JP2016040001A - 骨欠損部充填材料、及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】欠損した骨を骨本来の自己再生能力を活かして再建するのには相当の長期間を要する。本発明は、埋入された後骨再建作用をできるだけ早く開始させ、さらにその後欠損部を再建するのに十分な骨の形成が得られるまで欠損部に残って骨形成活動を促進する作用を継続する骨欠損部充填材料を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、エレクトロスピニングで製造された生分解性繊維からなる綿状の骨欠損部充填材料であり、前記生分解性繊維は、リン酸カルシウム粒子を４０〜６０重量％、ケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子を１０重量％以上、残部にポリＬ乳酸樹脂を３０重量％以上含んでおり、前記ポリＬ乳酸樹脂は非晶質相量が７５〜９８％である、骨欠損部充填材料を提供する。
【選択図】図１５

Description

本発明は生分解性繊維で綿状に形成された骨欠損部充填材料、及びその製造方法に関する。

近時、骨の自己再生能力を活かして欠損部の骨を再建するタイプの骨欠損部充填材料が開発されている。このタイプの骨欠損部充填材料は、生分解性樹脂に骨形成因子となるセラミックを含有させた多孔質繊維材料を欠損部に埋入し、骨形成因子を供給することによって、骨細胞による骨形成を促すものである。

上記タイプの骨欠損部充填材料は、ポリＬ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性樹脂の溶液とセラミック粒子を混合して作製した紡糸溶液をエレクトロスピニング等の方法で繊維化して製造されている。生分解性繊維のマトリックス樹脂は材料が体内に埋入された後、欠損部において材料の３次元的骨格を維持する足場材料となると共に、樹脂が生体液と接触して徐々に吸収分解されるに伴いリン酸カルシウム等の骨形成因子を露出又は溶出して骨形成の生体活性を発揮させ、その後骨形成が終わった後は生分解性樹脂は生体内で完全に分解吸収されて消失するように設計されている。

骨形成因子となるセラミックとしては、β-リン酸三カルシウム（β-ＴＣＰ）等の生体吸収性リン酸カルシウムが生体親和性と骨伝達性を併せもつ材料として用いられている。
生体吸収性リン酸カルシウムの生体活性のメカニズムは必ずしも明らかでないが、骨欠損部においてリン酸カルシウムの表面に骨形成細胞がよく接着し、増殖分化することによって骨形成するための足場（scaffold又はsubstrate)となると考えられている(非特許文献１)。炭酸カルシウムも同様に骨細胞の接着及び増殖の機能を示すことが知られている(非特許文献２、非特許文献３)

骨は破骨細胞と骨芽細胞のカップリングによるリモデリングによって形成されることが知られているが、その過程でカルシウムと共に微量のケイ素を供給すると骨芽細胞の増殖が刺激されて、増殖分化を促進させることが実験的に確認、報告されている(非特許文献４)。その知見に基づいて新しい骨欠損部充填材料として生分解性ポリマーにケイ素溶出型バテライト相炭酸カルシウム（ＳｉＶ）粒子を含んだ骨欠損部充填材料が提案されている(特許文献１)。骨欠損部に充填されて体液に接触して炭酸カルシウムが溶解されるに伴い微量のケイ素が徐々に溶出されて骨芽細胞を刺激して増殖・分化を促進する。さらに、炭酸カルシウムが分解されて溶出されたカルシウムイオンが細胞周辺に供給されることによって細胞の活動が活発化して高い活性が得られる。

特許第5179124号

Walsh et al.β-TCP bone graft substitutes in a bilateral rabbit tibial defect model. Biomaterials 29 (2008) 266-271) Obata et al. Electrospun microfiber meshes of silicon-doped vaterite/poly(lactic acid) hybrid for guided bone regeneration. Acta Biometatialla 6 (2010) 1248-1257. Fujiwara et al. Guided bone regeneration membrane made of polycaprolactone/calcium carbonate composite nano-fibers. Biomaterials 26 (2005) 4139-4147)。 Hench LL. Polak JM: Third-generation biomedical materials. Science 2002, 295: 1014-1017)

欠損した骨を骨の自己再生能力を活かして再建するのは永続的な骨修復が得られる優れた方法であるが、骨の自己再生には材料の埋入後少なくとも３〜６ヶ月の長期間を要する。従って、その方法に用いる骨欠損部充填材料は、埋入された後骨再建作用をできるだけ早く開始させ、さらにその後欠損部を再建するのに十分な骨の形成が得られるまで欠損部に残って骨形成活動を促進する作用を継続することが求められる。しかし、これまでの骨欠損部充填材料はいずれもこれらの互いに背反する要求を十分に満たすものは未だ得られていない。

本発明の骨欠損部充填材料は、エレクトロスピニングで製造された生分解性繊維を含む綿状の骨欠損部充填材料であり、前記生分解性繊維は、リン酸カルシウム粒子を４０〜６０重量％、好ましくは４０重量％、ケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子を１０重量％以上、好ましくは３０重量％、かつポリＬ乳酸樹脂を３０重量％以上を含み、好ましくは３０重量％、又は残部すべてである。また、前記ポリＬ乳酸樹脂の非晶質相量は７５〜９８％、好ましくは、該非晶質相量は８５〜９５％、さらに好ましくは８８〜９２％である。

本発明の骨欠損部充填材料に用いる生分解性繊維は、ＰＬＬＡ含有量をエレクトロスピニングによる紡糸が可能な範囲でできるだけ抑えられているので、繊維表面においてリン酸カルシウムと炭酸カルシウム粒子の露出量が大きく、体液と直接接する部分が大きい。
その結果、リン酸カルシウムと炭酸カルシウム粒子から高い生体活性が得られる。

本発明の骨欠損部充填材料が含有するケイ素溶出型炭酸カルシウム、好ましくはバテライト相のケイ素溶出型炭酸カルシウムである。該ケイ素溶出型炭酸カルシウムは溶解速度が速いため、埋入後カルシウムイオンを早期に溶出してカルシウムリッチの環境を作り出す。他方、炭酸カルシウムにドープされているケイ素種が徐々に溶出されて骨芽細胞の増殖を刺激して、骨形成を促進する。

本発明の骨欠損部充填材料は、埋入後バテライト相炭酸カルシウムから豊富な量のカルシウムイオンが溶出されて繊維表面に骨似アパタイトの生成を誘起する。マトリックス樹脂であるポリ乳酸はカルボキシル基を多く有しており、生体液に接触してポリ乳酸が加水分解されると骨似アパタイトの核生成を誘引するカルボキシル基を形成する。

本発明の骨欠損部充填材料の炭酸カルシウムはバテライト相のものを用いるのが好ましい。一般に炭酸カルシウムは結晶構造の違いからカルサイト相、アラゴナイト相、バテライト相の３つに分けられるが、バテライト相炭酸カルシウムが人体液中の溶解性が最も高い。従って、バテライト相炭酸カルシウムを含むＰＬＬＡは高い骨似アパタイト形成能力を有する。

本発明の骨欠損部充填材料に用いる生体吸収性リン酸カルシウムは、欠損部に埋入された後ゆっくりと時間をかけて生体吸収されて骨に置換される。本発明の骨欠損部充填材料は生体吸収性リン酸カルシウムを４０％以上含有するので、吸収置換による骨形成が有効に行われる。

本発明の骨欠損部充填材に用いるＰＬＬＡはリン酸カルシウムが吸収されて骨に置換される間は欠損部において骨格を維持して残留し、骨が形成される間は骨細胞がそこで活動するための足場となる。ＰＬＬＡは加水分解されにくいので、埋入後、体液に接触して直ちに分解吸収して消失してしまう恐れが少ない。

本発明の骨欠損部充填材の生分解性繊維の外径は１０〜５０μｍが好ましい。より好ましくは３０〜５０μｍの外径である。

本発明の骨欠損部充填材料の製造方法は、溶融したポリＬ乳酸溶液中にリン酸カルシウム粒子とＳｉＶ粒子を３者の重量比率リン酸カルシウム４０〜６０重量％、ケイ素溶出型炭酸カルシウム１０重量％以上、残部にポリＬ乳酸３０重量％以上となるように投入して、その状態で混錬し、前記混錬した溶液をその後常温冷却して固化させてポリＬ乳酸の分子量が２０万〜２５万、非晶質相量が７５％以上好ましくは８５％以上であるコンポジットを作製し、前記コンポジットを 溶剤で溶かして、紡糸溶液を作製し、前記紡糸溶液をエレクトロスピニング法を用いて紡糸して、生分解性繊維を製造し、前記生分解性繊維をエタノール溶液を満たしたコレクターに受けて堆積させることによって、綿状の骨欠損部充填材料を製造する工程を含む、前記骨欠損部充填材料の製造方法である。

本発明の骨欠損部充填材料の製造方法は、ケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子とリン酸カルシウム粒子と溶融ポリ乳酸をそれぞれ一定量含んだ溶液を一定時間と温度でニーダーを用いて混錬して、その過程でケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子に含まれるシロキサンのアミノ基部分とポリ乳酸構造の末端のカルボキシ基との結合（アミド結合）を生じさせる工程を含む。かかる製造方法により、紡糸溶液に含まれるポリ乳酸の秩序性の乱れを生じ、ポリ乳酸の非晶質相の割合が上がって溶解性が高まるため、その紡糸溶液を用いてエレクトロスピニングで製造された骨欠損部充填材料は、生体内においてより高い吸収性を有する。本発明の骨欠損部充填材料のポリＬ乳酸の好ましい非晶質相量は７５〜９８％であり、さらに好ましくは８５〜９５％、さらに好ましくは８８〜９８％である。

本発明の骨欠損部充填材料では、エレクトロスピニングで形成された直径約１０〜５０μｍのコンポジット繊維において、略球形状のＴＣＰ粒子（好ましい平均粒子径約3-4μｍ前後）と略球形状ＳｉＶ粒子（好ましい平均粒子径約1μｍ前後）がＰＬＬＡマトリックス樹脂中にほぼ均一に分散している。好ましくは、ＴＣＰ粒子、ＳｉＶ粒子は共にマトリックス樹脂中の特定の箇所に偏在せずにほぼ均一に分散している。その結果、微小なＴＣＰ粒子とＳｉＶ粒子が繊維表面付近と繊維の中心付近にわたって広く均一に散在するので、骨欠損部に材料が充填された後、ＰＬＬＡの分解生体吸収に伴い、ＴＣＰ粒子の骨吸収、ＳｉＶからのケイ素溶出とが、比較的長期間にわたって骨欠損部内において均一に生じる。

図１は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料の概観写真である。 図２は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料の繊維の表面を示すＳＥＭ写真である。 図３は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料繊維の断面を示すＳＥＭ写真である。 図４は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料の綿を構成する繊維が互いに絡みあった状態を示すSEM写真である。 図５は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料の綿を人体の脊椎固定用のインプラントの周囲に埋めて使用する方法を示す。 図６は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料の綿で自家骨を包んで使用する方法を示す。 図７は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料に用いるβ―TCPの粒子のSEM写真である。 図８は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料に用いるケイ素溶出型炭酸カルシウム（ＳｉＶ）の粒子のSEM写真である。 図９は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料に用いるケイ素溶出型炭酸カルシウム（ＳｉＶ）の粒子の構造予想図である。 図１０は、ケイ素溶出型炭酸カルシウムをトリス緩衝溶液に浸漬したときのケイ素とカルシウムの溶出特性を示すグラフである。 図１１（Ａ）は、ウサギの脊椎に本発明の実施例である骨欠損部充填材料の綿を埋植直後の状態を示すＸ線画像である。脊椎の右側が単独で埋植した状態を示 し、脊椎左側が自家骨混合で埋植した状態を示す。図１１（Ｂ）は図１１（Ａ）の12週間経過のCT画像である。脊椎の左側が単独で埋植した状態を示し、脊椎右側が自家骨混合で埋植した状態を示す。 図１２（Ａ）及び（Ｂ）はウサギの大腿骨に本発明の実施例である骨欠損部充填材料を骨髄穿刺液（Bone Marrow Aspirate）と共に埋植して12週間経過後の状態を示す染色切片画像である。 図１３（Ａ）〜（Ｃ）はウサギの脊椎に本発明の実施例である骨欠損部充填材料を骨髄穿刺液（Bone Marrow Aspirate）と自家骨と共に埋植して12週間経過後の状態を示す染色切片画像である。 図１４（１）は、サンプル〔１〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。 図１４（２）は、サンプル〔２〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。 図１４（３）は、サンプル〔５〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。 図１４（４）は、サンプル〔３〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。 図１４（５）は、サンプル〔４〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。 図１５は、サンプル〔１〕〜〔４〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによるＰＬＬＡの分子量の変化を示すグラフである。ポリ乳酸の含有量とＳｉＶの含有量によって、浸漬前の分子量に差が生じていた。浸漬開始後すぐに、分子量が大きく減少し、その後徐々に減少していく結果となった。 図１６は、サンプル〔１〕〜〔５〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して１〜１４日を経過することによる綿材料の乾燥重量の変化を示すグラフである。浸漬後のサンプルは、傾向としては、ＰＬＬＡの分子量の低いもののほうが、重量の減少も大きかった。 図１７（１）及び（２）はサンプル〔１〕〜〔５〕の結晶化度を測定したＤＳＣ測定の結果を示す。 図１８（１）及び（２）は、図１７のサンプルと同じ方法で作製した別のサンプル〔２〕’(70ＳｉＶ-30ＰＬＬＡ)、〔３〕’(30ＳｉＶ- 40TCP-30ＰＬＬＡ)、〔４〕’(10ＳｉＶ-60TCP-30ＰＬＬＡ)についてＤＳＣ測定の結果を示す。 図１９は、本発明の実施例である骨欠損部充填材料に３５ｋＧｙのγ線照射をして滅菌処理した場合のＰＬＬＡの分子量の減少を示す。

以下、本発明の実施態様を図面を参照しながら詳細に説明する。
＜生分解性樹脂＞
本発明の骨欠損部充填材料の生分解性樹脂としてはポリＬ乳酸（以下ポリＬ乳酸又はＰＬＬＡと称する）を用いるのが好ましい。ＰＬＬＡは生体吸収性ではあるが、ＰＬＧＡに比べて加水分解を生じにくい。そのため、ＰＬＬＡをマトリックス樹脂とする生分解性繊維は、欠損部で体液に接触して容易に分解せず、長期間消失せずに残留し、材料の骨格を維持することができる。

他面、マトリックス樹脂に含まれるリン酸カルシウム又は炭酸カルシウム等の骨成長因子が生体活性を発揮するには、これらの微粒子が体液に接触する必要があるが、マトリックス樹脂が人体液に容易に溶解しないものであると、骨形成因子がマトリックス樹脂の存在に妨げられて十分な骨形成作用を発揮できない。

ＰＬＧＡは生体液と接触して容易に分解吸収されるので、それに含有される骨形成因子が生体液と直接接触する妨げになることは少ない。しかし、ＰＬＧＡの分 解吸収速度は速すぎるので、材料の骨格を長期間維持できず、骨形成を生じさせるための足場となるのが難しいという問題がある。ＰＬＬＡは生体液に接触して分解される速度はかなり遅いので、埋入後長期間体内に残留し、十分な骨形成が完了する前に消失してしまうという問題は少ない。逆に分解吸収されない結果、含有する骨形成因子の生体液への露出又は溶出を妨げる可能性がある。また、骨形成が終わった後もＰＬＬＡが消失せずにさらに長期間体内に残留するのは人体の健康に与える影響上望ましくない。

溶融したＰＬＬＡをケイ素溶出型炭酸カルシウム（ＳｉＶ）と混合した溶液をニーダーを用いて混錬すると、ＰＬＬＡの分子量が減少する。その熱混錬過程で一部反応してシロキサンのアミノ基部分とポリ乳酸構造の末端のカルボキシ基との結合（アミド結合）が生じる（Wakita他、Dental Materials Journal 2011; 30(2): 232-238）。このため、ポリ乳酸の秩序性が乱れ、結果としてポリ乳酸の非晶質相の割合が上がるので、溶解性が高まる結果、生体内で速い吸収性を示す。しかし、骨形成のためには、少なくとも３〜６ヶ月は材料そのものが吸収されて消失せずに細胞の活動場所を確保することが望ましい。β-TCPにはＳｉＶのようなアミノ基の付いたケイ酸部分は有しないので、熱をかけて混練してもＰＬＬＡに変化が生じにくいので、ＰＬＬＡの吸収性が急激に高くなることはない。本発明の発明者等は、アミノ基のついたケイ酸部分を有しないリン酸カルシウムの相当量をＳｉＶとＰＬＬＡのコンポジットに混合することで、得られ たコンポジット材の生体吸収性はＳｉＶとＰＬＬＡのコンポジット材より遅くなり、骨が生成してくる前に材料がなくなってしまうようなことが起こらないように制御することが可能であることを見出した。

本発明の骨欠損部充填材料のポリＬ乳酸の非晶質相の割合は、混錬にあたってのケイ素溶出型炭酸カルシウムとリン酸カルシウムの配合比の他、繊維中に含まれるポリＬ乳酸の量よっても大きく影響を受けると考えられる。図１７に示す例では、ケイ素溶出型炭酸カルシウム３０重量％に対しポリＬ乳酸を７０重量％含むサンプル〔１〕ではポリＬ乳酸の結晶化度は２１．８％であるのに対し、ケイ素溶出型炭酸カルシウム７０重量％に対しポリＬ乳酸を３０重量％含むサンプル〔１〕ではポリＬ乳酸の結晶化度は７．５％と大きく下がっている。

＜リン酸カルシウム＞
本発明の骨欠損部充填材に用いるリン酸カルシウムとしては、リン酸水素カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸三カルシウム、炭酸含有アパタイト等の生体吸収性リン酸カルシウムなどがある。β―リン酸三カルシウムは、骨芽細胞系の細胞の増殖と分化のためのscaffoldになる物質として特に好適である。外見はパウダー状である。パウダーを構成する粒子の径は１〜６μｍのものが好ましい。本発明の充填材料を構成する繊維の外径が１０〜５０μｍであることからすると、粒子径は６μｍ以下程度のものが好適である。混錬にあたって混合するケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子と均一分散させるためには、粒子の外径がそれと同等の１〜２μｍ程度のものとすることが好ましい。

＜ケイ素溶出型炭酸カルシウム（ＳｉＶ）＞
本発明の骨欠損部充填材に用いるＳｉＶは、シロキサンと炭酸カルシウム（バテライト相）とのコンポジットであり、外見はパウダー状で、パウダーを構成する 粒子の径は１μｍ程度のものが好適である。ＳｉＶの構造予想図を図９に示す。走査型電子顕微鏡（SEM）写真を図８に示す。ＳｉＶの製造方法は特開平2008-100878（ケイ素溶出炭酸カルシウム、およびその製造方法）に詳細に開示されている。ＳｉＶ中のケイ素含有量は２〜４重量％、好ましくは２〜３重量％である。ケイ素含有量が４重量％を超えるとＳｉＶが球状とならなくなり、不定形になってしまうので、ＰＬＬＡとの混合分散が不均一になってしまう可能性があるので、好ましくない。

ＳｉＶは、欠損部に埋入されて体液と接触するとバテライト相炭酸カルシウムが加水分解されて短時間でカルシウムイオンが溶出する。ケイ素は徐々に溶出される。本発明の発明者等は、本出願に先立つ特願２０１１-０２１７９０において、ケイ素溶出型炭酸カルシウムのカルシウムイオンとケイ素種の溶出特性を開示した。ＰＬＬＡ 42gと2ＳｉＶ（Ｓｉを２重量％含むバテライト相炭酸カルシウム）18gを加熱ニーダーで200℃、45分間混練して2ＳｉＶを30wt%含有する複合体を調製した。該複合体1gに対してCHCl₃ 9.3gを混合した紡糸溶液を準備した。この紡糸溶液を用いて、エレクトロスピニング法により綿状物を作製した。得られた綿状物をトリス緩衝溶液に浸漬して３７℃に保持された恒温器に静置し、所定時間浸漬した後、固液分離して液中のＳｉとＣａの濃度を誘導プラズマ結合発光分析（ＩＣＰ）にて測定した。図１０は、特願２０１１-０２１７９０の図６であり、ＳｉとＣａのトリス緩衝溶液に浸漬したときの溶出特性を示す。同図は、トリス緩衝溶液に浸漬後、カルシウムは1日以内にかなりの量が溶出し、ケイ素は、その後徐々に微量が時間の経過と共に溶出されていくことを示している。

＜骨欠損部充填材料の製造＞
高温で溶融して作製したＰＬＬＡ溶液中にリン酸カルシウム粒子とＳｉＶ粒子を所定の重量比率となるように投入して、その状態で混錬し、その後常温冷却して固化させることで、ケイ素溶出型炭酸カルシウム／リン酸カルシウム／ＰＬＬＡのコンポジットを作製する。好ましくは、３者の重量比はＰＬＬＡ３０重量％以上／リン酸カルシウム４０〜６０重量％／ケイ素溶出型炭酸カルシウム１０重量％以上である。さらに好ましくは、ＰＬＬＡ３０重量％／リン酸カルシウム４０重量％／ケイ素溶出型炭酸カルシウム３０重量％である。

次いで、前記コンポジットをクロロホルムで溶解して紡糸溶液を作製し、それを一定の方法／条件下でエレクトロスピニングで紡糸して、生分解性繊維からなる綿状物を作製する。
コレクター容器にはエタノール液を満たして、エレクトロスピニングされた糸を受けて、堆積させる。コレクターに満たしたエタノール溶液が繊維表面に残ったクロロホルムを除去し、その結果コレクタープレート上に堆積される繊維同士が互いに接着するのを防ぐことができるので、ふわふわ感のある嵩密度が低い綿状物が形成される。

骨形成の促進の目的のためには、コンポジットに含まれる無機粒子（ＳｉＶ，β-ＴＣＰ）の含有量は多い方が生体活性が上がるので望ましい。しかし、無機粒子を一定限度以上多くするとＰＬＬＡと共に混錬することが難しくなる。本発明の発明者らの実験では、無機粒子全体の量が８０重量％かつＰＬＬＡ２０重量％では混錬ができなかった。本発明の骨欠損部充填材料において、ＰＬＬＡの含有量は３０重量％以上４０重量％以下であり、残りが骨形成無機セラミック粒子（ＳｉＶ、リン酸カルシウム）から構成されることが好ましい。

エレクトロスピニングの紡糸溶液は高温で溶融したＰＬＬＡに無機粒子を投入して混合して作製した溶液をニーダーで一定温度と時間混錬した上で冷却固化してコンポジットを作製し、次いでそのコンポジットをクロロホルムで溶かして紡糸溶液を作製するという２ステップを踏んで作製する。

ＰＬＬＡは本来分子配列秩序性が高く、樹脂が体液に接触しても加水分解し難い。紡糸溶液を作るのにＰＬＬＡの溶融溶液をニーダーで混錬すると、その混合過程（熱をかけて練る）でＳｉＶ粒子が一部反応して、ＳｉＶ中に含まれるシロキサンのアミノ基とポリ乳酸の末端のカルボキシ基との結合（アミド結合）が生じる（Wakita他、Dental Materials Journal 2011; 30(2): 232-238）。このため、ポリ乳酸の秩序性が乱れ、結果としてポリ乳酸の非晶質相の割合が上がるので、溶解性が高まる。これに対し、ＰＬＬＡに加える無機物がポリ乳酸とのアミド結合を作らないものであれば、ＰＬＬＡの非晶質の割合を上げることはないので、溶解性が急激に高くなることはない。

本発明の骨欠損部充填材では、リン酸カルシウム４０−５０重量％／ケイ素溶出型炭酸カルシウムが１０重量％以上／残部をＰＬＬＡ３０重量％以上という配合比率で混錬するので、生分解性繊維の非晶質の割合は適度に制御される。その結果、ＰＬＬＡマトリックス樹脂の体液に対する溶解性が適度にコントロールされる。
図１７に示す例では、ＳｉＶ７０重量％にＰＬＬＡ３０重量％を加えたサンプル〔２〕の結晶化度は８％以下であるのに対し、ＳｉＶを減らしてその分ＴＣＰを一定量加えたサンプル〔３〕（30SiV-40TCP-30PLLA）及び〔４〕(10SiV-60TCP-30PLLA)はＰＬＬＡの結 晶化度が８％以上１５％以下と高くなっている。

エレクトロスピニングを用いて製造される本発明の骨欠損部充填材の生分解性繊維の外径は１０〜５０μｍが好ましく、さらに好ましいのは３０〜５０μｍである。エレクトロスピニングで紡糸すると繊維は一般に数μｍ以下の外径になりやすいが、それと比較すると本発明の骨欠損部充填材の生分解性繊維は太い。繊維の外径が１０μｍ以上とすることで、本発明の綿状多孔体の内部に細胞が侵入していくために必要な繊維と繊維の間のスペース（ギャップ）を作り出すことが可能になる。エレクトロスピニングを用いて紡糸する繊維の径を５０μｍ以上にすることは難しい。

図３に示すように、本発明の骨欠損部充填材の生分解性繊維は繊維表面に超微細な無数の孔が形成されている。エレクトロスピニングによる紡糸では、ノズルから繊維状に射出された紡糸溶液が揮発する過程で、繊維表面に微細孔が形成される。本発明の骨欠損部充填材では、生分解性繊維に超微細孔が形成されていることで、含有するセラミック粒子（骨形成因子）と体液との接触面積が著しく増加していると考えられる。

＜滅菌処理＞
本発明の骨欠損部充填材料は、エレクトロスピニングで綿状に形成した後、ピンセット等を用いて所望のサイズ／重量（例２ｇ）に取り分けた上で、アルミ包装して滅菌処理を施す。滅菌の方法としては、放射線滅菌（ガンマ線、電子線）、酸化エチレンガス滅菌、高圧蒸気滅菌等がある。本発明ではγ線による放射線滅菌を好適に用いる。ＰＬＬＡの分子量２０万〜２５万のサンプルに２５ｋＧｙ〜３５ｋＧｙのγ線による放射線滅菌を施すと、分子量は７万〜１２万に減少する。図１９は、本発明の実施例である４０ＴＣＰ（ＳｉＶ３０重量％／ＴＣＰ４０重量％／ＰＬＬＡ３０重量％の組成の骨欠損部充填材料に３５ｋＧｙの線量のγ線照射をした場合のＰＬＬＡの分子量が減少した結果データを示す。

本発明の実施例のサンプルは以下に示す材料を使用して作製した。
・ケイ素溶出型炭酸カルシウム（ＳｉＶ）：水酸化カルシウム（試薬特級純度９６％以上 和光純薬工業株式会社）、メタノール（試薬特級 純度９９．８％以上 和光純薬工業株式会社）、γ‐アミノプロピルトリエトキシシラン（ＳＩＬＱＵＥＳＴ Ａ−１１００ 純度９８．５％以上モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社)、炭酸ガス（高純度液化炭酸ガス純度９９．９％ 大洋化学工業株式会社）を用いて調製されたＳｉ含量２．９重量％のバテライト相炭酸カルシウム。その製造方法の詳細は、特開平2008-100878（ケイ素溶出炭酸カルシウム、およびその製造方法）に開示されている。
図９にＳｉＶの構造予想図を、図８にＳｉＶ粒子のSEM 写真を示した。
・β―リン酸三カルシウム（Ca₃(PO₄)₂）：太平化学産業（株） β-ＴＣＰ−１００を用いた。粒径１．７ｍｍ以下のものを４μｍ程度に粉砕したもの（β―ＴＣＰ粉砕品）を用いた。
・ＰＬＬＡ：PURAC biochem社製PURASORB PL24 Poly(L-lactide) 分子量20-30万を使用した。

１．コンポジットの作製
ＰＬＬＡをニーダー中で１８０℃で溶融して作製した樹脂溶液中に、ＳｉＶ粒子とβ―ＴＣＰ粒子を投入してその状態で12分間混錬し、その後常温冷却して固化させることで、３０ＳｉＶ／４０β―ＴＣＰ／３０ＰＬＬＡコンポジットを作製した。

２．綿状物の作製
前記コンポジットをクロロホルムで溶解して紡糸溶液を作製し、該紡糸溶液をエレクトロスピニングで紡糸して、生分解性繊維からなる綿状物を作製した。
１）エレクトロスピニングの方法
コンポジットをクロロホルムで溶解して１０％濃度のエレクトロスピニング用紡糸溶液を作製した。
針の太さは１８Ｇ、電圧は２５ｋＶ、紡糸溶液のノズルからの吐出量：１５ｍｌ／時間とした。ノズルからコレクターまでの飛距離は２５ｃｍとした。コレクター容器にはエタノール液を満たして、エレクトロスピニングされた糸を受けて、堆積させた。コレクターにエタノール溶液を満たしてある結果、堆積される繊維同士が互いに接着するのを防ぐことができるので、嵩密度の低い綿状物を形成することが可能になる。
２）エレクトロスピニングで紡糸された繊維の構成を図２に示した。紡糸された生分解性繊維の直径は約５０μｍであった。
図３に、繊維径５０μｍの中に、β-ＴＣＰ粒子（平均粒子径3-４μｍ）とＳｉＶ粒子（平均粒子径約１μｍ）がＰＬＬＡマトリックス樹脂中にほぼ均一に分散した状態を示した。

３．綿状物の性状
図４に本発明の骨欠損部充填材料の実施例の綿状物を示すＳＥＭ写真を示した。該繊維が3次元方向に絡み合って綿状を形成している。該繊維は長手方向に互いに接着されておらず、ふわふわの3次元立体綿構造を形成している。綿を構成する各繊維間の距離は、約５０−２００μｍで平均５０μｍ前後である。

実施例の綿状物のサンプルの嵩密度、圧縮率、圧縮回復率を、ＪＩＳ規格Ｌ １９２７に準拠して測定したところ、嵩密度：0.01489g/cm³、圧縮率：52.61%、圧縮回復率：31.10%であった。

４．綿状物の繊維に含まれるポリＬ乳酸の溶解性
本発明の骨欠損部充填材料が体内に埋入されると該繊維を構成するポリＬ乳酸樹脂が溶解し生体吸収されるが、その速度は繊維中に含まれるポリＬ乳酸の含有量、非晶質相量等の相違によって異なる。そこで本発明の実施例のサンプルを複数用意して、その結晶化度をＤＳＣ測定するとともに、それらを水酸化ナトリウム溶液に浸漬し、見た目の変化、分子量、乾燥重量の減少を観察し、評価分析した。

１）実験の実施方法
実験サンプルとして、組成重量比の異なる〔１〕30ＳｉＶ-70ＰＬＬＡ 〔２〕70ＳｉＶ-30ＰＬＬＡ 〔３〕30ＳｉＶ-40TCP- 30ＰＬＬＡ、〔４〕10ＳｉＶ-60TCP-30ＰＬＬＡ、〔５〕50ＳｉＶ-50ＰＬＬＡを作製した。作製方法は[００３８]〜[００４０]に記載した方法に従った。作製した実験サンプル〔１〕〜〔５〕の結晶化度をＤＳＣ測定した。測定結果を図１７（１）及び（２）に示す。上記実験サンプル〔１〕〜〔５〕を5mmol/L 水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温放置し、朝晩に容器をひっくり返して撹拌して１日、３日、７日、１４日経過後の水酸化ナトリウム水溶液中のサンプル〔１〕〜〔５〕の見た目の変化と分子量（SEM観察）の変化を観察した。結果を図１４（１）〜（５）と図１５に示す。上記実験サンプル〔１〕〜〔４〕を 5mmol/L 水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、浸漬時、１日経過時、３日経過時、７日経過時、１４日経過時に綿材料を水酸化ナトリウム水溶液から取り出して各サンプルの分子量と乾燥重量の変化を観察した。結果を図１６に示す。

２）実験結果
[結晶化度]
図１７のＤＳＣ測定結果では、原料ＰＬＬＡは当初結晶化度が74.7%であるのに対し、熱混錬を経てエレクトロスピニングで紡糸した繊維中のＰＬＬＡの結晶化度は21.8%以下と大きく減少している。紡糸された繊維のＰＬＬＡの結晶化度は、ＰＬＬＡ含有量が多いサンプル（〔１〕及び〔５〕）の方がＰＬＬＡ の含有量が少ないサンプル（〔２〕、〔３〕、及び〔４〕）よりも高いことが観察された。紡糸された繊維に含まれるＰＬＬＡの量が３０重量％である３つのサ ンプル（〔３〕、〔４〕、及び〔５〕）を比較すると、ＳｉＶにＴＣＰを含有させたサンプルの方が、ＴＣＰを含有していないサンプルよりも結晶化度が高いことが観察された。 図１８は、サンプル〔２〕、〔３〕、及び〔４〕と同じ組成・方法で作製した別のサンプル〔２〕’〔３〕’〔４〕’についてＤＳＣ測定した結果を示す。図１７の結晶化度のデータとは実験測定誤差が認められる。サンプルの結晶化度のＤＳＣ測定値には、±５〜１０％の実験測定誤差があると見込まれることを考慮すると、サンプル〔２〕、〔３〕、〔４〕の結晶化度は約７５〜９８％、さらに正確には約８５〜９５％の範囲内であると考えられる。

[分子量の変化]
図１５の分子量測定で示す通り、ＳｉＶを３０重量％ＰＬＬＡ７０重量％含んだサンプル〔１〕では浸漬開始後１４日を経過しても、若干の減少傾向はあるものの大きな変化は認められなかった。これに対し、ＳｉＶ７０重量％／ＰＬＬＡ３０重量％含んだサンプル〔２〕、及びＳｉＶ３０重量％／ＴＣＰ４０重量％／ＰＬＬＡ３０重量％含んだサンプル〔３〕では浸漬開始後１日経過して分子量の大きな減少が認められた。ＳｉＶ１０重量％／ＴＣＰ６０重量％／ＰＬＬＡ３０重量％含んだサンプル〔４〕では、浸漬開始後１４日を経過して分子量の緩やかな減少傾向が認められた。

[乾燥重量の変化]
実験サンプル〔１〕〜〔４〕を水酸化ナトリウム溶液に浸漬後時間の経過による生分解性繊維の乾燥重量の変化（減少）を図１６に示す。サンプル〔１〕〜〔５〕の乾燥重量は浸漬開始後短期間（1日程度）で大きく減少し、その後は緩やかに減少していくことが観察された。

[見た目の変化]
サンプル〔１〕（３０ＳｉＶ-７０ＰＬＬＡ）を水酸化ナトリウム水溶液に、浸漬期間：0,1,3,7,14日の経過で外観の変化を観察した結果を図１４（１）に示す。浸漬開始後14日を経過しても綿の3次元骨格は大きく変わらずに維持されたままであった。
サンプル〔２〕（７０ＳｉＶ-３０ＰＬＬＡ）を水酸化ナトリウム水溶液に、浸漬期間：0,1,3,7,14日で経過を観察した結果を図１４（２）に示す。浸漬開始後３日を経過して綿の3次元骨格は失われ、14日経過した時点では短繊維としては残っているものの綿としては存在していなかった。
サンプル〔５〕（５０ＳｉＶ-５０ＰＬＬＡ）を水酸化ナトリウム水溶液に、浸漬期間：0,1,3,7,14日で経過を観察した結果を図１４（３）に示す。浸漬開始後14日を経過しても綿の3次元骨格は大きく変わらずに維持されたままであった。
サンプル〔３〕（３０ＳｉＶ-４０ＴＣＰ-３０ＰＬＬＡ）を水酸化ナトリウム水溶液に浸漬期間：0,1,3,7,14日で経過を観察した結果を図１４（４）に示す。浸漬開始後３日を経過して綿の3次元骨格は失われ、14日経過した時点では短繊維としては残っているも のの綿としては存在していなかった。
サンプル〔４〕（10ＳｉＶ-60TCP-30ＰＬＬＡ）を水酸化ナトリウム水溶液に浸漬期間：0,1,3,7,14日で経過を観察した結果を図１４（５）に示す。浸漬開始後１４日を経過して綿の3次元骨格は失われつつあるがかろうじて形状を維持しており、短繊維として は残っており、水酸化ナトリウム水溶液中に浮遊している。

見た目の変化の観察からは、ＰＬＬＡの含有量が大きいサンプル（サンプル〔１〕）は水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、14日経過しても大きな変化はなかった。逆にＰＬＬＡの含有量が少なくかつＳｉＶの含有量が大きいサンプル（サンプル〔２〕及び〔３〕）は水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、14日経過して大きな形状の変化が観察された。この結果は、水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、14日経過して起こる分子量の変化とほぼ一致する。

３．実験結果の分析、評価
１）ＳｉＶ３０重量％／ＰＬＬＡ７０重量％の組成のサンプル（サンプル〔１〕）は、見た目観察の結果、水酸化ナトリウム溶液中で分解しづらいことが観察された。この結果は、サンプル〔１〕は、ＰＬＬＡの分子量が高く（27万程度）、結晶化度が高い（図１７に示すＤＳＣ測定では21.8%）ことによると考えられる。
サンプル〔１〕にＴＣＰを４０重量％を混ぜた組成である３０ＳｉＶ／４０ＴＣＰ／３０ＰＬＬＡ（サンプル〔３〕）は、水酸化ナトリウム溶液に浸して１日で急激な分子量の減少が認められた。サンプル〔３〕は分子量２３万、結晶化度が低い（図１７に示すＤＳＣ測定では9.1%）。この違いの主な原因はサンプルの繊維に含まれるＰＬＬＡの含有量がサンプル〔１〕は７０重量％であるのに対し、サンプル〔３〕は３０重量％と少ないことが大きいと考えられる。
２）７０ＳｉＶ/３０ＰＬＬＡの組成のサンプル〔２〕は見た目観察の結果、水酸化ナトリウム溶液中で急速に分解されることが観察された。この結果は、サンプル〔２〕は、ＰＬＬＡの分子量が２０万程度と低く、結晶化度が低い（図１７に示すＤＳＣ測定では7.5%）ことによると考えられる。
サンプル〔２〕にＴＣＰを４０重量％混ぜた組成である３０ＰＬＬＡ/４０ＴＣＰ/３０ＳｉＶ（サンプル〔３〕）は、ＰＬＬＡの分子量は２３万程度で結晶化度は図１７に示すＤＳＣ測定では9.1%であった。ＳｉＶのシロキサンとＰＬＬＡのカルボキシル基との反応によるＰＬＬＡの分子配列秩序の乱れの発生が抑制された結果、結晶化度が上がって、分子量の減少及びそれに伴う綿材料の3次元骨格の崩壊の時期を遅らせたと考えられる。

＜動物実験＞
上記実施例で作成された綿状の骨欠損部充填材料のサンプルをγ線照射による滅菌処理を施した上で、ウサギの大腿骨（サンプル単独）、脊椎（サンプルに骨髄穿刺液を混合）、脊椎（サンプルに骨髄穿刺液と自家骨を混合）に埋植して、骨形成を評価した。

脊椎への埋植直後のＸ線視認性の評価は、単純Ｘ線画像の撮影により実施した。骨形成能の評価はＣＴ画像と染色切片により実施した。大腿骨の染色切片の作製方法は、骨孔に対してヨコ方向で作製し、脊椎の染色切片は矢状面で作製した。染色はヘマトキシリン・エオジンを実施した。

図１１に脊椎への埋植直後（Ａ）と、埋植後１２週経過後（Ｂ）の放射線学的データ、図１２に大腿骨への埋植後１２週経過後の組織学的データと組織形態計測学的データ、図１３に脊椎への埋植後１２週経過後の組織学的データ及び組織形態計測学的データをそれぞれ示す。

図１１のＣＴ画像から、試料１を脊椎に骨髄穿刺液を混合して埋植後１２週間を経過した後に埋植した部位に骨が形成されたことがわかる。

図１２の組織学的データ及び組織形態計測学的データから、試料１を大腿骨への埋植後１２週経過した後、実験のためにウサギの大腿骨に円状に形成した骨孔の２７．１％を占める部分に新生骨が形成されていることが確認できた。

図１３の組織学的データ及び組織形態計測学的データから、試料１を脊椎に骨髄穿刺液を混合して自家骨と共に埋植後１２週間を経過した後。埋植した部位の３９％の面積に新生骨が形成されたことが確認できた。

本発明の骨欠損部充填材料は、単独で使用する他、自家骨を綿材に包んだ状態で骨欠損部に充填するという方法で使用することが可能である。自家骨との親和性が高いため、欠損部に自家骨が充填されて、その状態で骨が形成されるのを助ける。図６は、自家骨を本発明の骨欠損部充填材料で包んで使用する状態を示す。ＳｉＶから溶出したケイ素が自家骨と欠損部の骨の骨芽細胞を刺激し、当該部位における骨形成が促進される。

本発明の骨欠損部充填材料のコンポジット繊維は、ＰＬＬＡマトリックス樹脂中において、ＴＣＰ粒子とＳｉＶ粒子とが共に互いに近接して保持された状態で体液と接触する。
この状態で、ＴＣＰの吸収置換による骨形成と微量のケイ素による骨芽細胞刺激による骨形成促進とが並行して有効に行われると考えられる。

本発明のポリＬ乳酸／リン酸カルシウム／ケイ素溶出型炭酸カルシウムコンポジットからなる生分解性繊維で形成された綿状骨欠損部充填材料は、人体の骨欠損部に充填されたときにＸ線によって充填位置を確認できる。

本出願の発明ではリン酸カルシウムとしてβ―ＴＣＰ等の生体吸収性のものを用いるが、生体吸収性ではないリン酸カルシウム（例：ハイドロキシアパタイト）もアミノ基のついたケイ酸部分を有しない点ではβ―ＴＣＰと同じである。そこで、β―ＴＣＰに変えてハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）を相当量加えてＳｉＶとＰＬＬＡとＨＡｐのコンポジットとしても、同様にアミド結合の発生による分子秩序の乱れに起因する非晶質相量の増加が抑制されて、それで得られたコンポジットの生体吸収性はＳｉＶとＰＬＬＡのコンポジットよりも遅らせることが可能である。従って、本件出願で述べたことはその限度でＨＡｐを用いたコンポジットについても基本的に適用可能であると考えられる。具体的には、本発明の骨欠損部充填材料と同様の構成を、β―ＴＣＰに代えてＨＡｐを用いて構成することが可能である。例えば、ＳｉＶ３０重量％／ＨＡｐ４０重量％／ＰＬＬＡ３０重量％の比率で構成することが可能である。

Claims (13)

1. エレクトロスピニングで製造された生分解性繊維を含む綿状の骨欠損部充填材料であって、
   前記生分解性繊維は、リン酸カルシウム粒子を４０〜６０重量％、ケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子を１０重量％以上、残部にポリＬ乳酸樹脂を３０重量％以上含んでおり、かつ前記ポリＬ乳酸樹脂の非晶質相量が７５〜９８％である、前記骨欠損部充填材料。
2. 前記ポリＬ乳酸樹脂の非晶質相量が８５％以上９５％以下である、請求項１に記載の骨欠損部充填材料。
3. 前記リン酸カルシウムはβ-ＴＣＰである、請求項１又は２に記載の骨欠損部充填材料。
4. 前記生分解性繊維は、ポリＬ乳酸溶液とケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子とリン酸カルシウム粒子の混合溶液をニーダーを用いて熱混錬して得たコンポジットを溶剤で溶解して製造した紡糸溶液を、エレクトロスピニングして製造されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料。
5. 前記ケイ素溶出型炭酸カルシウムはシロキサンを２〜４重量％含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料。
6. 前記ポリＬ乳酸樹脂の分子量が２０万〜２５万である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料。
7. 前記骨欠損部充填材料は、２５ｋＧｙ〜３５ｋＧｙのγ線照射による滅菌処理を施すことによってポリＬ乳酸の分子量が７万〜１２万に減少したものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料。
8. 前記生分解性繊維の外径は１０〜５０μｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料。
9. 前記ポリ乳酸樹脂中に前記リン酸カルシウム粒子とケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子がほぼ均一に分散されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料。
10. 溶融したポリＬ乳酸溶液中にリン酸カルシウム粒子とＳｉＶ粒子を３者の重量比率をリン酸カルシウム４０〜６０重量％、ケイ素溶出型炭酸カルシウム１０重量％以上、残部にポリＬ乳酸３０重量％以上の配合で投入して、その状態でニーダーを用いて混錬し、
    前記混錬した溶液をその後常温冷却して固化させてポリＬ乳酸の分子量が２０万〜２５万、非晶質相量が７５〜９８％であるコンポジットを作製し、
    前記コンポジットを溶剤で溶かして、紡糸溶液を作製し、
    前記紡糸溶液をエレクトロスピニング法を用いて紡糸して、生分解性繊維を製造し、
    前記生分解性繊維をエタノール溶液を満たしたコレクターに受けて堆積させることによって、綿状の骨欠損部充填材料を製造する工程を含む、
    前記骨欠損部充填材料の製造方法。
11. 前記ポリＬ乳酸樹脂の非晶質相量が８５％以上９５％以下である、請求項１に記載の骨欠損部充填材料の製造方法。
12. 前記リン酸カルシウムはβ-ＴＣＰである、請求項１又は２に記載の骨欠損部充填材料の製造方法。
13. 前記骨欠損部充填材料に、２５ｋＧｙ〜３５ｋＧｙのγ線照射による滅菌処理を施すことによってポリＬ乳酸の分子量を７万〜１２万に減少させる工程を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の骨欠損部充填材料の製造方法。