JP2016039813A - ヒトモノクローナル抗体およびそれを産生する方法 - Google Patents

ヒトモノクローナル抗体およびそれを産生する方法 Download PDF

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ナタリー サトコウスキ
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セミヨン ルビンチク
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Abstract

【課題】細菌およびウイルス抗原と共に腫瘍抗原および様々な自己抗原が含まれる広く多様な抗原に対するヒトモノクローナル抗体を産生する方法の提供。【解決手段】(a)ヒトB細胞集団をエプスタイン-バーウイルス（EBV）と共に遠心分離して、前記ヒトB細胞を感染させる工程であって、前記ヒトB細胞の集団の90〜99％がEBV感染によって不死化される工程、(b)前記ヒトB細胞を再懸濁する工程、及び(c)前記ヒトB細胞を培養して、不死化ヒトB細胞レパートリーを調製する方法。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全開示が参照により具体的に本明細書に組み入れられる、2007年8月3日
に提出された米国特許仮出願第60/953,739号の優先権を主張する。
発明の背景
本発明は、National Cancer Institute, National Institute of Healthから与えられ
た助成金番号5K01CA095443の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に
おいて一定の権利を有する。
I．発明の分野
本発明は一般的に、細胞生物学および免疫学の分野に関する。より詳しくは、本発明は
、ヒトモノクローナル抗体の産生に関する方法および組成物に関係する。
II．関連技術の説明
ワクチン接種に対する現在の代用法は、抗生物質、抗ウイルス剤、または病原体に結合
してこれを中和する血液由来のタンパク質である抗体の受動移入からなる治療である。抗
体源は、ヒトもしくはウマ血清などのポリクローナル供給源であってもよく、またはモノ
クローナル源（単細胞クローン）に由来してもよい。特異的抗原結合に関して制御および
選択することが技術的に可能であることから、モノクローナル抗体は、世界中の癌治療に
おいて劇的な治療利益を生じた。感染物質および毒素の処置においてもある程度の成功が
モノクローナル抗体に関して観察されているが、潜在的な治療物質および診断物質はほと
んど利用されていないままである。
ヒトの治療のためにモノクローナル抗体を開発する際に１つの特定の妨害となるのは、
一般的にマウス、ラット、およびウサギにおいて作製されるそのような抗体を「ヒト化」
する必要性である。ヒト化定常領域を有しないそのような抗体をヒト患者に投与すると、
ヒトは、「血清病」に罹りえて、これは文字通り、非ヒト抗体配列に対する抗体がレシピ
エントによって備えられることを意味している。研究用動物において産生されたヒト化モ
ノクローナル抗体は、この問題を回避することができるが、これは費用がかかりすぎ、抗
体のヒト化のための時間と費用は相当の量であり、ヒトにおける治療および診断のために
モノクローナル抗体を用いることを活用しようとする場合に妨害となる。
このように、本発明に従って、（a）IgM陽性ヒトB細胞の集団を得る段階；（b）該集団
を（i）ヒトB細胞を不死化するためにエプスタイン-バーウイルス（EBV）に、および（ii
）B細胞の分化を誘導するためにサイトカイン／増殖因子／シグナル伝達物質カクテルに
接触させて、それによってIgMからIgG免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチおよび
免疫グロブリンの分泌を引き起こす段階；ならびに（c）不死化、分化、免疫グロブリン
アイソタイプクラススイッチおよび分泌を支持する条件で細胞を培養する段階を含む、既
定の抗原に対して特異的な抗体を分泌する不死化ヒトB細胞を産生する方法が提供される
。方法はさらに、（d）予め決定された抗原に対する抗体を発現する不死化ヒトB細胞を選
択する段階を含んでもよい。選択する段階は、不死化B細胞培養培地上清について行われ
るイムノアッセイを含んでもよい。方法はさらに、段階（d）の不死化ヒトB細胞から重鎖
および／または軽鎖全体をコードする核酸を単離する段階を含んでもよく、またはさらに
段階（d）の不死化ヒトB細胞から重鎖および／または軽鎖抗原結合領域をコードする核酸
を単離する段階を含んでもよく、およびさらに重鎖および／または軽鎖のフレームワーク
領域をコードする核酸に該核酸をクローニングする段階を含んでもよい。段階（d）は、
凍結保存された不死化B細胞の融解後に行ってもよく、および／または該不死化B細胞から
の凍結保存された培養培地上清の融解後に起こってもよい。B細胞は、抗原で処理されて
いない細胞であってもよく、抗原で処理された細胞であってもよい。
既定の抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、毒素抗原、ウイルス
侵入に関する細胞受容体抗原、細菌侵入に関する細胞受容体、真菌侵入に関する細胞受容
体、寄生虫侵入を媒介する細胞受容体、毒素侵入を媒介する細胞受容体、腫瘍抗原、サイ
トカイン／ケモカイン／増殖因子抗原、炎症を媒介する分子上の抗原、疼痛を媒介する分
子上の抗原、組織損傷／障害を媒介する分子上の抗原、活性化分子／リガンド／受容体上
の抗原、共刺激分子／リガンド／受容体上の抗原、生得の免疫を媒介する分子上の抗原、
細胞接着分子上の抗原、細胞接着分子受容体上の抗原、疾患状態に関連する過剰発現され
た／不十分にグリコシル化された／酸化した／ミスフォールドした／変異した細胞タンパ
ク質（「改変された自己」抗原）上の抗原、細胞のアポトーシスを媒介する分子／リガン
ド／受容体上の抗原、または増殖阻害分子上の抗原を含んでもよい。
サイトカイン／シグナル伝達物質カクテルは、抗IgM F(ab')2またはB細胞受容体とクロ
スリンクするかもしくはB細胞受容体を活性化する他の物質、組換え型ヒトインターロイ
キン（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、インターフェロン-α（IFN）-
α、BAFF、および／もしくはB細胞分化を引き起こす他のサイトカイン、ならびに／また
は可溶性CD40L、ならびに／またはヒトB細胞に共刺激シグナルを供給する他の物質を含ん
でもよい。集団は、末梢血、扁桃、骨髄、脾臓、リンパ節、臍帯血、肝臓、アフェレーシ
ス技法、および／またはバフィーコートから得てもよい。
段階（b）における方法はさらに、EBV濃縮段階、感染の際の遠心段階、またはその双方
を含んでもよい。方法はさらに、段階（c）の後にヒトB細胞集団を凍結する段階を含んで
もよい。段階（b）（ii）は、段階（b）（ii）の後約0〜96時間で、または段階（b）（ii
）の後約16〜20時間で行ってもよい。該集団の約50％〜99％、または90％〜99％が、EBV
感染によって不死化されてもよい。段階（d）は、感染後1〜4週間で起こってもよく、ま
たは感染後2〜3週間で起こってもよい。
もう1つの態様において、炭疽菌毒素、エボラウイルス抗原、リシンA鎖、A鎖、ペスト
菌（Yersinia pestis）抗原、マールブルグウイルス抗原、MDRブドウ球菌（Staphylococc
us）抗原、コレラ毒素、ヘルペスBウイルス抗原、出血熱ウイルス抗原に免疫学的に結合
するIgGを発現する不死化ヒトB細胞が提供される。
他の態様は、出現しつつある感染疾患であるトリインフルエンザのH5血液凝集素に対し
て特異的な治療的ヒトモノクローナル抗体を提供する（SEQ ID NO:16および17）。いくつ
かの態様において、モノクローナル抗体は、癌血管新生分子である胎盤誘発増殖因子（PL
GF）、癌および自己免疫関連因子であるインターロイキン-6（IL6）、ならびに毒素であ
るブドウ球菌エンテロトキシンBおよびC2（それぞれ、SEBおよびSEC2）、およびリシンB
サブユニット（細胞結合ドメイン）に対して特異性を有する。
本明細書において記述されるいかなる方法または組成物も、本明細書において記述され
る他の任意の方法または組成物に対して実行されうると企図される。
特許請求の範囲および／または明細書における「含む」という用語に関連して用いる場
合の「１つの（a）」または「1つの（an）」という言葉の使用は、「1つ」を意味しても
よいが、同様に「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは1つより多く」
という意味とも一貫する。「約」は、記載の値から5〜10％変化した量が含まれると定義
される。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面に関連して考慮すると
、よりよく認識および理解されるであろう。しかし、以下の説明は、本発明およびその多
数の特異的詳細を示しているが、例として与えられ、制限ではないと理解されるべきであ
る。多くの置換、改変、付加、および／または再配列を行ってもよく、それらも本発明の
範囲に含まれ、その趣旨に含まれ、および本発明には、そのような置換、改変、付加、お
よび／または再配列の全てが含まれる。
以下の図面は、本明細書の一部を形成して、本発明の一定の局面をさらに証明するため
に含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と共にこれ
らの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解される可能性がある。
図1A〜B：EBV感染効率に及ぼすTLRリガンドおよびウイルス保存液濃度の効果。初代培養扁桃B細胞（106個/ml/ウェルを24ウェルプレートに播種して、表記のように様々なTLRリガンドを付加して、いくつかの異なる調製物からの濃縮または非濃縮B95-8ウイルス保存液1 mlを感染させた（実施例1を参照されたい）。4時間インキュベーション後、細胞を、5×104個/ウェルから開始して24個/ウェルで終わる2倍連続希釈を用いて96ウェルに分配した。感染後9日目に位相差顕微鏡によってLCLを視覚的に採点した。％不死化効率を実施例1において記述されるように計算した。平均値±SDを示す（n＝3）。図1A、TLRリガンドおよびウイルス調製の効果。図1B、ウイルス保存液濃度の効果。 図2A〜C：Q293A感染効率に及ぼすEBV濃度およびスピンフェクション（spinfection）の効果。Q293A細胞をトリプシン処理して、計数し、1×106個/1 ml/ウェルで6ウェルプレートに播種して、濃縮または非濃縮のEBfaV-GFP保存液1 mlを細胞に加えた。プレートを（図2A）非濃縮EBfaV-GFPと共に終夜インキュベートするか、（図2B）接種するために濃縮EBfaV-GFPと共に終夜インキュベートするか、または（図2C）スピンフェクションのために900 Gで1時間遠心した。EGFP蛍光を倒立顕微鏡によって感染後48時間で検出した。 図3A〜B：初代培養扁桃B細胞のEBfaV-GFPによる効率的な感染。B細胞（2×105個/0.1 ml/ウェル）を96ウェルプレートに播種して、10倍濃縮EBfaV-GFP 0.1 mlと共に混合して、900Gで1時間「スピンフェクト（spinfect）」または「スピノキュレート（spinoculate）」した。同等数の細胞に、陰性蛍光対照としてB95-8を感染させた。24時間後に、（図3A）蛍光顕微鏡による感染効率の視覚的評価として、または（図3B）感染のフローサイトメトリー分析のいずれかとして、感染を評価した。ゲートは、細胞の45％がバックグラウンドより上の蛍光を発することを示し、灰色のピークにおけるB95-8感染細胞に関する平均蛍光強度（MFI）は15.1であり、および緑色のピークにおけるEBfaV-GFP感染細胞に関する平均蛍光強度は61.9である。 異なるシグナル伝達物質によって1週間処置した3つの扁桃試料からのB細胞のIgGおよびIgM分泌プロフィール。個別の3つの試料からの扁桃B細胞を調製して、B95-8を接種して、24ウェルプレートに播種して、実施例1において記述されるように、表記のシグナル伝達物質およびサイトカインの組み合わせによって処置した。培養上清を感染後1週目に収集して、実施例1において記述されるように、IgGおよびIgMレベルに関してELISAによって分析した。試料および対照の平均値±SD（n＝4）を示す。 図5A〜B：異なるシグナル伝達物質の組み合わせによる処置後の代表的な試料の培養物における少なくとも8週間後のIgMおよびIgG発現プロフィール。3つの扁桃試料からのB細胞を単離して、B95-8 EBVを接種して、24ウェルプレートに播種して、実施例1において記述されるように、シグナル伝達物質の表記の組み合わせによって処置した。細胞を最初の3週間のあいだ1週間に1回処置して、培養上清を毎週収集した。感染後8週目または10週目に収集した培養上清を、実施例1において記述されるようにIgGおよびIgMレベルに関してELISAによって分析した。可溶性CD40L、またはIL-6および抗IgM(Fab')2と共に持続的に培養後にIgM（白い棒グラフ）からIgG（青色の棒グラフ）分泌にスイッチしたが、IL-4および抗IgM(Fab')2ではスイッチせず、またはサイトカインを加えない場合（培地）にスイッチしなかった2つの代表的な標本を（図5A）に示す。その時点で主にIgMが産生される1週間のみ培養したこれらの同じ標本に関するIgMおよびIgG分泌プロフィールを図4に示した。（図5B）は、BAFF、可溶性CD40Lおよび抗IgM(Fab')2と共に培養後、IgMからIgG分泌にスイッチした扁桃標本からの代表的な結果を描写する。この場合も、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチは、IL-4および抗IgM(Fab')2による処置後または培地のみによる処置後では起こらなかった。試料および対照の平均値±SD（n＝4）を示す。 図6A〜B：抗IgM(Fab')2およびIL4またはIL6と共に培養した不死化B細胞はインビトロで初期プラズマ様段階に分化した。表記のB細胞表面マーカーの発現（その役割を表5において要約する）を、高いIgMレベル（赤色）を分泌する抗IgM(Fab')2およびIL4、または高いIgGレベル（青色）を分泌する抗IgM(Fab')2およびIL6のいずれかと共に19週間培養した（図6A）初代培養扁桃B細胞（緑色）および（図6B）不死化B細胞に関して、フローサイトメトリー（実施例1を参照されたい）によって評価した。 H5 HA反応性抗体は、H5N1トリインフルエンザに一度も曝露されたことがない個体からのヒト血清中に存在する。Rituxanおよび精製ヒトIgGを5 mg/mlに希釈し、一方ヒト血清を完全なRPMI培地において1：1000に希釈した。試料または対照0.1 ml/ウェルを、組換え型H5 HAによって予めコーティングしたELISAプレートまたは非コーティング対照ウェルに1試料あたり3個ずつ加えた。方法において記述されるように（実施例1を参照されたい）、プレートを洗浄して、ブロックし、抗ヒトIgGによってプロービングした。H5 HAコーティングプレートを、結合緩衝液において2μg/mlに希釈した組換え型タンパク質0.1 ml/ウェルと共に終夜インキュベートすることによって調製した。バックグラウンドの非特異的結合の対照の助けとなるように、各試料を、結合緩衝液のみを加えた同数の対照の非コーティングウェルに加えた。H5 HAに対する特異的IgG結合を、対照の非コーティングウェルに対するバックグラウンド結合から得られた値を差し引くことによって計算した；試料および対照のOD405での吸光度の平均値±SDを示す（青色の棒グラフ）。 ボランティアV-5（PBMC A1）から得た不死化末梢血B細胞を刺激して、H5N1血液凝集素（H5 HA）に結合するIgGを産生させた。PBMC A1試料に由来するEBV不死化B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、IL-4、IL-6、およびBAFF（実施例1を参照されたい）による処置によって刺激してIgGを産生させて、96ウェルプレート3枚（104個/ウェル）において培養した。1週間後（青色の棒グラフ）および2週間後（赤色の棒グラフ）に、各プレートの全てのウェルからの培養上清を収集してプールし、次に、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関して試験した。試料および対照のOD405での吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。 PBMC A1試料から結合活性によって同定されたプレートの個々の列におけるH5 HA特異的IgG産生。反応性プレート1、2、および3のそれぞれの列における全てのウェルからの培養上清をプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関してアッセイした。試料および対照のOD405での吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。有意なH5 HA結合を有する列（プレート1の列E、プレート2の列C、D、およびE、プレート3の列D）をその後の分析のために選んだ。 PBMC A1試料から結合活性によって同定された列の隣接する対のウェルにおけるH5 HA特異的IgG産生。H5 HA反応性の列（図9において同定された）において隣接するウェルの対からの3週目の培養上清をプールして、実施例1において記述されるように、H5 HA結合に関してアッセイした。試料および対照のOD405での吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。プレート2の列Dにおけるウェル11および12を個々の分析のために選択した。 PBMC A1試料からのプレート2のウェルD11に局在するH5 HA特異的IgG産生。プレート2における個々のウェル、D11およびD12からの培養上清を、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関してアッセイした。試料および対照の吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。ヒト血清対照において見いだされたレベルと類似のレベルでのH5 HA反応性がウェルD11において観察された；このウェルからの細胞をサブクローニングのために選んだ。 PBMC A1試料からのプレート2のウェルD11において見いだされたH5 HA特異的B細胞のサブクローニング戦略。PBMC A1からのEBV-不死化B細胞を、IL-4、IL-6、BAFF、および抗ヒトIgM(Fab')2によって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート3枚において培養した（104個/ウェル）。H5 HA結合を実施例1において記述されるように決定した。各プレートにおける全てのウェルからの培養上清を収集して（150μl/ウェル）、50μl/ウェルをプールしてH5 HA結合に関してアッセイした。プレートは全て2週間後にH5 HA反応性IgGを含有して、これらのプレート上の個々の列からの培養上清を3週目にプールしてアッセイした。プレート1の列E、プレート2の列C、D、およびE、ならびにプレート3の列Dは、有意なH5 HA結合を有した。それぞれの反応性の列における二重に隣接するウェルからの培養上清を4週目にアッセイして、プレート1の列Eにおけるウェル5および6、ならびにプレート2の列Dにおけるウェル11および12がH5 HA結合を有するとして同定された。5週目に、プレート2における反応性のウェルD11を類似の様式で同定して、このウェルからの細胞を、細胞1、10、100、または1000個/ウェルを含有する96ウェルプレートにおける限界希釈分析によってサブクローニングした。その後毎週の間隔で、各プレートの全てのウェルからの培養上清をプールして、H5 HA結合に関してELISAによって試験した。H5 HAと反応性であるIgGを分泌する可能性があるクローン集団の同定を、8週目に細胞1個/ウェルを含有するプレートのウェルD11から単離した。単離戦略を概要する。 PBMC A2試料からのH5 HA特異的B細胞クローンを単離するためのサブクローニング戦略。PBMC A2からのEBV-不死化B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFF（実施例1を参照されたい）による処置によって刺激してIgGを産生させ、96ウェルプレート（104個/ウェル）6枚において培養した。H5 HA結合を実施例1において記述されるように決定した。各プレート上の全てのウェルからの培養上清を収集して（150μl/ウェル）、50μl/ウェルをプールしてH5 HA結合に関してアッセイした。プレート4、5および6はH5 HAに対して反応性であり、これらのプレート上の各列におけるウェルからの培養上清をプールしてアッセイした（2週目）。プレート4上の反応性の列DおよびG、プレート5上の列E、ならびにプレート6上の列Cからの二重に隣接するウェルの上清を収集して、H5 HA反応性に関して分析した（3週目）。プレート4上の反応性のウェルG8、プレート5上のE1、およびプレート6上のC3を、4週目に細胞1、10、100、または1000個/ウェルを含有する96ウェルプレートにおける限界希釈分析によってサブクローニングした。各プレート上の全てのウェルからの培養上清をプールして、H5 HA反応性に関してELISAによって試験して、8〜9週間後にプレート4およびプレート6からサブクローニングした細胞において可能性があるクローン集団を同定した。 PBMC B試料からの不死化B細胞に由来する培養上清におけるH5 HA特異的IgGの非存在。PBMC BからのEBV-不死化B細胞を、IL-4、IL-6、BAFF、および抗ヒトIgM(Fab')2によって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート（＜104個/ウェル）3枚において培養した。H5 HA結合を実施例1において記述されるように決定した。各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、50μl/ウェルをプールしてH5 HA結合に関してアッセイした。これを3週間連続して繰り返したが、H5 HA反応性が有意に検出されず、その時点でスクリーニングを中止した。 TNSL A試料からの不死化B細胞からの培養上清におけるH5 HA特異的IgG。TNSL AからのEBV-不死化B細胞を、IL-4、IL-6、BAFF、および抗ヒトIgM(Fab')2によって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート（2×105個/ウェル）10枚において培養した。H5 HA結合を実施例1において記述されるように決定した。各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、50μl/ウェルをプールしてH5 HA結合に関してアッセイした。1週目の分析は、反応性を示さなかったが、2週目ではプレート6および9において反応性が検出された。プレート6および9の個々の列における全てのウェルからの培養上清をプールして、実施例1において記述されたようにH5 HA結合に関してアッセイした。プレート9における列CおよびFは、反応性であった；しかし、3週間後に真菌の混入により試料が失われ、このためスクリーニングを中止した。 TNSL B試料からの不死化B細胞に由来する培養上清におけるH5 HA特異的IgGの非存在。TNSL BからのEBV-不死化B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート10枚において培養した（2×105個/ウェル）。H5 HA結合は、実施例1において記述されるように決定した。各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、50μl/ウェルをプールしてH5 HA結合に関してアッセイした。1週目の分析（4-11-07）は、プレート3において低レベルの反応性を示したが、このプレートにおける列Dからの培養上清は2週目で弱く反応性であった；しかし、3および4週目では、いずれのプレートにもH5 HA反応性を検出することができず、よってスクリーニングを中止した。。 TNSL C試料からの不死化B細胞に由来する培養上清におけるH5 HA特異的IgGの非存在。TNSL CからのEBV-不死化B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート10枚において培養した（＞2×105個/ウェル）。H5 HA結合は、実施例1において記述されるように決定した。各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、50μl/ウェルをプールしてH5 HA結合に関してアッセイした。1週目の分析は、プレート7、8、9、および10において非常に低レベルの反応性を示した；しかし、2および3週目では、いずれのプレートにもH5 HA反応性を検出することができず、よってスクリーニングを中止した。 TNSL D試料からの不死化扁桃B細胞は、培養1週間後にH5 HA反応性IgGを非常にわずかに産生したか、または全く産生しなかった。TNSL DからのEBV-不死化扁桃B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート10枚において1.5×105個/ウェルで培養した。1週間後、各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、各50μlをプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関して試験した。有意なH5 HA特異的結合はいずれのプレートにおいても検出されなかった。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL D試料からのプレート10の不死化扁桃B細胞は、培養2週間後にH5 HAに特異的に結合するIgGを産生した。TNSL D試料からのEBV-不死化扁桃B細胞を、96ウェルプレート10枚において1.5×105個/ウェルで培養した。2週間後に、各プレート上の全てのウェルからの培養上清150μlを収集して、50μlをプールして、実施例1において記述されるように、H5 HA結合に関して試験した。H5 HA特異的結合が、プレート1、8、9、および10において検出され、プレート10では最高の反応性であった。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL D試料からのプレート10の列Gにおける対の隣接するウェルからの培養上清において同定されたH5 HA特異的IgG産生。TNSL D試料からのEBV不死化B細胞からの培養上清（150μl/ウェル）を、培養3週間後の各ウェルから収集して、反応性のプレート1、8、9および10における対の隣接するウェルからの試料あたり50μlをプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関してアッセイした。列Gのウェル3および4（緑色）は、ヒト血清対照と類似の最高のH5 HA結合を有した。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL D試料からのプレート10のウェルG4におけるH5 HA反応性IgGの同定。プレート10、列G、ウェル3および4のTNSL D試料からのEBV不死化B細胞の培養上清（50μl/ウェル）を、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関して試験した。列G、ウェル4（緑色）は、最高のH5 HA結合を有し、このウェルからの細胞を持続的サブクローニングのために選択した。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL D試料からH5 HA特異的B細胞クローンを単離するためのサブクローニング戦略。TNSL D試料からのEBV-不死化扁桃B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート10枚において1.5×105個/ウェルで培養した。1週間後、各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、各50μlをプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関して試験した。1週間後、いずれのプレートもH5 HA反応性IgGを有しなかった。しかし、2週間後、プレート1、8、9、および10は反応性であり、プレート10は強い反応性を示した。プレート1、8および9における個々の列からの培養上清を3週目に分析して、プレート10の各列に関する隣接する対のウェルからの上清をプールして、同時にアッセイした。プレート10の列Gにおける対のウェル3および4は、H5 HA反応性IgGを産生し、産生はその後ウェルG4に限定され、これを細胞1、10、100、または1000個/ウェルを含有する96ウェルプレートにおける限界希釈分析によってサブクローニングした。H5 HA反応性IgGは、細胞100および1000個/ウェルを含有するプレートにおいて7および8週目に同定された。単細胞クローン集団の同定が現在進行中である。H5 HA反応性は、3週間後にプレート1、8、および9ではもはや同定することができず、その時点でスクリーニングを中止した。 TNSL E試料からの不死化扁桃B細胞は、培養1週間後にH5 HA反応性IgGを非常に弱く産生したか、または全く産生しなかった。TNSL E試料からのEBV-不死化扁桃B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート4枚において105個/ウェルで培養した。1週間後、各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、各50μlをプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関して試験した。陰性対照の精製ヒトIgGより上の有意なH5 HA特異的結合は、いずれのプレートにおいても検出されなかった。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 H5 HA反応性IgGは、TNSL E試料からのプレート1および3における個々の列からの培養上清において検出された。TNSL E試料からのEBV-不死化扁桃B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート4枚において105個/ウェルで培養した。2週間後、各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を収集して、プレート1および3における個々の列から各50μlをプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関して試験した；プレート2および4上の全てのウェルからの上清をプールして同時にアッセイした。プレート3の列Aならびにプレート1の列EおよびBは、H5 HA反応性IgGの有意なレベルを有し、さらなる分析に供した。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL E試料からのプレート3、5および6上のプールした隣接ウェルからの培養上清において同定されたH5 HA特異的IgG産生。プレート1の列BおよびE、ならびにプレート3の列Aにおける隣接ウェルの対からの3週目のTNSL-E培養上清をプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合活性に関してアッセイした。プレート1の列B、ウェル5および6；プレート1の列E、ウェル11および12、3および4；ならびにプレート3の列A、ウェル9および10は、H5 HA反応性IgG産生を示し、これらを個々の分析のために選択した。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL E試料からの反応性プレート上の個々のウェルからの培養上清におけるH5 HA反応性IgG産生の同定。プレート1のB5およびB6、E3およびE4、E11およびE12、ならびにプレート3のウェルA9およびA10の個々のウェルからの4週目の培養上清を、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関してアッセイした。強いH5 HA結合がプレート3のウェルA10から観察され、これをサブクローニングのために選択した。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 H5 HA特異的IgG産生は、TNSL E試料からの細胞1000個/ウェルを含有するプレートにおけるサブクローニング後2週間で培養上清において同定された。不死化B細胞を限界希釈分析によってサブクローニングした2週間後、プレートのそれぞれからの培養上清をプールして、実施例1において記述されるようにH5 HA結合に関してアッセイした。H5 HA結合は、細胞1000個/ウェルのプレートからの上清に限って観察された。さらなるサブクローニング分析が進行中である。試料および対照のOD405での吸光度レベルの平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL E試料からのH5 HA反応性B細胞を単離するためのサブクローニング戦略。TNSL E試料からのEBV-不死化扁桃B細胞を、抗ヒトIgM(Fab')2、CD40L、およびBAFFによって刺激してIgGを産生させて（実施例1を参照されたい）、96ウェルプレート4枚において105個/ウェルで培養した。1週間後、実施例1において記述されるように、各プレート上の全てのウェルからの培養上清（150μl/ウェル）を1週間後に収集して、各ウェルから50μlをプールして、実施例1において記述されるようにELISAによってアッセイしたが、対照より上の有意な結合は検出されなかった。2週間後、上清150μlを全てのウェルから収集して、プレート1および3の個々の列の各ウェルから、ならびにプレート2および4の全てのウェルから50μlをプールして、H5 HA結合に関して同時にアッセイした。プレート1の列BおよびE、ならびにプレート3の列Aは、2週間後に反応性であった。翌週に、反応性の列における対の隣接するウェルからの上清をプールして、H5 HA反応性に関して分析した。次に、プレート3の反応性のウェルA10からのB細胞を、細胞1、10、100、または1000個/ウェルを含有する96ウェルプレートにおける限界希釈分析によってサブクローニングした。1週間後に開始して、各ウェルからの培養上清を、これらのプレートから毎週収集してプールした；反応性は1000個/ウェルプレートにおいて認められ、H5 HA反応性IgG産生単細胞クローンの単離が現在進行中である。 TNSL EサブクローンからのプールされたウェルにおけるH5 HA反応性IgGの同定、しかし、TNSL-D、PBMC-A1およびA2サブクローンにおいては活性は存在しない。H5 HA反応性IgGは、プレート10のウェルG4におけるTNSL Dレパートリーにおいて、およびプレート3のウェルA10におけるTNSL Eレパートリーにおいて既に同定された（影をつけた挿入図）。これらのウェルの細胞を、細胞1000、100、10または1個/ウェルで96ウェルプレートにサブクローニングした。サブクローニングの3週間後、各プレートからの培養上清をプールして、実施例1において記述されるようにELISAによってH5 HA結合に関してアッセイした。PBMC-A1およびA2レパートリーから既に単離されたクローンからの培養上清を同時に試験した。対照は、既にH5 HA反応性であることが見いだされているボランティア（V5）からのヒト血清（1：1000倍希釈）、および非反応性の精製ヒトIgG（500 ng、Sigma）からなった。試料および対照の吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。 図30A〜C：TNSL EレパートリーからのH5 HA反応性クローンの単離。（図30A）TNSL-Eサブクローンを含有するプレート上の個々の列からのプールした培養上清（図29、細胞1000個/ウェル）を、実施例1において記述されるようにELISAによってH5 HA結合に関してアッセイした。強いH5 HA結合が列CおよびEにおいて観察された。（図30B）次に、列CおよびEにおける個々のウェルからの培養上清を、ELISAによってH5 HA結合に関してアッセイした。反応性のウェルC7およびE3における細胞を次に、限界希釈クローニングの追加の2回のラウンドによってサブクローニングした。（図30）得られたクローンC7F6およびE3A5からの培養上清をELISAによってH5 HA結合に関して試験した。全ての場合において、対照はボランディアV5からの反応性のヒト血清（1：1000倍希釈）および精製ヒトIgG（500 ng、Sigma）からなった。試料および対照の吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。 TNSL-EクローンE3A5およびC7F6は、H1またはH7 HAより高い親和性でH5 HAに結合するIgGを分泌するが、健康なボランティアからのヒト血清はより高い親和性でH1 HAに結合する。健康な成人ボランティア5人からの血清（1：1000倍希釈）、およびTNSL-EクローンE3A5およびC7F6からの培養上清を、実施例1において記述されるように、ELISAによってH1、H5、およびH7 HAに対するIgG結合に関してアッセイした。H1株は現在ほとんどのヒトインフルエンザウイルス感染症の原因であり、インフルエンザワクチンの標的であるが、H5およびH7はトリインフルエンザウイルス株である。試料および対照の吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。 図32A〜B：扁桃試料E単離体E3A5およびC7F6は、有意な量のIgGを分泌する。E3A5およびC7F6細胞をDPBSによって1回洗浄して、96ウェルプレートのウェルに培地0.2 ml中に表記の数で播種した。上清（0.1 ml）を72時間後に収集して、（A）実施例1において記述されるように、ヒトIgGおよびIgMレベルに関してアッセイした。いずれの単離体も、細胞数依存的パターンでIgGを分泌し、有意な量のIgMは産生されなかった。試料の吸光度の平均値±SD（n＝3）を示す。（B）表は、24時間のあいだに細胞1個によって分泌されるIgGのピコグラムとして計算された、それぞれの単離体に関するIgGの産生を示す。それぞれの値は12試料の平均値±SDを表す。 扁桃試料E単離体E3A5およびC7F6は、IgGIを分泌する。E3A5およびC7F6細胞をDPBSによって1回洗浄して、T25フラスコに106個/フラスコおよび培養培地10 mlで播種した。上清（5 ml）を96時間後に収集して、実施例1において記述されるように、ヒトIgG1、IgG2、およびIgG3に対するマウス由来モノクローナル抗体を用いて、ヒトIgGアイソタイプの有無に関してアッセイした。標準的なヤギ抗ヒトIgG-APを陽性対照として用いた。いずれの単離体もIgG1を分泌し、IgG2またはIgG3の検出可能な量は産生されなかった。試料の平均値±SD（n＝3）を示す。 図34A〜B：TE-3A10-E3A5および-C7F6クローンによって産生されたH5 HA反応性IgG1分子を含む軽鎖および重鎖可変領域の同定。軽鎖（X、ic）、および重鎖（VH）免疫グロブリン遺伝子を増幅するために用いられたフォワード（黒色）およびリバース（赤色）プライマーの配列を表（図34A）に記載する。可能性がある可変領域配列の最大数を増幅するようにプライマーを最適化した（Welschof et al, 1995, J. Innmunol. Methods, 179: 203-214から改作）。増幅産物のその後のクローニングおよびシークエンシングのために、XbaI（青色）の制限酵素切断部位配列をフォワードプライマーに加えて、SalI（赤色）をリバースプライマーに加えた（SEQ ID NO:1〜15）。（図34B）E3A5およびC7F6 H5 HA反応性クローンからのcDNAのPCR増幅を、それぞれのプライマー対を用いて行い、全てのPCR産物をシークエンシングした（別紙を参照されたい）。いずれのクローンもX1軽鎖変種を発現した；E3A5はVH3重鎖遺伝子を発現し、およびC7F6はVH1を発現し、2つのクローンが独自の起源を有して、共通の前駆体に由来しなかったことを示している（* シークエンシングによって確認された2 3-xbaおよび2 4a-xbaプライマーの21-xbaのあいだの3'プライマー相同性に起因する小さいほうのPCRバンド）。レーンM：マーカー＝Gibco-BRLからの1 kb Plusラダー；矢印は500 bpのバンドの位置を示す。 図35A〜E：H5 HA反応性クローンTE-3A10-E3A5および-C7F6の重鎖および軽鎖可変領域のDNAおよびアミノ酸配列。図34において記述されるPCR産物をシークエンシングして分析した。分析の結果を、E3A5およびC7F6の軽鎖（図35AおよびB）（SEQ ID NOS:16、17、18、19、20および21）、および重鎖（SEQ ID NOS:22、23、24、25、26、および27）に関してそれぞれ示す（図35CおよびD）。クローンのDNA配列を、最も近い相同性を有する生殖系列配列に対して整列させる。DNAコードのいかなる変化も以下に描写され、アミノ酸配列の変化を上に黄色で強調する。異なるセグメントおよび接合領域の配列を、以下のように色分けする：可変（V）セグメント、多様性（D）セグメント、接合（J）セグメント、Pヌクレオチド、Nヌクレオチド。双方のクローンの相補性決定領域の比較を（図35E）に示す。* C7F6重鎖のD-J領域における変化により、VBASE2ソフトウェアによるCDR3末端の位置の正確な予測は信頼不能となった（SEQ ID NO:28、29、30および31）。 （図３５Ａの説明を参照のこと） （図３５Ａの説明を参照のこと） （図３５Ａの説明を参照のこと） （図３５Ａの説明を参照のこと） PLGF結合：結合緩衝液の最適なELISA条件の決定。精製PLGFを、表記の結合緩衝液において4μg/mlにして、ELISAプレートに4℃で終夜結合させた。100 ng/ml PLGF mAb（マウスIgG1）100μlを各ウェルに加えて、RTで1時間インキュベートした。PLGFおよびPLGF mAb濃度は先の最適化実験において決定された。アイソタイプ対照：1000 ng/mlの精製マウスIgG；健康なボランディア（V-2）からの1：1000倍希釈したヒト血清；5000 ng/mlの精製ヒトIgG（Sigma）。アイソタイプ対照およびPLGF mAb結合をヤギ抗マウスIgG-APによって検出した；ヒト血清および精製ヒトIgG結合はヤギ抗ヒトIgG-APによって検出した（いずれも1：10,000倍に二次希釈）。中性ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（D-PBS）を選んだ。類似のアッセイをSEB、SEC2、リシンBサブユニット、およびIL6に関して開発した。 図37A〜C：扁桃XレパートリーにおけるSE Bre活性に関する迅速スクリーニング戦略。扁桃レパートリーTNSL-Xを表7において要約されるように不死化して、96ウェルプレート10枚において培養した。（図37A）2週間後、プレート10枚の全てにおける対応するウェル、たとえば全てのA1ウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてSEB結合に関して試験した。ウェルA8およびH3（強調）は、バックグラウンドより上に有意に増加して、ウェルA8およびH3がそれぞれ、プレート10枚の1つにおいて陽性であったことを示している。（図37B）同時に、それぞれのプレートにおける全てのウェルからの同じ培養上清のアリコートをプールして、ELISAによってSEB結合に関してアッセイしたところ、プレート4および8が反応性を有することが示された。それぞれのウェルに関するOD405の吸光度の値マイナスプレートの代表値を示す。（図37C）（図37A）におけるウェルA8およびH3の反応性を（図37B）におけるプレート4および8の反応性と組み合わせて、本発明者らは、プレート8のウェルA8およびプレート4のウェルH3（TX4A8およびTX8H3）が、その培養上清を試験することによってSEB反応性であることを確認した。対照は、1：5000倍希釈したマウス抗SEBモノクローナル抗体からなった（緑色の棒グラフ）。 図38A〜B：初代培養サブクローンプレートプールのレパートリーSEB反応性およびスクリーニングの確認。（図38A）扁桃レパートリーTR、TS、TV、およびTXを図2と同様にSEB反応性に関してスクリーニングした。確認された反応性を有するウェルを一次サブクローニングのために選んだ。（図38B）それぞれの一次サブクローンプレート上の全てのウェルをプールしてSEB反応性に関してスクリーニングした。TRおよびTSサブクローンは反応性を失ったが、それぞれのプレートにおけるTVおよびTXプールサブクローンでは、反応性が様々なレベルで検出された。 SEB反応性に関するTV-6F7一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを、一次サブクローニング後〜2週間でELISAによってスクリーニングした。TV-6F7-2H6、-3E2、および-3E4を、プレート各3枚、細胞50個/ウェルでの二次サブクローニングのために選んだ。 SEB反応性に関するTX-4H3一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを一次サブクローニング後〜2週間でELISAによってスクリーニングした。TX-4H3-1E7、3C6、および3D8を各プレート3枚で細胞50個/ウェルでの二次サブクローニングのために選んだ。 SEB反応性に関するTX-8A8一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを一次サブクローニング後〜2週間でELISAによってスクリーニングした。TX-8A8-1C6、3D7、および3F4を各プレート3枚で細胞50個/ウェルでの二次サブクローニングのために選んだ。 図42A〜B：レパートリーSEC2反応性の確認および一次サブクローンプレートプールのスクリーニング。（図42A）扁桃レパートリーTRおよびTSを、図2の戦略を用いてSEC2反応性に関してスクリーニングした。確認された反応性を有するウェル（TR-10A4、-10E12、TS-6C5）を一次サブクローニングのために選んだ。（図42B）それぞれの一次サブクローンプレートにおける全てのウェルをプールして、SEC2反応性に関してスクリーニングした。扁桃レパートリーTVも同様にスクリーニングしたところ、SEC2反応性を有するウェルTV-bB2が同定された。TRおよびTSサブクローンは、反応性を失った。ウェルTV-bB2をプレート3枚での一次サブクローニングのために選択した。 図43A〜B：SEC2反応性に関するTX-bB2一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを一次サブクローニング後〜2週間でELISAによってスクリーニングした。（図43A）各一次サブクローンプレートにおける全てのウェルをプールしてSEC2反応性に関してスクリーニングしたところ、プレート2において検出された。（図43B）TV-bB2-2E1および2F2を、各プレート2枚で細胞50個/ウェルでの二次サブクローニングのために選んだ。 図44A〜B：扁桃レパートリーTWのスクリーニングおよびPLGF反応性の確認。（図44A）プレート10枚の全てに関する対応するウェル、たとえば全てのA1ウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてPLGF結合に関して試験した。ウェルE 12（強調）は、バックグラウンドより有意に増加して、ウェルE12がプレート10枚の1つにおいて陽性であったことを示している。（図44B）TWレパートリープレート10枚のそれぞれにおけるE12ウェルからの培養上清をELISAによってPLGF反応性に関して個々にスクリーニングした。プレート1のウェルE12は、有意な反応性を有し、これをプレート5枚で細胞1000個/ウェルでのサブクローニングのために選択した。 図45A〜B：PLGF反応性に関するTW-1E12一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを一次サブクローニング後〜2週間でELISAによってスクリーニングした。（図45A）それぞれの一次サブクローンプレートにおける全てのウェルをプールして、SEC2反応性に関してスクリーニングしたところ、プレート2および5において反応性が検出された。（図45B）プレート2および5における個々のウェルをPLGF反応性に関してスクリーニングした。TW-2E3、2G9、5A10を、各プレート3枚で細胞50個/ウェルでの二次サブクローニングのために選んだ。 図46A〜C：扁桃レパートリーTZのスクリーニングおよびPLGF反応性の確認。（図46A）プレート10枚の全てにおける対応するウェル、たとえば全てのA1ウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてPLGF結合に関して試験した。ウェルB10、F9（強調）はバックグラウンドより上に有意に増加して、ウェルB10、F9が、プレート10枚の1つにおいて陽性であったことを示している。（図46B）TZレパートリープレート10枚のそれぞれに関して全てのウェルからのプールした上清をスクリーニングしたところ、プレート3および5がPLGF反応性を有することを示した。（図46C）ウェルB10およびF9の反応性をプレート3および5と組み合わせると、これは、TZ-3B10およびTZ-5F9が有意な反応性を有することを確認し、このように各プレート3枚で細胞1000個/ウェルでの一次サブクローニングのために選んだ。 図47A〜C：扁桃レパートリーTZのスクリーニングおよびリシンB反応性の確認。（図47A）プレート10枚の全てにおける6F10対応ウェル、たとえば全てのA1ウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてリシンB結合に関して試験した。ウェルB8、F10（強調）はバックグラウンドより上まで有意に増加して、ウェルB8、F10がプレート10枚の1つにおいて陽性であったことを示している。（図47B）TZレパートリープレート10枚のそれぞれにおける全てのウェルからのプールした上清をスクリーニングしたところ、プレート6および7がリシンB反応性を有することが示された。（図47C）ウェルB8およびF10の反応性をプレート6および7の反応性と組み合わせると、TZ-6F10およびTZ-7B8が有意な反応性を有することが確認され、このように各プレート5枚で細胞100個/ウェルでの一次サブクローニングのために選んだ。 リシンB反応性に関するTZ-7B8一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを一次サブクローニング後〜3週間でELISAによってスクリーニングした。TZ-7B8 1A12、1E3、2A1、2A3、4A1を二次スクリーニングのために選んだ。 リシンB反応性に関するTZ-6F10一次サブクローンプレートのスクリーニング。プレートを一次サブクローニング後〜3週間でELISAによってスクリーニングした。TZ-6F10 1C3、1D6、1F11、2F2、2G2、3E1、4H4、4G6、5D7を二次サブクローニングのために選んだ。 図50A〜C：扁桃NレパートリーにおけるH5 HA反応性に関する迅速なスクリーニング戦略。扁桃レパートリーN（TNSL-N）をエプスタイン-バーウイルスによって不死化して、組換え型ヒトBaff、可溶性CD40L、および抗ヒトIgM(Fab')2によって分化誘導して、表16において要約されるように96ウェルプレート10枚において培養した（2/5/08）。（図50A）3週間後、プレート10枚の全てにおける対応するウェル、たとえば全てのA1ウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてH5 HA結合に関して試験した。ウェルG7（強調）は、バックグラウンドより上に有意に増加して、ウェルG7がプレート10枚の1つにおいて陽性であったことを示している。（図50B）同時に、各プレートにおける全てのウェルからの同じ培養上清のアリコートをプールして3/3/08にELISAによってH5 HA結合に関してアッセイし、これはプレート6が反応性を有する（青色の棒グラフ）ことを示した。各ウェルのOD405吸光度の値マイナス無抗原バックグラウンドを示す。（図50C）（図50A）において示されるウェルG7の反応性を（図50B）において示されるプレート6の反応性と組み合わせて、3/4/08にELISAによって培養上清を試験することによって、プレート6のウェルG7（TN 6G7）が、H5 HA反応性であることが確認された（青色の棒グラフ）。対照は、H5 HA反応性クローンE3A5上清、H5 HA反応性ヒト血清（1：500倍希釈）、および非反応性ヒトIgG（1：300倍希釈；緑色の棒グラフ）からなった。 図51A〜C：H5 HA反応性に関するTN-6G7一次サブクローンのスクリーニングおよび二次サブクローニングのためのウェルの選択。（図51A）ウェルTN-6G7からの細胞を96ウェルプレート10枚にサブクローニングした（細胞500個/ウェル；一次サブクローニング）。2週間後、プレート10枚の全てにおける対応するウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてH5 HA結合に関して試験した。いくつかのウェルが反応性（淡黄色で強調）を示し、ウェルC8およびF8（強調して枠で囲む）は、バックグラウンドより上の有意な反応性を有し、ウェルC8およびF8がプレート10枚の少なくとも1つにおいて陽性であったことを示している。（図51B）同時に、これらの同じ培養上清のアリコートを各プレートの全てのウェルからプールして、3/19/08にELISAによってH5 HA結合に関してアッセイしたところ、プレート2、3、5、7および8（青色の棒グラフ）が反応性を有することが示された。各ウェルのOD405吸光度の値マイナスバックグラウンド（抗原を含有しないウェル）を示す。（図51C）（図51A）におけるウェルC8およびF8の反応性を、（図51B）におけるプレート2、3、5、7および8の反応性と組み合わせると、培養上清のELISA試験によってプレート7のウェルF8（TN-6G7-7F8）が最高のH5 HA反応性を有することが見いだされた（強調された青色の棒グラフ）；そのウェルからの細胞を二次サブクローニングのために選択した。対照は、H5 HA反応性クローンE3A5上清、H5 HA反応性ヒト血清（1：500倍希釈）、および非反応性ヒトIgG（1：300倍希釈；緑色の棒グラフ）からなった。 図52A〜B：H5 HA反応性に関するTN-6G7-7F8二次サブクローンのスクリーニングおよび三次サブクローニングのためのウェルの選択。（図52A）ウェルTN-6G7-7F8からの細胞を2枚の96ウェルプレート（細胞500個/ウェル；二次サブクローニング）にサブクローニングした。3週間後、双方のプレートにおける対応するウェルからの培養上清をプールして、1枚の96ウェルELISAプレートにおいてH5 HA結合に関して試験した。いくつかのウェルは反応性を示したが（黄色で強調）、ウェルG7は最高の反応性を示した。（図52B）最高の反応性を有するウェルは、（図52A）において陽性の結果を生じた個々のウェルから双方のプレートにおいて培養上清を試験することによって同定された。プレート2のウェルG7（TN-6G7-7F8-2G7）は、ELISA試験によって最高のH5 HA反応性を有した。対照は、H5 HA反応性クローンE3 A5上清、およびH5 HA反応性ヒト血清（1：500倍希釈；緑色の棒グラフ）からなった。 図53A〜B：クローンTN-6G7-7F8-2G7の初回特徴付け。（図53A）ウェルTN-6G7-7F8-2G7における細胞をプレート2枚（細胞50個/ウェル）にサブクローニングした；しかし、4週間後、双方のプレートに真菌が混入して、これらを廃棄した。この後、TN-6G7-7F8-2G7細胞の凍結したアリコートを融解して、短期間培養した後、96ウェルプレート2枚に平板培養した（細胞50個/ウェル、60ウェル/プレート、三次サブクローニング）。4週間後、双方のプレートからの培養上清を96ウェルELISAプレート2枚においてH5 HA結合に関して試験した。全てのウェルがH5 HA反応性を証明し、クローン性を示した。（図53B）TN-6G7-7F8-2G7上清におけるIgGをIgG1-4サブタイプに関して捕捉ELISAによって試験した。結果は、TN-6G7-7F8-2G7細胞がIgG1を分泌することを示した。精製ヒトIgG（2μg/ml、Sigma）を各IgGサブタイプの検出のための陽性対照として用いた。 図54A〜B：TN-6G7-7F8-2G7 H5 HA反応性IgG1分子を含む軽鎖および重鎖可変領域の同定。TN-6G7-7F8-2G7細胞を収集して、2.5×106個をH5 HA共役磁気ビーズ（H5 HA上のHIS-タグを通してビーズ上の抗HIS mAbに結合、THE（商標）MagBeads）と共にインキュベートした。磁気ビーズに結合した細胞をRNA抽出のために溶解した。軽鎖（λ、κ）および重鎖（VH）免疫グロブリン遺伝子を増幅するために用いられたフォワード（黒色）およびリバース（赤色）プライマーの配列を、表（図54A）において記載する（SEQ ID NO:1〜15）。可能性がある可変領域配列の最大数を増幅するようにプライマーを最適化した（Welschof et al, 1995, J. Immunol. Methods, 179: 203-214から改作）。増幅産物のその後のクローニングおよびシークエンシングのために、XbaIに関する制限酵素切断部位配列（青色）をフォワードプライマーに加えて、SalI（赤色）をリバースプライマーに加えた。（図54B）H5 HAに共役させた磁気ビーズから回収されたTN-6G7-7F8-2G7細胞27,000個から得たcDNAのPCR増幅（図53において記述される）は、TN-6G7-7F8-2G7細胞がλ1軽鎖およびVH3重鎖を発現することを示した。（* λ3-xbaおよびλ4a-xbaプライマーのλ1- xbaのあいだ3'プライマー相同性に起因する小さいほうのPCRバンド）。レーンM：マーカー＝Gibco-BRLからの1 kb Plusラダー；矢印は500 bpのバンドの位置を示す。 図55A〜C：H5 HA反応性クローンTN-6G7の重鎖および軽鎖可変領域のDNAおよびアミノ酸配列。図54において記述されたように得られたPCR産物をシークエンシングして、分析結果を軽鎖（図55A）（SEQ ID NO:32、33、34、および35）および重鎖（SEQ ID NO:36、37、および38）（図55B）に関して示す。クローンのDNA配列を、最も近い相同性を有する生殖系列配列に対して整列させた。アミノ酸の番号付けおよびCDRの配置は、Sequences of Proteins of Immunological Interestにおいて記述されるようにKabat et al（1991）に従って行った。DNAコードのいかなる変化も以下に描写され、アミノ酸配列の変化を上に黄色で強調する。異なるセグメントおよび接合領域の配列を以下のように色分けする：可変（V）セグメント、多様性（D）セグメント（緑色）、接合（J）セグメント（青色）、Pヌクレオチド（ピンク色）、Nヌクレオチド（赤色）。ドット3個（...）は、いくつかの生殖系列遺伝子において存在する配列（しかしTN-6G7-7F8-2G7では存在しない）に対応するDNAおよびアミノ酸配列におけるギャップを示す。Kabatの協定によるアミノ酸の整列を維持するためにギャップを挿入した。ダッシュ（−）は、TN-6G7配列と同一である生殖系列DNA配列を示す。（図55C）TN-6G7軽鎖および重鎖遺伝子の相補性決定領域を描写する。ドット1個（.）は、CDRアラインメント目的のために挿入されているギャップを示す（上記を参照されたい）。 （図５５Ａの説明を参照のこと） （図５５Ａの説明を参照のこと） E3A5ヒトmAbに関する解離定数（Kd）の決定。競合的ELISA法を用いて、Kdを計算した。第一に、移入実験を用いて、総抗体の10％未満がウェルをコーティングするリガンドに結合する条件を決定した。his-H5 HAの異なる濃度によって平衡にした一定の抗体濃度の滴定を用いて、E3A5に関するKdを計算した。υ、結合した抗体分画；[Ag]、遊離の抗原濃度。 図57A〜B：E3A5およびC7F6ヒトmAbの大規模産生のための組換え型発現ベクターの生成。（図57A）E3A5およびC7F6の双方の完全長の軽鎖および重鎖IgG1は、リーダーおよびC-末端配列に対するプライマーを用いてPCRによって生成されている。（図57B）NeoR選択マーカーと組み合わせたE3A5およびC7F6軽鎖、ならびにEGFP蛍光マーカーと組み合わせた重鎖を発現するレトロウイルスベクターの構築。 図58A〜B：リシンBサブクローニング細胞TZ-6F10-4H4およびTZ-7B8-2A3におけるELISA分析およびヒト免疫グロブリン（Ig）可変領域の同定。（図58A）TZ-6F10およびTZ-7B8サブクローンを、二次サブクローニングの2週間後に細胞25〜500個/ウェル（細胞数/ウェルをグラフの上部に記載する）でリシンBサブユニット結合に関してELISAによって試験した。TZ-6F10-4H4およびT7-7B8-2A3サブクローンはいずれも、細胞25または50個/ウェルから生じる有意な活性を有したことから、これらのサブクローンをIg遺伝子分析のために選んだ。（図58B）RT-PCRを、図34Aおよび54Aにおいて記載されるプライマー配列を用いて、同じPCR条件を用いてウェルTZ-6F10-4H4およびT7-7B8-2A3の細胞について行った。各ウェルは11/3および16配列、ならびにVH1およびVH3配列を含有した。増幅された配列を全てその後シークエンシングした。 図59A〜F：リシンB反応性サブクローニング細胞TZ-6F10-4H4およびTZ-7B8-2A3の重鎖および軽鎖可変領域のDNAおよびアミノ酸配列。方法において記述されるように、PCR産物をシークエンシングして分析した。分析結果を、軽鎖：TZ-6F10（図59A)（SEQ ID NOS:47、48、49、および50）、TZ-7F8（図59C、D）（SEQ ID NOS:55、56、57、58、59、60、61、および62）、ならびに重鎖TZ-6F10（図59B）（SEQ ID NOS:51、52、53、および54）、TZ-7B8（図59E)（SEQ ID NOS:63、64、65、および66）に関して示す。クローンのDNA配列を、最も近い相同性を有する生殖系列配列に対して整列させた。アミノ酸の番号付けおよびCDR配置は、Sequences of Proteins of Immunological Interestにおいて記述されるようにKabat et al（1991）に従って行った。DNAコードのいかなる変化も以下に描写され、アミノ酸配列の変化を上に黄色で強調する。異なるセグメントおよび接合領域の配列を以下のように色分けする：可変（V）セグメント、多様性（D）セグメント、接合（J）セグメント、Pヌクレオチド、Nヌクレオチド。ドット3個（...）は、いくつかの生殖系列遺伝子（しかし本発明者らの生殖系列遺伝子では存在しない）において存在する配列に対応するDNAおよびアミノ酸配列におけるギャップを示す。Kabatの協定によるアミノ酸の整列を維持するためにギャップを挿入した。ダッシュ（−）は、本発明者らの配列と同一である生殖系列DNA配列を示す。（図59F）（SEQ ID NO:67、68、69、70、および71）配列のそれぞれの相補性決定領域。ドット1個（.）は、CDRアラインメント目的のために挿入されているギャップを示す（上記を参照されたい）。 （図５９Ａの説明を参照のこと） （図５９Ａの説明を参照のこと） （図５９Ａの説明を参照のこと） （図５９Ａの説明を参照のこと） （図５９Ａの説明を参照のこと）
例示的な態様の説明
EP 0 218 158、EP 0 161 941、米国特許第5,024,946号、米国特許出願公開第2006/0252
124号、Traggia et al. (2004)およびLanzavecchia et al. (2006)が含まれる多様な先行
努力が、ヒトモノクローナル抗体の産生に向けられている。しかし、今日までのところ、
ヒト抗体選択に関して改善された方法がなおも必要である。
本発明は、ヒトモノクローナル抗体に関するこれまでの研究を制限する様々な問題に対
する解決策を提供する。特に、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを受けたこと
がない、すなわちなおもIgM+であるB細胞を標的とする段階、およびこれらの細胞を高い
効率のEBV形質転換プロトコールによって形質転換する段階によって、本発明者らはヒト
モノクローナル抗体を分泌するまれなB細胞を選択することが可能となった。加えて、EBV
不死化B細胞におけるIgMからIgGへの免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを効率
的に誘導するサイトカイン／増殖因子／シグナル伝達物質のカクテルを最適化した。
I．標的抗原
実質的にいかなる抗原も、本発明に従うB細胞を選択するために利用してもよい。これ
らには、毒素、細胞受容体（たとえば、ウイルス侵入のための、細菌侵入のための、真菌
侵入のための、寄生虫侵入のための、毒素侵入のための）、腫瘍抗原、サイトカイン／ケ
モカイン／増殖因子、サイトカイン／ケモカイン／増殖因子受容体、炎症メディエータ、
疼痛メディエータ、組織損傷／障害メディエータ、活性化分子／リガンド／受容体上の抗
原、共刺激分子／リガンド／受容体上の抗原、生得の免疫を媒介する分子、細胞接着分子
、細胞接着受容体、過剰発現された／不十分にグリコシル化された／酸化した／ミスフォ
ールドした／変異した細胞タンパク質（「改変された自己抗原」）、細胞アポトーシスを
媒介する分子／リガンド／受容体、または増殖阻害分子が含まれる。これらの一覧は網羅
的ではなく、例示のためにのみ提供される。
A．感染物質
多様な感染物質は、本発明の標的として作用しうる抗原を有する。たとえば、細菌、カ
ビおよび真菌、寄生虫、ならびにウイルスは全て、抗体の適した標的である抗原を提示す
る。

1．インフルエンザ
インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス、イサウイルス、およびトゴトウ
イルスを含むオルトミクソウイルス科のRNAウイルスである。インフルエンザウイルスに
は3つのタイプが存在する：インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、また
はインフルエンザウイルスC。インフルエンザAおよびCは多数の種に感染するが、インフ
ルエンザBはほとんど排他的にヒトに感染する。A型ウイルスは3つのインフルエンザタイ
プの中でも最もビルレントなヒト病原体であり、最も重度の疾患を引き起こす。インフル
エンザAウイルスは、これらのウイルスに対する抗体応答に基づいて異なる血清型に細分
類されうる。公知のヒト汎発流行死者の数によって順序がつけられた、ヒトにおいて確認
されている血清型は：
H1N1は「スペイン風邪」を引き起こした
H2N2は「アジア風邪」を引き起こした
H3N2は「香港風邪」を引き起こした
H5N1は2006〜7年インフルエンザシーズンに汎発流行の脅威である
H7N7は異常な人畜共通伝染能を有する
H1N2はヒトおよびブタにおける風土病である
H9N2、H7N2、H7N3、H10N7
インフルエンザBウイルスはほとんど排他的なヒト病原体であり、インフルエンザAほど
一般的ではない。インフルエンザBに対して感受性があることが知られている唯一の他の
動物は、アザラシである。このタイプのインフルエンザは、A型より2〜3倍低い割合で変
異して、その結果遺伝的多様性が低く、インフルエンザB血清型は1つのみである。この抗
原多様性の欠如の結果として、インフルエンザBに対するある程度の免疫は通常、幼少期
に獲得される。しかしながら、インフルエンザBは、永続的な免疫が可能ではない程度に
は変異する。その限定された宿主範囲（種間抗原シフトを阻害する）と共に、低減された
抗原性変化割合により、インフルエンザBの汎発流行が起こることはない。インフルエン
ザCウイルスは、ヒトおよびブタに感染して、重度の疾患および地域流行を引き起こしう
る。しかしインフルエンザCは他のタイプより一般的ではなく、通常小児において軽度の
疾患を引き起こすように思われる。毎年、三価のワクチンの成分として含められる実質的
に十分な病理学を有する3つの株は、インフルエンザA株H1N1およびH2N3、ならびにインフ
ルエンザBである。
以下は全てのインフルエンザウイルスに当てはまるが、他の株は、構造が非常に類似し
ている：インフルエンザAウイルス粒子またはビリオンは直径80〜120 nmであり、通常ほ
ぼ球形であるが、糸状型が起こりうる。ウイルスとしてはまれであるが、インフルエンザ
Aゲノムは核酸の1つの小片ではなく、そのかわりに、セグメント化されたネガティブセン
スRNAの小片を8個含有し（全体で13.5 kB）、タンパク質11個（HA、NA、NP、M1、M2、NS1
、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2）をコードする。これらのウイルスタンパク質の最もよく
特徴付けがなされているのは、血液凝集素およびノイラミニダーゼであり、これらはウイ
ルス粒子の外部に見いだされる2つの大きい糖タンパク質である。ノイラミニダーゼは、
成熟ウイルス粒子に結合する糖を切断することによって、感染細胞から子孫ウイルスの放
出に関与する酵素である。対照的に、血液凝集素は、標的細胞に対するウイルスの結合お
よびウイルスゲノムの標的細胞への侵入を媒介するレクチンである。血液凝集素（HAまた
はH）とノイラミニダーゼ（NAまたはN）タンパク質は、抗ウイルス薬の標的である。これ
らのタンパク質はまた、抗体によって認識される、すなわちそれらは抗原である。これら
のタンパク質に対する抗体の応答は、インフルエンザAウイルスの異なる血清型を分類す
るために用いられており、H5N1におけるHおよびNである。
インフルエンザウイルスは、典型的に哺乳動物の鼻、喉、および肺、ならびに鳥類の腸
管の上皮細胞表面のシアル酸糖に血液凝集素を通して結合する。細胞は、エンドサイトー
シスによってウイルスを取り込む。酸性のエンドソームにおいて、血液凝集素タンパク質
の一部がウイルスエンベロープを小胞膜に融合させて、ウイルスRNA（vRNA）分子、アク
セサリタンパク質、およびRNA依存的RNA転写酵素を細胞質に放出する。これらのタンパク
質およびvRNAは複合体を形成して、これが細胞核に輸送されて、そこでRNA依存的RNA転写
酵素が相補的なポジティブセンスvRNAの転写を開始する。vRNAは細胞質に輸送されて翻訳
されるか、または核内に留まる。新たに合成されたウイルスタンパク質は、細胞表面上の
ゴルジ体を通して分泌されるか、または核に戻るように輸送されてvRNAに結合して新しい
ウイルスゲノム粒子を形成する。他のウイルスタンパク質は、細胞mRNAを分解する段階、
放出されたヌクレオチドをvRNA合成のために用いる段階、および同様に宿主細胞mRNAの翻
訳を阻害する段階が含まれる、宿主細胞において多数の作用を有する。
将来のウイルスゲノム、RNA依存的RNA転写酵素、および他のウイルスタンパク質を形成
するネガティブセンスvRNAは、ビリオンへとアセンブルする。血液凝集素およびノイラミ
ニダーゼ分子はクラスタを形成して、細胞膜における隆起部分となる。vRNAおよびウイル
スコアタンパク質は、核を出てこの膜突出部に入る。成熟ウイルスは宿主リン脂質膜の球
体において細胞から出芽して、この膜外皮によって血液凝集素およびノイラミニダーゼを
獲得する。上記と同様に、ウイルスは血液凝集素を通して細胞に接着して、そのノイラミ
ニダーゼが宿主細胞からのシアル酸残基を切断すると、成熟ウイルスは離れる。新しいイ
ンフルエンザウイルスの放出後、宿主細胞は死滅する。
RNAプルーフリーディング酵素が存在しないために、RNA依存的RNA転写酵素は、インフ
ルエンザvRNAのおよそ全長であるほぼ10000ヌクレオチド 毎に1ヌクレオチド挿入の過ち
を起こす。よって、ほとんどあらゆる新たに作られたインフルエンザウイルスが変異体で
ある。ゲノムがvRNAの個別の8個のセグメントに分離することによって、1つより多いウイ
ルス株が1つの細胞に感染した場合にvRNAの混合または再集合が可能となる。得られたウ
イルス遺伝子学の急激な変化は抗原シフトを生じて、ウイルスは新しい宿主種に感染する
ことが可能となり、保護免疫を急速に克服する。これは疫学において考察されるように汎
発流行の出現において重要である。
i．ワクチン接種
インフルエンザに対する活性インフルエンザワクチンのワクチン接種は、小児および高
齢者などの高リスク群に強く推奨される。これらのワクチンは、いくつかの方策で産生さ
れうる；最も一般的な方法は、ニワトリの受精卵においてウイルスを成長させることであ
る。精製後、ウイルスを不活化して（たとえば、洗浄剤による処置によって）不活化ウイ
ルスワクチンを産生する。または、ウイルスを、ビルレンスを失うまで卵において生育さ
せることができ、弱毒化ウイルスを生ワクチンとして与えることができる。これらのイン
フルエンザワクチンの有効性は多様である。先に考察したように、ウイルスの高い変異率
により、特定のインフルエンザワクチンは通常、わずか数年の保護を付与するに過ぎない
。毎年、世界保健機構は、どのウイルス株が翌年に循環する可能性が最も高いかを予測し
て、製薬企業にこれらの株に対して最善の免疫を提供するワクチンを開発させている。ワ
クチンはまた、トリインフルエンザから家禽を保護するためにも開発されている。これら
のワクチンはまた、多数の株に対して有効となりえて、予防戦略の一部として用いられる
か、または大流行を撲滅するための試みにおいて選別と組み合わせられる。
ii．治療
2つのクラスの抗ウイルス剤はノイラミニダーゼ阻害剤とM2阻害剤（アダマンタン誘導
体）である。ノイラミニダーゼ阻害剤は現在、インフルエンザウイルス感染症にとって好
ましい。CDCは、2005〜06インフルエンザシーズンにおいてM2阻害剤を用いることを勧告
した。
オセルタミビル（商品名Tamiflu）およびザナミビル（商品名Relenza）などの抗ウイル
ス剤は、体内におけるウイルスの拡散を停止させるように設計されたノイラミニダーゼ阻
害剤である。これらの薬剤はインフルエンザAおよびBの双方に対してしばしば有効である
。コクラン共同計画は、これらの薬剤を精密に調べて、それらが症状および合併症を低減
させると結論した。ノイラミニダーゼ阻害剤に関しては耐性が今のところ問題とはなって
いない。耐性ウイルスは同定されているが、耐性ウイルスは完全にビルレントであり、伝
搬することができるアマンタジンの状況とは異なり、ノイラミニダーゼの場合は、そうい
った状況は起こっていない。異なるインフルエンザウイルス株は、これらの抗ウイルス剤
に対して異なる程度の耐性を有し、将来の汎発流行株がどの程度の耐性を有するかを予測
することは不可能である。
抗ウイルス剤アマンタジンおよびリマンタジンは、ウイルスのイオンチャンネルを遮断
して、ウイルスが細胞に感染することを防止するように設計される。これらの薬剤は、感
染の初期に投与された場合に特にインフルエンザAに対して有効であるが、インフルエン
ザBに対しては常に無効である。実際に、H3N2のアメリカ人単離体においてアマンタジン
およびリマンタジンに対して測定された耐性は、2005年に91％に増加した。モノクローナ
ル抗体は、ノイラミニダーゼ活性、M2、またはシアル酸に対する血液凝集素の結合を阻害
することができる。これは、本明細書において記述される技術の特色の1つである。
2．他のウイルス
インフルエンザのほかに、多様な他のウイルスを用いて抗体を生成してもよく、その後
抗体によって診断または処置してもよい。表1は、本発明と共に用いられる多様な他のウ
イルス標的を記載する：
(表1) ウイルス
アベルソンマウス白血病ウイルス（Abelson murine leukemia virus）、レトロウイルス
科（Retroviridae）
アデレードリバーウイルス（Adelaide River virus）、ラブドウイルス科（Rhabdovirida
e）
アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus）1、パルボウイルス科（Parvoviridae）
アデノ随伴ウイルス2、パルボウイルス科
アデノ随伴ウイルス3、パルボウイルス科
アデノ随伴ウイルス4、パルボウイルス科
アデノ随伴ウイルス5、パルボウイルス科
アフリカミドリザルサイトメガロウイルス（cytomegalovirus）、ヘルペスウイルス科（H
erpesviridae）
アフリカミドリザルHHV様ウイルス（HHV-like virus）、ヘルペスウイルス科
アフリカミドリザルポリオーマウイルス（polyomavirus）、パポーバウイルス科（Papova
viridae）
アフリカ馬疫ウイルス（African horse sickness viruses）1〜10、レトロウイルス科
アフリカ豚コレラウイルス（African swine fever virus）、アフリカ豚コレラ様ウイル
ス（African swine fever-like viruses）
アリューシャン病ウイルス（Aleutian disease virus）、パルボウイルス科
アリューシャンミンク病ウイルス（Aleutian mink disease virus）、パルボウイルス科
アメリカジリスヘルペスウイルス（herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ヒヒヘルペスウイルス、ヘルペスウイルス科
ヒヒポリオーマウイルス2、パポーバウイルス科
ウシアデノ随伴ウイルス（Bovine adeno-associated virus）、パルボウイルス科
ウシアデノウイルス（Bovine adenoviruses）1〜9、アデノウイルス科（Adenoviridae）
ウシアストロウイルス（Bovine astrovirus）1、アストロウイルス科（Astroviridae）
ウシアストロウイルス2、アストロウイルス科
ウシコロナウイルス（Bovine coronavirus）、コロナウイルス科（Coronaviridae）
ウシ下痢ウイルス（Bovine diarrhea virus）、フラビウイルス科（Flaviviridae）
ウシ脳炎ヘルペスウイルス（Bovine encephalitis herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ウシ腸内カリシウイルス（calicivirus）、カリシウイルス科（Caliciviridae）
ウシエンテロウイルス（Bovine enterovirus）1、ピコルナウイルス科（Picornaviridae
）
ウシエンテロウイルス2、ピコルナウイルス科
ウシ流行熱ウイルス（Bovine ephemeral fever virus）、ラブドウイルス科
ウシヘルペスウイルス1、ヘルペスウイルス科
ウシヘルペスウイルス2、ヘルペスウイルス科
ウシヘルペスウイルス4、ヘルペスウイルス科
ウシヘルペスウイルス5、ヘルペスウイルス科
ウシ免疫不全ウイルス（Bovine immunodeficiency virus）、レトロウイルス科
ウシ白血病ウイルス（Bovine leukemia virus）、レトロウイルス科
ウシ乳頭炎ウイルス（Bovine mamillitis virus）、ヘルペスウイルス科
ウシ乳頭腫ウイルス（Bovine papillomavirus）1、パポーバウイルス科
ウシ乳頭腫ウイルス2、パポーバウイルス科
ウシ乳頭腫ウイルス4、パポーバウイルス科
ウシ丘疹性口炎ウイルス（Bovine papular stomatitis virus）、ポックスウイルス科（P
oxviridae）
ウシパラインフルエンザウイルス（Bovine parainfluenza virus）3、パラミクソウイル
ス科（Paramyxoviridae）
ウシパルボウイルス（Bovine parvovirus）、パルボウイルス科
ウシポリオーマウイルス（Bovine polyomavirus）、パポーバウイルス科
ウシRSウイルス（Bovine respiratory syncytial virus）、パラミクソウイルス科
ウシライノウイルス（Bovine rhinovirus）1、ピコルナウイルス科
ウシライノウイルス2、ピコルナウイルス科
ウシライノウイルス3、ピコルナウイルス科
ウシシンシチウムウイルス（Bovine syncytial virus）、レトロウイルス科
カリフォルニア脳炎ウイルス（California encephalitis virus）、ブニヤウイルス科（B
unyaviridae）
カリフォルニアハーバー アザラシポックスウイルス（California harbor seal pox viru
s）、ポックスウイルス科
イヌアデノ随伴ウイルス（Canine adeno-associated virus）、パルボウイルス科
イヌアデノウイルス（Canine adenovirus）1、アデノウイルス科
イヌアデノウイルス2、アデノウイルス科
イヌカリシウイルス（Canine calicivirus）、カリシウイルス科
イヌコロナウイルス（Canine coronavirus）、コロナウイルス科
イヌジステンパーウイルス（Canine distemper virus）、パラミクソウイルス科
イヌヘルペスウイルス（Canine herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
イヌ微小ウイルス（Canine minute virus）、パルボウイルス科
イヌ口腔乳頭腫ウイルス（Canine oral papillomavirus）、パポーバウイルス科
イヌパルボウイルス（Canine parvovirus）、パルボウイルス科
ニワトリ貧血ウイルス（Chicken anemia virus）、サーコウイルス科（Circoviridae）
ニワトリパルボウイルス（Chicken parvovirus）、パルボウイルス科
チンパンジーヘルペスウイルス（Chimpanzee herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ワタオヘルペスウイルス（Cottontail herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ワタオウサギ乳頭腫ウイルス（Cottontail rabbit papillomavirus）、パポーバウイルス
科
牛痘ウイルス（Cow pox virus）、ポックスウイルス科
シカ繊維腫ウイルス（Deer fibroma virus）、パポーバウイルス科
シカパピローマウイルス（Deer papillomavirus）、パポーバウイルス科
ゾウロキソンドンタルヘルペスウイルス（Elephant loxondontal herpesvirus）、 ヘル
ペスウイルス科
ゾウパピローマウイルス（Elephant papillomavirus）、パポーバウイルス科
ゾウヘルペスウイルス（Elephantid herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
EBウイルス（Epstein-Barr virus）、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス（Equid herpesvirus）1、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス2、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス3、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス4、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス5、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス6、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス7、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス8、ヘルペスウイルス科
ウマ流産ヘルペスウイルス（Equine abortion herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ウマアデノ随伴ウイルス（Equine adeno-associated virus）、パルボウイルス科
ウマアデノウイルス（Equine adenovirus）1、アデノウイルス科
ウマ動脈炎ウイルス（Equine arteritis virus）、アルテリウイルス属（Arterivirus）
ウマサイトメガロウイルス（Equine cytomegalovirus）、ヘルペスウイルス科
ウマ脳症ウイルス（Equine encephalosis virus）1〜7、レオウイルス科（Reoviridae）
ウマヘルペスウイルス（Equine herpesvirus）1、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス3、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス4、ヘルペスウイルス科
ウマヘルペスウイルス5、ヘルペスウイルス科
ウマ伝染性貧血ウイルス（Equine infectious anemia virus）、レトロウイルス科
ウマ乳頭腫ウイルス（Equine papillomavirus）、パポーバウイルス科
ウマ鼻肺炎ウイルス（Equine rhinopneumonitis virus）、ヘルペスウイルス科
ウマライノウイルス（Equine rhinovirus）1、ピコルナウイルス科
ウマライノウイルス2、ピコルナウイルス科
ウマライノウイルス3、ピコルナウイルス科
ヨーロッパコウモリウイルス（European bat virus）1、ラブドウイルス科
ヨーロッパコウモリウイルス2、ラブドウイルス科
ヨーロッパ褐色野兎症候群ウイルス（European brown hare syndrome virus）、カリシウ
イルス科
ヨーロッパオオシカ乳頭腫ウイルス（European elk papillomavirus）、パポーバウイル
ス科
ヨーロッパジリスサイトメガロウイルス（European ground squirrel cytomegalovirus）
、ヘルペスウイルス科
ヨーロッパハリネズミヘルペスウイルス（European hedgehog herpesvirus）、ヘルペス
ウイルス科
ネコカリシウイルス（Feline calicivirus）、カリシウイルス科
ネコヘルペスウイルス（Feline herpesvirus）1、ヘルペスウイルス科
ネコ免疫不全ウイルス（Feline immunodeficiency virus）、レトロウイルス科
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（Feline infectious peritonitis virus）、コロナウイルス
科
ネコ白血病ウイルス（Feline leukemia virus）、レトロウイルス科
ネコ汎白血病ウイルス（Feline parlleukopenia virus）、パルボウイルス科
ネコパルボウイルス（Feline parvovirus）、パルボウイルス科
ネコシンシチウムウイルス（Feline syncytial virus）、レトロウイルス科
ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（Feline viral rhinotracheitis virus）、ヘルペスウ
イルス科
ノネズミヘルペスウイルス（Field mouse herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
口蹄疫ウイルス（Foot-and-mouth disease virus）A、ピコルナウイルス科
口蹄疫ウイルスASIA 1、ピコルナウイルス科
口蹄疫ウイルスC、ピコルナウイルス科
口蹄疫ウイルスO、ピコルナウイルス科
口蹄疫ウイルスSAT 1、ピコルナウイルス科
口蹄疫ウイルスSAT 2、ピコルナウイルス科
口蹄疫ウイルスSAT 3、ピコルナウイルス科
ヤギヘルペスウイルス（Goat herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ヤギ痘ウイルス（Goat pox virus）、ポックスウイルス科
ジリスＢ型肝炎ウイルス（Ground squirrel hepatitis B virus）、ヘパドナウイルス科
（Hepadnaviridae）
A群ロタウイルス（Group A rotaviruses）、レオウイルス科
B群ロタウイルス、レオウイルス科
C群ロタウイルス、レオウイルス科
D群ロタウイルス、レオウイルス科
E群ロタウイルス、レオウイルス科
F群ロタウイルス、レオウイルス科
モルモットサイトメガロウイルス（Guinea pig cytomegalovirus）、ヘルペスウイルス科
モルモットヘルペスウイルス（Guinea pig herpesvirus）1、ヘルペスウイルス科
モルモットヘルペスウイルス3、ヘルペスウイルス科
モルモットC型オンコウイルス（Guinea pig t, vpe C oncovirus）、レトロウイルス科
ハムスターヘルペスウイルス（Hamster herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ハムスターポリオーマウイルス（Hamster polyoma virus）、パポーバウイルス科
ハンタンウイルス（Hantaan virus）、ブニヤウイルス科
ゴマフアザラシヘルペスウイルス（Harbor seal herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
野ウサギ繊維腫ウイルス（Hare fibroma virus）、ポックスウイルス科
A型肝炎ウイルス（Hepatitis A virus）、ピコルナウイルス科
B型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス科
C型肝炎ウイルス、フラビウイルス科
ヘルペスウイルスM（Herpesvirus M）、ヘルペスウイルス科
ヒヒヘルペスウイルス（Herpesvirus papio）、ヘルペスウイルス科
オマキザルヘルペスウイルス型（Herpesvirus platyrrhinae type）、ヘルペスウイルス
科
ポトヘルペスウイルス（Herpesvirus pottos）、ヘルペスウイルス科
リスザルヘルペスウイルス2（Herpesvirus saimiri 2）、ヘルペスウイルス科
サケヘルペスウイルス（Herpesvirus salmonis）、ヘルペスウイルス科
タマリンヘルペスウイルス（Herpesvirus sanguinus）、ヘルペスウイルス科
ヒラメヘルペスウイルス（Herpesvirus scophthalmus）、ヘルペスウイルス科
ワタオウサギヘルペスウイルス（Herpesvirus sylvilagus）、ヘルペスウイルス科
ヘルペスウイルスT（Herpesvirus T）、ヘルペスウイルス科
タマリンヘルペスウイルス（Herpesvirus tarnarinus）、ヘルペスウイルス科
豚コレラウイルス（Hog cholera virus）、フラビウイルス科
サルヘルペスウイルス（Herpes simiae virus）、ヘルペスウイルス科
単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）1、ヘルペスウイルス科
単純ヘルペスウイルス2、ヘルペスウイルス科
ヘルペスウイルス（Herpes virus）B、ヘルペスウイルス科
ヨザルヘルペスウイルス（Herpesvirus aotus）1、ヘルペスウイルス科
ヨザルヘルペスウイルス3、ヘルペスウイルス科
クモザルヘルペスウイルス（Herpesvirus ateles）株73、ヘルペスウイルス科
ウサギヘルペスウイルス（Herpesvirus cuniculi）、ヘルペスウイルス科
シクロプシスヘルペスウイルス（Herpesvirus cyclopsis）、ヘルペスウイルス科
ヒトアデノウイルス（Human adenoviruses）1〜47、アデノウイルス科
ヒトアストロウルイルス（Human astrovirus）1、アストロウイルス科
ヒトアストロウルイルス2、アストロウイルス科
ヒトアストロウルイルス3、アストロウイルス科
ヒトアストロウルイルス4、アストロウイルス科
ヒトアストロウルイルス5、アストロウイルス科
ヒトカリシウイルス（Human calicivirus）、カリシウイルス科
ヒトカリシウイルス（Human caliciviruses）、カリシウイルス科
ヒトコロナウイルス（Human coronavirus）229E、コロナウイルス科
ヒトコロナウイルスOC43、コロナウイルス科
ヒトコクザッキーウイルス（Human coxsackievirus）A 1〜22、ピコルナウイルス科
ヒトコクザッキーウイルスA 24、ピコルナウイルス科
ヒトコクザッキーウイルスB 1〜6、ピコルナウイルス科
ヒトサイトメガロウイルス（Human cytomegalovirus）、ヘルペスウイルス科
ヒトエコーウイルス（Human echo virus）1〜7、ピコルナウイルス科
ヒトエコーウイルス11〜27、ピコルナウイルス科
ヒトエコーウイルス29〜33、ピコルナウイルス科
ヒトエコーウイルス9, ピコルナウイルス科
ヒトエンテロウイルス（Human enterovirus）68〜71、ピコルナウイルス科
ヒトフォーミーウイルス（Human foamy virus）、レトロウイルス科
ヒトヘルペスウイルス（Human herpesvirus）1、ヘルペスウイルス科
ヒトヘルペスウイルス2、ヘルペスウイルス科
ヒトヘルペスウイルス3、ヘルペスウイルス科
ヒトヘルペスウイルス4、ヘルペスウイルス科
ヒトヘルペスウイルス5、ヘルペスウイルス科
ヒトヘルペスウイルス6、ヘルペスウイルス科
ヒトヘルペスウイルス7、ヘルペスウイルス科
ヒト免疫不全ウイルス（Human immunodeficiency virus）1、レトロウイルス科
ヒト免疫不全ウイルス2、レトロウイルス科
ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus）11、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス16、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス18、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス31、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス33、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス5、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス6b、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス8、パポーバウイルス科
ヒトパピローマウイルス1a、パポーバウイルス科
ヒトパラインフルエンザウイルス（Human parainfluenza virus）1、パラミクソウイルス
科
ヒトパラインフルエンザウイルス2、パラミクソウイルス科
ヒトパラインフルエンザウイルス3、パラミクソウイルス科
ヒトパラインフルエンザウイルス4a、パラミクソウイルス科
ヒトパラインフルエンザウイルス4b、パラミクソウイルス科
ヒトポリオウイルス（Human poliovirus）1、ピコルナウイルス科
ヒトポリオウイルス2、ピコルナウイルス科
ヒトポリオウイルス3、ピコルナウイルス科
ヒトRSウイルス（Human respiratory syncytial virus）、パラミクソウイルス科
ヒトライノウイルス（Human rhinovirus）1〜100、ピコルナウイルス科
ヒトライノウイルス1A、ピコルナウイルス科
ヒトスプマウイルス（Human spumavirus）、レトロウイルス科
ヒトTリンパ球向性ウイルス（Human T-lymphotropic virus）1、レトロウイルス科
ヒトリンパ球向性ウイルス2、レトロウイルス科
ジャーグジークテウイルス（Jaagsiekte virus）、レトロウイルス科
日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、フラビウイルス科
JCウイルス（JC virus）、パポーバウイルス科
キルステンネズミ肉腫ウイルス（Kirsten murine sarcoma virus）、レトロウイルス科
ラゴスコウモリウイルス（Lagos bat virus）、ラブドウイルス科
リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（Lymphocytic choriomeningitis virus）、アレナウイルス
科（Arenaviridae）
マウス微小ウイルス（Mice minute virus）、パルボウイルス科
マウスニューモトロピックウイルス（Mice pneumotropic virus）、パポーバウイルス科
モロニーマウス肉腫ウイルス（Moloney murine sarcoma virus）、レトロウイルス科
モロニーウイルス（Moloney virus）、レトロウイルス科
サル痘ウイルス（Monkey pox virus）、ポックスウイルス科
マウスサイトメガロウイルス（Mouse cytomegalovirus）1、ヘルペスウイルス科
マウスエルバーフェルドウイルス（Mouse Elberfield virus）、ピコルナウイルス科
マウスヘルペスウイルス（Mouse herpesvirus）株68、ヘルペスウイルス科
マウス乳癌ウイルス（Mouse mammary tumor virus）、レトロウイルス科
マウス胸腺ヘルペスウイルス（Mouse thymic herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ミュールジカポックスウイルス（Mule deer pox virus）、ポックスウイルス科
ネズミアデノウイルス（Murine adenovirus）2、アデノウイルス科
Zネズミアデノウイルス（Z murine adenovirus）1、アデノウイルス科
マウス肝炎ウイルス（Murine hepatitis virus）、コロナウイルス科
マウスペルペスウイルス（Murine herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ネズミ白血病ウイルス（Murine leukemia virus）、レトロウイルス科
マウスパラインフルエンザウイルス（Murine parainfluenza virus）1、パラミクソウイ
ルス科
マウスポリオウイルス（Murine poliovirus）、ピコルナウイルス科
マウスポリオーマウイルス（Murine polyomavirus）パポーバウイルス科
マレーバレー脳炎ウイルス（Murray Valley encephalitis virus）、フラビウイルス科
ナイロビヒツジ病ウイルス（Nairobi sheep disease virus）、ブニヤウイルス科
ヒツジアデノ随伴ウイルス（Ovine adeno-associated virus）、パルボウイルス科
ヒツジアデノウイルス（Ovine adenoviruses）1〜6、アデノウイルス科
ヒツジアストロウイルス（Ovine astrovirus）1、アストロウイルス科
ヒツジヘルペスウイルス（Ovine herpesvirus）1、ヘルペスウイルス科
ヒツジヘルペスウイルス2、ヘルペスウイルス科
ヒツジ肺腺腫ウイルス（Ovine pulmonary adenocarcinoma virus）、レトロウイルス科
パタスモンキーヘルペスウイルスpHデルタ（Patas monkey herpesvirus pH delta）、ヘ
ルペスウイルス科
ペンギンポックスウイルス（Penguin pox virus）、ポックスウイルス科
マウス肺炎ウイルス（Pneumonia virus of mice）、パラミクソウイルス科
ブタアデノウイルス（Porcine adenoviruses）1〜6、アデノウイルス科
ブタアストロウイルス（Porcine astrovirus）1、アストロウイルス科
ブタサーコウイルス（Porcine circovirus）、サーコウイルス科
ブタ腸管カリシウイルス（Porcine enteric calicivirus）、カリシウイルス科
ブタエンテロウイルス（Porcine enterovirus）1〜11、ピコルナウイルス科
ブタ流行性下痢ウイルス（Porcine epidemic diarrhea virus）、コロナウイルス科
ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus
）、コロナウイルス科
ブタパルボウイルス（Porcine parvovirus）、パルボウイルス科
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（Porcine respiratory and reproductive syndrome）
、アルテリウイルス属
ブタルブラウイルス（Porcine rubulavirus）、パラミクソウイルス科
ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（Porcine transmissible gastroenteritis virus）、コロナ
ウイルス科
ブタC型オンコウイルス（Porcine type C oncovirus）、レトロウイルス科
イルカジステンバーウイルス（Porpoise distemper virus）、パラミクソウイルス科
霊長類カリシウイルス（Primate calicivirus）、カリシウイルス科
ウサギコロナウイルス（Rabbit coronavirus）、コロナウイルス科
ウサギ線維腫ウイルス（Rabbit fibroma virus）、ポックスウイルス科
ウサギ出血性疾患ウイルス（Rabbit hemorrhagic disease virus）、カリシウイルス科
ウサギ腎臓空胞化ウイルス（Rabbit kidney vacuolating virus）、パポーバウイルス科
イエウサギ口腔乳頭腫ウイルス（Rabbit oral papillomavirus）、パポーバウイルス科
ウサギ痘ウイルス（Rabbit pox virus）、ポックスウイルス科
狂犬病ウイルス（Rabies virus）、ラブドウイルス科
ラックーンパルボウイルス（Raccoon parvovirus）、パルボウイルス科
ラックーン痘ウイルス（Raccoon pox virus）、ポックスウイルス科
アカシカヘルペスウイルス（Red deer herpes virus）、ヘルペスウイルス科
アカカンガルーポックスウイルス（Red kangaroo virus）、ポックスウイルス科
トナカイヘルペスウイルス（Reindeer herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
トナカイ乳頭腫ウイルス（Reindeer papillomavirus）、パポーバウイルス科
レオウイルス（Reovirus）1、レオウイルス科
レオウイルス2、レオウイルス科
レオウイルス3、レオウイルス科
細網内皮症ウイルス（Reticuloendotheliosis virus）、レトロウイルス科
アカゲザルHHV-4様ウイルス（Rhesus HHV-4-like virus）、ヘルペスウイルス科
アカゲザル白血球随伴ウイルス1（Rhesus leukocyte associated herpesvirus strain 1
）、ヘルペスウイルス科
アカゲザルサイトメガロウイルス（Rhesus monkey cytomegalovirus）、ヘルペスウイル
ス科
アカゲザルパピローマウイルス（Rhesus monkey papillomavirus）、パポーバウイルス科
風疹ウイルス（Rubella virus）、トガウイルス科（Togaviridae）
アザラシポックスウイルス（Seal pox virus）、ポックスウイルス科
センダイウイルス（Sendai virus）、パラミクソウイルス科
羊型悪性カタル熱ウイルス（Sheep associated malignant catarrhal fever of）、ヘル
ペスウイルス科
ヒツジ乳頭腫ウイルス（Sheep papillomavirus）、パポーバウイルス科
ヒツジ肺腺腫に関連するヘルペスウイルス（Sheep pulmonary adenomatosis associated
herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ヒツジポックスウイルス（Sheep pox virus）、ポックスウイルス科
サルアデノウイルス（Simian adenoviruses）1〜27、アデノウイルス科
サルエージェントウイルス（Simian agent virus）12、パポーバウイルス科
サルエンテロウイルス（Simian enterovirus）1〜18、ピコルナウイルス科
サルフォーミーウイルス（Simian foamy virus）、レトロウイルス科
サル出血熱ウイルス（Simian hemorrhagic fever virus）、アルテリウイルス属
サルA型肝炎ウイルス（Simian hepatitis A virus）、ピコルナウイルス科
サル免疫不全ウイルス（Simian immunodeficiency virus）、レトロウイルス科
サルパラインフルエンザウイルス（Simian parainfluenza virus）10、パラミクソウイル
ス科
サルパラインフルエンザウイルス41、パラミクソウイルス科
サルパラインフルエンザウイルス5、パラミクソウイルス科
サルロタウイルス（Simian rotavirus）SA11、レオウイルス科
サル肉腫ウイルス（Simian sarcoma virus）、レトロウイルス科
サルTリンパ球向性ウイルス（Simian T-lymphotropic virus）、レトロウイルス科
サルD型ウイルス（Simian type D virus 1）、レトロウイルス科
サル水痘ヘルペスウイルス（Simian vancella herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
SV40(Simian virus 40)、パポーバウイルス科
シンドビスウイルス（Sindbis virus）、トガウイルス科
スカンクポックスウイルス（Skunk pox virus）、ポックスウイルス科
クモザルヘルペスウイルス（Spider monkey herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
リス線維腫ウイルス（Squirrel fibroma virus）、ポックスウイルス科
リスザルヘルペスウイルス（Squirrel monkey herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
リスザルレトロウイルス（Squirrel monkey retrovirus）、レトロウイルス科
ブタサイトメガロウイルス（Swine cytomegalovirus）、ヘルペスウイルス科
ブタ不妊および呼吸器症候群ウイルス（Swine infertility and respiratory syndrome v
irus）、アルテリウイルス属
豚痘ウイルス（Swine pox virus）、ポックスウイルス科
ツバイアデノウイルス（Tree shrew adenovirus）1、アデノウイルス科
ツバイヘルペスウイルス（Tree shrew herpesvirus）、ヘルペスウイルス科
ワクチニア亜種（Vaccinia subspecies）、ポックスウイルス科
ワクチニアウイルス（Vaccinia virus）、ポックスウイルス科
水痘ウイルス（Varicella-zoster virus）1、ヘルペスウイルス科
水疱性口炎ウイルス、アラゴアス（Vesicular stomatitis Alagoas virus）、ラブドウイ
ルス科
水疱性口炎ウイルス、インディアナ（Vesicular stomatitis Indiana virus）、ラブドウ
イルス科
水疱性口炎ウイルス、ニュージャージー（Vesicular stomatitis New Jersey virus）、
ラブドウイルス科
ウエストナイル熱ウイルス（West Nile virus）、フラビウイルス科
西部ウマ脳炎ウイルス（Western equine encephalitis virus）、トガウイルス科
ウッドチャックB型肝炎ウイルス（Woodchuck hepatitis B virus）、ヘパドナウイルス科
ウッドチャックヘルペスウイルスマーモット（Woodchuck herpesvirus marmota）1、ヘル
ペスウイルス科
ウーリーサル肉腫ウイルス（Woolly monkey sarcoma virus）、レトロウイルス科
ヤバサル腫瘍ウイルス（Yaba monkey tumor virus）、ポックスウイルス科
黄熱ウイルス（Yellow fever virus）、フラビウイルス科
3．他の感染性物質
ウイルスに加えて、本発明に従って他の感染性物質を標的としてもよい。それらは、表
2に説明される細菌、ならびに真菌および寄生虫を含む。
(表2) 細菌
バシラス菌種（Bacillus spp.）
バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）
気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）
パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）
百日咳菌（Bordetella pertussis）
百日咳菌
ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス（Branhamella (Moraxella) catarrhalis）
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ非産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ非産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ非産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ非産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ産生)
ブランハメラ（モラキセラ）・カタラリス (β-ラクタマーゼ産生)
カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
カンピロバクター・ジェジュニ
カンピロバクター・ピロリ（Campylobacter pylori）
カンピロバクター・ピロリ
コリネバクテリウム（Corynebacterium）JK
コリネバクテリウムJK
エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）
エンテロコッカス・フェカーリス
エンテロコッカス・フェカーリス
エンテロコッカス・フェカーリス）
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）
エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp.）
軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）
インフルエンザ菌
インフルエンザ菌(β-ラクタマーゼ非産生)
インフルエンザ菌(β-ラクタマーゼ非産生)
インフルエンザ菌(β-ラクタマーゼ産生)
インフルエンザ菌(β-ラクタマーゼ産生)
インフルエンザ菌(ペニシリン感受性)
インフルエンザ菌(ペニシリン耐性)
パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）
レジオネラ菌種（Legionella spp.）
レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）
レジオネラ・ニューモフィラ
レジオネラ・ニューモフィラ
リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
リステリア・モノサイトゲネス
リステリア・モノサイトゲネス
マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）
マイコプラズマ・ホミニス
マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）
マイコプラズマ・ニューモニエ
淋菌（Neisseria gonorrhoeae）
淋菌(β-ラクタマーゼ非産生)
淋菌(β-ラクタマーゼ非産生)
淋菌(β-ラクタマーゼ産生)
淋菌(β-ラクタマーゼ産生)
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）
ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
黄色ブドウ球菌
黄色ブドウ球菌(ペニシリン感受性)
黄色ブドウ球菌(ペニシリン感受性)
黄色ブドウ球菌(ペニシリン耐性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン感受性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン感受性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン感受性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン耐性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン耐性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン耐性)
黄色ブドウ球菌(メチシリン耐性)
スタフィロコッカス コアグラーゼ（Staphylococcus coaglase）f
スタフィロコッカス コアグラーゼf
スタフィロコッカス コアグラーゼf (β-ラクタマーゼ非産生)
スタフィロコッカス コアグラーゼf (β-ラクタマーゼ産生)
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）
スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）
シュードモナス・フルオレッセンス（Staphylococcus hominis）
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）
ストレプトコッカス・アガラクティエ
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）
肺炎連鎖球菌
肺炎連鎖球菌
肺炎連鎖球菌
肺炎連鎖球菌
肺炎連鎖球菌
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）
化膿性連鎖球菌
化膿性連鎖球菌
化膿性連鎖球菌
ストレプトコッカス菌種（Streptococcus spp.）
ストレプトコッカス菌種
ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）
ウレアプラズマ・ウレアリティカム
マイコプラズマ・ホミニス
マイコプラズマ・ニューモニエ
黄色ブドウ球菌
ウレアプラズマ・ウレアリティカム
B．他の抗原（非感染物質）
多様な他の抗原が本発明に従って用いることが企図される。たとえば、自己抗原は通常
、特異的自己免疫疾患に罹っている患者の免疫系によって認識される正常なタンパク質ま
たはタンパク質複合体（および時にDNAまたはRNA）である。これらの抗原は、通常の条件
では免疫系の標的であってはならないが、主に遺伝的および環境的要因により、そのよう
な抗原に対する正常な免疫寛容がこれらの患者では失われている。以下の自己抗原が本発
明の抗体の標的として企図される：アセチルコリン受容体、アデニンヌクレオチドトラン
スロケーター（ANT）、芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼ、アシアロ糖タンパク質受容
体、殺細菌／透過性増加タンパク質（Bpi）、カルシウム感知受容体、コレステロール側
鎖切断酵素（CYPllα）、IV型コラーゲンα3鎖、チトクロームP450 2D6（CYP2D6）、デス
ミン、デスモグレイン1、デスモグレイン3、f-アクチン、GMガングリオシド、グルタミン
酸デカルボキシラーゼ（GAD65）、グルタメート受容体（GLUR）、H/K ATPアーゼ、17-α-
ヒドロキシラーゼ（CYP17）、21-ヒドロキシラーゼ（CYP21）、IA-2（ICA512）、インス
リン、インスリン受容体、1型内因子、白血球機能関連抗原（LFA-1）、ミエリン関連糖タ
ンパク質（MAG）、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質
（MOG）、ミオシン、p-80-コイリン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体-E2（PDC-E2）
、ヨウ化ナトリウムシンポータ（NIS）、SOX-10、甲状腺および眼筋共有タンパク質、サ
イログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、甲状腺刺激ホルモン受容体、組織トランスグ
ルタミナーゼ、転写共活性化因子p75、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ
、チロシンヒドロキシラーゼ、ACTH、アミノアシル-tRNAヒスチジルシンテターゼ、アミ
ノアシル-tRNAシンテターゼ（いくつか）、カルジオリピン、炭酸脱水素酵素II、コラー
ゲン（多数の型）、セントロメア関連タンパク質、DNA依存的ヌクレオソーム刺激ATPアー
ゼ、フィブリラリン、フィブロネクチン、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、β2-糖タ
ンパク質I（β2-GPI）、ゴルジン（95、97、160、180）、熱ショックタンパク質、ヘミデ
スモソームタンパク質180、ヒストンH2A-H2B-DNA、IgE受容体、ケラチン、ミエロペルオ
キシダーゼ、プロテナーゼ3（PR3）、RNAポリメラーゼI〜III（RNP）、シグナル認識タン
パク質（SRP54）、トポイソメラーゼ-I（Scl-70）、チューブリン、ビメンチン、C1阻害
剤、C1q、第II因子、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、
第XII因子、トロンビン、vWF、60-kDa Roタンパク質、糖タンパク質IIb/IIIg、およびIg/
IX、酸化LDL、アンフィフィシン、サイクリンB1、DNAトポイソメラーゼII、デスモプラキ
ン、ゲフィリン、Huタンパク質、神経ニコチンアセチルコリン受容体、p53、p62（IGF-II
mRNA結合タンパク質）、リカバリン(recoverin)、Riタンパク質、βIVスペクトリン、シ
ナプトタグミン、電位ゲートカルシウムチャンネルおよびyoタンパク質。
用いることができるもう1つの抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、腫瘍細胞表面に
おいてMHC IまたはMHC II分子によって提示される抗原である。これらの抗原は時に、腫
瘍細胞のみによって提示され、正常細胞によって決して提示されえない。この場合、それ
らは腫瘍特異的抗原（TSA）と呼ばれ、典型的に腫瘍特異的変異に起因する。より一般的
であるのは腫瘍細胞と正常細胞によって提示される抗原であり、それらは腫瘍関連抗原（
TAA）と呼ばれる。これらの抗原を認識する細胞障害性Tリンパ球は、腫瘍細胞が増殖して
転移する前に腫瘍細胞を破壊することができる可能性がある。腫瘍抗原はまた、たとえば
変異した受容体の形で腫瘍の表面に存在しえて、この場合それらはB細胞によって認識さ
れるであろう。腫瘍抗原には、MAGE (1-10)およびBAGEタンパク質、MUC-1、CEA、17-1A、
TRP-2、M-尿中抗原、M-胎児抗原、UTAA、GM2ガングリオシド、GD2ガングリオシド、hTRT
、サイトケラチン19、SCCA-1および-2、Orf73、PSA、CA 19-9、CA 72-4、CA 195、CA 55.
1、NOVA2、CA 125、ART1、CASA、ならびにCO-029が含まれる。
もう1つの群の抗原標的は、ヒトおよび他の動物において見いだされるシグナル伝達タ
ンパク質を伴う。これらにはサイトカイン受容体および対応するサイトカイン、増殖因子
およびその対応する受容体、ならびにケモカインおよびその対応する受容体が含まれる。
インターフェロンα、β、およびγ、インターロイキン（IL-1α、-1β、-2、-3、-4、-5
、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-2
2、-23、LIF）、GM-CSF、G-CSF、TGF-α、IGF-I、IGF-II、TGF-β、BMP、VEGF、EPO、NGF
、BDNF、PDGF、ニューロトロフィン、TPO、GDF-8、GDF-9、bFGF、EGF、HGF、CCLl、CCL2
、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15
、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、C
CL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXC
L11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCLl、XCL2、CX3CL1、および
前述のリガンドのそれぞれの受容体が含まれる。
II．IgM+ B細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製
以下は、それによってヒトモノクローナル抗体を得ることができる一般的技法の説明で
ある。これらの技法は例示的であり、改変されてもよいが、それでも本発明の本質的な局
面を保持する。
A．IgM+ B細胞集団を得る
扁桃からB細胞を調製するために、扁桃組織を抗生物質と混合して、乱切りにしておよ
そ1 mm3の小片となるように細切した後、扁桃片を軽くすりつぶしてナイロンストレーナ
を通して濾す。次に懸濁液をFicollクッション上で遠心する。単核球を含有する境界層を
抽出して、DPBSによって洗浄して懸濁させる。抗体および磁気ビーズを用いる負の選択に
よってさらなる濃縮（＞95％）を得ることができる。
末梢血からB細胞を調製するために、静脈血を、凝固を防止するためにヘパリンナトリ
ウムを含有するシリンジから採取して、希釈してFicollクッション上で遠心して、収集し
、アリコートで保存する。単核球を含有する境界層を抽出して、DPBSにおいて洗浄および
懸濁させる。さらなる濃縮は先に述べたように達成することができる。
B．EBVの不死化
EBV上清による接種によって感染させるために、B細胞を細胞106〜107個/mlで完全RPMI
培地に懸濁させて、等量の濾過したEBV上清と共に混合した後、37℃および5％CO2で4時間
インキュベートした。感染細胞が細胞培養に関して望ましい濃度で懸濁されるように（一
般的に細胞105〜106個/ml）、完全RPMI培地を加えることによって培養体積を調節しても
よい。次に、細胞をマルチウェルプレートに分配して、37℃および5％CO2の組織培養イン
キュベーターに移す。
スピンフェクションの場合、B細胞を完全RPMI培地において106〜107個/mlで懸濁して、
10倍限外濾過濃縮EBVの等量と混合して、6ウェル組織培養プレートのウェルに入れた。プ
レートを900 gで室温で1時間遠心して、その際に感染細胞は完全RPMI培地に所望の濃度（
一般的に105〜106個/ml）で懸濁され、これをマルチウェルプレートに分配して、37℃お
よび5％CO2の組織培養インキュベータに移す。
任意で、B細胞を感染時または感染後にToll様受容体（TLR）に接触させてもよい。リガ
ンドを以下の最終濃度で加えてもよい：Pam3CSK4（0.5μg/ml）、ザイモサン（1μg/ml）
、ポリI:C（25μg/ml）、LPS（5μg/ml）、イミキノイド（1μg/ml）、およびCpG（1μg/
ml）。
感染性は感染経路に基づいて多様である。EBV上清の接種による扁桃B細胞の感染によっ
て、B細胞のおよそ1〜5％の不死化が起こる。TLRリガンドを加えると感染効率はおよそ倍
加する。濃縮ウイルスのスピンフェクションによる扁桃B細胞の感染は、24時間後の感染
効率を実質的に100％まで増加させる。
C．免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを誘導するための培養
B細胞分化および免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを誘導するために、サイ
トカインおよび他のシグナル伝達物質を、EBV感染B細胞に、感染直後、感染の16〜20時間
後、および／または毎週の間隔（2、3、4、または5回）で連続的に加える。物質は培地に
おいて希釈してもよく、以下の最終濃度で細胞に加えてもよい：組換え型ヒトインターロ
イキン（IL）IL-4、0.2 ng/ml；IL-5、0.2 ng/ml；IL-6、0.1 ng/ml；IL-9、0.2 ng/ml；
IL-10、0.24 ng/ml；IL-13、1 ng/ml；組換え型ヒトインターフェロン-α2a（IFN-α2a）
、2,000 IU/ml；組換え型ヒトBAFF、1 ng/ml；組換え型ヒト可溶性CD40L、5 ng/ml；ヤギ
抗ヒトIgM F(ab')2、1.4μg/ml（量は概算である）。特定の組み合わせは、IgM F(ab')2
、CD40L±BAFF；抗IgM F(ab')2およびBAFF；CD40L±BAFF；抗 IgM F(ab')2およびIL-6±I
L4；ならびに抗IgM F(ab')2およびIL-9±IL-13を含む。
免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチの開始は、サイトカイン／増殖因子／シグ
ナル伝達物質カクテルに曝露後約7〜約10日に始まり、プロセスはその後10日間続く。
D．不死化B細胞の選択
収集後、扁桃および血液B細胞培養物から1週間に1回培養上清を収集して、プールして
、ELISA、またはドットブロットもしくはフローサイトメトリーなどの他のスクリーニン
グフォーマットを用いて試験する。抗原をポリスチレン（たとえば、96ウェル）プレート
のウェルに層状にして、たとえば終夜結合させてもよい。次にプレートを洗浄してブロッ
クし、不死化B細胞培養上清試料または対照に1試料あたり3個ずつまたは他の複製実験で
接触させる。その後、プレートを十分に洗浄した後、たとえば比色定量基質／p-ニトロフ
ェノールリン酸二ナトリウム塩のAP変換によって結合IgGを検出するために、アルカリホ
スファターゼ（AP）共役ヤギ抗ヒトIgGまたは他の抗体を加える。
先の考察に基づいて、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチは、サイトカイン／
増殖因子／シグナル伝達物質カクテルに曝露後約7日目に始まる。それゆえ、約7〜21日、
約10〜21日、約7〜10日、もしくは約10〜14日、または7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19、20、もしくは21日に、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを
受け、したがって主にIgGを分泌するB細胞が選択されると考えられる。
III．ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のクローニングおよび発現
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖配列をクローニングおよび発現するために様々な方
法を使用してもよい。参照により本明細書に組み入れられるWeltschof et al. (1995)は
、本発明者らが用いた方法を詳細に記述している。可変領域または可変＋定常領域をクロ
ーニングしてもよい。
Takekoshi et al (2001)によって記述された技術などの他の技術も同様に有用である。
その参照において、全細胞RNAを、市販のキット（RNeasyミニキット、Qiagen）を用いて
沈降した細胞から単離した。ランダム9量体、ヌクレオチドおよび逆転写酵素（Takara, R
NA-PCRキット、Ohtsu）を用いて、cDNAを合成して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によっ
て、ヒト免疫グロブリン（Ig）に対して特異的な重鎖および軽鎖プライマーによって増幅
した。「タッチダウン」PCRプロトコールを利用し、すなわち95℃で1分間の変性、1分間
のアニーリング、および72℃で2分間の伸長の各3サイクルを全11サイクル用いた。アニー
ル温度は65〜55℃まで1℃きざみで多様であった。タッチダウンサイクルの後にアニール
温度55℃で25サイクルを行った。得られたPCR産物をアガロースにおいてゲル精製して、Q
iaquickスピンカラム（Qiagen）を用いて抽出した。軽鎖および重鎖Fc遺伝子を、発現ベ
クターpFab1-His2ベクターのNheI/AscIおよびSfiI/NotI部位にクローニングした。軽鎖（
κおよびλ）およびFc重鎖遺伝子（γおよびμ）とライゲーションしたpFab1-His2ベクタ
ーを、コンピテント大腸菌（E. coli）JM109細胞（Toyobo、Osaka）に導入した。形質転
換後、大腸菌細胞を、Luria-Bertani（LB）／アンピシリン（50μg/ml）プレートにおい
て平板培養した。単離された細菌コロニーを、アンピシリン（50μg/ml）およびMgCl2（1
.5 mM）を有するSuper Broth（SB）2 mlと共に30℃でインキュベートした。イソプロピル
-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いてFabタンパク質の産生を誘導した。細菌
培養物からの細胞を沈降させて、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete, Boehringer M
annheim）と共にB-PER（Pierce）0.3 mlに懸濁させて、室温で5分間振とうさせた。細胞
溶解物を15,000 gで10分間遠心して、Fab抗体部分を含有する得られた上清を収集した。
前述は純粋に例示的であり、他の方法を使用してもよい。
IV．抗体産生
クローニングした後、ヒト軽鎖および重鎖の核酸を適当な発現ベクターに挿入して、抗
体の産生を支持する宿主細胞（たとえば、抗体産生細胞）に移入する。産生のために企図
される特定の細胞株は293細胞、CHO細胞、COS細胞、または様々な型の骨髄腫細胞、IgGを
欠損する細胞である。これらの細胞は、2つの基本的な方策においてヒトMAb産生のために
活用されてもよい。第一に、骨髄腫または不死化細胞を、当初の融合のための体細胞およ
び骨髄腫細胞を提供するために用いられたタイプの組織適合性の動物（たとえば、同系マ
ウス）に注入する（しばしば腹腔内に）、または非適合性の細胞を注入するために免疫欠
損動物に注入することができる。任意で、動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチ
ルペンタデカン）などの油によって注射前にプライミングする。注入された動物は、トラ
ンスフェクトされた骨髄腫によって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍
を発症する。血清または腹水などの動物の体液を採取してヒトMAbを高濃度で提供するこ
とができる。第二に、個々の細胞株をインビトロで培養することができ、この場合ヒトMA
bは培養培地に自然に分泌され、そこから抗体を高濃度で容易に得ることができる。
いずれかの手段によって産生されたヒトMAbを、望ましければ濾過、遠心、およびHPLC
またはアフィニティクロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いてさら
に精製してもよい。本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインなど
の酵素による消化が含まれる方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィ
ド結合の切断によって産生されたモノクローナル抗体から得ることができる。
V．診断
本発明はインビボ診断技法においてヒトモノクローナル抗体を用いることを企図する。
たとえば、癌は起源がヒトである場合に全身投与することができる抗体を用いて都合よく
検出される。「検出可能な標識」は、結合した抗体の検出を容認する化合物および／また
は元素である。多くの適当なイメージング物質が、その抗体への付着法と共に当技術分野
において公知である（たとえば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる、
米国特許第5,021,236号、第4,938,948号および第4,472,509号を参照されたい）。用いら
れるイメージング部分は、常磁性イオン；放射活性同位元素；蛍光体；NMR検出可能な物
質；X線イメージングでありうる。
常時性イオンの場合、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバル
ト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテル
ビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプ
ロシウム（III）、ホルミウム（III）および／またはエルビウム（III）などの例として
のイオンが挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。X線イメージングなどの他の状況に
おいて有用なイオンには、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）および特にビスマス（
III）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
治療および／または診断応用のための放射性同位元素の場合、アスタチン211、14炭素
、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Eu、ガリウム67、3水素、ヨウ
素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム1
88、75セレン、35イオウ、テクネチウム99m、および／またはイットリウム90が挙げられ
る。一定の態様において用いるためには125Iがしばしば好ましく、テクネチウム99mおよ
び／またはインジウム111も同様にその低エネルギーおよびロングレンジでの検出に適し
ているためにしばしば好ましい。本発明の放射活性標識モノクローナル抗体は、当技術分
野において周知の方法に従って産生されてもよい。例として、モノクローナル抗体を、ヨ
ウ化ナトリウムおよび／またはカリウムとの接触によって、および過塩素酸ナトリウムな
どの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素的酸化剤によってヨウ素化す
ることができる。本発明に従うモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスによって、
たとえば過テクネチウム酸をスズ溶液によって還元することによって、還元したテクネチ
ウムをSephadexカラムにおいてキレート化して、このカラムに抗体を適用することによっ
て、テクネチウム99mによって標識されてもよい。または、たとえば過テクネチウム酸、S
NCl2などの還元剤、フタル酸ナトリウム-カリウム溶液などの緩衝液、および抗体をイン
キュベートすることによって、直接標識技術を用いてもよい。しばしば、金属イオンとし
て存在する放射性同位元素を抗体に結合させるために用いられる中間官能基は、ジエチレ
ントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
共役体として用いることが企図される蛍光標識には、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BO
DIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カ
スケードブルー、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、オ
レゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー
、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ROX、TAMRA、TET、テ
トラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが含まれる。
本発明において企図されるもう1つのタイプの抗体共役体は、主にインビトロで用いる
ことが意図される共役体であり、この場合抗体は二次結合リガンドにおよび／または色素
形成基質に接触すると着色産物を生成する酵素（酵素タグ）に連結される。適した酵素の
例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ、
またはグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよび
／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は、当
業者に周知であり、たとえば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米
国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号
；第4,275,149号；および第4,366,241号において記述される。
抗体をその共役部分に付着または共役させるために、いくつかの方法が当技術分野にお
いて公知である。いくつかの付着法は、たとえば抗体に付着したジエチレントリアミン五
酢酸無水物（DTPA）；エチレンジアミン四酢酸；N-クロロ-p-トルエンスルホンアミド；
および／またはテトラクロロ-3α-6α-ジフェニルグリクリル-3などの有機キレート物質
を使用して金属キレート錯体を用いることを伴う（そのそれぞれが参照により本明細書に
組み入れられる米国特許第4,472,509号および第4,938,948号）。モノクローナル抗体はま
た、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング物質の存在下で酵素と反
応させてもよい。フルオレセインマーカーとの共役体は、これらのカップリング物質の存
在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許第4,938,948
号において、乳腺腫瘍のイメージングはモノクローナル抗体を用いて達成され、検出可能
なイメージング部分を、メチル-p-ヒドロキシベンズイミデートまたはN-スクシニミジル-
3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオネートなどのリンカーを用いて抗体に結合させる。
分子を抗体に部位特異的に付着させるなおもう1つの公知の方法は、ハプテンに基づく
アフィニティ標識との抗体の反応を含む。本質的に、ハプテンに基づくアフィニティ標識
は、抗原結合部位でアミノ酸と反応して、それによってこの部位を破壊して、特異的抗原
反応を遮断する。しかし、これは、それによって抗体共役体による抗原結合が失われるこ
とから有利ではない可能性がある。
アジド基を含有する分子も同様に、低い強度の紫外線によって生成される反応性のニト
レン中間体を通してタンパク質に対する共有結合を形成するために用いてもよい（Potter
& Haley, 1983）。特に、プリンヌクレオチドの2-および8-アジド類似体は、粗細胞抽出
物においてヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして用
いられている（Owens & Haley, 1987；Atherton et al, 1985）。2-および8-アジドヌク
レオチドはまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマップするためにも用い
られており（Khatoon et al., 1989；King et al., 1989；およびDholakia et al, 1989
）、抗体結合物質として用いられてもよい。
VI．受動免疫
A．投与
受動抗体免疫の主な長所は、数週間およびおそらく数ヶ月持続しうる即時免疫状態を直
ちに提供することである。いくつかのヒトIgGアイソタイプは、30日を超える血清半減期
を有し、これは受動免疫された人に長命な保護を付与する。抗体は、それらが凝集体を含
有せず、宿主組織と反応性を有しない限り、最小の毒性を有する天然の産物である。同様
に、活性なワクチンが利用できることから、ワクチンと抗体の同時投与は、即時の保護と
長期間持続する保護の双方を提供することが可能である（たとえば、曝露後予防における
狂犬病に関して）。
上記のように産生されたMabの投与は、受動免疫に関する一般的プロトコールに従う。
受動抗体は一般的に全身投与されるが、経口投与は、一定の胃腸管物質に対して有用とな
りうる。臨床で用いられる多くの抗体調製物が静脈内投与されるが、自己免疫疾患のため
に治療的に用いられる新規モノクローナル抗体はしばしば、皮下投与されて、肝炎の予防
のためのγグロブリンの注射は従来から筋肉内投与であった。静脈内投与の必要性は、大
量の受動免疫にとって重度の制約であり、この実践は少数のレシピエントに限定される可
能性がある。しかし、この短所はおそらく、Ig調製物を理論的に筋肉内、皮下、病変内、
または腹腔内にさえ投与することができることからおそらく回避される可能性がある。よ
って、論理的に複雑な静脈内注入を必要とすることなく、腕、脚、もしく臀部の大きい筋
肉、または胃もしくは大腿の皮下脂肪の1つへの送達にとって適した抗体調製物を生成す
ることが可能となる。これらの投与経路のための抗体調製物は高い特異性を必要として、
比較的少量での投与を容認することから、本発明は、この選択肢を提供するために理想的
に適している。
B．薬学的組成物
宿主に投与する場合、MAbは宿主への投与にとって適した製剤に懸濁されると想像され
る。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される製剤および／または水性培地において分
散された抗体の有効量を含む。「薬学的および／または薬理学的に許容される」という句
は、動物に投与した場合に、具体的に適当であればヒトに投与した場合に、有害反応、ア
レルギー反応、および／または他の望ましくない反応を生じない組成物を指す。
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意の溶媒、
分散媒体、コーティング、抗菌および／または抗真菌剤、等張および／または吸収遅延剤
等が含まれる。そのような媒体または物質を薬学的に活性な物質のために用いることは当
技術分野において周知である。従来の培地または物質が活性成分と非適合性である場合を
除き、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も同様に組成物に組み
入れることができる。ヒトに投与する場合、調製物は、FDA Office of Biologies standa
rdsによって必要とされる無菌性、発熱性、全身安全性および／または純度標準を満たす
べきである。
抗体は一般的に、非経口投与のために製剤化され、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、病
変内、または腹腔内経路による注射のために製剤化される。生存成分または内容成分とし
て細胞を含有する水性組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知である。全ての場
合において、剤形は無菌的であるべきで、容易なシリンジ作動性が存在する程度に、およ
び細胞の生存性が維持される程度に流動的でなければならない。一般的に培養培地の大部
分は、投与前に細胞から除去されると企図される。
一般的に、分散剤は、様々な可溶性受容体、抗体、阻害因子、または生存細胞を、基礎
分散培地および細胞の生存を維持するために必要な他の成分と共に、インビボでの増殖ま
たは分化に影響を及ぼすおそらく追加の成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによっ
て調製される。製剤化の際に、溶液は投与製剤と適合性である様式でまたは治療的に有効
である量で投与される。いくらかの用量の変動は、処置される被験者の状態に応じて必ず
生じる。投与の責任を有する人は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決
定する。
VII．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。当業者は、
後述の実施例に開示される技術が本発明の実践において十分に機能するように本発明者ら
によって発見された技術を示すものであり、従ってその実践における好ましい様式を構成
するとみなされることができることを認識すべきである。しかし、当業者は、本開示に照
らして、開示される具体的態様に多くの変更を加えることが可能でありかつ、本発明の趣
旨および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果が得られることを認識すべきで
ある。
実施例1 - H5 HAに反応性のB細胞のための材料および方法
扁桃腺B細胞の単離および培養
扁桃腺からB細胞を調製するために、扁桃腺組織を、1x Antibiotic-Antimycotic（Gibc
o/Invitrogen cat. #15240-062）が添加された20〜30mLのダルベッコのリン酸緩衝生理食
塩水（DPBS、CaCl2またはMgCl2不含；Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY cat. #14190
144）を含む無菌ペトリ皿（VWR International, cat. #25384-088）内に置いた。組織を
切り刻み、メスで約1mm3片に細分化した。追加のリンパ球を、2枚の無菌顕微鏡スライド
（VWR cat. #12-550-34）のすりガラス表面の間での扁桃腺片の穏やかな粉砕により放出
させ、単一の細胞調製物を70μmナイロンストレーナ（BD Falcon, cat. #352350, BD Bio
sciences, Two Oak Park, Bedford, MA）を通して濾すことにより作製した。この懸濁物
をFicoll（Amersham Biosciences cat. #17-1440-03, Uppsala, Sweden）クッション（15
ml Ficoll上の35mlのサンプル）上に層状にし、1500Gで20分間分離した。単核細胞を含む
境界層を抽出し、DPBSで2回洗浄し（1300Gで7分間）、カウントし、DPBS中に108個細胞/m
lで再懸濁させた。高度に濃縮された（>95%）B細胞集団を、StemCell Technologies Inc.
（Vancouver, Canada）からのStemSep Negative Selection Human B-cell Enrichment Ki
t抗体カクテル（cat. #14064A）および磁気ビーズ（cat. #19150）を使用し、製造業者の
指示に従い、「The Big Easy」EasySepマグネット（StemCell Tech. cat. #18001）での
使用のための以下の改変により得た。すべての工程を、層流バイオハザードフードにおい
て、外界温度で実施した。細胞懸濁物を、無菌丸底14mlポリプロピレンチューブ（VWR ca
t. #60818-689）中に置き、等量のStemSep Negative Selection Human B-cell Enrichmen
t Kit抗体カクテルと混合し、10分間インキュベートした。次に、抗体カクテル量と等し
い量の磁気ビーズ懸濁液を加え、続いて10分間インキュベーションした。チューブ内の量
をDPBSで10mlにし、チューブ（キャップ無し）を磁気内に10分間置き、その時にチューブ
（依然として磁気内にある）の内容物を穏やかに1回の注ぎで第2の無菌14mlチューブ中に
デカントした。非B細胞がその壁に付着している元のチューブを磁気から取り外し、第2の
チューブを10分間の浄化インキュベーションのために挿入した。第1および第2のネガティ
ブ選択工程後に得られる濃縮B細胞懸濁液を、15ml Falconチューブ中に注ぎ、カウントし
、DPBSで洗浄し（1300Gで7分間）、37℃、5% CO2組織培養インキュベータにおけるインビ
トロ培養（一般的に105〜106個細胞/ml）のために適切な量の完全RPMI培地中に再懸濁さ
せた。完全RPMI培地は、10%ウシ胎児血清（FBS, HyClone cat. #SH30088.03, lot. #AQC2
3460, Logan, Utah）を添加したRPMI 1640（Gibco/Invitrogen cat. #11875-093）、およ
び100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン（cat. #15140-122）、2mM L-グル
タミン（cat. #25030-081）、1mM ピルビン酸ナトリウム（cat. #11360-070）、10mM HEP
ES（cat. #15630-080）、0.1% 2-メルカプトエタノール（cat. #21985.023）、および0.1
% Falk's Cloning Cocktail（50mM α-チオグリコール（Sigma, cat.# M6145）、20μM
バソクプロインジスルホン酸（Sigma, cat. #B1125）、100mM Naピルビン酸（cat. #1136
0-070）、1M HEPES pH 7.4（cat. #15630-080）からなる）を含む。L-グルタミン、ピル
ビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびHEPESをGibco/Invitrogen
から得た。
末梢血B細胞の単離および培養
末梢血からB細胞を調製するために、静脈血（180mlまで）を、1〜5mlクエン酸またはヘ
パリン硫酸（凝固を防ぐ）を含む60mlシリンジ中に採り、等量のDPBSで希釈し、Ficollク
ッション（15ml Ficoll上の35mlの希釈サンプル）上に層状にし、2000rpmで20分間分離し
た。血清（上層から）を回収し、一定分量で保存した。単核細胞を含む境界層を抽出し、
DPBSで2回洗浄し（1300Gで7分間）、カウントし、DPBS中に108個細胞/mlで再懸濁させた
。高度に純粋なB細胞集団が、StemSep Negative Human B-cell Enrichment Kit（StemCel
l Technologies Inc.）の使用により、末梢血B細胞の単離について記載のとおりに得られ
た。単離されたB細胞を洗浄し（1300Gで7分間）、105〜106個細胞/mlの完全RPMI培地（上
記）で再懸濁させ、37℃、5% CO2組織培養インキュベータ中で培養した。
EBVストック調製
感染性エプスタイン-バーウイルス（EBV）ストックを調製するために、B95-8細胞、慢
性的にB95-8株EBVに感染させたマーモセットのリンパ芽球様細胞株（LCL）（Miller & Li
pman, 1973）、またはEBfaV-GFP細胞（Speck et al., 1999；下記）を、約105個細胞／ml
の細胞密度で、37℃、5% CO2組織培養インキュベータにおいて完全RPMI培地（上記）中で
培養した。EBfaV-GFP細胞はB95-8細胞に由来し、ここでEBVゲノムは相同組換えにより改
変され、LMP2a遺伝子を欠失させ、それを高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）（CMV前初期
プロモータの制御下）ならびにネオマイシン耐性（neoR）遺伝子（Speck et al., 1999）
と置換した。これらの細胞は、EBfaV-GFP（LMP2a- EGFP+）ゲノムおよび野生型B95-8ゲノ
ムの混合物を含む。
約140mlの細胞培養物（B95-8 EBVまたは組換えEBfaV-GFPのいずれかを含む）は、酢酸
ミリスチン酸ホルボール（PMA、10ng/ml、Calbiochem, cat. #524400）での処理により、
溶菌性ウイルス産生期への移行が誘導された。PMAとの4時間のインキュベーション後、PM
Aを培養上清から除去し、完全RPMI培地と交換した。細胞を高度にコンフルエントになる
まで3〜4日間培養し、その時点で細胞を遠心分離（1300Gで7分間）により除去し、培養上
清を150ml Nalgene 0.45μm真空フィルター（Corning cat. #430320）を通して濾過した
。濾過された上清は、-80℃の1.5mlエッペンドルフチューブ中での保存のために1.4mlの
一定分量で、液体窒素中で瞬間凍結した、または、以下に記載のとおりに限外濾過により
濃縮した。
EBV濃縮
ウイルス濃縮は、濾過された上清を2つのCentricon Plus-70（100K MWカットオフ）ユ
ニット（Millipore, Billerica, MA）に添加することにより実施し、製造業者の指示に従
って濃縮した。フィルターユニットは、最小の濃縮液量（約0.5ml/濾過ユニット）が達成
されるまで、15〜45分間遠心分離（2000G）にかけた（15分毎にモニターした）。濾液を
捨て、ウイルス含有濃縮物を、完全RPMI培地を用い全量最大14ml（または元の培養上清量
の1/10）になるように再懸濁させた。1mlの一定分量を凍結バイアル中に移し、液体窒素
中で瞬間凍結させ、保存のために-80℃のフリーザーに移した。
接種によるB細胞感染
B細胞を完全RPMI培地中で106〜107個細胞/mlに再懸濁させ、等量の濾過されたEBV上清
と混合し、次にT-25フラスコ中に置き、37℃および5% CO2の組織培養インキュベータ中で
4時間インキュベートした。培養体積を次に完全RPMI培地の添加により調整し、感染細胞
を所望の濃度（一般的に105〜106個細胞/ml）で細胞培養のために再懸濁させ、マルチウ
ェルプレート中に分注し、37℃および5% CO2の組織培養インキュベータに移すようにした
。
濃縮EBVストックでのスピンフェクションによるB細胞感染
B細胞を完全RPMI培地中で106〜107個細胞/mlに再懸濁させ、等量の濃縮EBVと混合し、6
ウェル組織培養プレート（Greiner bio-one, cat. #65760）のウェル中に置いた。プレー
トを外気温度で1時間900Gの遠心分離にかけ、その時に感染細胞が所望の濃度（一般的に1
05〜106個細胞/ml）で完全RPMI培地中に再懸濁させ、マルチウェルプレート中に分注し、
37℃および5% CO2の組織培養インキュベータに移した。
TLRリガンド存在下での感染
B細胞を上記のとおりにB95-8株EBVで感染させ、感染時にToll様受容体（TLR）リガンド
を加えた。リガンドを以下の最終濃度で加えた：リポタンパク質Pam3-CSK4（0.5μg/ml）
、ザイモサン（Zymoson）（1μg/ml）、ポリイノシン、ポリシチジン酸（poly I：C）（2
5μg/ml）、リポポリサッカリド（LPS）（5μg/ml）、イミキモド（1μg/ml）、非メチル
化CpG DNA（1μg/ml）。すべてのTLRリガンド（InVivogen Incから）が、モハメド・セー
ラム博士（MUSC）の好意により供与された。
リンパ芽球腫細胞の増殖によるB細胞不死化効率の評価
感染の12時間後、B細胞をカウントし、2倍希釈系列として96ウェル丸底プレート（Grei
ner cat#650180）のウェル中に分注し、この際ウェルの各連続列は先の列で見いだされた
細胞数の半分を含んだ。最初の列は50,000個細胞／ウェルを含み、希釈系列の最終列は24
個細胞／ウェルを含んだ。細胞を37℃および5% CO2の組織培養インキュベータ中で9日間
インキュベートし、その時点でリンパ芽球腫細胞の増殖は顕微鏡により見ることができた
。不死化効率を、リンパ芽球腫細胞の増殖がウェル中の少なくとも1個のB細胞のEBV不死
化に起因したとの仮定に基づき推測した。このように、効率は、リンパ芽球腫細胞の増殖
が顕微鏡により一貫して観察された、ウェル当たりの最低細胞数を含むウェルを含む列か
ら算出し、初めにウェル中に分注された細胞数当たりの1つの不死化事象として表わした
。
293細胞のEBV-GFP感染効率の評価
組換えEBV-GFPウイルスは、潜伏感染膜タンパク質2 (latent membrane protein-2) (LM
P2)遺伝子の代わりに高感度緑色蛍光タンパク質をコードするEGFP遺伝子を含むため、ウ
イルスでの感染が感染後24時間という早期に蛍光顕微鏡により、または、フローサイトメ
トリーにより測定できる。293細胞を、以下のとおりに、接種により、または、スピンフ
ェクションにより感染させた。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、完全DMEM培地（DMEM（
Mediatech cat #10-013-CM）、10% Cosmic Calf血清（CCS, HyClone cat. #HS0087.03, l
ot. #APE21241）、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/ml（Gibco/Invitroge
n, cat. #15140-122）を含む）中に、6ウェルプレートへ1×106個細胞/1ml/ウェルで再懸
濁させた。1mlのEBfaV-GFPウイルスストック（濃縮または未濃縮）を細胞に加えた。プレ
ートを、接種のために一晩インキュベートした、または、スピンフェクションのために90
0Gで1時間遠心分離にかけた。感染効率は、蛍光顕微鏡を使用した目視検査により感染後4
8時間目に測定した。
B細胞のEBfaV-GFP感染効率の評価
定量的にB細胞感染効率を評価するために、扁桃腺B細胞を2×105個細胞/100μl/ウェル
で96ウェルプレートのウェル中に分注した。TLRリガンドを、先に上記の濃度でウェルの
一部に加え、細胞を37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。濃縮EBfaV-GFPウイルスス
トック（100μl/ウェル）を次に全ウェルに加え、細胞を先に記載したとおりにスピンフ
ェクションにより感染させた。感染効率を、24時間後にEGFP+細胞についてのフローサイ
トメトリーにより分析した。
フローサイトメトリー分析を、Becton Dickinson FACSCalibur機器を使用し、MUSCフロ
ーサイトメトリー施設で、確立された方法に従って実施した。抗体を表3に列挙する。
(表3) B細胞の特性付けのための抗体
Figure 2016039813
B細胞分化の誘導
不死化プロセス中でのB細胞分化に及ぼすそれらの効果を決定するために、サイトカイ
ンおよび他のシグナル伝達薬剤を、感染直後または感染の16〜20時間後のいずれかで、1
週間間隔でさらに2回、EBV感染したB細胞に加えた。すべての薬剤を完全RPMI培地中で希
釈し、そして以下の最終濃度で細胞に加えた：組換えヒトインターロイキン（IL）IL-4、
0.2ng/ml；IL-5、0.2ng/ml；IL-6、0.1ng/ml；IL-9、0.2ng/ml；IL-10、2.4ng/ml；IL-13
、1ng/ml；組換えヒトインターフェロン-α（IFN-α2a）、2,000IU/ml；組換えヒトBAFF
、1ng/ml；組換えヒト可溶性CD40L、5ng/ml；ヤギ抗ヒトIgM（Fab'）2、1.4μg/ml；IL-4
（cat. #200-04）、IL-5（cat. #200-05）、IL-6（cat. #200-06）、IL-9（cat. #200-09
）、IL-10（cat. #200-10）、IL-13（cat. #200-13）、CD40L（cat. #310-02）、およびB
AFF（cat. #310-13）はPeproTech（Rocky Hill, NJ）から得られた。IFN-α2a（Roferon
（登録商標）-A）はRoche Pharmaceuticalsからであり、ヤギ抗ヒトIgM（Fab'）2（cat.
#109-006-129）はJackson Immune Research Laboratories Inc.からであった。
H5ヘマグルチニン結合試験に使用した不死化B細胞レパートリーの作製
扁桃腺または抹消血のB細胞に、上記のとおり、スピンフェクションにより濃縮B95-8ウ
イルスを感染させた。スピンフェクション直後、細胞を、IL-4（0.2ng/ml）、IL-6（0.1n
g/ml）、BAFF（10ng/ml）、およびヤギ抗ヒトIgM（Fab'）2（1.62μg/ml）（3つのサンプ
ルについて）、またはCD40L（5ng/mL）、BAFF（10ng/ml）、およびヤギ抗ヒトIgM（Fab'
）2（1.62μg/ml）（5つのサンプルについて）を加えた完全RPMI培地中に再懸濁させた。
ELISAによるヒト免疫グロブリンIgMおよびIgG産生の測定
培養上清（24ウェルプレートの各ウェルから1ml）を、感染後1週目から開始して、種々
の時間点で回収し、アッセイまで-20℃で凍結保存した。解凍した上清、10μl/サンプル
、または、精製ヒトIgG（Sigma-Aldrich cat. #I2511）もしくはIgM（cat. #I8260）から
なる10μlのスタンダードを、100mM Na2HPO4、pH 9からなる90μlの結合バッファーと混
合した。サンプルを次にNunc 96ウェルEasyWashプレート（Costar cat. #3369）の4組の
ウェルに直接結合させた。すべてのサンプルを2組のプレートに加え、1つはIgGの検出の
ため、他方はIgMの検出のためであった。プレートを室温で1時間インキュベートし、PBST
（80.0g NaCl、11.6g Na2HPO4、2.0g KCl、5ml Tween-20、pH 7.0、10L中）からなる洗浄
バッファーで4回洗浄し、洗浄バッファー中の2% BSAで1時間ブロッキングした。IgGおよ
びIgMを結合したプレートを、ヤギ抗ヒトIgGまたはIgM（それぞれSouthern Biotech cat
#2040-04または2020-04）が結合したアルカリホスファターゼ（AP）を使用して検出し、1
：1,000希釈した100μl/ウェルを1時間加えた。洗浄後、発色基質p-ニトロフェニルリン
酸二ナトリウム塩（PNPP、Peirce cat #37620）のAP変換を、Multiskan Spectrumプレー
トリーダー（ThermoLabsystems）を使用してOD405での吸光度を測定することにより検出
した。培養上清サンプル中のヒト免疫グロブリンのレベルを、MultiSkanソフトウェアを
使用し、精製ヒトIgGおよびIgMスタンダードの標準曲線の較正に従って算出した。
H5 HA ELISA分析のためのサンプル回収
培養上清を、週1回、扁桃腺および末梢血の固定化B細胞培養物から回収した（各ウェル
から150μl、新鮮RPMI＋CD40L、BAFF、および抗ヒトIgMで交換した）。1および2週間後、
上清を、プレート上の各ウェルからの25μlのサンプルを合わせることによりプールした
。3週目について、プールした上清を、特定列（A、B、Cなど）中の各ウェルからの50μl
を合わせることにより、各プレート上の個々の列から生成した。全ウェルからの上清を、
個々のまたはプールした2つのウェルをテストする際に、分析のために使用した。ひとた
び抗H5 HA IgGを分泌する個々のウェルが同定されれば、そのウェルからの細胞をカウン
トし、各々が1000、100、10、または1個細胞／ウェルを含む、少なくとも4枚の96ウェル
プレート中にサブクローンニングした。2週間後、プレート、次に列、次にウェルからの
サンプル回収および上清の分析を繰り返した。サブクローンニング戦略の目的は、最初に
1ウェル当たりわずか1個の細胞を蒔いたウェルからH5 HA反応性IgGを得ることであった。
H5 HA ELISA
H5N1鳥インフルエンザ株A/Vietnam/1203/2004（Protein Sciences Corp）からの精製組
換えH5ヘマグルチニン（HA）を、高pHの100mMリン酸ナトリウム結合バッファー（pH9.0）
中で2μg/mlに希釈し、96ウェルEasyWashプレート（Costar cat. #3369）中に50μl/ウェ
ルで分注し、一晩結合させた。各サンプル中での非特異的なプレート結合のコントロール
のために、等しい数のウェルには結合バッファーのみを入れた。プレートを次に洗浄し、
2% BSAを含む中性pHの100mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.2）でブロッキングした。
サンプルまたは対照からの培養上清、100μl/ウェルを3通りに加えた。対照は、完全RPMI
培地で1：500に希釈した健康なヒトボランティアからの血清；完全RPMI培地中で5μg/ml
に希釈した精製ヒトIgG（Sigma）およびRituxan（登録商標）（ヒト化抗CD20 IgG1モノク
ローナル抗体、Genentech, San Francisco, CA 94080, cat. #50242-051-21, lot #M7026
7）を含んだ。続いて、プレートを十分に洗浄した。次に、1：1000希釈したアルカリホス
ファターゼ（AP）結合ヤギ抗ヒトIgG（Southern Biotech cat. #2040-04）を100μl/ウェ
ル加え、外気温度で1時間インキュベートし、p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（P
NPP、Peirce cat. #37620）からなる発色基質のAP変換による検出が続いた。吸光度は405
nmで測定した。結果は、平均OD405値±標準偏差（n=3）で表わした。未コーティングウェ
ル（結合バッファーだけ）への非特異的なサンプル結合に起因するバックグラウンド値を
、H5 HAコーティングウェルへの結合から得られた値から引いた。
実施例2 - H5 HAに反応性のB細胞での結果
Toll様受容体（TLR）リガンドおよびEBVの濃縮は、EBV感染力を有意には改善しない
Traggiai et at.（2004）は、少なくとも1つのTLRリガンド（CpG）の培養記憶B細胞へ
の添加によってEBV感染効率を増強できることを報告した。ナイーブB細胞がいくつかのTL
Rを発現するため（Bourke et al., 2003）、いくつかのTLRリガンドがナイーブB細胞のEB
V感染に及ぼす効果を評価することが合理的であった。初代B細胞を、Pam3（Pam3Cys-Ser
（Lys）4）（0.5μg/mL）、ザイモサン（1μg/mL）、Poly I：C（ポリイノシン‐ポリシ
チジル酸）（25μg/mL）、LPS（リポポリサッカリド）（5μg/mL）、イミキモド（1μg/m
L）、CpG（10μg/mL）、または無リガンドのいずれかと一晩インキュベートした。これら
は、共通の病原性抗原を模倣する合成タンパク質である。これらの各々は、B細胞中の異
なる先天性免疫経路を活性化する。リポペプチドPam3（Hamilton-Williams et al., 2005
）はTLR2および1に結合し、ザイモサン（サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyc
es cerevisiae）から調製された酵母細胞壁成分）はTLR2および6に結合し、Poly I：C（
ウイルス二本鎖DNA模倣体）はTLR3に結合し、LPS（微生物細胞壁成分）はTLR4に結合し（
Hamilton-Williams et al., 2005）、イミキモド（イミダゾキノリンファミリー中の小分
子化合物で、抗ウイルス効果および抗腫瘍効果の両方を呈する）はTLR7に結合し、低メチ
ル化CpG DNAはTLR9に結合する（Hamilton-Williams et al., 2005）。本発明者らはこれ
らのTLRリガンドを選んだ。その理由は、それらは広範なTLRに結合し、良好な範囲の活性
を与えうるからである。一晩のインキュベーション後、細胞を、未濃縮B95-8 EBVの2つの
異なる調製物（調製物1、調製物2）で感染させた。図1Aに示すとおり、イミキモド、Pam3
、およびCpGの添加によって、一部の場合において、感染効率が1.5%近く改善されたが、
しかし、全般的な感染力は非常に低かった。また、ウイルスストック調製物の間の変動が
、ウイルス感染力に有意な影響を与えた（図1A）。
TLRリガンドの添加によって感染効率が本発明者の必要性のために十分なだけ増加しな
かったため、レトロウイルス感染増加での成功のためにウイルス濃縮を追及した（Kanbe
& Zhang, 2004）。ウイルス濃縮を使用して、高ウイルス力価およびより大きな感染力が
達成されている；濃縮はいくつかの技術を通じて達成できる。これらの試験のために、本
発明者らは限外濾過遠心分離を使用し、EBVを10倍に濃縮した。濃縮または未濃縮EBVを初
代B細胞に適用し、感染力を、位相差顕微鏡を使用して測定し、リンパ芽球形成を評価し
た。これらの知見は、EBVの濃縮によって、わずか1%の感染力に達した同じ調製物からの
未濃縮ウイルスと比較し、感染効率が5%近く改善されることを示した（図1B）。ウイルス
濃縮によって感染力が有意に増加したが、それはナイーブB細胞レパートリーの大部分を
不死化するには依然十分ではなかった。
ウイルス濃縮および「スピンフェクション」の組み合わせによるEBV感染力の増加
「スピンフェクション」または「スピノキュレーション（spinoculation）」によってH
IVなどの他のエンベロープを持つウイルスの感染力が増強されると報告されている（Audi
ge et al., 2006; O'Doherty et al., 2000）。この技術は、細胞およびウイルスストッ
クを合わせること、次にこの組み合わせを低速度で1時間遠心分離することを含む。濃縮
および「スピンフェクション」技術を評価するために、付着性細胞株Q293Aに組換えEBfaV
-GFPウイルスを感染させ、その中のEBV潜伏遺伝子LMP2aを高感度緑色蛍光タンパク質EGFP
遺伝子（Speck et al., 1999）で置換した。Q293A細胞に、EBfaV-GFPウイルスストックの
濃縮または未濃縮調製物を24時間接種し、または、濃縮ウイルスで、900Gで1時間「スピ
ンフェクト」した。図2Aは、未濃縮ウイルスの低感染効率を実証した。未濃縮ウイルスを
上回る感染力の著しい増加が、EBfaV-GFPの10倍濃縮で観察された（図2B）。図2Cでは、Q
293A細胞を濃縮ウイルスで「スピンフェクト」した；組み合わせによって、未濃縮または
濃縮のいずれかのウイルスでの接種を上回り、感染効率が増加した（図2A-C）。
「スピンフェクション」およびEBV濃縮によって樹立細胞株の感染効率が増加したが、
これらの技術は依然として初代ヒトB細胞で評価する必要があり、感染効率を定量化する
必要があった。初代扁桃腺B細胞を、濃縮された非蛍光B95-8 EBVで、または、蛍光EBfaV-
GFPで「スピンフェクト」し、EGFP発現について感染後24時間目に分析した。蛍光顕微鏡
を使用した感染効率の目視検査によって、ウイルス濃縮および「スピンフェクション」の
組み合わせが扁桃腺B細胞に効果的であることが明らかになった（図3A）。感染効率を、
感染後24時間目にEGFP発現についてのフローサイトメトリーにより定量化した。「スピン
フェクション」および濃縮の組み合わせによって初代B細胞のEBV感染が有意に増加し、EB
faV-GFP感染細胞の45%がB95-8感染細胞よりも高い蛍光を有し、平均蛍光強度（MFI）値は
15.1と比較して61.9であった（図3B）。図3Bの全ピークのシフトは、B細胞の100%近くが
この方法を使用してEBfaV-GFPで感染され、未濃縮ウイルスでの接種を上回る大きな改善
であり、扁桃腺B細胞レパートリーの大部分を不死化するために十分でありうる。
全体的に、B細胞のEBV感染の最適化でのこれらの結果は、TLRリガンド刺激およびウイ
ルス濃縮は本発明者らの必要性に対して十分に感染効率を増加させないことを示す。しか
し、ウイルス濃縮および「スピンフェクション」の組み合わせによって初代B細胞の感染
は劇的に増加した。
T細胞由来サイトカインは、異なるサンプルからのIgMおよびIgG分泌に対し、変動する効
果を有した
ナイーブB細胞は、B細胞受容体（BCR）と特定抗原の間の相互作用を通じて活性化され
る；活性化はT細胞からの共刺激シグナルにより助けられる。インビボでのB細胞分化は、
T細胞の助けに依存的である。したがって、本発明者らは、BCRを架橋して抗原を模倣する
状態でT細胞由来の増殖因子と分化因子の両方を提供できるならば、EBV不死化LCLはイン
ビトロで分化を強いられうると仮定した。
この仮定をテストするために、本発明者らは、具体的にはIgG分泌により決定される分
化に異なるサイトカインおよび／またはシグナル伝達分子の組み合わせが及ぼす効果を検
証した。これらの薬剤がIgMおよびIgG分泌に有する効果を検証するために、初代扁桃腺B
細胞にB95-8 EBVを感染させ、表4に列挙するサイトカインもしくは他の薬剤または図4に
まとめたこれらの組み合わせで処理し、1週間後、培養上清をELISAによりIgMまたはIgGに
ついて分析した。図4は、感染および処理後1週間目の3つの異なるサンプルにおけるIgMお
よびIgGの分泌パターンを示す。IgMは、大半のサイトカイン処理後に、サンプルのすべて
によりIgGよりも高レベルで主に分泌された（図4）。具体的には、BAFF処理またはBAFFお
よびCD40Lの組み合わせによって未処理細胞を上回りIgM分泌が増加し（図4）、抗IgM（Fa
b'）2を含むサイトカインの組み合わせで処理したB細胞は、一般的に、未処理対照と比較
した場合、1週間後に全免疫グロブリン分泌が減少した（図4）。免疫グロブリン分泌の類
似のパターンが3つの異なるドナーサンプルから得られたため、シグナル伝達薬剤は再現
可能な効果を有した。また、免疫グロブリン分泌の大部分がIgMであったため、これは、
扁桃腺B細胞の大部分が免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチまたは親和性成熟を
受けていなかったことを示す。
(表4) Igクラススイッチカクテルのためのサイトカインおよび因子
Figure 2016039813
抗IgM（Fab'）2、CD40L、および／またはサイトカインによる、培養における数週間後の
免疫グロブリンクラススイッチの誘導
扁桃腺B細胞をサイトカインおよびシグナル伝達薬剤で3週間処理した；培養上清を、各
週後、10週目までELISAにより分析した。図4に表わすドナーサンプルの2つからの扁桃腺B
細胞を、限られたパネルのシグナル伝達薬剤の組み合わせで3週間処理した。これらのサ
ンプルは、1週間後、主にIgMを最初に分泌したが（図4）、IgMおよびIgGの発現パターン
は経時的にインビトロで変化した。培養後10日という早期に開始し、免疫グロブリンアイ
ソタイプクラススイッチが、サイトカインの特定の組み合わせでの処理後に起こった。図
5に見られるように、8週間を超えて培養された細胞では、免疫グロブリン発現パターンが
明確に異なった（図5Aおよび5B）。CD40L単独、またはIL-6との組み合わせでの抗IgM（Fa
b'）2での継続的なサイトカイン処理は、高レベルのIgG分泌をもたらした（図5A）。この
IgGの増加は、IgM分泌の下落を伴った（図5A）。対照的に、抗IgM（Fab'）2およびIL-4で
処理したB細胞は、IgGよりも高レベルのIgMを分泌した（図5Aおよび5B）。図5Bは、CD40L
、抗IgM（Fab'）2、およびBAFFと培養した細胞も、優先的なIgG分泌をもたらすことを示
した。全クラスで、B細胞は、何週間にもわたり高レベルで免疫グロブリンの分泌を継続
した。これらの結果は、LCLが、シグナル伝達薬剤での処理後にIgMからIgGへの免疫グロ
ブリンアイソタイプクラススイッチを受けていたことを示唆した。
シグナル伝達薬剤を用いた処理による、EBV不死化B細胞の初期プラズマB細胞期への分化
の誘導
図5Aおよび5Bは、抗IgM（Fab'）2およびIL-6、可溶性CD40L単独、または抗IgM（Fab'）
2、BAFF、および可溶性CD40Lで処理されたEBV不死化細胞が、優先的にIgG分泌を増加する
が、抗IgM（Fab'）2およびIL-4で処理された、または、サイトカインおよびシグナル伝達
薬剤の非存在下で、培地だけで培養されたEBV不死化細胞がIgMを主に分泌することを実証
した。不死化細胞は、20週間を超えて多量の免疫グロブリンを分泌した（データ示さず）
。これらの観察結果は、まとめると、B細胞分化が起こっていたことを示した。不死化B細
胞がインビトロでプラズマ様細胞に分化するか否かを研究するために、抗IgM（Fab'）2お
よびIL-4またはIL-6で処理され、主にIgMまたはIgGをそれぞれ分泌するEBV不死化B細胞を
、共通のB細胞表面マーカー（説明については表5を参照のこと）について染色し、不死化
前に初代扁桃腺B細胞と比較した。図6Aは、非感染の初代扁桃腺B細胞（上パネル）の大半
がナイーブであり、または、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを受けていなか
ったことを示した。初代扁桃腺B細胞は汎親和性B細胞表面マーカーCD19およびCD20につい
て陽性染色され、細胞の大部分が表面免疫グロブリンIgD（免疫グロブリンアイソタイプ
クラススイッチまたは体細胞超変異を受けていないナイーブB細胞および成熟B細胞のマー
カーである）について陽性染色された。また、初代細胞は、活性化マーカーCD27およびCD
30の低レベル発現を有した（図6A）。対照的に、主にIgMまたはIgGを分泌した不死化細胞
（図6B、下パネル）は、表現型的に初期プラズマ細胞と似ていた；予測されうるとおり、
両方の集団が、汎B細胞マーカーCD19について陽性であったが、しかし、それらはCD20（
プラズマB細胞で共通して喪失される）およびIgD（ナイーブおよび初期成熟B細胞のマー
カーである）の発現減少を有し、それらは活性化マーカーCD30およびCD27の発現増加を有
した（図6B）。主にIgGまたはIgMを分泌する不死化B細胞は、CD38（IgG分泌細胞で情報制
御された終末分化マーカーである）の発現においてだけ異なった（図6B）。これらの結果
によって、シグナル伝達薬剤で処理された不死化細胞が実際にインビトロで分化していた
ことが確認された。
(表5) フローサイトメトリーによりB細胞集団を特性付けするために使用される細胞決定
因子
Figure 2016039813
概要：
今日まで、初代B細胞の組換えEGFP発現ウイルスでのエプスタイン-バーウイルス感染が
最適化されて、蛍光細胞の一晩集団が達成され、有意に増加した平均蛍光活性（MFI）は
、例えば、バックグラウンドMFI 15.1と比較し、遠心限外濾過および「スピンインフェク
ション」技術を使用したウイルス濃縮を通して61.9であった。シグナル伝達薬剤の組み合
わせ（CD40L単独または抗IgM（Fab'）2およびBAFFとの組み合わせ；または、IL-4を伴う
、または伴わない、IL-6との組み合わせでの抗IgM（Fab'）2）を同定し、それらは一貫し
てB細胞の活性化および分化を増加させ、優先的なIgG分泌をもたらした。サイトカインの
他の組み合わせは、一貫して、IgG分泌、例えば、IL-9およびIL-13を誘導した。異なるB
細胞表面マーカーに特異的な抗体でのフローサイトメトリー染色によって、インビトロで
分化誘導されていたEBV不死化B LCLが、プラズマB細胞と似ており、それらが由来する初
期の初代扁桃腺B細胞とは似ていなかったことが示された。
H5N1ヘマグルチニン（HA）特異的抗体の、健康なヒトの血清における存在
インビトロでのプラズマ細胞の作製は、鳥インフルエンザをはじめとする目的の標的に
特異的なヒトモノクローナル抗体の作製のために利用されうることを示唆した。大半の人
々が鳥インフルエンザに暴露されていないが、他の密接に関連するインフルエンザ株には
暴露されている。従って、健康な個人が、ヒトインフルエンザウイルスにより刺激され、
鳥インフルエンザのH5 HAタンパク質と交差反応する記憶B細胞を有しうると想定すること
が合理的である。H5 HA反応性IgG抗体が健康な個人の血液中に存在するか否かを確認する
ために、血清を、H5N1鳥インフルエンザ（HS 1-5）に暴露されていなかった5人の健康な
ボランティアから回収し、次に、市販の組換えH5 HAに結合する抗体でのELISAによりアッ
セイした。血清中のこれらの抗体を検出するために、組換えH5 HAを使用したELISAを作製
した。H5 HA特異的結合を、全結合からバックグラウンドを引くことにより算出した（方
法に記載）。4人のドナー（HS1、2、3、5）が血清中に変動量のH5 HA特異的IgGを有し（
図7）、ドナーHS 3および5が最高の反応性を有した。対照的に、ドナーHS 4は陰性対照（
CD20抗原に特異的なヒト化モノクローナル抗体リツキシマブ（Rituxan（登録商標））ま
たは精製全ヒトIgGからなる）よりも低い反応性を有し、このボランティアがH5 HA交差反
応性IgG抗体を欠くことを示す（図7）。健康なボランティアの血清におけるH5 HA特異的I
gGの検出は、H5 HA反応性IgG抗体がELISAスクリーニングにより検出できることを示した
。しかし、本発明者らはELISAを使用してIgM抗体結合を検出できなかった。その理由は、
バックグラウンド結合が高過ぎ、意味のある結果が出せなかったからである（データ示さ
ず）。これらの結果は、鳥インフルエンザのH5ヘマグルチニンに特異的なIgG抗体が、EBV
不死化細胞中のB細胞分化経路を利用することにより作製できるとの仮説を支持した。そ
の理由は、それらは、H5N1に暴露されない健康な人が、ウイルスに対する抗体反応を作る
能力を有することを示したからである。
PBMCからの不死化B細胞レパートリーによる、H5 HAに特異的なIgG抗体の分泌
ELISAの結果は、所与の特異性のB細胞クローンが、H5N1鳥インフルエンザに暴露されて
いない個人から単離できることを示唆した。不死化および分化の技術をテストするために
、PBMCをボランティア5（HS5=V5）から抽出した。B細胞を、2つの異なるサイトカイン／
シグナル伝達薬剤の組み合わせを使用して培養した：（1）抗IgM（Fab'）2、IL-4およびI
L-6（PBMC A1の結果を参照のこと）；（2）抗IgM（Fab'）2、CD40LおよびBAFF（PBMC A2
の結果を参照のこと）。
PBMC A1：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、ボランティアHS 5の
PBMCから単離し、EBVで不死化した。細胞を、抗IgM（Fab'）2、IL-4、およびIL-6で処理
し、B細胞の分化および免疫グロブリン産生を誘導し、次に96ウェルプレート3枚に蒔いた
。1週間後、各プレートの全ウェルからの培養上清を回収し、プールした；3枚のプレート
のいずれかからのプールされた上清サンプルにおいて、ヒト血清対照と比較して、検出さ
れるH5 HA特異的IgG結合はほとんど存在しなかった（図8）。しかし、2週間の処理後、H5
HA特異的IgGは、B細胞の全3枚のプレートからのプールされた培養上清において検出され
た（図8、プレート1、プレート2、およびプレート3）。H5 HA反応性IgGを分泌する反応性
B細胞クローンの位置を決定するために、反応プレート上の各列の全ウェルをプールし、
アッセイした。3枚のプレートの各々からのいくつかの列が、H5 HA反応性B細胞を含んだ
（プレート1、列E；プレート2、列C、D、およびE；ならびにプレート3、列D）（図9）。
図10は、最も反応性の高いB細胞がプレート2、列Dの隣接ウェル11および12からのプール
された上清中に位置することを示した。上清のさらなる分析では、反応性B細胞が、プレ
ート2、列D、ウェル11に見出された（図11）；これらの細胞は、陽性血清対照と類似のレ
ベルのH5 HA反応性IgGを分泌していた（図11）。このウェルをサブクローンニングした；
しかし、H5 HA反応性B細胞は、それらが12週間の培養後に単離される前に死んだ。クロー
ン単離計画の概要および知見を、図12および表6にまとめている。
(表6) H5 HAと反応性の抗体を分泌する不死化ヒトB細胞のスクリーニングおよび産生に関
するデータのまとめ
Figure 2016039813
Figure 2016039813
PBMC A2：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、ボランティアHS 5の
PBMCから2回目に単離し、EBVに感染させた。細胞を次に、方法に記載のとおりに、抗IgM
（Fab'）2、CD40L、およびBAFFでの処理により分化を誘導した。（薬剤のこの組み合わせ
によって、PBMC A1およびBで使用された組み合わせを上回るIgG抗体産生レベルが改善さ
れた）6枚の各96ウェルプレートの全ウェルからの培養上清を、感染後、週1回回収し、プ
ールし、H5 HA反応性IgG抗体についてアッセイした。4週間後、異なるプレート（プレー
ト4 G8、プレート5 E1、およびプレート6 C2）の3つのウェルはH5 HA反応性IgGを含んだ
。3つの反応性ウェルをサブクローンニングし、図13に概説し、および、表6にまとめると
おり、続いて可能なクローンをウェルの2つから同定した。H5 HA反応性B細胞は、培養に
おいて10週後に、それらの単離前に死んだ。
PBMC B：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、ボランティア6の末
梢血から単離し、EBVで不死化した。不死化細胞を、抗IgM（Fab'）2、IL-4、およびIL-6
で処理し、96ウェルプレート3枚に蒔いた。3週間のサイトカイン処理後、H5 HA特異的IgG
抗体は、ボランティア6の上清または血清中に検出されなかった（図14）。このサンプル
の分析は、血清または不死化細胞の上清のいずれかにおけるH5 HA反応性が繰り返し欠如
したため、中断された。
概要：
ボランティア２名からの末梢血由来B細胞を単離し、EBVで不死化し、次に抗IgM（Fab'
）2、IL-4、およびIL-6；または、抗IgM（Fab'）2、CD40L、およびBAFFのいずれかで分化
を誘導した。H5 HA反応性IgG抗体を分泌するB細胞をボランティア1名から、2つの別々の
場合（PBMC A1およびA2）に単離し、いずれかの方法を使用して分化を誘導した。これら
のサンプルにおいてより多くのH5 HA反応性IgG分泌B細胞を得るために、異なるサイトカ
インの組み合わせを、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを誘導する効率を最適
化する目的でテストした。この変化によって、PBMC A2レパートリーから、PBMC A1レパー
トリーからよりも多くの反応性細胞が産出されるが、差は有意ではなかった。サンプルを
、同じボランティアから1ヶ月を少し超える間隔で単離した。対照的に、ボランティア6か
ら単離されたB細胞は、反応性クローンを産生しなかった。これらの結果を表6にまとめて
いる。
扁桃腺からの不死化B細胞レパートリーによる、H5 HAに特異的なIgG抗体の分泌
H5 HA反応性IgGを産生する不死化B細胞を、それらがナイーブB細胞の分化を誘導するこ
とを証明するために、抹消血（PBMC）から単離することが成功しており、レパートリーの
作製のためのナイーブの細胞集団は、医学的理由のために扁桃摘出術を受けた、その他の
点では健康な小児からの扁桃腺B細胞から得た。図6Aで実証されたとおり、扁桃腺B細胞は
主にナイーブであり、または、免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを受けていな
い。本発明者らは、26の扁桃腺サンプルでの末梢血サンプルで実施された実験を繰り返し
た（表6にまとめた）。分化を誘導するための処理によって、最初の扁桃腺（TNSL A）後
の抗IgM（Fab'）2、IL-4、およびIL-6から、残りのすべて（TNSL B〜E）について抗IgM（
Fab'）2、CD40L、およびBAFFに変わった。その理由は、第2の組み合わせによってIgG分泌
が選択的に増加したからである（データ示さず）。扁桃腺レパートリーのいくつかからの
代表的な結果を図15〜32に示す。
TNSL A：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、扁桃腺から単離し、
EBVで不死化し、抗IgM（Fab'）2、IL-4、およびIL-6で処理し、次に96ウェルプレート10
枚中で培養した。1週間後、H5 HA反応性IgGは検出されなかった。しかし、2週間のサイト
カイン処理後、H5 HA結合活性が、プレート10枚のうち2枚（プレート6および9）で検出さ
れた（図15）。3週間後、2列（プレート9のCおよびF）が交差反応性IgGを有するとして同
定された；残念ながら、このサンプルは真菌混入のために失われ、分析は中断された（図
15）。この喪失にもかかわらず、このサンプルによって、目的の抗原への抗原のIgG反応
性を得ることが扁桃腺B細胞から可能になることが実証された。
TNSL B：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、扁桃腺から単離し、
EBVで不死化し、抗IgM（Fab'）2、CD40L、およびBAFFで処理し、IgG抗体産生を増加させ
、96ウェルプレート10枚中に蒔いた。低レベルのH5 HA反応性IgGが、2週間の分析後、プ
レート3列Dで検出されたが、反応性は続いて回復されなかった；従って、サンプル分析は
中断した（図16）。
TNSL C：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、扁桃腺から単離し、
EBVで不死化し、抗IgM（Fab'）2、CD40L、およびBAFFで刺激し、96ウェルプレート10枚中
に蒔いた。第1週後、H5 HA反応性IgGが、プレート7、8、9、および10（図17）で、非常に
低レベルで検出された。しかし、2週間後、H5 HA反応性IgG抗体はプレートのいずれでも
検出されず、反応性は続いて回復されなかった。従って、サンプル分析を4週間後に中断
した（図17）。
TNSL D：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、扁桃腺から単離し、
EBVで不死化し、抗IgM（Fab'）2、CD40L、およびBAFFで刺激し、10枚の96ウェルプレート
中に蒔いた。1週間後、培養上清中に検出可能なH5 HA反応性IgGは存在しなかった（図18
）。しかし、2週間後、H5 HA反応性IgGがプレート1、8、9、および10で同定された（図19
）。プレート10は強いH5 HA反応性を呈し、ボランティアHS 5からのヒト血清と類似して
いた；従って、個々のウェルからの培養上清を直ぐに分析した。他のプレートは第2週後
に結合強度を失い、サブクローンニングのために追跡されなかった。反応性B細胞が、プ
レート10、列Gで、隣接ウェル3および4からのプールされたサンプル中で見出され、ヒト
血清対照と類似の結合レベルを呈した（図20）。反応性ウェルがG4として同定された（図
21）；しかし、反応性は低下しており、抗体を産生する細胞の死が始まっていることを示
す。このウェルからのB細胞を続いてサブクローンニングしたが、図29に示したとおり、H
5 HA反応性IgGを産生する細胞は生存せず、単離できなかった。単離計画を図22にまとめ
ている。
TNSL E：
B細胞を、方法に記載のとおりに、および、表6にまとめるとおり、扁桃腺から単離し、
EBVで不死化し、抗IgM（Fab'）2、CD40L、およびBAFFで刺激し、96ウェルプレート4枚中
に蒔いた。1週間後、プレート1および3はH5 HAに反応性が弱かった（図23）。2週間後、
プレート1、列BおよびEならびにプレート3、列Aが、H5 HAと反応性のIgGを分泌するB細胞
を含むとして同定された（図24）。プールされた隣接ウェルからの培養上清の分析によっ
て、プレート1、列Bウェル5および6、列E、ウェル3および4、11および12；ならびにプレ
ート3列A、ウェル9および10がH5 HAと反応性のIgGを含むことが決定された（図25）。こ
れらの対のウェルのうち、プレート1列Eウェル11およびプレート3、列A、ウェル10がH5 H
A反応性IgGを含んだ（図26）。プレート3ウェルA10をサブクローンニングした。その理由
は、それが最も強いH5 HA結合を有したからである。反応性が、5週間後にわずか1000個の
細胞を含むウェル中で検出された（図27）。一次ラウンドのサブクローンニングのための
単離計画を図28にまとめ、概説した。H5 HA反応性が、1000個細胞／ウェルを含むプレー
トでの一次ラウンドのサブクローンニング中に同定された（図29）。反応性細胞をウェル
C7およびE3において同定した（図30Aおよび30B）。これらのウェルからの細胞を、2つの
追加ラウンドの限界希釈クローンニングにかけ、2つのH5 HA反応性クローン、TE-3A10-E3
A5およびTE-3A10-C7F6（それぞれE3A5およびC7F6と呼ばれる場合もある）（図30C）の同
定をもたらした。
TNSL-E由来のH5 HA反応性クローン、TE-3A10-C7F6およびTE-3A10-E3A5の特性付け
H5 HAへの結合の特異性を評価するために、H5 HAへのTE-3A10-C7F6およびTE-3A10-E3A5
（C7F6およびE3A5）の結合についての相対的親和性を、H1 HAおよびH7 HAについてのそれ
らの親和性と比較して試験した。H1およびH7 HAに特異的なELISAアッセイを開発した。ク
ローンC7F6およびE3A5からの培養上清を、健康な成人ボランティア5名からのヒト血清と
の比較で、相対的結合についてアッセイした（図31）。大半の健康な成人が、H1 HAに対
する抗体応答を有すると予測されうる。その理由は、大半のヒトインフルエンザウイルス
感染がH1株ウイルスを原因とし、H1 HAが毎年のインフルエンザンワクチンの成分である
からである。図31に見られるように、すべてのボランティアが血清中にH1 HA反応性IgGを
有していた。しかし、予測のとおり、H5 HAおよびH7 HAへのずっと低い血清反応性を有し
た。その理由は、H5およびH7は鳥インフルエンザ株であるからである。対照的に、クロー
ンC7F6およびE3A5の両方が、H5 HAに結合したIgGを分泌したが、H1またはH7 HAへの結合
よりも有意に高い反応性であり（図31）、C7F6およびE3A5の両方がH5 HAに比較的特異的
であることを示す。興味深いことに、H5 HA反応性クローンがヒト株H1 HAへいくらかの交
差反応性を有したが、他の鳥H7株との低レベルの反応性を有した。精製ヒトIgGを対照と
して使用し、図31に見られるように、H1 HA反応性もこのサンプル中に存在し、全ドナー
において見出されるH1 HAとの強い反応性と一致する。
用量反応型の実験によって、C7F6およびE3A5クローンが約20〜50pg/細胞/日のIgGを産
生することが示された。E3A5およびC7F6細胞をDPBSで洗浄し、96ウェルプレートのウェル
中に10,000個、5,000個、2,500個、および1,250個/ウェルを同じ量の培養培地（200μl/
ウェル）中に播種した。培養上清を72時間後に回収し、IgGおよびIgMレベルについて評価
した。各テストサンプル中のクローンにより産生されたIgGおよびIgMのレベルの算出は、
実験値を標準曲線に由来する値（未知濃度の精製IgGおよびIgMを連続希釈することにより
確立）と比較することにより実施した。図32に見られるように、C7F6およびE3A5細胞の両
方が用量依存的にIgGだけを産生した。予測どおり、IgMは産生されなかった（図32）（最
高細胞数で見られるIgMの残留バックグラウンドレベルは、ヤギ抗ヒトIgM ELISA検出抗体
のヒトIgGとの交差反応性に起因した）。最高細胞密度（10,000個細胞/200μl）で、クロ
ーンが72時間に4〜5μg/ml培地を産生した。すべての細胞密度での各サンプルからのデー
タを合わせて、平均IgG産生量/細胞/24時間を算出した。E3A5細胞は平均で49±16pg IgG/
細胞/24時間を産生し、C7F6細胞は平均で21±11pg IgG/細胞/24時間を産生した（図32）
。E3A5細胞がより低い細胞密度でC7F6細胞よりも速く増殖したため（データ示さず）、こ
れらの差は有意ではないであろう。
次に、C7F6およびE3A5単離株により産生されたIgGサブタイプを同定した。ヒトIgGは4
つのサブタイプ、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を有し、それぞれIgG1が最も多く、IgG4
が最も少なく見られた。各クローンのサブタイプを同定するために、両方の単離株からの
培養上清を、ELISAにより、3つの最もよく見られるサブタイプであるヒトIgG1、IgG2、お
よびIgG3を特異的に認識する検出抗体、マウスモノクローナル抗体（各々がアルカリホス
ファターゼ（AP）に結合している）を使用してテストした。（図33）に見られるように、
C7F6およびE3A5の両方がIgG1を分泌した。陽性対照として、AP標識ポリクローナルヤギ抗
ヒトIgGを使用し、全IgGサブタイプにIgG1特異的モノクローナル抗体よりも良好に結合し
、より高いOD405値をもたらした（図33）。
TE-3A10-E3A5およびTE-3A10-C7F6クローンにより産生されるH5 HA結合免疫グロブリンの
重鎖および軽鎖の可変領域配列の分析
全RNAを各クローンの約106個の細胞から、RNEasyプロトコール（Qiagen, #74104）を使
用し、QIAshredderカラム（Qiagen, #79654）で抽出した。RNAを、High Capacity cDNA R
everse Transcription Kit（Applied Biosystems, #4368813）で、製造業者の指示に従い
cDNAに変換し、PCRにより、軽鎖および重鎖型の含量について、Welschof et al.（1995）
から適応したプラーマー組を使用して分析した（図34A）。すべてのフォワードプライマ
ーがXbaI制限酵素部位を取り込み、リバースプライマーがSalI制限酵素部位を取り込んだ
。PCR産物を1%アガロースゲルで分析した結果（図34B）、E3A5およびC7F6の両方がλ1軽
鎖を有し、E3A5がVH3重鎖を有し、C7F6がVH1重鎖を有したことを示す。検出可能な産物を
もたらす反応を、プルーフリーディングAccuzyme（商標）Mixキット（Biolinc, # BIO-25
027）を使用してスケールアップした。PCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen,
# 28704）を使用してゲル精製し、各々の一部を、シークエンシングのために、MUSC DNA
Core Facilityへ、元のフォワードおよびリバースPCRプライマーと共に提出した。各産
物の残りを、XbaIおよびSalI（New England Biolabs）で消化し、哺乳動物発現ベクター
中への続くサブクローンニングのために、XbaI/SalI消化したpSP73プラスミド（Promega,
# P2221）中にクローンニングした。フォワードおよびリバースDNA配列をVector NTI（I
nvitrogen）ALIGN機能を使用して整列させ、組み合わせた修正配列を生成した。これらを
VBASE2オンラインソフトウェア（Retter et al., 2005）を使用して分析した。この分析
の結果を図35A〜35Eに示す。配列ナンバリングおよびモチーフ整列化をKabatスタンダー
ドに従って実施した（Johnson and Wu, 2000）。E3A5（SEQ ID NO：16および17）はVL遺
伝子セグメントIGLV063およびJLセグメントIGLJ3*02を有し、生殖系列の配列との相同性
はそれぞれ99%および100%であった（図35A）。C7F6（SEQ ID NO：19および20）はVL遺伝
子セグメントIGLV067およびJLセグメントIGLJ1*01を有し、生殖系列の配列との相同性は
それぞれ99%および100%であった（図35B）。E3A5（SEQ ID NO：22および23）はVH遺伝子
セグメントIGHV157、DHセグメントIGHD4-17*1、およびJHセグメントIGHJ3*02を有し、生
殖系列の配列との相同性はそれぞれ90%、93%、および96%であった（図35C）。C7F6（SEQ
ID NO：25および26）はVH遺伝子セグメントIGHV220、DHセグメントIGHD2-2*03、およびJH
セグメントIGHJ6*02を有し、生殖系列の配列との相同性はそれぞれ90%、93%、および96%
であった（図35D）。C7F6およびE3A5の両方についての軽鎖および重鎖の相補性決定領域
を図35Eに描写している（SEQ ID NO：28、29、30、および31）。
実施例3 - SEB、SEC-2、PLGF、およびリシンB鎖と反応性のモノクローナル抗体を分泌す
るヒトB細胞を産生するための材料および方法
不死化扁桃腺レパートリーの作製
濃縮EBVストックの生成および扁桃腺組織からのB細胞の調製を実施例1および2に記載し
ている。これらの方法は変更されていない。EBV不死化B細胞の分化誘導のために、本発明
者らは、先に記載したとおりに、可溶性CD40リガンド（5ng/ml）、BAFF（10ng/ml）、お
よびヤギ抗ヒトIgM F（ab'）2（1.62ng/ml）を含む10% FBS（Hyclone）を添加した完全RP
MI培地（Gibco）を使用した。
ELISA分析のためのサンプル回収
サンプル培養上清の回収およびELISAによる抗原反応性についてのスクリーニングを以
下のとおりに改変している。培養上清を、96ウェルプレートの対応するウェル中に、形質
導入後10〜14日目に各ウェルから100μl回収し、一定分量をプールし（各プレートの全ウ
ェルからの30μlの上清）、抗原反応性についての特異的ELISAによりスクリーニングした
。培養上清を、CD40L、BAFF、および抗ヒトIgM（Fab'）2を含む100μlの新鮮RPMI培地と
交換した。抗原反応性がプールされたウェル中で検出された場合、プールに寄与する個々
のウェルの各々を5つの新しいウェルに分割し、培養物の生存を保存し、陽性ウェルの同
一性を追加のELISA実験により確認した。ひとたび特定抗原に反応性のIgGを含む個々のウ
ェルが、迅速スクリーニング戦略を使用して、扁桃腺レパートリーにおいて同定されてい
れば、そのウェルからの細胞をカウントし、その50〜80%を96ウェルプレート中にサブク
ローンニングし（約500〜1000個細胞/ウェル、カウントに依存する）、残りを凍結した。
7〜10日後、上清を上に概説したとおりに回収し、迅速スクリーニング分析を繰り返した
。これに、2つの追加ラウンドの限界希釈サブクローンニングおよびスクリーニングが続
いた。クローン性は、最低希釈時に、クローンが96ウェルプレートのウェルの30%未満で
得られ、プレートのすべてのクローンが特定抗原に反応性のIgGを産生した場合に想定し
た。
SEB ELISA
テスト抗原のアッセイプレートへの結合
前日に、1X結合バッファー（20mM Tris-Cl pH 8.5）にSEB抗原（BT202redおよびビオチ
ン化BT202 B、Toxin Technologies, Inc.）を5μg/mL加える。使用するバッファーの量は
、50μLバッファー/ウェルで5mL/96ウェルプレートである。注：SEB/SEC2ボックスにおい
て鍵の掛った80℃フリーザー中に保存されたSEB抗原。各々の一定分量0.5μg/μL SEBを
個々に標識する。増加順に一定分量を使用する。一定分量の解凍および使用時、IBCノー
ト中にSEB毒素ログと共に使用を記録する。マルチチャネルピペッターを使用し、50μL/
ウェルの抗原結合バッファーミックスを非無菌平底96ウェルプレート（CoStar EIA/RIAプ
レート、フタ無し96ウェルEasy Wash, prod #3369を使用する）のテストウェルに加える
。対照バックグラウンドウェルについて、50μLの1X結合バッファー（抗原なし）を加え
る。プレートを付着性プレートフィルムで覆い、4℃で一晩置く。
ELISAアッセイ
20℃のフリーザーからアッセイのために必要な任意の上清サンプルを取り出し、室温で
放置して解凍する。プレート洗浄機（Wellwash 4 Mk2）を以下のとおりに準備する：コン
トロールカードを機械の右側に挿入し、機械をオンにする。カードのパラメーターが以下
のとおりに設定されていることを確かめること：Dials: SoakX0.5min=0、Pause＝0、Wash
es=3、VolumeX50μL=4; Toggles: single、12way、plate、stepoff、wash HI、dry、F1 o
ff、F2 off、F dry。廃棄物が存在する場合、廃棄物容器を空にする。dH2O容器を1X TBST
容器と交換する。開始前に少なくとも500mL/プレートのTBSTが容器中にあることを確認す
ること。＜PRIME＞ボタンを押して、システムからdH2Oを流す。「Wash Plate」を置き、
＜4＞列ボタン次に＜START＞ボタンを押すことによりシステムを洗浄する。プレート洗浄
機はプレートの最初の半分を3回洗浄し、次にプレートを吸引して乾燥させておくべきで
ある。
ブロッキング
付着性プレートフィルムを洗浄すべきプレートから取り外し、洗浄機に置く。プレート
を3回洗浄する（＜8＞次に＜START＞を押す）。洗浄後、残りのTBSTをプレートから素早
く振って乾かす（以降、各洗浄後にこれをする）。マルチチャネルピペッターを使用して
100μlのブロッキング溶液を各ウェル中にピペットで加える。プレートを付着性プレート
フィルムで覆い、室温で1時間放置する。
サンプル結合
96ウェルプレートからの上清のサンプルを使用する場合、解凍したサンプルプレートを
2K rpm/2分/室温での遠心分離において短時間スピンする。任意の上清サンプルを必要に
応じて希釈する。希釈するためにブロッキング溶液を使用し、100μLの希釈サンプルを1
ウェル当たりに加えることができる。バックグラウンド対照での2通りのアッセイのため
に、少なくとも400μLの希釈サンプルが必要になりうる。ブロッキングしたプレートを3
回洗浄する。サンプルを、プレート図表に従い、100μLのサンプル/ウェルを使用してピ
ペットで加える。必要に応じて、（+）および（-）対照をプレートに加える（例、SEBア
ッセイのためのブロッキングバッファー中のマウスα-SEBモノクローナル抗体の1：5000
希釈）。ブランクウェルには100μLのブロッキング溶液が加えられている。プレートを付
着性プレートフィルムで覆い、450rpmで1時間に設定したプレートシェーカーに置く。複
数のプレートを振盪するために、パラフィルムの細片を、添加前に、プレートスタックの
周りに巻く。
2°抗体結合
二次抗体の希釈物を作製する。ブロッキング溶液および適切な希釈率の適切な抗体を使
用する。1ウェル当たり100μLが必要であり、そのため1プレート当たり10mLが必要になり
うる。［α-ヒトIgG 2°Abについて、ヤギα-ヒトIgG抗体を1：10,000希釈で使用する（1
μL 2°Ab/10mLブロッキング溶液）。陽性対照マウスα-SEBモノクローナル抗体について
、ヤギ抗マウスIgG-AP 2°Abの1：10,000希釈を使用する］。サンプル結合後、シェーカ
ーを取り外し、付着性フィルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを3から4
に変更し、プレートを4回洗浄する。100μLの二次抗体を各ウェル中にピペットで加える
。プレートを新しい付着性フィルムで密封し、450rpmのプレートシェーカー上に1時間置
く。
基質の添加
2°Ab結合が完了する5分前に、反応物を調製する。1枚のプレートについて、2mLの5x基
質バッファーを8mLのdiH2Oおよび2つの反応錠剤と15mL培養チューブ中で混合する。錠剤
が完全に溶解するまで反転により混合する。プレートをミキサーから取り外し、付着性フ
ィルムを取り外す。毒素を封じ込めるため、すべての手順をドラフト中で実施すべきであ
る。バイオハザード廃棄物容器中の処分すべきすべての廃棄物および消耗品をオートクレ
ーブする。液体廃棄物は処分前に10%漂白剤で処理する。アッセイ中には適切な防御装備
（手袋および安全ゴーグル）を使用する。使用前にSEB特定IBC規制を参照すること。完了
までの時間：プレートコーティング（アッセイの前日）：30分間、ELISAアッセイ：4〜8
時間＋現像時間（30分間〜24時間）。
SEC2 ELISA
テスト抗原のアッセイプレートへの結合
前日に、1X結合バッファー（20mM Tris-Cl pH 8.5）にSEC-2抗原を5μg/mL加える。使
用するバッファーの量は、50μLバッファー/ウェルで5mL/96ウェルプレートである。注：
SEB/SEC2ボックスにおいて鍵の掛った80℃フリーザー中に保存されたSEC-2抗原。各々の
一定分量0.5μg/μL SEC-2を個々に標識する。増加順に一定分量を使用する。一定分量の
解凍および使用時、IBCノート中にSEC-2毒素ログと共に使用を記録する。マルチチャネル
ピペッターを使用し、50μL/ウェルの抗原結合バッファーミックスを非無菌平底96ウェル
プレート（CoStar EIA/RIAプレート、フタ無し96ウェルEasy Wash, prod #3369を使用す
る）のテストウェルに加える。対照バックグラウンドウェルについて、50μLの1X結合バ
ッファー（抗原なし）を加える。プレートを付着性プレートフィルムで覆い、4℃で一晩
置く。
ELISAアッセイ
20℃のフリーザーからアッセイのために必要な任意の上清サンプルを取り出し、室温で
放置して解凍する。プレート洗浄機（Wellwash 4 Mk2）を以下のとおりに準備する：コン
トロールカードを機械の右側に挿入し、機械をオンにする。カードのパラメーターが以下
のとおりに設定されていることを確かめること：Dials: SoakX0.5min=0、Pause=0、Washe
s=3、VolumeX50μL=4; Toggles: single、12way、plate、stepoff、wash HI、dry、F1 of
f、F2 off、F dry。廃棄物が存在する場合、廃棄物容器を空にする。dH2O容器を1X TBST
容器と交換する。開始前に少なくとも500mL/プレートのTBSTが容器中にあることを確認す
ること。＜PRIME＞ボタンを押して、システムからdH2Oを流す。「Wash Plate」を置き、
＜4＞列ボタン次に＜START＞ボタンを押すことによりシステムを洗浄する。プレート洗浄
機はプレートの最初の半分を3回洗浄し、次にプレートを吸引して乾燥させておくべきで
ある。
ブロッキング
付着性プレートフィルムを洗浄すべきプレートから取り外し、洗浄機に置く。プレート
を3回洗浄する（＜8＞次に＜START＞を押す）。洗浄後、残りのTBSTをプレートから素早
く振って乾かす（以降、各洗浄後にこれをする）。マルチチャネルピペッターを使用して
100μlのブロッキング溶液を各ウェル中にピペットで加える。プレートを付着性プレート
フィルムで覆い、室温で1時間放置する。
サンプル結合
96ウェルプレートからの上清のサンプルを使用する場合、解凍したサンプルプレートを
2K rpm/2分/室温での遠心分離において短時間スピンする。任意の上清サンプルを必要に
応じて希釈する。希釈するためにブロッキング溶液を使用し、100μLの希釈サンプルを1
ウェル当たりに加えることができる。バックグラウンド対照での2通りのアッセイのため
に、少なくとも400μLの希釈サンプルが必要になりうる。ブロッキングしたプレートを3
回洗浄する。サンプルを、プレート図表に従い、100μLのサンプル/ウェルを使用してピ
ペットで加える。必要に応じて、（+）および（-）対照をプレートに加える（例、SEC-2
アッセイのためのブロッキングバッファー中のマウスα-SEC-2モノクローナル抗体の1：5
000希釈）。ブランクウェルには100μLのブロッキング溶液が加えられている。プレート
を付着性プレートフィルムで覆い、450rpmで1時間に設定したプレートシェーカーに置く
。複数のプレートを振盪するために、パラフィルムの細片を、添加前に、プレートスタッ
クの周りに巻く。
2°抗体結合
二次抗体の希釈物を作製する。ブロッキング溶液および適切な希釈率の適切な抗体を使
用する。100μLが1ウェル当たりに必要であり、そのため10mLが1プレート当たりに必要に
なりうる。［α-ヒトIgG 2°Abについて、ヤギα-ヒトIgG抗体を1：10,000希釈で使用す
る（1μL 2°Ab/10mLブロッキング溶液）。陽性対照マウスα-SEC-2モノクローナル抗体
について、ヤギα-マウスIgG-AP 2°Abの1：10000希釈を使用する］。サンプル結合後、
シェーカーを取り外し、付着性フィルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアル
を3から4に変更し、プレートを4回洗浄する。100μLの二次抗体を各ウェル中にピペット
で加える。プレートを新しい付着性フィルムで密封し、450rpmのプレートシェーカー上に
1時間置く。
基質の添加
2°Ab結合が完了する5分前、反応物を調製する。1枚のプレートについて、2mLの5x基質
バッファーを8mLのdiH2Oおよび2つの反応錠剤と15mL培養チューブ中で混合する。錠剤が
完全に溶解するまで反転により混合する。プレートをミキサーから取り外し、付着性フィ
ルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを4から6に変更し、プレートを6回
洗浄する。100μLの調製反応物をプレートの各ウェルに加える。新しい付着性フィルムを
プレートに置き、プレートリーダー下のデスクの引き出しにプレートを置く。引き出しに
プレートを放置し、無色から黄色への色の変化をモニターする。現像のための時間は、極
めて強い反応での30分間から非常に弱い反応での6時間まででありうる。色が一部のウェ
ルで顕著である場合、および、溶液が飽和する前に、プレートを読むことが理想的である
。
プレートリーディング
プレートが定量できる状態になった際、プレートリーダーがオンになっており、MSS2.2
ソフトウェアのためのScanIt REがオープンになっていることを確かめること。適切なプ
レートリーディングプログラムを開き、適宜、実行を設定する。カバーフィルムを取り付
けるべきプレートから取り外す。プレートを機械に取り付け、スキャンする。スキャンの
結果を観察し（Photometric and Statistics）、追加のスキャンが必要か否かを決定する
。スキャニングが完了したら、プレートを取り外し、カバーフィルムを交換し、引き出し
に一晩置く。すべてのスキャンが完了した後、プレートリーダーをオフにする。
試薬およびバッファー：
抗原：Staph Entertoxin C-2 Toxin Technologies, Inc. (CT222red)
陽性対照抗体：抗SEC g1マウスMab：Toxin Technologies, Inc.(MC165)
結合バッファー（1X）20mM Tris-Cl、pH 8.5
TBSTバッファー（1X）50mM Tris、0.9% NaCl（w:v）、0.1% Tween-20（v:v）、HClでpH
7.5にする。5X TBSストックからdiH2Oを使用して希釈し、Tween-20を加え、撹拌子を使
用して数分間混合する。それをガラスボトルまたはTBST Wellwash容器中で混合できる。
撹拌子を容器中に残す。
ブロッキング溶液（1X）Pierce SuperBlockドライブレンド、TBSブロッキングバッファ
ー（prod #0037545）。1パケットのバッファー粉末を200mLのdiH2Oに加える。溶解するま
で混合する。4℃で保存する。毒素を封じ込めるため、すべての手順は、ドラフト中で実
施すべきである。バイオハザード廃棄物容器中の処分すべきすべての廃棄物および消耗品
をオートクレーブする。液体廃棄物は処分前に10%漂白剤で処理する。アッセイ中には適
切な防御装備（手袋および安全ゴーグル）を使用する。使用前にSEC特定IBC規制を参照す
ること。
完了までの時間：プレートコーティング（アッセイの前日）：30分間、ELISAアッセイ
：4〜8時間＋現像時間（30分間〜24時間）
PLGF ELISA
テスト抗原のアッセイプレートへの結合
前日に、1X結合バッファー（1x DPBS、Gibco 14190）にPLGF抗原を2μg/mL加える。使
用するバッファーの量は、50μLバッファー/ウェルで5mL/96ウェルプレートである。マル
チチャネルピペッターを使用し、50μL／ウェルの抗原結合バッファーミックスを非無菌
平底96ウェルプレート（CoStar EIA/RIAプレート、フタ無し96ウェルEasy Wash, prod #3
369を使用する）のテストウェルに加える。対照バックグラウンドウェルについて、50μL
の1X結合バッファー（抗原なし）を加える。プレートを付着性プレートフィルムで覆い、
4℃で一晩置く。
ELISAアッセイ
20℃のフリーザーからアッセイのために必要な任意の上清サンプルを取り出し、室温で
放置して解凍する。プレート洗浄機（Wellwash 4 Mk2）を以下のとおりに準備する：コン
トロールカードを機械の右側に挿入し、機械をオンにする。カードのパラメーターが以下
のとおりに設定されていることを確かめること：Dials: SoakX0.5min=0、Pause=O、Washe
s=3、VolumeX50μL=4; Toggles: single、12way、plate、stepoff、wash HI、dry、F1 of
f、F2 off、F dry。廃棄物が存在する場合、廃棄物容器を空にする。dH2O容器を1X TBST
容器と交換する。開始前に少なくとも500mL/プレートのTBSTが容器中にあることを確認す
ること。＜PRIME＞ボタンを押して、システムからdH2Oを流す。「Wash Plate」を置き、
＜4＞列ボタン次に＜START＞ボタンを押すことによりシステムを洗浄する。プレート洗浄
機はプレートの最初の半分を3回洗浄し、次にプレートを吸引して乾燥させておくべきで
ある。
ブロッキング
付着性プレートフィルムを洗浄すべきプレートから取り外し、洗浄機に置く。プレート
を3回洗浄する（＜8＞次に＜START＞を押す）。洗浄後、残りのTBSTをプレートから素早
く振って乾かす（以降、各洗浄後にこれをする）。マルチチャネルピペッターを使用して
100μlのブロッキング溶液を各ウェル中にピペットで加える。プレートを付着性プレート
フィルムで覆い、室温で1時間放置する。
サンプル結合
96ウェルプレートからの上清のサンプルを使用する場合、解凍したサンプルプレートを
2K rpm/2分/室温での遠心分離において短時間スピンする。任意の上清サンプルを必要に
応じて希釈する。希釈するためにブロッキング溶液を使用し、100μLの希釈サンプルを1
ウェル当たりに加えることができる。バックグラウンド対照での2通りのアッセイのため
に、少なくとも400μLの希釈サンプルが必要になりうる。ブロッキングしたプレートを3
回洗浄する。サンプルを、プレート図表に従い、100μLのサンプル／ウェルを使用してピ
ペットで加える。必要に応じて、（+）および（-）対照をプレートに加える（例、PLGFア
ッセイのためのブロッキングバッファー中のマウスα-ヒトPLGFモノクローナル抗体の1：
2000希釈）。ブランクウェルには100μLのブロッキング溶液が加えられている。プレート
を付着性プレートフィルムで覆い、450rpmで1時間に設定したプレートシェーカーに置く
。複数のプレートを振盪するために、パラフィルムの細片を、添加前に、プレートスタッ
クの周りに巻く。
2°抗体結合
二次抗体の希釈物を作製する。ブロッキング溶液および適切な希釈率の適切な抗体を使
用する。100μLが1ウェル当たりに必要であり、そのため10mLが1プレート当たりに必要に
なりうる。α-ヒトIgG 2°Abについて、ヤギα-ヒトIgG抗体を1：10,000希釈で使用する
（1μL 2°Ab/10mLブロッキング溶液）。陽性対照マウスα-ヒトPLGFモノクローナル抗体
について、ヤギα-マウスIgG-AP 2°Abの1：10000希釈を使用する］サンプル結合後、シ
ェーカーを取り外し、付着性フィルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを
3から4に変更し、プレートを4回洗浄する。100μLの二次抗体を各ウェル中にピペットで
加える。プレートを新しい付着性フィルムで密封し、450rpmのプレートシェーカー上に1
時間置く。
基質の添加
2°Ab結合が完了する5分前、反応物を調製する。1枚のプレートについて、2mLの5x基質
バッファーを8mLのdiH2Oおよび2つの反応錠剤と15mL培養チューブ中で混合する。錠剤が
完全に溶解するまで反転により混合する。プレートをミキサーから取り外し、付着性フィ
ルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを4から6に変更し、プレートを6回
洗浄する。100μLの調製反応物をプレートの各ウェルに加える。新しい付着性フィルムを
プレートに置き、プレートリーダー下のデスクの引き出しにプレートを置く。引き出しに
プレートを放置し、無色から黄色への色の変化をモニターする。現像のための時間は、極
めて強い反応での30分間から非常に弱い反応での6時間まででありうる。色が一部のウェ
ルで顕著である場合、および、溶液が飽和する前に、プレートを読むことが理想的である
。
プレートリーディング
プレートが定量できる状態になった際、プレートリーダーがオンになっており、MSS2.2
ソフトウェアのためのScanIt REがオープンになっていることを確かめること。適切なプ
レートリーディングプログラムを開き、適宜、実行を設定する。カバーフィルムを取り付
けるプレートから取り外す。プレートを機械に取り付け、スキャンする。スキャンの結果
を観察し（Photometric and Statistics）、追加のスキャンが必要か否かを決定する。ス
キャニングが完了したら、プレートを取り外し、カバーフィルムを交換し、引き出しに一
晩置く。すべてのスキャンが完了した後、プレートリーダーをオフにする。
試薬およびバッファー：
抗原：組換えヒトPLGF PeproTech (100-06)
陽性対照抗体：マウス抗ヒトPLGF Mab：R&D Systems (MAB264)
結合バッファー（1X）1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Gibco (14190)
TBSTバッファー（1X）50mM Tris、0.9% NaCｌ（w:v）、0.1% Tween-20（v:v）、HClでp
H 7.5にする。5X TBSストックからdiH2Oを使用して希釈し、Tween-20を加え、撹拌子を使
用して数分間混合する。それをガラスボトルまたはTBST Wellwash容器中で混合できる。
撹拌子を容器中に残す。
ブロッキング溶液（1X）Pierce SuperBlockドライブレンド、TBSブロッキングバッファ
ー（prod #0037545）。1パケットのバッファー粉末を200mLのdiH2Oに加える。溶解するま
で混合する。4℃で保存する。長期保存（>1週間）のために、100mgアジ化ナトリウム/200
mLを加える。
基質（1X）Pierceホスファターゼ基質キット（prod #37620）。1枚のプレートについて
、10mLを以下のとおりに15mL培養チューブ中に作製する：2mLの5X DEA基質バッファー、8
mLのdiH2O、2つのPNPP錠剤。錠剤が完全に溶解するまで反転により混合する。
完了までの時間：プレートコーティング（アッセイの前日）：30分間、ELISAアッセイ
：4〜8時間＋現像時間（30分間〜24時間）
リシンB ELISA
テスト抗原のアッセイプレートへの結合
前日に、1X結合バッファー（1x DPBS、Gibco 14190）にリシンB鎖抗原を5μg/mL加える
。使用するバッファーの量は、50μLバッファー/ウェルで5mL/96ウェルプレートである。
マルチチャネルピペッターを使用し、50μL/ウェルの抗原結合バッファーミックスを非無
菌平底96ウェルプレート（CoStar EIA/RIAプレート、フタ無し96ウェルEasy Wash, prod
#3369を使用する）のテストウェルに加える。対照バックグラウンドウェルについて、50
μLの1X結合バッファー（抗原なし）を加える。プレートを付着性プレートフィルムで覆
い、4℃で一晩置く。
ELISAアッセイ
20℃のフリーザーからアッセイのために必要な任意の上清サンプルを取り出し、室温で
放置して解凍する。プレート洗浄機（Wellwash 4 Mk2）を以下のとおりに準備する：コン
トロールカードを機械の右側に挿入し、機械をオンにする。カードのパラメーターが以下
のとおりに設定されていることを確かめること：Dials: SoakX0.5min=0、Pause=0、Washe
s=3、VolumeX50μL=4; Toggles: single、12way、plate、stepoff、wash HI、dry、F1 of
f、F2 off、F dry。廃棄物が存在する場合、廃棄物容器を空にする。dH2O容器を1X TBST
容器と交換する。開始前に少なくとも500mL/プレートのTBSTが容器中にあることを確認す
ること。＜PRIME＞ボタンを押して、システムからdH2Oを流す。「Wash Plate」を置き、
＜4＞列ボタン次に＜START＞ボタンを押すことによりシステムを洗浄する。プレート洗浄
機はプレートの最初の半分を3回洗浄し、次にプレートを吸引して乾燥させておくべきで
ある。
ブロッキング
付着性プレートフィルムを洗浄すべきプレートから取り外し、洗浄機に置く。プレート
を3回洗浄する（＜8＞次に＜START＞を押す）。洗浄後、残りのTBSTをプレートから素早
く振って乾かす（以降、各洗浄後にこれをする）。マルチチャネルピペッターを使用して
100μlのブロッキング溶液を各ウェル中にピペットで加える。プレートを付着性プレート
フィルムで覆い、室温で1時間放置する。
サンプル結合
96ウェルプレートからの上清のサンプルを使用する場合、解凍したサンプルプレートを
2K rpm/2分/室温での遠心分離において短時間スピンする。任意の上清サンプルを必要に
応じて希釈する。希釈するためにブロッキング溶液を使用し、100μLの希釈サンプルを1
ウェル当たりに加えることができる。バックグラウンド対照での2通りのアッセイのため
に、少なくとも400μLの希釈サンプルが必要になりうる。ブロッキングしたプレートを3
回洗浄する。サンプルを、プレート図表に従い、100μLのサンプル/ウェルを使用してピ
ペットで加える。必要に応じて、（+）および（-）対照をプレートに加える（例、リシン
アッセイのためのブロッキングバッファー中のマウスα-リシンBモノクローナル抗体の1
：5000希釈）。ブランクウェルには100μLのブロッキング溶液が加えられている。プレー
トを付着性プレートフィルムで覆い、450rpmで1時間に設定したプレートシェーカーに置
く。複数のプレートを振盪するために、パラフィルムの細片を、添加前に、プレートスタ
ックの周りに巻く。
2°抗体結合
二次抗体の希釈物を作製する。ブロッキング溶液および適切な希釈率の適切な抗体を使
用する。1ウェル当たり100μLが必要であり、そのため1プレート当たり10mLが必要になり
うる。［α-ヒトIgG 2°Abについて、ヤギα-ヒトIgG抗体を1：10,000希釈で使用する（1
μL 2°Ab/10mLブロッキング溶液）。陽性対照マウスα-リシンBモノクローナル抗体につ
いて、ヤギα-マウスIgG-AP 2°Abの1：10000希釈を使用する］サンプル結合後、シェー
カーを取り外し、付着性フィルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを3か
ら4に変更し、プレートを4回洗浄する。100μLの二次抗体を各ウェル中にピペットで加え
る。プレートを新しい付着性フィルムで密封し、450rpmのプレートシェーカー上に1時間
置く。
基質の添加
2°Ab結合が完了する5分前、反応物を調製する。1枚のプレートについて、2mLの5x基質
バッファーを8mLのdiH2Oおよび2つの反応錠剤と15mL培養チューブ中で混合する。錠剤が
完全に溶解するまで反転により混合する。プレートをミキサーから取り外し、付着性フィ
ルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを4から6に変更し、プレートを6回
洗浄する。100μLの調製反応物をプレートの各ウェルに加える。新しい付着性フィルムを
プレートに置き、プレートリーダー下のデスクの引き出しにプレートを置く。引き出しに
プレートを放置し、無色から黄色への色の変化をモニターする。現像のための時間は、極
めて強い反応での30分間から非常に弱い反応での6時間まででありうる。色が一部のウェ
ルで顕著である場合、および、溶液が飽和する前に、プレートを読むことが理想的である
。
プレートリーディング
プレートが定量できる状態になった際、プレートリーダーがオンになっており、MSS2.2
ソフトウェアのためのScanIt REがオープンになっていることを確かめること。適切なプ
レートリーディングプログラムを開き、適宜、実行を設定する。カバーフィルムを取り付
けるプレートから取り外す。プレートを機械に取り付け、スキャンする。スキャンの結果
を観察し（Photometric and Statistics）、追加のスキャンが必要か否かを決定する。ス
キャニングが完了したら、プレートを取り外し、カバーフィルムを交換し、引き出しに一
晩置く。すべてのスキャンが完了した後、プレートリーダーをオフにする。
試薬およびバッファー：
抗原：リシンB鎖Vector Laboratories (L-1290)
陽性対照抗体：マウス抗リシンB Mab：Santa Cruz Biotechnologies (sc-52197)
結合バッファー（1X）1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Gibco (14190)
TBSTバッファー（1X）50mM Tris、0.9% NaCl（w:v）、0.1% Tween-20（v:v）、HClでpH
7.5にする。5X TBSストックからdiH2Oを使用して希釈し、Tween-20を加え、撹拌子を使用
して数分間混合する。それをガラスボトルまたはTBST Wellwash容器中で混合できる。撹
拌子を容器中に残す。
ブロッキング溶液（1X）Pierce SuperBlockドライブレンド、TBSブロッキングバッファ
ー（prod #0037545）。1パケットのバッファー粉末を200mLのdiH2Oに加える。溶解するま
で混合する。4℃で保存する。長期保存（>1週間）のために、100mgアジ化ナトリウム/200
mLを加える。
基質（1X）Pierceホスファターゼ基質キット（prod #37620）。1枚のプレートについて
、10mLを以下のとおりに15mL培養チューブ中に作製する：2mLの5X DEA基質バッファー、8
mLのdiH2O、2つのPNPP錠剤。錠剤が完全に溶解するまで反転により混合する。
完了までの時間：プレートコーティング（アッセイの前日）：30分間、ELISAアッセイ
：4〜8時間＋現像時間（30分間〜24時間）
IL6 ELISA
テスト抗原のアッセイプレートへの結合
前日に、1X結合バッファー（1x DPBS、Gibco 14190）にIL-6抗原を5μg/mL加える。使
用するバッファーの量は、50μLバッファー/ウェルで5mL/96ウェルプレートである。マル
チチャネルピペッターを使用し、50μL/ウェルの抗原結合バッファーミックスを非無菌平
底96ウェルプレート（CoStar EIA/RIAプレート、フタ無し96ウェルEasy Wash, prod #336
9を使用する）のテストウェルに加える。対照バックグラウンドウェルについて、50μLの
1X結合バッファー（抗原なし）を加える。プレートを付着性プレートフィルムで覆い、4
℃で一晩置く。
ELISAアッセイ
20℃のフリーザーからアッセイのために必要な任意の上清サンプルを取り出し、室温で
放置して解凍する。プレート洗浄機（Wellwash 4 Mk2）を以下のとおりに準備する：コン
トロールカードを機械の右側に挿入し、機械をオンにする。カードのパラメーターが以下
のとおりに設定されていることを確かめること：Dials: SoakX0.5min=0、Pause=0、Washe
s=3、VolumeX50μL=4; Toggles: single、12way、plate、stepoff、wash HI、dry、F1 of
f、F2 off、F dry。廃棄物が存在する場合、廃棄物容器を空にする。dH2O容器を1X TBST
容器と交換する。開始前に少なくとも500mL/プレートのTBSTが容器中にあることを確認す
ること。＜PRIME＞ボタンを押して、システムからdH2Oを流す。「Wash Plate」を置き、
＜4＞列ボタン次に＜START＞ボタンを押すことによりシステムを洗浄する。プレート洗浄
機はプレートの最初の半分を3回洗浄し、次にプレートを吸引して乾燥させておくべきで
ある。
ブロッキング
付着性プレートフィルムを洗浄すべきプレートから取り外し、洗浄機に置く。プレート
を3回洗浄する（＜8＞次に＜START＞を押す）。洗浄後、残りのTBSTをプレートから素早
く振って乾かす（以降、各洗浄後にこれをする）。マルチチャネルピペッターを使用して
100μlのブロッキング溶液を各ウェル中にピペットで加える。プレートを付着性プレート
フィルムで覆い、室温で1時間放置する。
サンプル結合
96ウェルプレートからの上清のサンプルを使用する場合、解凍したサンプルプレートを
2K rpm/2分/室温での遠心分離において短時間スピンする。任意の上清サンプルを必要に
応じて希釈する。希釈するためにブロッキング溶液を使用し、100μLの希釈サンプルを1
ウェル当たりに加えることができる。バックグラウンド対照での2通りのアッセイのため
に、少なくとも400μLの希釈サンプルが必要になりうる。ブロッキングしたプレートを3
回洗浄する。サンプルを、プレート図表に従い、100μLのサンプル/ウェルを使用してピ
ペットで加える。必要に応じて、（+）および（-）対照をプレートに加える（例、IL-6ア
ッセイのためのブロッキングバッファー中のマウスα-ヒトIL-6モノクローナル抗体の1：
5000希釈）。ブランクウェルには100μLのブロッキング溶液が加えられている。プレート
を付着性プレートフィルムで覆い、450rpmで1時間に設定したプレートシェーカーに置く
。複数のプレートを振盪するために、パラフィルムの細片を、添加前に、プレートスタッ
クの周りに巻く。
2°抗体結合
二次抗体の希釈物を作製する。ブロッキング溶液および適切な希釈率の適切な抗体を使
用する。100μLが1ウェル当たりに必要であり、そのため10mLが1プレート当たりに必要に
なりうる。［α-ヒトIgG 2°Abについて、ヤギα-ヒトIgG抗体を1：10,000希釈で使用す
る（1μL 2°Ab/10mLブロッキング溶液）。陽性対照マウスα-ヒトIL-6モノクローナル抗
体について、ヤギα-マウスIgG-AP 2°Abの1：10000希釈を使用する］サンプル結合後、
シェーカーを取り外し、付着性フィルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアル
を3から4に変更し、プレートを4回洗浄する。100μLの二次抗体を各ウェル中にピペット
で加える。プレートを新しい付着性フィルムで密封し、450rpmのプレートシェーカー上に
1時間置く。
基質の添加
2°Ab結合が完了する5分前、反応物を調製する。1枚のプレートについて、2mLの5x基質
バッファーを8mLのdiH2Oおよび2つの反応錠剤と15mL培養チューブ中で混合する。錠剤が
完全に溶解するまで反転により混合する。プレートをミキサーから取り外し、付着性フィ
ルムを取り外す。コントロールカードの洗浄ダイアルを4から6に変更し、プレートを6回
洗浄する。100μLの調製反応物をプレートの各ウェルに加える。新しい付着性フィルムを
プレートに置き、プレートリーダー下のデスクの引き出しにプレートを置く。引き出しに
プレートを放置し、無色から黄色への色の変化をモニターする。現像のための時間は、極
めて強い反応での30分間から非常に弱い反応での6時間まででありうる。色が一部のウェ
ルで顕著である場合、および、溶液が飽和する前に、プレートを読むことが理想的である
。
プレートリーディング
プレートが定量できる状態になった際、プレートリーダーがオンになっており、MSS2.2
ソフトウェアのためのScanIt REがオープンになっていることを確かめること。適切なプ
レートリーディングプログラムを開き、適宜、実行を設定する。カバーフィルムを取り付
けるプレートから取り外す。プレートを機械に取り付け、スキャンする。スキャンの結果
を観察し（Photometric and Statistics）、追加のスキャンが必要か否かを決定する。ス
キャニングが完了したら、プレートを取り外し、カバーフィルムを交換し、引き出しに一
晩置く。すべてのスキャンが完了した後、プレートリーダーをオフにする。
試薬およびバッファー：
抗原：組換えヒトIL-6 GenScript (Z00372-1mg)
陽性対照抗体：マウス抗ヒトIL-6 Mab：PeproTech (500-M06)
結合バッファー（1X）1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Gibco(14190)
TBSTバッファー（1X）50mM Tris、0.9% NaCl（w:v）、0.1% Tween-20（v:v）、HClでpH
7.5にする。5X TBSストックからdiH2Oを使用して希釈し、Tween-20を加え、撹拌子を使
用して数分間混合する。それをガラスボトルまたはTBST Wellwash容器中で混合できる。
撹拌子を容器中に残す。
ブロッキング溶液（1X）Pierce SuperBlockドライブレンド、TBSブロッキングバッファ
ー（prod #0037545）。1パケットのバッファー粉末を200mLのdiH2Oに加える。溶解するま
で混合する。4℃で保存する。長期保存（>1週間）のために、100mgアジ化ナトリウム／20
0mLを加える。
基質（1X）Pierceホスファターゼ基質キット（prod #37620）。1枚のプレートについて
、10mLを以下のとおりに15mL培養チューブ中に作製する：2mLの5X DEA基質バッファー、8
mLのdiH2O、2つのPNPP錠剤。錠剤が完全に溶解するまで反転により混合する。
完了までの時間：プレートコーティング（アッセイの前日）：30分間、ELISAアッセイ
：4〜8時間＋現像時間（30分間〜24時間）
実施例4 - SEB、SEC-2、PLGF、およびリシンB鎖と反応性のモノクローナル抗体を分泌す
るB細胞での結果
特定抗原と反応性のヒトIgGを検出するELISAの開発
SEB、SEC2、PLGF、リシンBサブユニット、またはIL6と反応性の抗体についての不死化
扁桃腺レパートリーをスクリーニングするために、本発明者らは酵素結合免疫吸着検定法
（ELISA）を開発した。各ELISAについて、特定抗原を最初にプレートに結合させ、そして
次にヒトIgGを含む不死化レパートリーからの細胞上清をウェルに適用した。非特異的IgG
を洗い流し、抗原特異的IgGを抗原コーティングしたウェルに結合させた。結合したIgGを
、次に、標識抗ヒトIgGで、発色基質（OD405nmでの吸光度が増加する）の存在下で検出し
、分光光度法により検出した。各ELISAで次が必要となった：1）プレートに結合した抗原
の量の最適化；2）検出抗体の最適化；3）バッファーの最適化；4）陽性対照として使用
したマウスモノクローナル抗体結合との比較。例として、工程3および4、バッファーの最
適化およびマウスモノクローナル抗体結合との比較（PLGF ELISAのために使用）を図36に
示す。類似の結果が各ELISAについて得られた。各々のための最適化条件を、材料および
方法のセクションにおいて詳細に記載した。
不死化扁桃腺レパートリーの作製
11の扁桃腺レパートリーを作製し、異なる抗原との反応性についてスクリーニングした
：TNSL-R、-S、-T、-V、-W、-X、-Y、-Z、-α、-β、-γ。各レパートリーが、10枚の96
ウェル丸底プレート中に蒔かれた7〜21×107個のEBV不死化細胞を含み、可溶性CD40リガ
ンド（5ng/ml）、BAFF（10ng/ml）、およびヤギ抗ヒトIgM F（ab'）2（1.62ng/ml）で分
化誘導された（「材料および方法」に記載）。各レパートリーの特徴のまとめを表7およ
び9に見出すことができる。また、以前に作製され、次に、液体窒素中で凍結保存されて
いた3つの不死化扁桃腺レパートリーを、解凍し、2枚の24ウェルプレート中で培養した：
TNSL-G、-H、-I（表7および9）。
(表7) SEBと反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞の単離に関するデー
タのまとめ
Figure 2016039813
Figure 2016039813
(表9) SEC-2と反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞の単離に関するデ
ータのまとめ
Figure 2016039813
不死化扁桃腺レパートリーのスクリーニング
11の扁桃腺レパートリー、および3つの解凍されたレパートリーを、SEB（表1）およびS
EC2（表7）への結合についてスクリーニングした。10の新しいレパートリー（TNSL-R、-S
、-V、-W、-X、-Y、-Z、-α、-β、-γ）、および3つの解凍されたレパートリーを、PLGF
結合についてスクリーニングした（表11）。9の新しいレパートリー（TNSL-R、-S、-V、-
W、-X、-Z、-α、-β、-γ）、および3つの解凍されたレパートリーを、リシンBサブユニ
ット結合についてスクリーニングした（表13）。4の新しいレパートリー（TNSL-R、-S、-
β、-γ）を、IL6結合についてスクリーニングした（表15）。より少ないレパートリーを
IL6についてスクリーニングした。その理由は、そのELISAを最適化するためにより長い時
間が必要であったからである。
(表11) PLGFと反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞の単離に関するデ
ータのまとめ
Figure 2016039813
(表13) リシンB鎖と反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞の単離に関
するデータのまとめ
Figure 2016039813
(表15) IL-6と反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞の単離に関するデ
ータのまとめ
Figure 2016039813
SEB反応性の不死化細胞株の単離
すべての11の新しい扁桃腺レパートリーについての培養上清を、SEB反応性について、
不死化に続く10dと18dの間にスクリーニングした（表7にまとめる）。反応性IgGを伴うウ
ェルを検出するために使用する迅速スクリーニング戦略の例を図37に示す。合計960ウェ
ルを含む10枚の96ウェルプレートからの扁桃腺レパートリーTNSL-X（TX）上清を、10枚の
プレートの各々の対応するウェル、例えばウェルA1プールからプールされた上清（図37A
）、および各プレートのウェルのすべてからのプールされた上清（プレートプール、図37
B）を含む2つのELISAでスクリーニングした。図37Aは、10枚のプレートの1つのウェルA8
およびH3中の細胞がSEBに反応性であることを示した。図37Bは、TXプレート2および4がSE
B反応性である細胞を含むことを示した。図37Cのこれらのデータを組み合わせると、本発
明者らは、TXプレート4および8のウェルA8およびH3をテストした。結果は、プレート8の
ウェルA8（TX-8A8）、およびプレート4のウェルH3（TX-4H3）が活性を含むことを示した
。これらのウェルは、このように一次サブクローンニング分析のために選んだ。表8に見
られるように、TX-8A8およびTX-4H3を、最初に3枚の各96ウェルプレート中に6/04/08にサ
ブクローンニングした（1,000個細胞／ウェルを含む）。
(表8) SEBと反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞のサブクローンニン
グのまとめ
Figure 2016039813
図38Bに見られるように、8日間の培養後、これらのプレートの各々がSEB反応性細胞を
含んだ。2週間の培養後、各プレートからの個々のウェルをSEB反応性についてテストした
（図40および図41）。最高の反応性を伴う3つのTX-4H3ウェル（TX-1E7、-3C6、-3D8、図4
0）を、6/23/08の二次ラウンドのサブクローンニングのために選び、ここで50個細胞／ウ
ェルを含む2枚のプレートを作製した（表8）。また、最高の反応性を伴う3つのTX-8A8ウ
ェル（TX-8A8-1C6、-3D7、-3F4、図41）を、6/23/08の二次ラウンドのサブクローンニン
グのために選び、ここで50個細胞／ウェルを含む2枚のプレートを作製した（表8）。細胞
を現在十分なレベルにまで増殖させ、個々のウェル中でSEB反応性IgGについてテストして
いる。表7および図38Aに見られるように、SEB反応性細胞を3つの他のレパートリー（TNSL
-R、-S、-V）において検出した。反応性細胞を含むウェル（TS-2B1、-8B12、TS-7C2、TR-
9D8、TV-6F7）をサブクローンニングし、反応性をTV-6F7プレートからの細胞において検
出したが、しかし、TS-8B12、TS-7C2、およびTR-9D8細胞株からでは失われていた（図38B
）。最高の反応性を伴う3つのTV6F7ウェル（TV-6F7-2H6、-3E2、-3E4、図39）を、6/23/0
8の二次ラウンドのサブクローンニングのために選び、ここで50個細胞/ウェルを含む2枚
のプレートを作製した（表8）。細胞を現在十分なレベルにまで増殖させ、個々のウェル
中でSEB反応性IgGについてテストしている。
SEC2反応性の不死化細胞株の単離
表9および図42に見られるように、SEC2反応性細胞を3つの扁桃腺レパートリー（TNSL-R
、-S、および-V）において検出した。反応性細胞を含むウェル（TR-10A4、TR-10E12、TS-
6C5、およびTV-bB2）をサブクローンニングし、反応性をTV-bB2プレートの3枚のうちの1
枚からの細胞において検出した（図43A）が、TR-10A4、TR-10E12、TS-6C5プレートからで
は失われていた（図42B）。最高の反応性を伴う2つのTV6F7ウェル（TVbB2 2E1、2F2、図4
3B）を、6/23/08の二次ラウンドのサブクローンニングのために選び、ここで50個細胞/ウ
ェルを含む2枚のプレートを作製した（表10）。
(表10) SEC2と反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞のサブクローンニ
ングのまとめ
Figure 2016039813
PLGF反応性の不死化細胞株の単離
表11ならびに図44および図46に見られるように、PLGF反応性細胞を2つの扁桃腺レパー
トリー（TNSL-W、および-Z）において検出した。反応性細胞を含むウェル（TW-1E12、図4
4；TZ-3B10およびTZ-5F9、図46）をサブクローンニングした。5つのサブクローンニング
したTW-1E12プレートのうち2つがPLGF反応性であった（図45A）。これらのプレートの個
々のウェルをスクリーニングし、最高の反応性を伴う3つのウェル（TW 2E3、2G9、5A10）
を、6/23/08の二次ラウンドのサブクローンニングのために選び、ここで50個細胞/ウェル
を含む2枚のプレートを作製した（表12）。細胞を現在十分なレベルにまで増殖させ、個
々のウェル中でPLGF反応性IgGについてテストしている。
(表12) PLGFと反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞のサブクローンニ
ングのまとめ
Figure 2016039813
リシンBサブユニット反応性の不死化細胞株の単離
表13ならびに図47Cに見られるように、リシンBサブユニット反応性細胞を扁桃腺レパー
トリーTNSL-Zの2つのウェル（TZ-7B8およびTZ-6F10）において検出した。反応性細胞を含
むウェルを6/21/08にサブクローンニングし、96ウェルプレート5枚の各々が50個細胞／ウ
ェルを含んだ（表14）。これらのプレートの個々のウェルを7/14/08にスクリーニングし
、最高の反応性を伴うウェル（TZ-7B8-1A12、-1E3、-2A1、-2A3、-4A1、図48）および（T
Z-6F10 1C3、1D6、1F11、2F2、2G2、3E1、4H4、4G6、5D7、図49）を二次ラウンドのサブ
クローンニング、シークエンシングのために選んだ。
(表14) リシンB鎖と反応性のモノクローナル抗体を分泌する不死化ヒトB細胞のサブクロ
ーンニングのまとめ
Figure 2016039813
リシンBサブユニット反応性細胞TZ-6F10-4H4およびTZ-7B8-2A3の特性付け
二次ラウンドのサブクローンニング（25〜500個細胞／ウェル）から2週間後、個々のウ
ェルからの培養上清を、3通り、リシンBサブユニット反応性についてELISAによりテスト
した。図58Aに見られるように、2回目のサブクローンニング細胞を含む12/20ウェルが変
動レベルのリシンB反応性を有した。ウェルTZ6F10-4H4およびTZ-7B8-2A3中の細胞を、免
疫グロブリンシークエンシング分析のために選んだ。RT-PCRを、図54Aに記載のプライマ
ーを使用して、先の記載のとおりに実施した。各ウェルにおいて、λ1/3およびλ6からな
る2つの軽鎖および重鎖配列を同定した（VH1およびVH3）。PCR増幅産物をシークエンシン
グした。シークエンシングによって、TZ-6F10-4H4についての軽鎖免疫グロブリン可変領
域がIGLV048およびIGLJ03*2遺伝子セグメントで構成されることが示された（図59A）（SE
Q ID NO：41および42）。VH3重鎖免疫グロブリン可変領域はIGHV035で構成された（図59B
）（SEQ ID NO：45および46）。軽鎖領域は生殖系列配列と>99%の相同性を有し、重鎖領
域は超変異されており、89%のVH生殖系相同性を伴った；得られた配列を、生殖系列配列
に対して比較し、図59AおよびBに提示する。重鎖および軽鎖の相補性決定領域を図59Fに
おいて同定する。スクリーニングによって、TZ-7B8-2A3についてのλ3軽鎖免疫グロブリ
ン可変領域がIGLV063およびIGLJ03*2遺伝子セグメントで構成されることが示された（図5
9C）（SEQ ID NO：49および50）。第2のλ6軽鎖配列をウェルTZ-7B8-2A3中の細胞におい
て同定し、ILGV048およびIGLJ3*02遺伝子セグメントで構成された（図59D）（SEQ ID NO
：52および53）。VH1重鎖免疫グロブリン可変領域はIGHV157、IGHD3-10*2、IGHJ04*2で構
成された（図59E）（SEQ ID NO：57および58）。軽鎖領域は生殖系列配列と>98%の相同性
を有し、重鎖領域は超変異されており、96%のVH生殖系相同性、生殖系と46% DHおよび81%
JH相同性を伴った；得られた配列を、生殖系列配列に対して比較し、図59C〜Eに提示す
る。重鎖および軽鎖の相補性決定領域を図59Fにおいて同定する（SEQ ID NO：60、61、62
、63、および64）。
IL6反応性の不死化細胞株についてのスクリーニング
表15に見られるように、4つの不死化細胞株をIL6反応性についてテストしたが、検出さ
れたIL6特異的細胞株は現在まで存在していない。
実施例5 - H5 HAと反応性の抗体を分泌するヒトB細胞のための材料および方法
扁桃腺および末梢血由来のB細胞レパートリーの生成および分析
濃縮EBVストックの生成および扁桃腺組織および末梢血のサンプルからのB細胞の調製が
先に記載されている。EBV不死化B細胞の分化誘導のために、先の記載したとおりに、可溶
性CD40リガンド（5ng/ml）、BAFF（10ng/ml）、およびヤギ抗ヒトIgM F（ab'）2（1.62ng
/ml）を含む完全RPMI培地を使用した。
ELISA分析のためのサンプル回収
サンプル培養上清の回収およびELISAによるH5 HA反応性についてのスクリーニングを以
下のとおりに改変している。培養上清を、96ウェルプレートの対応するウェル中に、形質
導入後10日目に各ウェルから100μl回収し、一定分量をプールし（各プレートの全ウェル
からの30μlの上清）、H5 HA反応性についてのELISAによりスクリーニングした。培養上
清を、CD40L、BAFF、および抗ヒトIgM（Fab'）2を含む100μlの新鮮RPMI培地と交換した
。H5 HA反応性がプールされたウェル中で検出された場合、プールに寄与する個々のウェ
ルの各々を5つの新しいウェルにサブクローンニングし、生存を保存し、陽性ウェルの同
一性を追加のELISA実験により確認した。ひとたびH5 HA反応性IgGを含む個々のウェルが
、迅速スクリーニング戦略において同定されていれば、そのウェルからの細胞をカウント
し、その50〜80%を96ウェルプレート中にサブクローンニングし（約500個細胞／ウェル、
カウントに依存する）、残りを凍結した。サブクローンニング後の種々の時間に、上清を
上に概説したとおりに回収し、迅速スクリーニング分析を繰り返した。これに、追加ラウ
ンドの限界希釈サブクローンニングおよびスクリーニングが続いた。クローン性は、最低
希釈で、プレートの全ウェルが抗H5 HA反応性IgGを産生した場合に想定した。
H5 HAおよびHISタグ付きH5 HA ELISA
Hisタグ付き組換えH5 HA（株H5N1 A/Vietnam/1203/2004）をImmune Technology Corpか
ら得た（#IT-003-0051p）。このタンパク質（H5 a.a. 18〜530）はN末端6ヒスチジン（6
×His）タグおよびHA切断部位に欠失（ΔRRRKKR）を有する。Hisタグ付きH5 HAを中性pH
結合バッファー（1x DPBS、pH 7.2）中で、2μg/mlで96ウェルELISAプレートのウェルの
コーティングのために調製した（50μl/ウェル）；目盛付きプレートを一晩4℃で結合さ
せた。各サンプルおよび対照についての非特異的結合を、3通りに、H5 HAコーティングウ
ェルに対し、結合バッファーだけを受けた等しい数の未コーティングウェルから得られた
結果を比較することにより評価した。次の日、プレートを洗浄し、中性pHブロッキング溶
液（SuperBlock-TBS、pH 7.4、Pierceから）＋0.1% Tween 20でブロッキングし、サンプ
ルまたは対照（100μl/ウェル）と3通りにインキュベートした。対照は、以前にH5 HA反
応性（RPMI培養培地中で1：500で希釈）であることが見出されたボランティア（V5）から
のヒト血清、および非反応性の精製ヒトIgG（500ng/0.1ml RPMI培養培地、Sigma）からな
った。十分な洗浄後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（Southern）を各ウェ
ルに加え、発色基質の反応および検出が続いた。H5 HA結合についての平均OD405値±標準
偏差（n=3）（平均非特異的結合を引いた）をすべてのグラフに示す。
HISタグ付きH5 HAに結合させた磁気ビーズを使用した抗H5 HA Igを発現する細胞集団の濃
縮
2つの異なるビーズシステムを用いた。試薬の量をスクリーニングすべき1×106個細胞
当たりで与え、異なる細胞数に従って変更した。THE（商標）Anti-His MagBeads（GenScr
ipt Corporation, #L00275）について、0.5mg（50μlのストック）ビーズを2mlの冷DPBS
で3回洗浄し、0.2mlの冷洗浄バッファー1（DPBS＋0.2% BSAおよび20mM EDTA）中に再懸濁
させた。洗浄したビーズを氷上で0.5μgのHISタグ付きH5 HAと混合し、氷上で1時間振盪
しながらインキュベートし、次にWB1で2回洗浄した。MagnaBead（登録商標）Biotin Bind
er（Invitrogen, # 110.47）について、15μl（4×108ビーズ/ml）のビーズを冷DPBSで3
回洗浄し、0.2mlの冷WB1中に再懸濁させた。ビーズを氷上で1μgのTHE（商標）Anti-His
mAb[biotin]（GenScript, #A00613）および1μgのHISタグ付きH5 HAと混合し、氷上で1時
間振盪しながらインキュベートし、次にWB1で2回洗浄した。いずれのビーズ：：his-H5 H
A複合体についても、DPBSで3回洗浄した1×106個の細胞を0.2mlのWB1中に再懸濁させ、ビ
ーズ複合体と合わせる。チューブを氷上で30分間振盪する。懸濁液を氷冷WB1で10mlにし
、3分間の分離のためのEasySepマグネット中に置く。未結合細胞（フロースルーまたはFT
と呼ぶ）を含む上清を回収し、ビーズ-細胞の残余分を10mlのWB1で2回洗浄する。次に、3
mlの室温のトリプシン-EDTA溶液（Mediatech Cellgro #21-053-C1）を加えて、そして室
温で5分間インキュベートする。次に、7mlの完全培養培地を不活性トリプシンに加え、も
はやビーズに付着しない細胞（トリプシン洗浄分画）を回収する。ビーズを10mlのWB1で2
回洗浄し、1mlの完全培養培地（トリプシンビーズ分画）中に再懸濁させる。FTおよびト
リプシン分画をカウントし、1600rpmで7分間遠心分離し、完全RPMI培地中に再懸濁し、96
ウェルプレートのウェル中に1×104〜5×104個細胞／ウェルで分注する。
IgGサブタイプの同定
TN-6G7-7F8-2G7培養上清を回収し、抗ヒトIgGでプレコーティングした96ウェルELISAプ
レートのウェル中に分注し、先のセクションに記載のとおりに、SuperBlock＋0.1% Tween
-20でブロッキングした。ブロッキング後、プレートを十分に洗浄し、次に、100μlの4つ
のサブタイプ特異的アルカリホスファターゼ標識マウスモノクローナル抗体とインキュベ
ートした：抗Hu IgG1（Invitrogen 05-3322）、抗体Hu IgG2（Invitrogen 05-3522）、抗
体Hu IgG3（Invitrogen 05-3622）、および抗体Hu IgG4（Invitrogen 05-3722）。すべて
の抗体をブロッキング溶液で1：250に希釈した。抗体との1時間のインキュベーションの
後、続けて発光基質反応および検出を行った。平均OD405値±標準偏差（n=3）を報告した
。
クローンTN-6G7-7F8-2G7の重鎖および軽鎖可変領域配列の分析
全RNAを、約105〜106個細胞から、RNEasyプロトコール（Qiagen, # 74104）を使用して
、QIAshredderカラム（Qiagen, # 79654）で抽出した。RNAを、High Capacity cDNA Reve
rse Transcription Kitで、製造業者の指示（Applied Biosystems, # 4368813）に従って
cDNAに変換し、Welschof et al.（1995）から適用したプライマー組を使用した軽鎖およ
び重鎖型含量についてのPCRにより分析した（図xAを参照のこと）。すべてのフォワード
プライマーがXbaI制限酵素部位を取り込んでいたが、リバースプライマーはSalI制限酵素
部位を取り込んでいた。PCR産物を1%アガロースゲルで分析した（図xB）。検出可能な産
物をもたらす反応を、プルーフリーディングAccuzyme（商標）Mixキット（Bioline, # BI
O-25027）を使用してスケールアップした。PCR産物を、QIAquick Gel Extraction Kit（Q
iagen, # 28704）を使用してゲル精製し、各々の一部を、シークエンシングのために、MU
SC DNA Core Facilityへ、元のフォワードおよびリバースPCRプライマーと共に提出した
。各産物の残りを、XbaIおよびSalI（New England Biolabs）で消化し、哺乳動物発現ベ
クター中への続くサブクローニングのために、同様にXbaI/SalI消化されたpSP73プラスミ
ド（Promega, # P2221）中にクローンニングした。フォワードおよびリバースDNA配列をV
ector NTI（Invitrogen）ALIGN機能を使用して整列させ、組み合わせた修正配列を生成し
た。これらをVBASE2オンラインソフトウェア（Retter et al., 2005）を使用して分析し
た。配列ナンバリングおよびモチーフ整列化をKabatスタンダードに従って実施した（Joh
nson and Wu, 2000）。
実施例6 - H5 HAと反応性の抗体を分泌するヒトB細胞での結果
TN-6G7-7F8-2G7細胞の由来
ヒト扁桃腺由来の不死化B細胞レパートリーを、表16にまとめるとおりに作製した。H5N
1ヘマグルチニン（H5 HA）反応性についてエプスタイン-バーウイルス（EBV）感染後10〜
14日目にすべてをスクリーニングした。TN-6G7-7F8-2G7細胞は扁桃腺レパートリーTNSL-N
に由来した（表16で、黄色で強調）。培養上清を、プレートプール（単一プレート中の全
ウェルに由来する培養上清のプールされた一定分量）およびウェルプール（すべての10枚
のプレート上の同じ位置の特定のウェルからのプールされた一定分量）のテストで構成さ
れる迅速スクリーニングELISA方法を使用してスクリーニングした。図50に示すとおり、
これらのデータの相関関係によって個々の陽性ウェルの迅速道程が可能になった。図50A
に見られるように、プールされたウェルからの培養上清のELISA分析によって、H5 HA反応
性IgGが10枚のプレートのうち少なくとも1枚のウェルG7中に見出されることが示された。
図50Bは、反応性がプレート6で最高であることを示した。陽性ウェルからの培養上清中で
の反応性の立証を、次の日に実施した。ELISAを3通りに実施し、プレートへのバックグラ
ウンド結合（H5 HA抗原の非存在下）を結果から引いた。図50Cは、プレート6ウェルG7が
最高の反応性を有することを示した；このように、ウェル6G7からの細胞を500個細胞／ウ
ェルで10枚の96ウェルプレート中にサブクローンニングし、一次ラウンドのサブクローン
ニングと呼んだ。2週間後、サブクローンニング細胞からの培養上清を、類似の迅速スク
リーニング戦略を使用して、H5 HA反応性についてスクリーニングした（図51）。図51Aに
見られるように、H5 HA反応性が複数のウェル中で同定され、C8およびF8が最高の反応性
を有した。図51Bは、有意なH5 HA反応性がプレート2、3、5、7、および8で検出された；
従って、ウェルC8およびF8からの培養上清をこれらのプレートの各々でテストした。図51
Cに見られるように、ウェル2C8、8C8、および7F8が活性を含み、ウェル7F8が最高の反応
性を有した。そのウェルからの細胞は、従って、500個細胞／ウェルで2枚のプレート中に
サブクローンニングされ、二次ラウンドのサブクローンニングと呼んだ。3週間後、両方
のプレートからのウェルプールからの培養上清を、ELISAにより、H5 HA反応性についてス
クリーニングした。図52Aに見られるように、複数のウェルが陽性であり、ウェルG7が最
高の反応性を有した。図52Bは、最も強い反応性がプレート2ウェルG7中の培養上清に由来
することを示した；このように、このウェルからの細胞を50個細胞／ウェルで2枚の96ウ
ェルプレート中にサブクローンニングし、三次ラウンドのサブクローンニングと呼んだ。
真菌汚染によって、4週間後、プロセスを同じウェルに由来する凍結細胞の一定分量を使
用して繰り返す必要があった。4週間後、両方のサブクローンニングしたプレートの全ウ
ェルはH5 HA反応性であることが見出され、クローン性を示唆した（図53A）。サブクロー
ンニング戦略を表17にまとめた。
(表16) H5 HAと反応性の抗体を分泌する不死化ヒトB細胞の単離に関するデータのまとめ
Figure 2016039813
Figure 2016039813
Figure 2016039813
(表17) H5 HAと反応性の抗体を分泌するTN-6G7不死化ヒトB細胞のサブクローンニングの
まとめ
Figure 2016039813
TN-6G7-7F8-2G7細胞の特性付け
TN-6G7-7F8-2G7細胞からの培養上清におけるIgGのサブタイピングによって、細胞がIgG
1を分泌することが示された（図53B）。これは確認され、RT-PCR分析によりさらに分析さ
れ（図54）、細胞がλ1軽鎖およびVH3重鎖を発現することが示された（図54B）。PCR増幅
産物のシークエンシングによって、軽鎖免疫グロブリン可変領域がIGLV015およびIGLJ2*0
1遺伝子セグメントで構成されることが示された（図55A）（SEQ ID NO：32および33）。
重鎖免疫グロブリン可変領域はIGHV318、IGHD4-23*1、およびIGHJ4*3で構成された（図55
B）（SEQ ID NO：36および37）。軽鎖領域は生殖系列配列と>99%の相同性を有し、重鎖領
域は超変異されており、92%のVH生殖系相同性、生殖系列と56% DHおよび80% JH相同性を
伴った；得られた配列を、生殖系列配列に対して比較し、図55Aおよび55Bに提示する。重
鎖および軽鎖の相補性決定領域を図55C（SEQ ID NO：39および40）において同定する。
実施例7 - 競合ELISAによるTE-3A10-E3A5モノクローナル抗体についての解離定数（K d ）
の決定
解離定数は、抗原についての抗体の親和性の測定値である。解離定数が低いほど、親和
性は高くなる。一般的に、Kdが10-8未満である抗体を治療範囲内で考える。E3A5モノクロ
ーナル抗体についての抗体解離定数を算出するために、研究者らは平衡状態にある抗原-
抗体複合体の濃度、全抗体濃度、および平衡状態にある抗原部位の量を知る必要があった
。これらを次に使用して、スキャッチャードプロットを生成した。スキャッチャード方程
式は［x］/［Ag］=（［AbT］-［x］）/Kdであり、ここで［x］および［Ag］はそれぞれ平
衡状態にある抗体-抗原複合体および抗原の濃度であり、［AbT］は全抗体濃度である。研
究者らは、Friguet et al. (1985)により提示された方法を使用し、ここで、抗原-抗体の
平衡状態はコーティングされた抗原への暴露前に事前に確立される。コーティングされた
抗原がわずか一部分（10%以下）の遊離抗体と相互作用する場合、それによって平衡状態
が有意に移動することはなく、このように真の親和性が測定されることを確実にする。親
和性定数の逆数によって次に解離定数Kdが出され、ここでKa=1/Kdである。
コーティングされた抗原と相互作用する抗体の量の決定
上記のとおり、わずか10%の抗体がプレート上で抗原に結合することが重要である。そ
の条件が満たされたか否かを判断するために、2枚の同一の96ウェルプレート中のウェル
をhis-H5 HA（DPBS中500ng/mlで100μl/ウェル）で、4℃で一晩コーティングした。次の
日、2倍希釈系列のＥ3A5を、RPMI 1640完全培地を希釈剤として使用して準備した。プレ
ートを洗浄し、標準的H5 HA ELISAプロトコールに従ってブロッキングした後、抗体希釈
液をウェル中に3通り置き（プレート1の100μl/ウェル）、室温で15分間インキュベート
した。次に、プレート1の全ウェルの内容物をプレート2のそれらの正確な対応物に移し、
続いて2回目の15分間インキュベーションをした。続いて、両方のプレートを洗浄し、ブ
ロッキングバッファー中で1：10,000希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgG
Fc検出抗体（100μl/ウェル）に1時間暴露させた。発色基質の反応および検出に続き、
平均OD405値±標準偏差（n=3）を得て、相対的抗体濃度に対してプロットした。線をデー
タ点に適合させ、プレート1（S1）および2（S2）での線の傾きを決定した。コーティング
された抗原への抗体結合のレベルを、式S1-S2/S1により算出した。0.1以下の値は、抗体
の10%以下がプレートをコーティングする抗原に結合したことを示す。
Kdの決定
H5 HA抗原でコーティングした96ウェルプレートを記載のとおりに調製した。18ng/mlで
E3A5を含む溶液を完全培地で調製した。His-H5 HA（75kDa）を10の異なる濃度で連続2倍
希釈（1.3x10-7M〜1.3x10-10M）として調製した。等量の抗体溶液および抗体希釈液の各
々を一緒に混合し、室温で一晩平衡化させた。次の日、事前にインキュベートした抗体-
抗原溶液を加え、調製プレートの洗浄されたウェルに100μl/ウェルで加えた。15分間の
インキュベーションに続き、工程の残りは上に厳密に記載したプロトコールに従った。
以下の方程式をKd算出において利用した：［Ab］＝［AbT］（A/Ao）；［x］＝［AbT］
（Ao-A）/Ao；［Ag］＝［AgT］-［x］。Aoは可溶性抗原の非存在下での吸光度であり、A
は特定の抗原濃度での吸光度である。v/［Ag］対vをプロットするグラフで、ここでv＝［
x］／［AbT］を生成した。グラフの傾きから、E3A5についての親和性定数Ka、およびその
逆数Kdを算出した。図56に見られるように、H5 HAへのE3A5結合についての2枚の複製プレ
ートから算出された平均Kdは1.625x10-9であり、標準誤差は3.75x10-10であった。
実施例8 - TE-3A10-E3A5および-C7F6細胞からの完全長Ig鎖の産生、および組換えレトロ
ウイルス発現ベクターの構築
クローンE3A5およびC7F6から単離された組換えIg遺伝子を産生する細胞株を作製するた
めに、完全長の重鎖および軽鎖Ig遺伝子をそれらのcDNAから増幅した。可変領域は約400b
pであり、完全長の軽鎖は約700bp、完全長の重鎖は約1400bpであった（図XXXA）。プライ
マーを作製するために、GenbankのBLASTサーチをクローンニングされた可変領域配列を使
用して実施し、新しいプライマーデザインのためにリーダーペプチド配列を同定した。重
鎖および軽鎖の定常領域のC末端のためのリバースプライマーは、それらの遺伝子の発表
された配列に由来した。使用したプライマーはそれぞれ
Figure 2016039813
および
Figure 2016039813
であり、E3A5およびC7F6 cDNAからのIgG軽鎖の増幅のためにリバースプライマー
Figure 2016039813
を組み合わせた。同様に、
Figure 2016039813
および
Figure 2016039813
をリバースプライマー
Figure 2016039813
と共に使用し、それぞれC7F6およびE3A5の重鎖を増幅した。PCR反応をAccuPrime Taq DNA
ポリメラーゼ（Invitrogen、#12339-016）を使用して、提供されるPCRバッファーI、およ
び最終濃度各1μMのプライマーで実施した。E3A5およびC7F6細胞の両方からの完全長の重
鎖および軽鎖を単離した（図57A）。
フォワードプライマーおよびリバースプライマー中に取り込まれた制限酵素部位によっ
て発現ベクター中への直接的挿入が可能になった。レトロウイルスベクターを完全長のE3
A5およびC7F6 Ig遺伝子のCHO、293細胞および骨髄腫細胞株への送達のために選んだ。そ
の理由は、レトロウイルスベクターは細胞のDNA中に組込まれ、安定な細胞株の迅速樹立
が可能になるからである。レトロウイルスベクターを構築するために、pQCXINレトロウイ
ルスベクター（Clontech）を、ネオマイシン耐性遺伝子（neoR）を高感度緑色蛍光タンパ
ク質（EGFP）の遺伝子と置換することにより改変し、pQCXIGを作製した（図57B）。E3A5
およびC7F6 Ig遺伝子PCR産物を、Qiagenスピンカラムを使用して精製し、EcoR1およびNot
1制限エンドヌクレアーゼ（EcoR1バッファー中）で一晩消化し、同じくEcoR1およびNot1
で消化されたレトロウイルス発現ベクタープラスミドと連結した。図57Bに記載のように
、軽鎖をpQCXIN中に挿入し、pQC.E3A5-LC.INおよびpQC.C7F6-LC.INを生成し、重鎖をpQCX
IG中にクローンニングし、pQC.E3A5-HC.IGおよびpQC.C7F6-HC.IGを生成した。
本明細書で開示および請求される組成物および／または方法のすべてを、本開示に照ら
して、必要以上の実験なしに、行い、そして実行する。本発明の組成物および方法が好ま
しい実施態様に関して記載されており、変形、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱
することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法に、ならびに工程において、
または、方法の一連の工程において適用できることは当業者に明らかでありうる。より具
体的には、化学的および生理学的のいずれでも関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の
薬剤に代用でき、同じまたは類似の結果が達成されうることは明らかでありうる。当業者
に明らかであるすべてのそのような類似の代用物および改変は、添付の特許請求の範囲に
より定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると見なされる。
VII. 参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書で示すものを補足する例示的な手順または他の詳細
を提供する範囲で、具体的に参照により本明細書に組み入れられる。
Figure 2016039813
Figure 2016039813

Claims (34)

  1. 以下の工程を含む、予め決定された抗原に特異的な抗体を分泌する不死化ヒトB細胞を
    産生する方法：
    (a)IgM陽性ヒトB細胞集団を得る工程；
    (b)該集団を、
    (i)ヒトB細胞を不死化するために、エプスタイン-バーウイルス（EBV）と、および
    (ii)免疫グロブリンアイソタイプのIgMからIgGへのクラススイッチを誘導するために
    、サイトカイン／増殖因子／シグナル伝達物質のカクテルと
    接触させる工程；
    (c)前記不死化および免疫グロブリンアイソタイプクラススイッチを支持する条件下で
    細胞を培養する工程。
  2. 以下の工程をさらに含む、請求項1記載の方法：
    (d)予め決定された抗原に対する抗体を発現する不死化ヒトB細胞を選択する工程。
  3. 予め決定された抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、毒素抗原、
    ウイルスの侵入に関する細胞受容体抗原、細菌の侵入に関する細胞受容体、真菌の侵入に
    関する細胞受容体、寄生虫の侵入を媒介する細胞受容体、毒素の侵入を媒介する細胞受容
    体、腫瘍抗原、サイトカイン／ケモカイン／増殖因子抗原、サイトカイン／ケモカイン／
    増殖因子受容体抗原、炎症を媒介する分子上の抗原、疼痛を媒介する分子上の抗原、組織
    損傷／障害を媒介する分子上の抗原、活性化分子／リガンド／受容体上の抗原、共刺激分
    子／リガンド／受容体上の抗原、先天免疫を媒介する分子上の抗原、細胞接着分子上の抗
    原、細胞接着分子受容体上の抗原、病状に関連する過剰発現した／不十分にグリコシル化
    された／酸化した／ミスフォールドした／変異した細胞タンパク質（「改変された自己」
    抗原）上の抗原、細胞アポトーシスを媒介する分子／リガンド／受容体上の抗原、増殖阻
    害分子上の抗原、H5N1血液凝集素（H5 HA）、癌血管新生分子である胎盤誘発増殖因子（P
    LGF）、癌および自己免疫関連因子であるインターロイキン-6（IL6）、ブドウ球菌エンテ
    ロトキシンB（SEB）、ブドウ球菌エンテロトキシンC2（SEC2）、またはリシンBサブユニ
    ットを含む、請求項1記載の方法。
  4. 予め決定された抗原がH5 HA、PLGF、IL6、SEB、SEC2、またはリシンBサブユニットであ
    る、請求項3記載の方法。
  5. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項2記載の方法。
  6. 予め決定された抗原がH5 HAである、請求項4記載の方法。
  7. 予め決定された抗原がPLGFである、請求項4記載の方法。
  8. 予め決定された抗原がIL6である、請求項4記載の方法。
  9. 予め決定された抗原がSEBである、請求項4記載の方法。
  10. 予め決定された抗原がSEC2である、請求項4記載の方法。
  11. 予め決定された抗原がリシンBサブユニットである、請求項4記載の方法。
  12. 選択する工程が、不死化B細胞培地の上清に対して実施されるイムノアッセイを含む、
    請求項2記載の方法。
  13. サイトカインカクテルが、B細胞受容体とクロスリンクするもしくはB細胞受容体を活性
    化する抗IgM F(ab’)2または他の物質、組換えヒトインターロイキン(IL)-2、IL-4、IL-5
    、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、INFα、BAFF、および／もしくはB細胞の分化を引き起こす
    他のサイトカイン、ならびに／または可溶性CD40L、ならびに／またはヒトB細胞に共刺激
    シグナルを供給する他の物質を含む、請求項1記載の方法。
  14. 集団が末梢血、扁桃、骨髄、脾臓、リンパ節、臍帯血、肝臓、アフェレーシス技法、お
    よび／またはバフィーコートから得られる、請求項1記載の方法。
  15. 工程（d）の不死化ヒトB細胞から重鎖および／または軽鎖全体をコードする核酸を単離
    する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
  16. 工程（d）の不死化ヒトB細胞から重鎖および／または軽鎖の抗原結合領域をコードする
    核酸を単離する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
  17. 前記核酸を、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域をコードする核酸へとクロ
    ーニングする工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
  18. 工程（b）が、EBVを濃縮する工程、感染の間に遠心分離する工程、または両方をさらに
    含む、請求項1記載の方法。
  19. 工程（c）の後に、ヒトB細胞集団を凍結する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  20. 工程（b）（ii）の後に、工程（b）（ii）を約0〜96時間実施する、請求項1記載の方法
    。
  21. 工程（b）（ii）の後に、工程（b）（ii）を約16〜20時間実施する、請求項20記載の方
    法。
  22. 集団の約50%〜99%がEBV感染によって不死化される、請求項1記載の方法。
  23. 集団の約95%〜99%がEBV感染によって不死化される、請求項22記載の方法。
  24. 工程（d）が、感染の後1〜4週間行われる、請求項2記載の方法。
  25. 工程（d）が、感染の後2〜3週間行われる、請求項24記載の方法。
  26. 工程（d）が、保存された凍結不死化B細胞を解凍した後、および／または不死化B細胞
    由来の保存された凍結培地上清を解凍した後に行われる、請求項2記載の方法。
  27. B細胞が抗原で処理されていない、請求項1記載の方法。
  28. B細胞が抗原で処理された、請求項1記載の方法。
  29. 炭疽菌毒素、エボラウイルス抗原、リシンA鎖、A鎖、ペスト菌（Yersinia pestis）抗
    原、マールブルグウイルス抗原、MDRブドウ球菌（Staphylococcus）抗原、およびコレラ
    毒素と免疫学的に結合するIgGを発現する、ハイブリドーマではない不死化ヒトB細胞。
  30. EBVで不死化されている、請求項29記載の不死化ヒトB細胞。
  31. 請求項29記載の細胞によって作製された、単離されたモノクローナル抗体。
  32. H5N1血液凝集素（H5 HA）に対して特異性を有する、単離されたモノクローナル抗体。
  33. 以下を含む、請求項32記載の単離された抗体：
    （a）SEQ ID NO：22、25、または36に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および

    （b）SEQ ID NO：16、19、または32に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  34. 以下を含む、請求項32記載の単離された抗体：
    （a）SEQ ID NO：23、26、または37の核酸配列によってコードされている重鎖可変領域
    ；および
    （b）SEQ ID NO：17、20、または33の核酸配列によってコードされている軽鎖可変領域
    。
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