシンは、大きなポリペプチド鎖の一部としてCDRを組み込んでもよく、CDRを別のポリペプチド鎖に共有結合的に結合してもよく、もしくは、CDRを非共有結合的に組み込んでもよい。CDRは、イムノアドヘシンが、目
的の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
渉(RNAi)として公知のプロセスによって、二本鎖RNA(dsRNA)が、多くの生物体において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得ることを教示する。しかしながら、哺乳類細胞において、30塩基対又はそれより長いdsRNAは、タンパク質合成の終了及びアポトーシスを介する細胞死すらも引き起こす、配列非特異的応答を誘導し得る。最近の研究は、RNA断片がRNAiの配列特異的メディエーターであるこ
とを示す(Elbashirら、2001)。これらの低分子干渉RNA(siRNA)による遺伝子発現の干渉が、線虫(C. elegans)、ショウジョウバエ、植物において及びマウス胚幹細胞、卵母細胞及び初期胚において遺伝子をサイレンシングするための天然に起こる戦略方法として現在認識されている(Cogoniら、1994; Baulcombe, 1996; Kennerdell, 1998; Timmons, 1998; Waterhouseら、1998; Wianny 及びZernicka-Goetz, 2000; Yangら、2001;
Svobodaら、2000)。
分子(siRNA)をコードする核酸配列に作動可能に連結されたpol IIプロモーターを包含する発現カセットを含有するウイルスベクターを用いる方法を提供する。
であり得る。したがって、単離された核酸としては、限定されないが、他の配列から独立した分離分子として存在するDNA分子(例、化学的に合成された核酸又はPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたcDNAもしくはゲノムDNA断片)並びにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス(例、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス)又は原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNA内に組み込まれているDNAが挙げられる。さらに単離された核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるDNA分子等の改変核酸を含み得る。例えば、cDNAライブラリ又はゲノムDNA制限消化を包含するゲル薄片内の何百から何百万の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸と考えられない。
mRNAのコード又は非コード領域の一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ASMase、Bak又はBaxの翻訳開始部位の周りの領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45又は50ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において公知の手順を用いた化学合成及び酵素的ライゲーション反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸(例、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に生じるヌクレオチド又は、分子の生物学的安定性を増加するようにもしくはアンチセンスとセンス核酸との間に形成
される二本鎖の物理的安定性を増加するように設計された様々な改変ヌクレオチド(例え
ば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る)を用い
て化学的に合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る、改変ヌクレオチドの例としては、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ホドウラシル(hodouracil)、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−ソウリジン(thouridine)、5−カルボキシメチルアミノメチ−イルウラシル(5-carboxymethylaminometh-yluracil)、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルキュー
オシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メトニルシトシン(metnylcytosine)、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテン−イルアデニン(2-methylthio-N6-isopenten- yladenine)、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−スロウラシル(2-thlouracil)、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−シクシ酢酸(cxyacetic acid)(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボシキプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6−ジアミノプリン等が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、アンチセンスの向きに核酸がサブクローニングされている(即ち、以下の小節にさらに記載される、挿入された核酸から転写されたRNAが、目的の標的核酸に対してアンチセンスの向きであるだろう)発現ベクターを用いて生物学的に作成され得る。
安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであってもよく、又は、例えば、DNA二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合、ダブルへリックスの主溝内での特異的相互作用を介したものであってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接接種を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的にするために改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、アンチセンス分子は、全身投与のために、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターもしくは抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することにより、選択された細胞表面に発現したレセプター又は抗原に特異的に結合するように改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するため、アンチセンス核酸分子は、強いpol II又はpol IIIポリメラーゼの制御下に置かれたベクターコンストラクトが好ましい。
と診断された、又は発症の危険性がある個体であり得る。治療組成物は、例えば、結合剤、充填剤、担体、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤及び賦形剤、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等として通常使用される添加剤等を含有してもよい。これらの組成物は典型的に、1%−95%の活性成分、好ましくは2%−70%の活性成分を含有する。
乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア)等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びにポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは、100日を越える分子の放出が可能であり、特定のヒドロゲルは、より短期間タンパク質を放出する。
内、及び鼻腔内並びに病巣内投与(例、局所的免疫抑制治療)を含む、任意の好適な方法により投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。さらに、好適な投与としては、特に抗体の用量の低下を伴う、脈内注入が含まれる。好ましくは、投与は注射により与えられ、最も好ましくは投与が短いか又は慢性的かに部分的に依存して静脈内又は皮下注射により与えられる。
細胞培養及び刺激
ら得た。細胞を5% CO2インキュベーター内、37℃で10% 熱不活性化ウシ胎仔血清及び10mM Hepes(pH7.4)、2mM L−グルタミン、1mM ピルビ
ン酸ナトリウム、100μM 非必須アミノ酸、100単位/ml ペニシリン及び100μg/ml ストレプトマイシンを添加した、RPMI1640培地中で増殖した。UV−C又は抗Fasでの刺激の前に、細胞を新鮮培地で再懸濁し、4時間順化させた。次いで、別段記載しない限り、50ng/ml 抗FasCH−11活性抗体(Upstate Biotechnology, Lake Placid NY)又はFB−UVXL−1000クロスリンカー(Fisher Biotech, Pittsburgh PA)を用いて50ジュール/m2 UV−Cで、Jurkat細胞を処理した。プラットフォーム研究のために、均一なレセプターの関与を保証するためにJurkat細胞をCH−11と共に4℃で20分間培養し、刺激を開始させるために37℃に温めた。
、30μg/ml ナイスタチン(Sigma-Aldrich, Milwaukee WI)、50μM イミプ
ラミン(Sigma-Aldrich)又は1μg/ml マウスモノクローナル抗セラミド抗体MI
D15B4(Alexis Biochemicals, San Diego CA)と共に予備培養した。ナイスタチン
、イミプラミン及び抗セラミド研究を0.5% 脂質フリーウシ胎仔血清(HyClone, Logan UT)含有RPMI中で行った。各研究において、生存率を評価するために、細胞のア
リコートをトリパンブルーで染色した。
C57BL/6雌と雄SV129/C57BL/6asmase−/−マウスを交配することにより、C57BL/6バックグラウンドへのasmase−/−遺伝子型戻し交雑を行った。続いて、asmase+/−遺伝子型の雄F1マウスをC57BL/6の雌と交配した。次に、純粋C57BL/6バックグラウンドにおけるasmase+/−遺伝子型を得るために、雄のasmase+/−後代と野生型C57BL/6の雌マウスとの交配プロトコルを、10世代続けた。戻し交配が確立されたら、C57BL/6asmase+/+マウスを異種交配させて、実験的動物を得た。BMT実験において用いた雄及び雌宿主は8−12週齢であった。BMTプロトコルは、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。マウスをMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerの病原体のない施設内の殺菌したマイクロアイソレーターケージ内に収容し、通常の食事及びオートクレーブした高塩素消毒飲料水(pH3.0)を与えた。この施設は、アメリカの実験動物管理評価認定協会により承認され、農務省及び保健社会福祉省、国立衛生研究所の規則及び基準にしたがって維持される。
ら入手した。塩化アンモニウム赤血球細胞(RBC)溶解バッファ、コンカナバリンA(conA)及びコンカナマイシンA(CMA)をSigma(St. Louis, MO)から入手し
た。
逆行性コラゲナーゼかん流により、肝細胞を単離した。つまり、肝臓を20mL バッファ1(グルコース+0.1mM EGTAを含むKrebsリンガー)、続いて25mL
バッファ2[5000ユニットコラゲナーゼI型(Sigma)を含む0.2mM C
aCl2含有グルコースを含むKrebsリンガー]で、7ml/分の速さで蠕動ポンプ(Rainin Instrument LLC. Woburn, MA)によってかん流した。かん流した肝臓を切除し
、バッファ2中で細分化し、100μM細胞ストレーナーを通じて濾過し、50xgで2度洗浄し、並びに10% ウシ胎仔血清含有RPMI1640完全培地に再懸濁した。生存率は、通常90%より高かった。
100及び0.1%クエン酸ナトリウムにより、4℃、5分で透過処理した細胞についてTUNEL染色を行った。あるいは、刺激した細胞を2% パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、100μlの24μg/ml ビスベンズイミド三塩酸塩溶液(Hoechst #33258; Sigma-Aldrich, Milwaukee WI)で10分間染色し
た。核の周辺に沿ったクロマチンの凝縮(condensation)、セグメント化、凝縮(compaction)又はアポトーシス小体の出現を含む核アポトーシスの生態学的変化を、前述のようにして、Axiovert S-100 Zeiss蛍光顕微鏡を用いて定量化した33。ポイントあたり最も少なくて200個の細胞を試験した。
2001 #7]、内皮細胞表面マーカーCD31(PharMingenカタログNo.1951D)に対する抗体を用いた免疫染色により、内皮細胞を同定した。
加されたRPMIに再懸濁した。
脂質フリーウシ胎仔血清中で予備培養し、並びに漸増用量のUV−C又は抗Fasで4時間刺激した。その後、細胞を20% FBS、20mM L−グルタミン及び40% メチルセルロース培地含有RPMI培地に懸濁し、3連で塗布した。培養の14−16日後、プレートを倒立顕微鏡により解析し、20より多い細胞の凝集体をコロニーとしてスコア化した。各条件についてのコロニー形成を、非処理対照細胞について得られた値に対して算出した。コロニー生存曲線を、FITソフトウェアプログラム96の変更を用いて最小二乗回帰分析により算出した。該プログラムは、線量−生存率データの各セットに対する重み付けした加重最小二乗を繰り返すことにより曲線をフィットさせ、生存曲線パラメータの共変量及び対応する信頼領域を見積もり、並びに生存曲線をプロットする。これはまた、D0(放射線感受性レベルを示す、カーブの指数部分における傾きの逆数)及びNナンバー(肩の大きさの指標)といった曲線パラメータを導き出す。
Sで2度洗浄し、蛍光封入剤(Dako, Carpenteria CA)にマウントした。SPOTデジタルカメラを備えたAxiovert S-100 Zeiss蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出した。プラットフォームを包含する細胞即ち蛍光が細胞表面の15%未満に凝縮した細胞のパーセンテージを、ポイントあたり150−250個の細胞を計数することにより測定した。あるいは、マウスモノクローナル抗セラミド抗体MID 15B4 IgM(1:50希釈、Alexis
Biochemicals)、マウスモノクローナル抗Fas CH−11 IgM(1:500希
釈、Upstate Biotechnology)又はポリクローナルウサギ抗ASMase抗体1598(
1:100希釈)を用いてプラットフォームを同定し、それぞれCy3結合抗マウス又は抗ウサギIgM(1:500希釈、Roche Molecular Biochemicals)を用いて検出した。ウサギポリクローナル抗CD46(1:1000希釈、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA)をネガティブ対照として用いた。いくつかの研究において、Leica T
CS SPZ直立共焦点顕微鏡を用いて、共焦点画像を得た。あるいは、0.5x106肝細胞をCTLで示した時間の間刺激し、プラットフォーム形成を記載したようにして評価した。
トリトンX−100、100mM NaC1、10mM NaF、10mM Na2P2O7、10mM EDTA及び10μg/mlずつのアプロトニン及びロイペプチン)に溶解した。試料を14000gで遠心分離し、上清を4X SDSサンプルバッファに添加した。溶解液を10% SDS−PAGEゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。カスパーゼ3(BD PharMingen, San Diego CA)、カスパーゼ8(BD PharMingen)又はカスパーゼ9(Cell Signaling Technology, Beverly MA)に対するウサギポリクロ
ーナル抗体を用いて、カスパーゼ切断を検出した。マウスモノクローナル抗カスパーゼ8(clone 1-1-37; Upstate Biotechnology)又は抗FADD(BD PharMingen)抗体をそれ
ぞれ用いて、カスパーゼ8及びFADD発現レベルを検出した。
及び0.6%トリトンX−100]中で等量の溶解液を60分間、37℃でインキュベートすることによりASMase活性を測定した。その後、エタノールでの10X希釈により反応を停止し、20x4mmの逆相Aquasil C18カラム(Keystone Scientific, Bellefonte PA)を備えたWIPS 712(Waters Corp., Milford MA)オートサンプラーにより5μlのアッセイ混合物をサンプリングした。1.2ml/分の流速で、95% MeOHでの定組成溶離により0.4−0.5分以内に、BODIPY−C12セラミドである反応産物を基質から特異的に分離した。それぞれ505及び540nmの励起及び発光波長に設定したWaters 474 (Waters Corp.)蛍光検出器を用いて、蛍光を定
量化した。既知量のBODIPY−C12セラミドの標準について確立された標準曲線から導出される回帰式を用いて、生成産物の量を算出した。あるいは、記載されたようにして14、[14Cメチルコリン]スフィンゴミエリン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を基質として用いる放射酵素アッセイにより、ASMase活性を定量化した。つまり、50J/m2 UV−C又は50ng/ml CH−11刺激後に、示した時間0.2% トリトンX−100含有PBSにJurkat細胞を溶解した。基質の存在下
で、0.1mM ZnCl2、1mM EDTA及び0.1% トリトンX−100を添加した250mM 酢酸ナトリウム、pH5.0中で、ポスト核上清を活性についてアッセイした。1時間後、CHCl3:MeOH:1N HC1(100:100:1、v/v/v)で反応を終了し、シンチレーションカウンターにより産物を定量した。両方のアッセイが、UV−C又はFas刺激後に同一の明らかな倍増を生じたために、これらのデータを照合した。しかしながら、ミカエリスメンテン動態解析による決定では、BODIPY−C12スフィンゴミエリンは、より非効率的に触媒され、より低いVmaxをもたした。したがって、放射酵素アッセイから導出された基準ASMase特異的活性を、本文書を通じて示している。
。つまり、照射後3.5日のマウスを高炭酸ガス窒息により屠殺し、小腸の試料を採取し、上述のように組織学的染色のために調製した。生存陰窩を、10以上の隣接した好色素性非パネート細胞、少なくとも1つのパネート細胞及び内腔を包含するとして定義した。腸の横断切片の周囲を1つのユニットとして用いた。生存陰窩の数を、各周囲について計数した。10−20周囲をマウスごとにスコア化し、各データ点を作成するために2−4匹のマウスを用いた。データを平均±標準誤差として報告した。
から22の異なるパラメータについてスコア化し101、並びに、公開されたように異常角化及びアポトーシス細胞の数について皮膚を評価した102。記載されたようにして、ホルマリン保存し、パラフィン包埋し、TUNEL染色及びヘマトキシリン/エオシン対比染色した切片について、絨毛及び陰窩細胞アポトーシスをスコア化した18、62。
、20U/ml IL−2及び増加量の抗CD3 mAb(0−10μg/ml)含有培地に24時間再懸濁した。その後、細胞を固定し、25μlの24μg/ml ビスベンズイミド三塩酸塩溶液(Hoechst #33258; Sigma-Aldrich, Milwaukee WI)で染色し、蛍
光顕微鏡により、上記のように、アポトーシスを定量化した。
GVHDにおけるASMASEの役割
smase−/−レシピエントから小腸、肝臓及び皮膚を採取した。ヘマトキシリン&エオシン染色した肝臓切片は、asmase+/+レシピエントと比較して、asmase−/−ではより目立たない、リンパ球浸潤(図22A、矢印)、門脈域浸潤、内皮炎(図22A、右パネル)及び肝臓構造喪失により特徴付けられる、肝臓GvHDを示した。同様に、絨毛の鈍化、固有層炎症、陰窩幹細胞喪失及び崩壊並びに粘膜の萎縮を含む腸GvHDは、asmase−/−レシピエントにおいてより目立たなかった(図22B、矢印はアポトーシス細胞を示す)。半定量的組織学的解析は、同種異系骨髄及びT細胞のasmase+/+レシピエントが、肝臓(表1、15.7±1.5対8.3±2.7、p<0.05)及び小腸(表2、10.7±1.1対3.5±0.5、p<0.01)においてBMのみ受けた同腹子よりも有意に高くスコア化されたことを明らかにした。ASMase欠損は、GvHD関連臓器損傷を大きく保護し、肝臓及び小腸において、それぞれ、10.2±0.5及び7±0.1までスコアを低下させた(表2、asmase+/+同腹子に対して肝臓及び腸についてそれぞれp<0.005)。
致の両方に渡って、野生型同腹子と比較して、asmase−/−宿主における、GvHD罹患率及び死亡に対する保護と密接に相関する。
ASMase欠損は炎症を防ぐ
±1.9から13.4±1.1及び2.3±1.2から24.3±7.0pg/ml血清に増加した(それぞれ、p<0.05)(表3)。宿主ASMaseの遺伝子不活性化は、7日目に、血清IL−2及びIFN−γを、それぞれ19.1±2.0及び32.8±12.4pg/ml血清に、(asmase+/+宿主に対してp<0.05)並びにIL−1β及びTNF−αを、それぞれ2.9±1.2及び17.3±3.0pg/ml血清に(asmase+/+宿主に対してp<0.05且つ有意でない)減少させた(表3)。血清サイトカインの減衰は、C57BL/6宿主へのドナーB10.BR BM及びT細胞のメジャーミスマッチモデルに渡って保存され(表2、asmase+/+対asmase−/−宿主における119.1±14.2対63.3±10.8pg/mlのIFN−γ p<0.05、asmase+/+対asmase−/−宿主における136.8±11.5対63.7±9.0pg/mlのTNF−α、p<0.005)、ASMase欠損は、同系異種BM及びT細胞のレシピエントにおける血清サイトカイン産生を通常弱めたことを実証した。
asmase+/+同腹子と比較して、asmase−/−において統計的に差異がない(図23A 上段パネル及びB10.BRについては非掲載)一方で、CD8+T細胞増殖は、マイナー(図12A)及びメジャーMHC(非掲載)不一致モデルの両方に渡って有意に損なわれた。注入3日後、CD8+細胞の増殖は、asmase−/−宿主から回収した集団の26.4%と比較して、asmase+/+宿主における全ドナーLP CD8+T細胞集団の54.1%を占めた(図23A下段パネル、p<0.005)。同様に、asmase+/+宿主における全ての集団の81.5%からasmase−/−宿主における67.1%にまで、増殖ドナーB10.BR CD8+細胞は減少した(非掲載、p<0.005)。さらに、増殖の減弱は、BM及び3x106T細胞の注入から14日後においてasmase+/+レシピエントにおける1.69±0.28x106細胞からasmase−/−レシピエントにおける0.55±0.28x106まで、脾臓ドナーLP/J CD8+T細胞の有意な減少をもたらした(図23B、p<0.001)。
種移植したasmase−/−又はasmase+/+宿主由来の脾臓T細胞は、conAでチャレンジした場合にex vivoで同様の特異的増殖応答を提示するため、T細胞増殖
能力は、asmase−/−宿主内への移植においてインタクトなままであった(図24)。T細胞増殖能力は、asmase−/−宿主への移植においてインタクトなままである。同系(LP)又は同種異系(Balb/c)脾細胞又はマイトジェン(ConA)に対する応答におけるドナーLP BM及びT細胞のC57BL/6asmase+/+又はC57BL/6asmase−/−レシピエントから採取した脾臓T細胞の増殖を測定するチミジン取り込みアッセイ。データ(平均±標準誤差)は、3つの独立した実験から得られる3連の測定値を示す。
mase−/−宿主におけるin vivoでのCD8+CTL増殖の欠損を実証し、並びに、
これらのBMTレシピエントにおいて、血清炎症性サイトカインレベルの減衰への生物学的意義のある結果を示す。
2A2抗体の作成方法
ハイブリドーマ作製
クエン酸、140mM NaCL、pH2.7で溶出した。抗体含有画分をTrisにより中和し、透析し、抗体をカラムアフィニティーにより精製した。NaCL勾配を用いて抗体を溶出した。抗体を25mM リン酸塩、100mM NaCL、pH5.8に対して透析し、1mg/mlに分割し、−20℃で保管した。
モノクローナル抗体の産生
ルで、20%ウシ胎仔血清、10% ハイブリドーマ添加物(Sigma)、2mM L−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100mg/ml ストレプトマイシン、10mM HEPES及び1xヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(Sigma)含有RPMI1640選択培地に播種し、培養した。KS細胞におけるFACS解析及び市販のタンパク質混合物(アネキシンV、セラミドBSA及びAPA)を用いるELISAによりハイブリドーマ上清を選択した。選ばれたハイブリドーマを限定希釈法により4回サブクローニングし、アネキシンV塗布プレート上でELISAにより検査した。条件培地を安定ハイブリドーマ培養物から採取した。mAbのIgクラスをマウスmAbアイソタイピングキット(Santa Cruz)で決定した。mAbの免疫グロブリンクラスを,マウスmAbアイソタイプキットを用いて決定した。アネキシンVに結合する2A2 mAb(mIgM)は、ELISAにより確認されたセラミドに対する弱い交差結合活性を有する。
Claims (37)
- 治療有効量の抗セラミド抗体又はその生物学的活性断片を投与することを含む、移植片対宿主病を予防又は治療する方法。
- 抗体がヒト化されている、請求項1に記載の方法。
- 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項2に記載の方法。
- モノクローナル抗体が2A2 IgMである、請求項3に記載の方法。
- 治療有効量の抗セラミド抗体又はその生物学的活性断片を投与することを含む、放射線病及びGI症候群を予防又は治療する方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項4に記載の方法。
- モノクローナル抗体が2A2 IgMである、請求項5に記載の方法。
- 抗体がヒト化されている、請求項4に記載の方法。
- 治療有効量の抗セラミド抗体又はその生物学的活性断片を投与することを含む、自己免疫疾患を予防又は治療する方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項9に記載の方法。
- モノクローナル抗体が2A2 IgMである、請求項9に記載の方法。
- モノクローナル抗体2A2 IgM又はその生物学的活性断片。
- 抗体がヒト化されている、請求項12に記載の2A2 IgM。
- ヒト化抗セラミド抗体又はその生物学的断片を含む医薬組成物。
- モノクローナル抗体2A2 IgM又はその生物学的活性断片を含む医薬組成物。
- 抗体がヒト化されている、請求項14又は請求項15に記載の医薬組成物。
- スタチンをさらに含む、請求項14に記載の医薬組成物。
- イミプラミンをさらに含む、請求項14に記載の組成物。
- 治療有効量のイミプラミンを投与することを含む、放射線病又はGI症候群を予防又は治療する方法。
- 治療有効量のイミプラミンを投与することを含む、移植片対宿主病を予防又は治療する方法。
- 治療有効量のイミプラミンを投与することを含む、自己免疫疾患を予防又は治療する方法。
- 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における移植片対宿主病を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、ASMaseをコードする配列番号7として特定されるヒト遺伝子又は配列番号2として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。
- 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における移植片対宿主病を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、Baxをコードするコードする(encoding encoding)配列番号8として特定される
ヒト遺伝子又は配列番号4として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。 - 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における移植片対宿主病を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、Bakをコードするコードする(encoding encoding)配列番号9として特定される
ヒト遺伝子又は配列番号6として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。 - 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における放射線障害又はGI症候群を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、ASMaseをコードする配列番号7として特定されるヒト遺伝子又は配列番号2として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。
- 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における放射線障害又はGI症候群を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、Baxをコードするコードする(encoding encoding)配列番号8として
特定されるヒト遺伝子又は配列番号4として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。 - 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における放射線障害又はGI症候群を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、Bakをコードするコードする(encoding encoding)配列番号9として
特定されるヒト遺伝子又は配列番号6として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。 - 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における自己免疫疾患を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、ASMaseをコードする配列番号7として特定されるヒト遺伝子又は配列番号2として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。
- 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における自己免疫疾患を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が、Baxをコードするコードする(encoding encoding)配列番号8として特定されるヒ
ト遺伝子又は配列番号4として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。 - 治療有効量の長さ8−50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することを含む、動物における自己免疫疾患を予防又は治療する方法であって、ここで該アンチセンス核酸が
、Bakをコードするコードする(encoding encoding)配列番号9として特定されるヒ
ト遺伝子又は配列番号6として特定されるcDNAに対して、ハイブリダイズすることによって安定な二本鎖を形成するために十分に相補的である、方法。 - 治療有効量の抗セラミド抗体又はその生物学的活性断片を投与することを含む、炎症を治療する方法。
- 化合物が、患者が放射線を受ける前に投与される、請求項5に記載の方法。
- 化合物が、患者が骨髄移植を受ける前に投与される、請求項1に記載の方法。
- 1H4、15D9及び5H9マウスモノクローナル抗体からなる群より選ばれるモノクローナル抗体又はその断片もしくは変異体。
- 抗体がヒト化されている、請求項34に記載のモノクローナル抗体。
- セラミドと交差反応するモノクローナル抗体であって、ここで、該抗体が宿主を全細胞で免疫することにより得られる、モノクローナル抗体。
- 全細胞がカポジ肉腫(KS)細胞又は活性化内皮を再現するその他の細胞である、請求項35に記載のモノクローナル抗体。
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