JP2016034939A - 含水エタノール製剤及びその製造方法、並びに、リゾチーム加工品及び／又はその塩並びにその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】透明性に優れた含水エタノール製剤及びその製造方法、並びにリゾチーム加工品及び／又はその塩並びにその製造方法を提供する。
【解決手段】含水エタノール製剤は、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品を含有し、下記に規定される蛍光強度が５，５００以上である。蛍光強度：前記含水エタノール製剤を前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度
【選択図】なし

Description

本発明は、含水エタノール製剤及びその製造方法、並びに、リゾチーム加工品及び／又はその塩並びにその製造方法に関する。

リゾチームは、卵、動物の組織、体液、植物など生物界に広く存在する酵素である。工業的には、卵白から単離されるリゾチームが、食品及び医薬品に応用されている（特許文献１）。例えば、リゾチームは抗菌作用を有することから、消毒剤の成分として広く使用されている。

特開平５−２２１８７５号公報

本発明者らは、リゾチームを含水エタノール製剤の成分として使用する場合、エタノール溶液中でリゾチームが十分に溶解せず、リゾチームが沈殿するという問題を発見した。

そこで、本発明者らは、リゾチームの蛍光強度が特定以上になるまで過加熱して得られるリゾチーム加工品及び／又はその塩が、エタノールへの溶解性に優れており、該リゾチーム加工品及び／又はその塩を用いて、透明性に優れた含水エタノール製剤を得ることができることを見出し、本発明を想到した。

本発明は、透明性に優れた含水エタノール製剤及びその製造方法、並びにリゾチーム加工品及びその製造方法を提供する。

１．本発明の一態様に係る含水エタノール製剤は、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品を含有し、下記に規定される蛍光強度が５,５００以上である。
蛍光強度：前記含水エタノール製剤を、前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度

２．上記１に記載の含水エタノール製剤は、波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上であることができる。

３．上記１又は２に記載の含水エタノール製剤は、前記含水エタノール製剤を２５℃で１ヵ月保存した後の波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上である。

４．上記１ないし３のいずれかに記載の含水エタノール製剤において、前記エタノールの濃度が４０質量％以上９０質量％以下であることができる。

５．上記１ないし４のいずれかに記載の含水エタノール製剤において、前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が固形分換算で０．１質量％以上５質量％以下である、含水エタノール製剤。

６．上記１ないし５のいずれかに記載の含水エタノール製剤において、エタノール以外の水溶性アルコールをさらに含有することができる。

７．上記１ないし６のいずれかに記載の含水エタノール製剤は、スプレー式容器に充填されていることができる。

８．上記１ないし６のいずれかに記載の含水エタノール製剤は、ポンプ式容器に充填されていることができる。

９．上記１ないし６のいずれかに記載の含水エタノール製剤は、不織布に含浸されていることができる。

１０．本発明の一態様に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩は、下記定義によって規定される蛍光強度が４，０００以上である：
蛍光強度：前記リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度

１１．本発明の一態様に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法は、上記１０に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩を製造する方法であって、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超であり、ｐＨが５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチーム及び／又はその塩を、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になるまで加熱する第１の加熱工程と、前記第１の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％未満の極小値になるまで加熱した後、７０％になるまで該水溶液を加熱する第２の加熱工程と、前記第２の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える状態で該水溶液をさらに加熱する第３の加熱工程と、を含む。

１２．上記１１に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩を製造する方法において、前記第３の加熱工程の加熱条件が、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になるまで加熱する条件であることができる。

１３．上記１１又は１２に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法において、前記第３の加熱工程の後に、前記水溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥させて、粉末状のリゾチーム加工品及び／又はその塩を得る工程をさらに含む。

１４．本発明の一態様に係る含水エタノール製剤の製造方法は、上記１１ないし１３のいずれかに記載の製造方法で得られたリゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程を含む。

１５．本発明の一態様に係る含水エタノール製剤の製造方法は、上記１０に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程と、を含む。

１６．上記１４又は１５に記載の含水エタノール製剤の製造方法において、前記含水エタノール製剤を得る工程において、前記含水エタノール製剤における前記リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．１質量％以上５質量％以下となるように、前記リゾチーム加工品と前記エタノール及び水とを混合することができる。

１７．上記１４ないし１６のいずれかに記載の含水エタノール製剤の製造方法において、前記含水エタノール製剤を得る工程において、前記含水エタノール製剤におけるエタノールの濃度が４０質量％以上９０質量％以下となるように、前記リゾチーム加工品及び／又はその塩と前記エタノール及び水とを混合することができる。

上記１ないし９のいずれかに記載の含水エタノール製剤によれば、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品を含有し、上記定義で規定される蛍光強度が５，５００以上であることにより、水溶性を有し、かつエタノールへの溶解性に優れているため、上記１ないし９のいずれかに記載の含水エタノール製剤は透明性に優れている。

上記含水エタノール製剤は例えば、医薬品として、食品の洗浄用途として、又は衛生用途としての使用が可能である。この場合、菌の除去用途として上記含水エタノール製剤を使用することができる。より具体的には、上記含水エタノール製剤は例えば、容器（例えば、ノズル又はスプレー等が付属されている容器、あるいはこれらが付属していない容器）に収容した形態にて、あるいは、不織布に含浸させた形態にて使用することができる。

また、上記１０に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩は、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であることにより、水溶性を有し、かつエタノールへの溶解性に優れているので、透明性に優れた含水エタノール製剤の製造に使用することができ、かつ、菌の不活化作用を有する。

また、上記１１ないし１３に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法によれば、前記第１の加熱工程、前記第２の加熱工程及び前記第３の加熱工程により、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であることから、水溶性を有し、かつエタノールへの溶解性に優れているため、菌の不活化作用を有するリゾチーム加工品及び／又はその塩を得ることができる。

また、上記１４、１６及び１７に記載の含水エタノール製剤の製造方法によれば、上記１１ないし１３に記載の製造方法で得られたリゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程を含むことにより、水溶性を有し、かつ、エタノールへの溶解性に優れているため、抗菌作用を有するリゾチーム加工品及び／又はその塩を得ることができ、かつ、前記含水エタノール製剤を得る工程によって、透明性に優れ、かつ、菌の不活化作用を有する含水エタノール製剤の製造に使用することができる。

また、上記１５ないし１７に記載の含水エタノール製剤の製造方法によれば、上記１０に記載のリゾチーム加工品とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程を含むことにより、透明性に優れ、かつ、菌の不活化作用を有する含水エタノール製剤を得ることができる。

本発明の一実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法において、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程での加熱時間と透過率との関係を模式的に表す図である。 本発明の一実施例で得られたリゾチーム加工品及び／又はその塩の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）結果を示す写真である。

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。

＜含水エタノール製剤＞
本発明の一実施形態に係る含水エタノール製剤は、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品を含有し、下記に規定される蛍光強度が５，５００以上であることを特徴とする。
蛍光強度：前記含水エタノール製剤を前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品（以下、「リゾチーム加工品等」と記載することもある。）の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度

本発明において、「含水エタノール製剤」とは、水を含むエタノールを含む製剤をいい、その性状は、液状のものや、ジェル等の粘稠物等、流動性組成物であるとよい。また、本発明において「室温」とは、２０℃以上２５℃以下のことをいう。

［蛍光強度］
本発明で規定される含水エタノール製剤の蛍光強度は、含水エタノール製剤に含まれる蛋白質の表面疎水性の指標である。すなわち、本発明で規定される含水エタノール製剤の蛍光強度が高いほど、含水エタノール製剤に含まれる蛋白質の表面疎水性が高いといえる。

そのため、本実施形態に係る含水エタノール製剤の蛍光強度は主に、該含水エタノール製剤に含まれるリゾチーム加工品等の表面疎水性に起因している。通常、蛋白質の表面疎水性を高めると、蛋白質の疎水性部分同士が引き合い、凝集するため、水やエタノールへの溶解性が低下する。しかしながら、本実施形態に係るリゾチーム加工品等は、表面疎水性が高いにもかかわらずエタノールへの溶解性に優れており、かつ、水溶性を有するという特徴を有する。

本実施形態に係る含水エタノール製剤に含まれるリゾチーム加工品等が、エタノールへの溶解性及び水溶性の双方に優れている原因は明らかではないが、該リゾチーム加工品等は表面疎水性が極めて高いのに加えて、該リゾチーム加工品等が本実施形態に係る含水エタノール製剤中において「水溶性を有する凝集体」の形態で溶解しているので、水溶性に優れているためであると推測される。

表面疎水性がより高い点で、本実施形態に係る含水エタノール製剤の蛍光強度は、下記定義によって規定される５，５００以上であることが好ましく、６，０００以上であることが好ましく、さらに６，５００以上であることが好ましく、通常１０，０００以下である。

本発明において、含水エタノール製剤及び後述するリゾチーム加工品等の蛍光強度は、Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295に記載された方法にて測定された値である。なお、本発明におけるリゾチーム加工品等の蛍光強度の測定に用いるリン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸水素二ナトリウムを用いて調製したものである。また、本発明におけるリゾチーム加工品等の蛍光強度は、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、リン酸塩としてリン酸二水素ナトリウム及びリン酸水素二ナトリウムで調製される）の蛍光強度をブランク値として別途測定し、該ブランク値を差し引いた値である。

本実施形態に係る含水エタノール製剤及び後述する実施形態に係るリゾチーム加工品の蛍光強度は、日本分光株式会社、型名ＦＰ−８５００蛍光分光光度計を用いて、励起波長３９０ｎｍ、励起バンド幅１０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ、蛍光バンド幅１０ｎｍ、レスポンス０．５ｓｅｃ、感度Ｌｏｗ（約２７０±１０Ｖ）（電源周波数（５０／６０Ｈｚ））、ペリスタシッパＳＨＰ−８２０型使用の条件で測定したときの値である。なお、他の蛍光分光光度計を用いて測定することもできるが、その際は感度等の測定条件を本願で規定する条件に合わせる必要がある。

［リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品］
本発明において、「リゾチーム」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸とのβ−１，４結合を加水分解する性質を有するタンパク質をいう。また、本発明において、「リゾチーム加工品」とは、リゾチーム及び／又はその塩とは異なる立体構造を有するものをいい、リゾチームを変性させて得ることができる。

リゾチームは、卵、動物の組織、体液、植物など生物界に広く存在し、基質特異性と構造から大きく以下の５種のファミリーに分類される。
１．リゾチーム（細菌型）
２．リゾチーム（ニワトリ型）
３．リゾチーム（グース型）
４．リゾチーム（ファージ型；Ｖタイプ）
５．リゾチーム（ＣＨ型）

本実施形態に係る含水エタノール製剤では、リゾチームとして、上記５種のファミリーのいずれも使用することができる。これらのリゾチームのなかでも、原料であるリゾチームとして、卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム等のリゾチーム（ニワトリ型）が好ましく、さらに、低コストで入手可能である点から、卵白リゾチームがより好ましい。

また、リゾチームの塩としては、食品添加物又は薬学的に許容可能である塩が挙げられ、塩酸、炭酸、リン酸、ホウ酸、へキサメタリン酸、硝酸、硫酸などの無機酸の塩、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、グルタミン酸、グリセロリン酸、グルコン酸などの有機酸の塩があげられる。リゾチームの塩のなかでも、無機酸の塩が好ましく、消炎剤として広く使用され、安全性が確立している点から、塩化リゾチームがより好ましい。

（蛍光強度）
表面疎水性がより高く、エタノールへの溶解性がより優れている点で、下記定義によって規定されるリゾチーム加工品等の蛍光強度は４，５００以上であることが好ましく、５，０００以上であることがより好ましく、通常、１０，０００以下である。
蛍光強度：前記リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度

（濃度）
本実施形態に係る含水エタノール製剤において、エタノールへの溶解性により優れているため、透明性をより高めることができる点で、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が固形分換算で０．１質量％以上５質量％以下であることが好ましく、０．２質量％以上であるのがより好ましく、０．５質量％超（例えば０．６質量％以上）であることがさらに好ましく、０．７質量％以上であることが最も好ましく、一方、４質量％以下であるのがより好ましく、２質量％以下であることがさらに好ましい。

本実施形態に係る含水エタノール製剤において、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品は、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品から選ばれる少なくとも１種を含有することができる。また、本実施形態に係る含水エタノール製剤において、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品から選ばれる複数種類を含有する場合、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度（固形分換算）は、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の合計量の濃度（固形分換算）を意味する。

（二量体及び三量体）
前記リゾチーム加工品及び／又はその塩は、約２９Ｋ（＝１０^３）Ｄａの蛋白質及び／又は約３６．５ＫＤａの蛋白質を含むことができ、約２９ＫＤａの蛋白質及び約３６．５ＫＤａの蛋白質の両方を含むことがより好ましい。すなわち、本実施形態に係る含水エタノール製剤は、約２９ＫＤａの蛋白質及び／又は約３６．５ＫＤａの蛋白質を含むことができる。本実施形態に係る含水エタノール製剤ならびに前記リゾチーム加工品又はその塩中に約２９ＫＤａの蛋白質及び／又は約３６．５ＫＤａの蛋白質が含まれていることは、後述する実施例に示す電気泳動によって確認することができる。なお、電気泳動は、市販の電気泳動キッドを用いて行うことができる。

約２９ＫＤａの蛋白質は、リゾチーム加工品及び／又はその塩の二量体であると推測され、約３６．５ＫＤａの蛋白質は、リゾチーム加工品及び／又はその塩の三量体であると推測される。

本実施形態に係る含水エタノール製剤中において、リゾチーム加工品及び／又はその塩として、約２９ＫＤａの蛋白質及び／又は約３６．５ＫＤａの蛋白質が含まれていることにより、リゾチーム加工品及び／又はその塩が表面疎水性の高い状態にて該含水エタノール製剤中に存在していると推測される。

（製造方法）
リゾチーム加工品及び／又はその塩は、後述する実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法の欄に記載された第１加熱工程、第２加熱工程及び第３加熱工程によって製造することができる。

［エタノール］
本実施形態に係る含水エタノール製剤は、殺菌効果を有し、かつリゾチーム加工品等の溶解性をより高めることができる点で、エタノールの濃度は４０質量％以上９０質量％以下であることができ、５０質量％以上であることが好ましく、５５質量％以上であることがより好ましく、６５質量％以上であることがさらに好ましく、一方、８０質量％以下であることが好ましく、７５質量％以下であることがより好ましい。

［透過率］
本実施形態に係る含水エタノール製剤は、透明性に優れている点で、波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上であることができ、９０％以上であることが好ましい（通常１００％以下である）。波長６６０ｎｍの光は、工業用水試験法ＪＩＳ Ｋ０１０１において、水の濁り度合を測定する波長として定められている。また、本発明において、波長６６０ｎｍの光の透過率は、公知の吸光光度計によって測定することができる。

また、本実施形態に係る含水エタノール製剤は、長期間保存後も透明性を維持することができる点で、本実施形態に係る含水エタノール製剤を２５℃で１ヵ月保存した後の波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることが好ましい（通常１００％以下である）。

［エタノール以外の水溶性アルコール］
本実施形態に係る含水エタノール製剤は、エタノール以外の水溶性アルコールをさらに含有することができる。本実施形態に係る含水エタノール製剤が水溶性アルコールをさらに含有することにより、該含水エタノール製剤の透明性をより保持することができる。

なかでも、透明性をより保持し、かつ、アルコールによる殺菌効果と、リゾチーム加工品等が有する菌の不活化作用とを併せ持つことができるため、消毒剤として利便性がより高い点で、本実施形態に係る含水エタノール製剤はエタノールに加えて、エタノール以外の水溶性アルコールの少なくとも１種を含むことが好ましい。

エタノール以外の水溶性アルコールとしては、例えば、イソプロパノール等のエタノール以外の炭素数３、４又は５の低級アルコール、あるいはグリセリン、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール等が挙げられる。これらの水溶性アルコールは、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。

本実施形態に係る含水エタノール製剤が水溶性アルコールを含む場合、その含有量は通常、０．１質量％以上２０質量％以下であり、０．５質量％以上であることが好ましく、一方、１０質量％以下であることが好ましい。ただし、本実施形態に係る含水エタノール製剤が水溶性アルコールを含む場合、含水エタノール製剤を構成する各成分の総量が１００質量％を超えないものとする。また、リゾチーム加工品等の安定性をより保持することができる点で、本実施形態に係る含水エタノール製剤がエタノール以外の水溶性アルコールを含む場合、エタノールの含有量に対するエタノール以外の水溶性アルコールの含有量は質量比で１／７００以上１／５以下であることが好ましい。

本実施形態に係る含水エタノール製剤の水の含有量は１０質量％以上５０質量％以下であることが好ましく、下限値は１５質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがさらに好ましく、一方、上限値は４０質量％以下であることが好ましく、３０質量％以下であることがさらに好ましい。ただし、本実施形態に係る含水エタノール製剤は、含水エタノール製剤を構成する各成分の総量が１００質量％を超えないものとする。また、リゾチーム加工品等の溶解性をより高めることができる点で、本実施形態に係る含水エタノール製剤において、エタノールの含有量に対する水の含有量は質量比で１／１０以上であることが好ましく、また１／１以下であることが好ましく、１／３以上１／１以下であることがより好ましい。

［その他の素材］
本実施形態に係る含水エタノール製剤において、上記リゾチーム加工品等、エタノール及び水以外にその他の配合素材を含有することができる。

その他の素材としては、例えば、グリシン、有機酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、デヒドロ酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化アルキルジアミノエチルグリシン、ヨードチンキ、ポピドンヨード、セチル酸化ベンザルコニウム、トリクロサン、クロルキシレノール、イソプロピルメチルフェノール、ε−ポリリシン、ラクトフェリン、ナイシン、バクテリオシン、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、酵素分解ハトムギ抽出物、しらこタンパク抽出物、ツヤプリシン、ペクチン分解物等の静菌剤を本発明の効果を損なわない範囲で適宜組み合わせて使用することができる。

本実施形態に係る含水エタノール製剤はさらに、クエン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤、トコフェロール酢酸エステル等の酸化防止剤、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース等の増粘剤などの添加剤、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤を必要に応じて含有していてもよい。

［剤型］
本実施形態に係る含水エタノール製剤の粘度（例えば１〜１００，０００ｍＰａ・ｓ）は使用方法に応じて適宜定めることができる。例えば、噴霧可能な粘度の液剤とし、トリガースプレーヤー、ポンプ容器、スクイズ容器、エアゾル容器等の容器に充填することにより、本実施形態に係る含水エタノール製剤を含む液滴を、手指、食品、調理器具、住居環境、嘔吐物、排泄物等に噴霧することにより、菌の不活化を手軽に行うことができる。すなわち、上記容器は、本実施形態に係る含水エタノール製剤を含む。

また、本実施形態に係る含水エタノール製剤に、不活化の対象物（例えば、手指、食品、医療機器、医療器具、調理器具、住居環境）を浸すことにより、菌の不活化を手軽に行うことができる。

また、本実施形態に係る含水エタノール製剤を不織布に含浸させたシートの形態で使用することができる。すなわち、上記不織布は、本実施形態に係る含水エタノール製剤が含浸されている。この場合、不織布の材質としては、例えば、紙、繊維が挙げられる。本実施形態に係る含水エタノール製剤を不織布に含浸させたシートシートを対象物の表面に接触させることにより、菌の不活化を手軽に行うことができる。

さらに、本実施形態に係る含水エタノール製剤をローション状又はジェル状とすることにより、化粧品、あるいは、医薬品又は医薬部外品である皮膚外用剤として使用することができる。

［一具体例］
本実施形態に係る含水エタノール製剤の一具体例は、リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品並びにエタノール及び水を含み、前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が固形分換算で０．１質量％以上５質量％以下であり、前記エタノールの濃度が４０質量％以上９０質量％以下である。この場合、前記含水エタノール製剤を２５℃で１ヵ月保存した後の波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上である。

＜リゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法＞
本発明の一実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法は、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であるリゾチーム加工品及び／又はその塩を製造する方法であって、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超であり、ｐＨが５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチームの水溶液を、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になるまで加熱する第１の加熱工程（以下、単に「第１の加熱工程」ともいう。）と、前記第１の加熱工程の後に、７０％未満の極小値まで加熱した後、さらに該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になるまで該水溶液を加熱する第２の加熱工程（以下、単に「第２の加熱工程」ともいう。）と、前記第２の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える状態で該水溶液をさらに加熱する第３の加熱工程（以下、単に「第３の加熱工程」ともいう。）と、を含む。

本実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法によれば、前記第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程によって、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であるリゾチーム加工品及び／又はその塩を得ることができ、かつ、上記リゾチームの製造方法によって得られたリゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合することにより、該リゾチーム加工品及び／又はその塩を含む、透明性に優れた含水エタノール製剤を得ることができる。

（加熱のメカニズム）
図１は、本実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法において、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程での加熱時間と透過率との関係を模式的に表す図である。本発明者らは、リゾチームを含む水溶液を加熱する際に、波長６６０ｎｍの光の透過率が加熱時間に応じて図１に示すように変化することを見出した。当該透過率の変化は主に、得られるリゾチーム加工品の表面疎水性の変化及び水溶性の変化（水溶性の低下及びこれに続く水溶性の増加）に起因すると推測される。

図１に示されるように、第１の加熱工程によって、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超である水溶液の該光の透過率が低下して７０％になる。より具体的には、第１の加熱工程によって、水溶液の透明度が低下する。

また、第２の加熱工程によって、図１に示されるように、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率は７０％から７０％未満の極小値まで低下した後で、７０％まで上昇する。すなわち、この場合、目視にて水溶液の白濁及び／又は沈殿が確認された後（言い換えれば、該水溶液の透過率（透明性）が低下した後）、該白濁及び／又は沈殿が次第に消失する（言い換えれば、該水溶液の透過率（透明性）が上昇する）ことができる。

さらに、第３の加熱工程では、第２の加熱工程によって７０％となった前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える値に増加した後、該透過率が７０％を超える状態で該水溶液をさらに加熱する。より具体的には、第３の加熱工程においては、該水溶液中に白濁及び／又は沈殿が生じない（言い換えれば、該水溶液の透過率（透明性）が維持されている）ことが好ましい。

［第１の加熱工程］
第１の加熱工程の加熱対象は、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、通常１００％以下）であり、ｐＨが５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチーム及び／又はその塩の水溶液である。

第１の加熱工程によって、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になることは、該水溶液の透過率が低下することを意味し、例えば、目視にて該水溶液の白濁を確認することができる。

すなわち、第１の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造及び／又はリゾチームの表面の表面疎水性が上昇し、疎水性部分が引き合い凝集して、前記水溶液中のリゾチームの溶解性が低下する結果、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超から７０％に低下すると推測される。

（原料）
第１の加熱工程において水溶液中で使用する、原料であるリゾチーム及び／又はその塩は、上述した含水エタノール製剤の欄で例示したリゾチームを使用することができる。低コストで入手容易である点から、原料であるリゾチーム及び／又はその塩は卵白リゾチームであるのが好ましい。

（原料の濃度）
リゾチームの立体構造を確実に変化させることができ、かつ、リゾチームの凝集を防止して、得られる含水エタノール製剤の透明性を高めることができる点で、第１の加熱工程において、水溶液中のリゾチームの濃度は０．５質量％以上であることが好ましく、１質量％以上であることがより好ましく、一方、７質量％以下であることが好ましく、５質量％以下であることがより好ましい。

（リゾチーム及び／又はその塩の水溶液）
リゾチーム及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒は水であるが、リゾチーム及び／又はその塩の水への溶解性に影響しない範囲で水と混和する有機溶媒を含有してもよい。リゾチーム及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒における水の割合は通常８０質量％以上１００質量％以下である。また、リゾチーム及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒が、水と混和する有機溶媒を含む場合、リゾチーム及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒における該有機溶媒の割合は通常１質量％以上２０質量％以下である。

前記有機溶媒としては、水と混和する有機溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１、４−ジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が挙げられ、これらを単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。

（ｐＨ）
リゾチームの凝集を防止して、得られる含水エタノール製剤の透明性を高めることができ、かつ、得られるリゾチーム加工品の表面疎水性を高めることができる点で、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程において、前記水溶液のｐＨは５．０以上ことが好ましく、５．０を超えるのがより好ましく、５．５以上であることがさらに好ましく、一方、７．０以下であることが好ましく、６．５以下であることがより好ましい。

また、必要に応じて、酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、酢酸、リン酸等の有機酸）、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基）又は緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）を使用して、前記水溶液を上記範囲のｐＨに調整してもよい。

例えば、リゾチームがリゾチームの塩（例えば塩化リゾチーム）である場合、酸、アルカリ又は緩衝液を使用して、水溶液のｐＨを上記範囲のｐＨに調整したうえで、第１の加熱工程を行うことが好ましい。

［第２の加熱工程］
第２の加熱工程において、第１の加熱工程で得られた水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％から７０％未満の極小値になり、さらに７０％になるように加熱するとは、第１の加熱工程で得られた水溶液の透過率がさらに低下した後増加に転じ、目視で次第に透明になっていくことを確認できることをいう。

すなわち、第２の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造がさらに変化し、リゾチームの表面疎水性がさらに高まるにつれて、リゾチームの水溶性がが一旦低下した後に高まる結果、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になると推測される。

第２の加熱工程においてリゾチームの表面疎水性がさらに高まるにつれて、リゾチームの水溶性が一旦低下した後に高まるメカニズムは明らかでないが、第２の加熱工程によって、第１の加熱工程において生じたリゾチームの凝集がさらに進行し、次いで凝集したリゾチーム同士が結合して線状の凝集体に変化し、この凝集体が前記水溶液に溶解するため、表面疎水性が高められつつ、前記水溶液中のリゾチームの溶解性が上昇するためであると推測される。

図１に示されるように、第２の加熱工程によって、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率は７０％から７０％未満の極小値まで低下した後で、７０％まで上昇する。前記水溶液中のリゾチームの立体構造をより確実に変化させることができる点で、第２の加熱工程による、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率の極小値は６０％未満であることが好ましく、５０％未満であることがより好ましい（通常０％以上）。

第２の加熱工程は第１の加熱工程の後に引き続いて行うことができる。すなわち、第２の加熱工程は第１の加熱工程と連続的に行うことができる。

［第３の加熱工程］
第３の加熱工程では、前記第２の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える状態で該水溶液をさらに加熱する。第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程により、リゾチーム加工品及び／又はその塩を得ることができる。

すなわち、第３の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造がさらに変化し、リゾチームの水溶性を維持した状態で、リゾチームの表面疎水性がさらに高められる結果、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える値を維持することができると推測される。

前記水溶液中のリゾチームの立体構造をより確実に変化させることができる点で、第３の加熱工程は、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７５％以上になるまで加熱することがより好ましく、８０％以上になるまで加熱することがより好ましい（通常１００％以下である）。

さらに、第３の加熱工程は、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になるまで加熱することが好ましく、９０％以上になるまで加熱することがより好ましい（通常１００％以下である）。

第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になることは、第３の加熱工程で得られたリゾチーム加工品及び／又はその塩の表面疎水性及び水溶性がより高められることを意味し、換言すれば、該リゾチーム加工品及び／又はその塩がエタノール及び水への溶解性により優れていることを意味する。より具体的には、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であるリゾチーム加工品及び／又はその塩が得られた指標とすることができる。

第３の加熱工程は第２の加熱工程の後に引き続いて行うことができる。すなわち、第３の加熱工程は第１の加熱工程及び第２の加熱工程と連続的に行うことができる。

第３の加熱工程において、前記透過率が７０％を超える状態でさらに加熱されて透明化した水溶液は、室温に戻しても該透過率を維持することができる（言い換えれば、透明性を維持することができる）。その原因としては、該水溶液中に含まれるリゾチーム加工品等の形態である線状の凝集体の立体構造が室温でも維持されているためであると推測される。

（加熱温度及び加熱時間）
本実施形態に係る含水エタノール製剤の製造方法における、リゾチーム加工品及び／又はその塩の製造において、高い収率を達成することができ、かつ、該水溶液を第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程でそれぞれ規定される透過率に調整できる点で、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程における該水溶液の中心品温を７０℃以上となるように加熱することが好ましく、製造時間を短縮できる点で、８０℃以上がより好ましく、９０℃以上がさらに好ましく、通常、１３０℃以下であってもよく、さらには約１００℃以下であってもよい。なお、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程における加熱時間は、加熱温度及び処理量に応じて各工程で規定する透過率を満たすように適宜決定することができる。

より具体的には、第１の加熱工程と第２の加熱工程を同じ加熱温度で連続して行う場合、第１の加熱工程における加熱時間及び第２の加熱工程における加熱時間は、合計で中心品温が７０℃以上７５℃以下の場合は５分間以上１２０分間以下、中心品温が７５℃超８０℃以下の場合は５分間以上７５分間以下、中心品温が８０℃超８５℃以下の場合は５分間以上６５分間以下、中心品温が８５℃超９０℃以下の場合は５分間以上４５分間以下、中心品温が９０℃超９５℃以下の場合は５分間以上３５分間以下、中心品温が９５℃超１００℃以下の場合は５分間以上２０分間以下であることが好ましい。

第３の加熱工程における加熱時間は、中心品温が７０℃以上７５℃以下の場合は５分間以上６００分間以下、中心品温が７５℃超８０℃以下の場合は５分間以上３６０分間以下、中心品温が８０℃超８５℃以下の場合は５分間以上２４０分間以下、中心品温が８５℃超９０℃以下の場合は５分間以上１９５分間以下、中心品温が９０℃超９５℃以下の場合は５分間以上１５０分間以下、中心品温が９５℃超１００℃以下の場合は５分間以上１００分間以下であることが好ましい。

第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程を同じ加熱温度で連続して行う場合、第１の加熱工程における加熱時間及び第２の加熱工程における及び第３の加熱工程における加熱時間は、合計で中心品温が７０℃以上７５℃以下の場合は１２５分間以上７２０分間以下、中心品温が７５℃超８０℃以下の場合は８０分間以上４３５分間以下、中心品温が８０℃超８５℃以下の場合は７０分間以上３０５分間以下、中心品温が８５℃超９０℃以下の場合は５０分間以上２４０分間以下、中心品温が９０℃超９５℃以下の場合は４０分間以上１８５分間以下、中心品温が９５℃超１００℃以下の場合は２５分間以上１２０分間以下であることが好ましい。すなわち、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超であり、ｐＨが５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチーム及び／又はその塩の水溶液を上記各中心品温にて各加熱時間加熱することにより、上記実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩を得ることができる。

[含水エタノール製剤を得る工程]
本実施形態に係る製造方法では、含水エタノール製剤を得る工程によって、上記実施形態に係る含水エタノール製剤を得ることができる。

本実施形態に係る製造方法において、透明性により優れた含水エタノール製剤を得ることができる点で、含水エタノール製剤を得る工程において、該含水エタノール製剤におけるリゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で好ましくは０．１質量％以上５質量％以下（より好ましくは０．２質量％以上、さらに好ましくは０．５質量％超、例えば０．６質量％以上であり、特に好ましくは０．７質量％以上、一方、より好ましくは４質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下）となるように、前記エタノールと前記第３の加熱工程で得られた前記水溶液とを混合するのが好ましい。この場合、上記実施形態に係る含水エタノール製剤の欄で例示された他の成分をさらに混合することができる。

また、本実施形態に係る含水エタノール製剤を得る製造方法において、殺菌効果を有し、透明性により優れた含水エタノール製剤を得ることができる点で、例えば、含水エタノール製剤を得る工程において、該含水エタノール製剤におけるエタノールの濃度が好ましくは４０質量％以上９０質量％以下（より好ましくは５０質量％以上、さらに好ましくは５５質量％以上、さらに好ましくは６５質量％以上、一方、より好ましくは８０質量％以下、さらに好ましくは７５質量％以下）となるように、前記エタノールと前記第３の加熱工程で得られた前記水溶液とを混合することが好ましい。

＜リゾチーム加工品及び／またはその塩＞
本発明の一実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩は、上記実施形態に係る含水エタノール製剤の欄において記載された通りであり、下記定義によって規定される蛍光強度が４，０００以上（好ましくは４，５００以上、より好ましくは５，０００以上）である。前記蛍光強度は、前記リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度の値である。なお、リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．０５質量％であり、リン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液で希釈するとは、具体的には、例えばリゾチーム加工品及び／又はその塩を固形分換算で１質量％含有する水溶液の蛍光強度を測定する場合、前記水溶液５ｇと０．２５Ｍのリン酸緩衝液８０ｍＬを１００ｍＬのメスフラスコに入れた後、精製水で１００ｍＬにメスアップすることで調整されることをいう。

（蛍光強度）
本発明で規定されるリゾチーム加工品及び／又はその塩の蛍光強度は、リゾチーム加工品及び／又はその塩の表面疎水性の指標である。すなわち、本発明で規定されるリゾチーム加工品及び／又はその塩の蛍光強度が高いほど、リゾチーム加工品及び／又はその塩の表面疎水性が高く、リゾチーム加工品及び／又はその塩の表面疎水性が高いと言える。

通常、蛋白質の表面疎水性を高めると、蛋白質の疎水性部分同士が引き合い、凝集するため、水やエタノールへの溶解性が低下する。しかしながら、本実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩は、表面疎水性が高いにもかかわらずエタノールへの溶解性に優れており、かつ、水溶性を有するという特徴を有する。

本実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩が、エタノールへの溶解性及び水溶性の双方に優れている原因は明らかではないが、リゾチーム加工品及び／又はその塩は表面疎水性に優れているため、エタノールへの溶解性に優れており、かつ、リゾチーム加工品及び／又はその塩が水及び／又はエタノール中で水溶性を有する凝集体として該エタノールに溶解しているので、水溶性に優れているためであると推測される。

（製造方法）
本実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩は、上記実施形態に係る含水エタノール製剤の製造方法の欄に記載された第１加熱工程、第２加熱工程及び第３加熱工程によって製造することができる。

なお、本実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法において、前記第３の加熱工程の後に、前記水溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥させて、粉末状のリゾチーム加工品及び／又はその塩を得る工程をさらに含むことができる。

噴霧乾燥及び凍結乾燥は、常法に則り行うとよい。

＜含水エタノール製剤の製造方法＞
本実施形態に係る含水エタノール製剤の製造方法は、上記実施形態に係るリゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法によって得られた、上記リゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程（以下、単に「含水エタノール製剤を得る工程」ともいう。）と、を含む。すなわち、上記実施形態に係る含水エタノール製剤は、上記製造方法によって得ることができる。

この場合、前記含水エタノール製剤を得る工程において、該含水エタノール製剤におけるリゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で好ましくは０．１質量％以上５質量％以下（より好ましくは０．２質量％以上、０．５質量％超、例えば０．６質量％以上であることがさらに好ましく、０．７質量％以上であることが最も好ましく、一方、より好ましくは４質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下）となるように、前記エタノール及び水と前記リゾチーム加工品及び／又はその塩とを混合してもよい。この場合、上記実施形態に係る含水エタノール製剤の欄で例示された他の成分をさらに混合することができる。

前記含水エタノール製剤を得る工程において、該含水エタノール製剤におけるエタノールの濃度が好ましくは４０質量％以上９０質量％以下（より好ましくは５０質量％以上、さらに好ましくは５５質量％以上、さらに好ましくは６５質量％以上、一方、より好ましくは８０質量％以下、さらに好ましくは７５質量％以下）となるように、前記エタノール及び水と前記リゾチーム加工品及び／又はその塩とを混合してもよい。

＜含水エタノール製剤の使用方法（菌の不活化方法）＞
本実施形態に係る含水エタノール製剤を、菌を不活化する対象領域へ噴霧又は塗布したり、菌を不活化する対象物と混合したり、摂取させる等の方法（菌を不活化する方法）をとることができる。

＜作用効果＞
本実施形態に係る含水エタノール製剤は、リゾチーム加工品等を含有するため、菌の不活化に有用であり、かつ、該リゾチーム加工品等が水及びエタノールへの溶解性に優れているため、該リゾチーム加工品等が該含水エタノール製剤中で沈殿しにくく、透明性に優れているため、食器や器具を着色しないため、幅広く使用できる。

以下、試験例により本発明を具体的に説明する。
［実施例１］
清水９８０ｇにリゾチーム（鶏卵卵白を原料とする卵白リゾチーム）２０ｇを添加、混合し、該リゾチームの２質量％水溶液を調製した。その後、前記水溶液を中心品温８０℃で１０分間加熱した結果、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％に低下した（第１の加熱工程）。次いで、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％未満の極小値（２０％）になるまで加熱した後、さらに該水溶液の光の透過率が７０％になるまで中心品温８０℃で加熱し、第２の加熱工程で６０分間の加熱処理を行った（第２の加熱工程）。次いで、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が上昇し、７０％超を維持した状態で該水溶液を中心品温８０℃で２０分間加熱した（第３の加熱工程）。これにより、リゾチーム加工品を２質量％含有する水溶液を得た。

なお、第３加熱工程後の水溶液の透過率は９６％であり、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した水溶液をエタノールと質量比で１：１にて混合したときの透過率は９７％であった。

得られたリゾチーム加工品の２質量％水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、得られたろ液９８ｇをエタノール１００ｇ、グリセリン１ｇ、及びグリセリン脂肪酸エステル１ｇと混合し、試験番号１の含水エタノール製剤を得た。

表１に示す条件、すなわち、リゾチーム水溶液のｐＨ、リゾチーム濃度、加熱時間、加熱時の中心品温を変更した以外は試験番号１と同様の方法によって、試験番号２ないし２５のリゾチーム加工品を調製した。なお、試験番号２２の含水エタノール製剤は、リゾチーム加工品を０．０５質量％含有する水溶液を凍結乾燥することにより、リゾチーム加工品の濃度を２質量％に濃縮した後、エタノール等と混合することにより調製した。

次いで、リゾチーム加工品の量、エタノールの量及び水の量を変更して、リゾチーム加工品の濃度及びエタノールの濃度を表１に示す値とした以外は試験番号１と同様の方法により、各リゾチーム加工品を含む、試験番号２ないし２５の含水エタノール製剤（粘度：３ｍＰａ・ｓ）を調製した。なお、表１の各含水エタノール製剤の総量から、リゾチーム加工品、エタノール、グリセリン、及びグリセリン脂肪酸エステルの各量を差し引いた値に基づいて、該含水エタノール製剤中の水の濃度を算出することができる。

なお、各試験番号における含水エタノール製剤及び水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率は、吸光光度計（型名「ＵＶ−２４５０」、株式会社島津製作所製）によって測定された。表１では、各試験番号における第１の加熱工程の前の水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率（％）、第２の加熱工程中での波長６６０ｎｍの光の透過率の極小値（％）、ならびに加熱終了時の水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率（すなわち、第３の加熱工程後の水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率）（％）を示している。なお、試験番号１ないし２５では、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程を連続して行っており、表１の加熱時間は第１、第２及び第３の加熱工程における加熱時間の合計である。

また、表１において、含水エタノール製剤の透明さは、以下の基準によって評価された。なお、試験番号２３については、リゾチーム加工品が含水エタノール製剤中で沈殿したため、含水エタノール製剤についての評価は行わなかった。
○：目視にて、濁り又は沈殿物が確認されなかった。
×：目視にて、濁り又は沈殿物が確認された。

試験番号１ないし１６は、加熱前の水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超であり、ｐＨが５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチーム及び／又はその塩の水溶液を、第１の加熱工程によって、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になるまで該水溶液を加熱し、次いで、第２の加熱工程によって、前記水溶液が一旦白濁した後、白濁が次第に消失して透明性が高くなる（波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％となる）まで該水溶液を加熱し、次いで、第３の加熱工程によって、該水溶液の透明性を維持しながら（前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える状態を維持しながら）該水溶液を加熱することにより、リゾチーム加工品を得た。

また、試験番号１ないし１６のリゾチーム加工品を得るための製造工程において、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上であった。

これに対して、試験番号１７ないし２５のリゾチーム加工品を得るための製造工程において、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％未満であった。

また、表１に示していないが、試験番号１ないし１６の含水エタノール製剤はいずれも、２５℃で１か月保存した後の波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上であったことが確認された。

これに対して、試験番号１７ないし２５の含水エタノール製剤は、２５℃で１か月保存した後の波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％未満であった。

なお、試験番号１７および１８では、水溶液における前記光の透過率が７０％未満（２０％）に低下した後、再び７０％以上には上昇しなかった。また、試験番号２０では、水溶液における前記光の透過率が７０％未満（１５％）に低下した後、４０％まで上昇したものの、７０％以上まで上昇しなかった。また、試験番号２１では、水溶液における前記光の透過率が７０％未満（２０％）に低下した後、５０％まで上昇したものの、７０％以上まで上昇しなかった。また、試験番号２３では、水溶液における前記光の透過率が７０％未満（１０％）に低下した後、加熱を続けても該透過率は１０％のままであった。また、試験番号２４では、水溶液における前記光の透過率が７０％未満（２０％）に低下した後、５２％まで上昇したものの、７０％以上まで上昇しなかった。

［試験例２］
試験番号１で得られたリゾチーム加工品の水溶液及び試験番号１における加熱時間を変えて得られたリゾチーム加工品の水溶液について電気泳動を行った。

より具体的には、卵白リゾチームの２質量％水溶液を加熱温度８０℃にて加熱時間０分、１５分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分時点にて採取した該水溶液５０μＬにサンプルバッファー９５０μＬを加え、１００℃で１０分間加熱した後、氷冷し、１０μＬ（リゾチーム加工品として１０μｇ）を電気泳動ゲルにチャージした。なお、サンプルバッファーとして２−メルカプトエタノールを加えていないもの（非還元）を使用した。電気泳動のゲルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（テフコ株式会社製、ゲル濃度４−１０％、ゲル厚１ｍｍ）を使用し、２０ｍＡの定電流で泳動した。染色液にはクマシーブルーＲ２５０を用いた。

図２は、電気泳動の結果を示す写真である。図２に示すように、加熱時間６０分、９０分、及び１２０分時点にて、約２９ＫＤａの蛋白質（二量体と推測）及び／又は約３６．５ＫＤａの蛋白質（三量体と推測）を示すバンドが明らかに検出された。また、図２に示すように、加熱時間が長いほど、これらの蛋白質を示すバンドが濃くなる（すなわち、生成する前記蛋白質の量が増加する）ことが確認された。このことから、同一の加熱温度においては、加熱時間が長いほど、該蛋白質の表面疎水性が増加し、エタノールへの溶解性が高い蛋白質が得られると推測される。

また、試験番号１ないし１６の含水エタノール製剤は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の不活化効果を有していることが確認された。

［配合例１］
試験番号１で得られた含水エタノール製剤と下記の成分とを配合したジェル状の消毒剤（含水エタノール製剤）を調製し、ポンプ式容器に充填した。
含水エタノール製剤（試験番号１） ５０質量％
エタノール ４８質量％
グリセリン １質量％
カルボキシビニルポリマー １質量％

［配合例２］
下記の配合比にて、試験番号１０で得られた含水エタノール製剤と下記の成分との混合物を不織布に含浸させて、ウエットティシュを調製した。
含水エタノール製剤（試験番号１０） ９９質量％
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油 １質量％

［配合例３］
下記の配合比にて、試験番号１６で得られた含水エタノール製剤と下記の成分との混合物を調製した後、スプレー式容器に充填した。
含水エタノール製剤（試験番号１６） ９９質量％
グリセリン ０．５質量％
グリセリン脂肪酸エステル ０．５質量％

本発明の含水エタノール製剤は、例えば、手指、体躯、医療器具、学校，病院，福祉施設等の施設、工場、住居等の消毒を行う消毒剤、食品添加物、菌の除去剤として有用である。

本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成、例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims (17)

1. リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品を含有し、
   下記に規定される蛍光強度が５，５００以上である、含水エタノール製剤。
   蛍光強度：前記含水エタノール製剤を、前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度
2. 請求項１において、
   波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上である、含水エタノール製剤。
3. 請求項１又は２において、
   前記含水エタノール製剤を２５℃で１ヵ月保存した後の波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上である、含水エタノール製剤。
4. 請求項１ないし３のいずれか１項において、
   エタノールの濃度が４０質量％以上９０質量％以下である、含水エタノール製剤。
5. 請求項１ないし４のいずれか１項において、
   前記リゾチーム及び／又はその塩、あるいはこれらの加工品の濃度が固形分換算で０．１質量％以上５質量％以下である、含水エタノール製剤。
6. 請求項１ないし５のいずれかにおいて、
   エタノール以外の水溶性アルコールをさらに含有する、含水エタノール製剤。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項において、スプレー式容器に充填された、含水エタノール製剤。
8. 請求項１ないし６のいずれか１項において、ポンプ式容器に充填された、含水エタノール製剤。
9. 請求項１ないし６のいずれか１項において、不織布に含浸させた、含水エタノール製剤。
10. 下記定義によって規定される蛍光強度が４，０００以上である、リゾチーム加工品及び／又はその塩：
    蛍光強度：前記リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が０．０５質量％になり、且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加して得られる液を３０分間室温で反応させた後の該液について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度
11. 請求項１０に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩を製造する方法であって、
    波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超であり、ｐＨが５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチーム及び／又はその塩の水溶液を、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になるまで加熱する第１の加熱工程と、
    前記第１の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０未満の極小値まで加熱した後、７０％になるまで該水溶液を加熱する第２の加熱工程と、
    前記第２の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える状態で該水溶液をさらに加熱する第３の加熱工程と、を含む、リゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法。
12. 請求項１１において、
    前記第３の加熱工程の加熱条件が、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になるまで加熱する条件である、リゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法。
13. 請求項１１又は１２において、
    前記第３の加熱工程の後に、前記水溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥させて、粉末状のリゾチーム加工品及び／又はその塩を得る工程をさらに含む、リゾチーム加工品及び／又はその塩の製造方法。
14. 請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載の製造方法で得られたリゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程を含む、含水エタノール製剤の製造方法。
15. 請求項１０に記載のリゾチーム加工品及び／又はその塩とエタノール及び水とを混合して、含水エタノール製剤を得る工程を含む、含水エタノール製剤の製造方法。
16. 請求項１４又は１５において、
    前記含水エタノール製剤を得る工程において、前記含水エタノール製剤における前記リゾチーム加工品及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．１質量％以上５質量％以下となるように、リゾチーム加工品とエタノール及び水とを混合する、含水エタノール製剤の製造方法。
17. 請求項１４ないし１６のいずれか１項において、
    前記含水エタノール製剤を得る工程において、前記含水エタノール製剤におけるエタノールの濃度が４０質量％以上９０質量％以下となるように、前記リゾチーム加工品及び／又はその塩と前記エタノール及び水とを混合する、含水エタノール製剤の製造方法。

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