JP2016093192A - hPS細胞由来の胚体内胚葉からの特定の内胚葉の派生 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ヒト線維芽細胞由来幹(hBS)細胞を含むヒト多能性幹細胞の分化を制御し、特定の内胚葉細胞を得るための方法に関する。特に、本発明は、hPS細胞由来の胚体内胚葉細胞の分化を特定の内胚葉細胞に向けて制御するための特定濃度でのキーとなる因子としてのFGF2の使用に関する。本発明は、FGFRの使用およびMAPKシグナル伝達経路の活性化を含む内胚葉細胞を得る方法も提供する。
【選択図】なし
Description
AA;アクチビンA
アルブミン(ALB)
アルファ-フェトプロテイン(AFP)
尾部型ホメオボックス2(CDX2)
ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)
胚体内胚葉(DE)
FBS;胎仔ウシ血清
FGF2;線維芽細胞増殖因子2
線維芽細胞増殖因子(FGF)
フォークヘッドボックスA2(FOXA2)
造血組織発現ホメオボックス(HHEX)
肝細胞核因子4、アルファ(HNF4A)
hBS細胞;ヒト胚盤胞由来幹細胞
hPS細胞;ヒト多能性幹細胞
KO-SR;ノックアウト血清代替物
膵臓および十二指腸ホメオボックス1(PDX1)
運動ニューロンおよび膵臓ホメオボックス1(MNX1)
NK2ホメオボックス1(NKX2-1)
NK6ホメオボックス1(NKX6-1)
ソニックヘッジホッグホモログ(ショウジョウバエ)(SHH)
SRY(性決定領域Y)-ボックス9(SOX9)
SRY(性決定領域Y)-ボックス17(SOX17)
本明細書で使用されるように、「ヒト多能性幹細胞」(hPS)とは、いかなる供給源由来でもよく、適切な条件下で、3種の胚層(内胚葉、中胚葉、外胚葉)のすべての派生物である異なる細胞型のヒト子孫を産生することができる細胞のことである。hPS細胞は、生後8〜12週間のSCIDマウスにおいてテラトーマを形成する能力および/または組織培養において3種の胚葉すべての同定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義に含まれるのは、文献ではヒト胚性幹(hES)細胞(たとえば、Thomsonら(1998)、Heinsら(2004)参照)の他にも誘導多能性幹細胞(たとえば、Yuら、(2007) Science 318:5858頁; Takahashiら、(2007) Cell 131 (5):861頁参照)として表示されることの多いヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞を含む様々な種類の胚細胞である。本明細書に記載される様々な方法および他の実施形態は、多種多様な供給源由来のhPS細胞を必要とするまたは利用し得る。たとえば、使用するのに適したhPS細胞は発生中の胚から得ることができる。さらにまたは代わりに、適切なhPS細胞は、樹立細胞系統および/またはヒト誘導多能性幹(hiPS)細胞から得ることができる。
ヒトES細胞のインビトロ培養
未分化hPS(D.A. Melton, Howard Hughes Medical Institute (Harvard University、Cambridge、MA)から得られたトリプシン適応SA181およびSA121 (Cellartis、Gothenburg、www.cellartis.com)、HUES-3、HUES-4ならびにHUES-15(Cowanら、2004年))を以下の通りに増殖させ(Cowanら、2004年; Heinsら、2004年)、プロトコールもhttp://mcb.harvard.edu/melton/hues/で入手可能である。手短に言えば、KO-DMEM、10%ノックアウト血清代替物、10ng/ml bFGF、1%非必須アミノ酸、1%Glutamax、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、ベータメルカプトエタノール(全試薬がGIBCO、Invitrogen社製より)および10%プラスマネート(Talecris Biotherapeutics Inc社製)を含有するhBS培地において有糸分裂的に不活化されたマウス胚線維芽細胞(MEF)(Department of Experimental Biomedicine/TCF from Sahlgrenska Academy at the University of Gothenburg、Sweden)上で細胞は維持された。細胞は0.05%トリプシン/EDTA(GIBCO、Invitrogen社製)を用いて継代され、分割比1:3から1:6の間で再度プレーティングされた。細胞系統は、the Institute of Clinical Genetics、University of Linkoping、Swedenによって標準Gバンド形成により核型決定(karyotype)された。解析ごとに、15〜20の分裂中期が評価された。SA121、HUES-4およびHUES-15は核型的に正常であり、HUES-3(サブクローン52)は過剰染色体17(82%)を得ておりSA181は過剰染色体12(45%)を得ていた。
図1に従ったhPS細胞の胚体内胚葉細胞および特定の内胚葉細胞への分化
hPS細胞は、密度12,000〜24,000細胞/cm2で播種され、コンフルエンスまで培養された。次にhPS細胞は、上記の通りに胚体内胚葉に分化された(D’Amourら、2005年)。手短に言えば、細胞はPBS中で洗浄され、低血清(0〜0.2% FBS)中3日間100ng/mlアクチビンA(R&D systems社製)およびRPMI 1640(GIBCO、Invitrogen社製)中25ng/ml WinglessタイプMMTV組込み部位ファミリーメンバー3A(Wnt3a)を用いて処置された。
特定の内胚葉細胞の特徴付け
FGF阻害アッセイ
FGF受容体阻害アッセイは、3日目にDE誘導に続いて培地にSU5402(Calbiochem社製; 10M)、LY294002(Cell Signalling technology社製; 12.5μM)およびU1026(Cell Signalling technology社製; 10μM)を添加することにより実施された。対照培養物は等量の希釈DMSOを用いて処置された。適切な阻害剤を補充された新鮮な培地が毎日添加された。個々の実験ごとにmRNA解析のために異なる時点(9〜12日目)で別々のウェルから2から3つの試料が採取された。
全RNAは、GenElute Mammalian total RNA kit (Sigma-Aldrich社製)を用いて抽出された。全RNA濃度は、NanoDrop ND-1000分光光度計(Nanodrop Technologies社製)を用いて測定された。逆転写は、2.5μMランダムヘキサマーおよび2.5μMオリゴ(dT)(Invitrogen社製)を使用して製造業者の使用説明書に従って、SuperScriptIIIを用いて実施された。リアルタイムPCR測定は、ABI PRISM 7900HT Sequence Detector System (Applied Biosystems社製)上で実施された。10μl SuperMix-UDG w/ROX、400nMの各プライマー、0.125×SYBR Green I(全試薬がInvitrogen社製)を含有する20μl反応物が使用された。プライマー配列は、補助データとして利用可能である(図6)。予想PCR産物の形成は、アガロースゲル電気泳動および融解曲線解析により確証された。遺伝子発現データはACTBまたはRPL7発現に対して正規化された。追加の正規化対照として、データは全RNA濃度に対しても正規化され、類似のデータを得た。リアルタイムPCRデータ解析は記載の通りに実施された(Bustin、2000年; Stahlbergら、2005年)。
hPS細胞は、室温で15分間4%パラホルムアルデヒドに固定化され、PBS-T(PBS中0.1% TritonX-100)中で3回洗浄された。固定化された細胞は15分間PBS中0.5% Triton X-100を用いて透過処理され、室温で1時間5%正常ロバ血清(Jackson Immunoresearch社製)を補充したPBS-T中でブロックされ、その後、細胞は以下の主要抗体および希釈度:ヤギポリクローナル抗体(pAb)抗FOXA-2(Palle Serupから寄贈; Santa Cruz Biotechnology; 1:200)、モルモットpAb抗PDX-1(Chris Wright; BetaCellBiologyConsortium社製; 1:1500)、ヤギ抗PDX-1(Chris Wright; BetaCellBiologyConsortium社製; 1:1500)、ウサギpAb抗NKX6-1(BetaCellBiologyConsortium社製; 20 1:4000)、マウス抗CDX-2(Jonathan Draperから寄贈; Biogenex社製; 1:500)、ウサギpAb抗SOX-9(Chemicon社製; 1:500)、ウサギ抗HNF-6(Santa Cruz Biotechnology社製; 1:400)、マウスmAb-抗PH-3(Cell Signaling technology社製; 1:50)、ウサギpAb抗MKi67(Novocastra; 1:200)、ウサギ抗SOX2(Palle Serupから寄贈; Chemicon社製; 1:250)、ヤギ抗アルブミン(Bethyl laboratories社製; 1:300)と一緒に4℃で一晩インキュベートされた。一晩のインキュベーション後、細胞はPBS中で5分間3回洗浄され、室温で5%血清を補充されたPBS-T中60分間対応する蛍光二次抗体(Alexa 488、Cy3 and 647; Jackson Immunoresearch and Invitrogen社製;製造業者の使用説明書に従って希釈される)と一緒にインキュベートされた。細胞核は、4分間の4’-6’ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI) (Sigma-Aldrich社製; 1:1000)インキュベーションにより視覚化された。免疫蛍光染色は落射蛍光顕微鏡(Zeiss Axioplan 2)により検出され解析された。
PDX1陽性細胞の百分率は、Imaris Imagingソフトウェア(Bitplane)を使用して計算された。パラメータごとに10の無作為に選択されたフィールドが選択された。DAPI染色を使用して、該ソフトウェアが細胞の全面積を推定した。PDX1陽性細胞の面積は同じように計算された。最後に、PDX1陽性細胞の百分率は、PDX1陽性細胞の面積をDAPI陽性面積で割ることにより計算された。リアルタイムPCR測定からの生データはSDS 2.2.1からエクスポートされ、Microsoft Excelグラフパッドにより解析された。すべてのデータは、ボンフェローニ補正を用いて多変量比較(one-way ANOVA)により統計学的に解析された。すべての値は、平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表され、p<0.05の場合に有意と見なされた。
FGF2の低用量は、肝臓細胞運命を促進するが、中間FGF2濃度はhPS細胞の分化を膵臓細胞運命に向けて方向付ける
本発明では、アクチビンA/Wnt3a処置hPS細胞が、それぞれ腹側および背側膵臓が生じる前方前腸内胚葉と後方前腸内胚葉の両方を生み出すことができるのかどうかが調べられた。実際、特徴的な前腸/中腸マーカーの発現を評価することにより、アクチビンA/Wnt3a処置hPS細胞が自発的に前腸および中腸内胚葉に分化することを我々は明らかにしている(図1B)。さらに、前腸由来臓器のうち、肝臓前駆体が優勢であった(図1B、2A)。全体で、これらの所見から、前方前腸内胚葉は自発的に肝臓に分化するが、前方前腸内胚葉も後方前腸内胚葉も、それぞれ腹側および背側膵臓内胚葉に自発的に特定化しないことが示唆される。FGF2が前腸内胚葉の分化を膵臓運命に方向付けることができるのかどうかを試験するために、異なる濃度のFGF2(0、4、16、32、64および256ng/ml)がPDX1発現を誘導する能力を評価した。濃度は一部マウス外稙片研究に基づいていた(Deutschら、2001年)。分化プロトコール(図1A)が、5つの異なる細胞系統;HUES-3:サブクローン52、HUES-4、HUES-15ならびに細胞系統特異的最適化を回避するためのトリプシン適応SA181およびSA121に適用された。FGF2濃度(16〜256ng/ml)で処置された細胞のほうが密になり多くのクラスターを含有していた。低用量のFGF2(4ng/ml)を用いて処置されたhPS細胞培養物中に肝細胞様細胞が見られた。mRNA解析および免疫蛍光染色により、肝臓マーカーアルブミン(ALB)、one cutホメオボックス1(以前はHNF6として知られていたONECUT1)、肝細胞核因子4アルファ(HNF4A)の用量依存発現が明らかにされ、HHEX発現は非用量依存的な形で中程度に減少しただけであった(少なくとも試験されたFGF2濃度の範囲内では)。FGF2濃度を増加すると、ALB、ONECUT1およびHNF4Aの発現は下方調節された。これは、ALB染色によるタンパク質レベルでも確証され、0および4ng/ml FGF2では豊富なALB陽性細胞が見られたが、256ng/ml FGF2では見られなかった(図1B)。
高用量のFGF2は、hPS細胞の分化を前方前腸および小腸細胞に方向付ける
肝細胞マーカーのALB、HNF4AおよびONECUT1の発現は、FGF2濃度が増加するに従って減少するために(図1B)、前方前腸関連マーカーSRY(性決定領域Y)-ボックス2(SOX-2)の発現レベルは増加し、最高レベルは256ng/mlにおいて見られた(図2A)。一貫して、Sox-2発現は、E13.5マウス胚においては、食道、肺および胃などの前方前腸派生物に限定されていた(補足、図2)。肺および甲状腺は前方前腸内胚葉の同一領域から生じるために、これらの臓器に関連するマーカーの発現パターンはmRNA解析により評価された。甲状腺特異的マーカーのサイログロブリン(TG)は、FGF2の濃度が増加するに従って下方調節されたが(データは示されていない)、肺および甲状腺特定化の最初期のマーカーであるNKX2-1 (Serlsら、2005年)は256ng/mlで上方調節されており、肺細胞型への分化を示唆していた。線維芽細胞増殖因子10(FGF10)、sproutyホモログ2(ショウジョウバエ)(SPRY2)、ソニックヘッジホッグホモログ(ショウジョウバエ)(SHH)およびSHH受容体patchedホモログ1(ショウジョウバエ)(PTCH1)などの肺運命の誘導に関連するがこれに限定されない追加のマーカーも上方調節されていた(図3)。II型肺胞上皮細胞により産生される肺サーファクタントタンパク質C(SP-C)およびクララ細胞10kDaタンパク質(CC10)はmRNA試料において検出することはできず、NKX2-1陽性細胞は初期肺前駆体細胞を表していることを示唆していた。
ERK1/2マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達はPDX1誘導に必要とされる
FGFはその対応するFGFRを通じて、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ(PI3K)およびERK1/2マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)を含むいくつかのシグナル伝達経路を活性化する(図4B)。FGFR mRNA発現はすべての試料において検出された。さらに、上昇レベルのFGFR1およびFGFR3ならびに減少レベルのFGFR2およびFGFR4に向かう傾向は、FGF2濃度が増加するに従って見られた(図4A)。FGFR媒介シグナル伝達が膵臓内胚葉に向かう分化のために必要かどうかを決定するため、FGFRチロシンキナーゼ阻害剤のSU5402、MAPK阻害剤のU1026およびPI3K阻害剤のLY294002の効果が調べられた(図4C)。SU5402を用いた処置によりPDX1陽性細胞の数は著しく減少し、FGF2(64ng/ml)がFGFRを通じてPDX1陽性細胞の誘導を媒介していることが示唆される。さらに、U1026の存在下でFGF2を用いた処置により、PDX1発現は減少し、FGFRシグナル伝達によるMAPK経路の活性化はPDX1の誘導に必要であることが示されている。これとは対照的に、細胞がLY294002の存在下でFGF2を用いて処置されても、PDX1発現は無変化のままであり、活性なPI3K経路はPDX1の誘導に必要ではないことが示唆される。これらの結果により、hPS細胞におけるFGF2誘導PDX1発現は、FGFRシグナル伝達のMAPK経路下流の特定の活性化に依拠していることが実証されている。
Claims (20)
- hPS細胞由来の胚体内胚葉細胞の膵臓内胚葉細胞への分化を制御する、16〜150ng/mlの範囲の濃度でのFGF2のインビトロでの使用。
- 前記hPS細胞がhBS細胞である、請求項1に記載の使用。
- 培地中のFGF2の濃度が0ng/mlより多くかつ500ng/ml以下である、請求項1または2に記載の使用。
- 前記膵臓内胚葉細胞がPDX1ならびに以下のマーカー:NGN3、CPA1、SOX9、HNF6、HNF1b、E-カドヘリン、MNX1、PTF1AおよびNKX6-1のうちの1つまたは複数を発現する、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記膵臓内胚葉細胞がPDX1およびNKX6-1を発現する、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記膵臓内胚葉細胞が以下のマーカー:SOX9、ONECUT1、FOXA2を発現する、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記膵臓内胚葉細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドおよびグレリンからなる群から選択される少なくとも1つの膵臓ホルモンを発現する、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
- 前記分化が、請求項1に記載の膵臓内胚葉運命への分化に適している濃度でFGF2を含有する培地において胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、請求項1から7のいずれかに記載の使用。
- 膵臓内胚葉細胞を調製するための方法であって、16〜150ng/ml FGF2を含有する培地において、2〜20日間胚体内胚葉細胞をインキュベートする段階を含むインビトロでの方法。
- 請求項9に記載の方法により入手可能な膵臓内胚葉細胞。
- 請求項4から7のいずれか一項に記載の特徴を有する、請求項10に記載の膵臓内胚葉細胞。
- FGFRを誘導する段階を含む、膵臓内胚葉細胞を調製するためのインビトロでの方法。
- FGFRがFGFR1、FGFR2、FGFR3および/またはFGFR4である、請求項12に記載の方法。
- 前記FGFRがFGFを胚体内胚葉細胞の培養物に添加することにより誘導される、請求項12または13に記載の方法。
- MAPKシグナル伝達経路がFGFR誘導により活性化される、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項4から7のいずれか一項に記載の特徴を有する膵臓内胚葉細胞を調製するための、請求項12から15のいずれか一項に記載のインビトロでの方法。
- 前記膵臓内胚葉細胞が、増殖についてのマーカーを発現する前駆体細胞を含む、請求項9に記載のインビトロでの方法。
- 増殖についてのマーカーがMKI67、PH3またはBrduである、請求項17に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉細胞が、増殖についてのマーカーを発現する前駆体細胞を含む、請求項1から7のいずれかに記載の使用。
- 増殖についてのマーカーがMKI67、PH3またはBrduである、請求項19に記載の使用。
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