JP2016010357A - カゼイン加水分解物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、これらの医薬品は、満月様顔貌、骨粗鬆症、胃腸炎等の様々な副作用を示すことも知られており、副作用が少なく、かつ、抗炎症活性を有する新規な物質が求められていた。
KPV配列からなるトリペプチドは、α型メラニン細胞刺激ホルモン(以下、α−MSHという)のカルボキシ末端配列である。α−MSHは、インターロイキン8により引き起こされる炎症現象を抑制し、抗炎症活性を示すことが知られており、α−MSHの活性シグナルは、そのカルボキシ末端配列であるKPV配列に局在化している。また、KPV配列からなるトリペプチドは、単独で抗炎症活性を有することも知られている。
しかしながら、KPV配列からなるトリペプチドの製造方法については、工業的に有用なものとすることができる程度の収率や安定性が得られる方法が未だ見出されていない。
アスペルギルス属微生物由来の酵素と、
パンクレアチンと、
を用いてカゼインを分解することにより、Lys−Pro−Val(KPV)配列からなるペプチドを、トリペプチドの状態で含むカゼイン加水分解物を製造する、カゼイン加水分解物の製造方法を提供する。
また、本技術に係る製造方法において、前記アスペルギルス属微生物由来の酵素は、前記パンクレアチンと同時、又は、前記パンクレアチンを添加後、に用いることができる。
本技術に係る製造方法において、前記アスペルギルス属微生物由来の酵素の使用量の下限は特に限定されないが、カゼインに対して3.0質量%以上とすることができる。
また、前記パンクレアチンの使用量の下限も特に限定されないが、カゼインに対して0.02質量%以上とすることができる。
本技術に係る製造方法において、前記アスペルギルス属微生物由来の酵素の使用量の上限も特に限定されないが、カゼインに対して20.0質量%以下とすることができる。
また、前記パンクレアチンの使用量の上限も特に限定されないが、カゼインに対して15.0質量%以下とすることができる。
本技術に係る製造方法によって得られる前記カゼイン加水分解物は、前記ペプチドをトリペプチドの状態で含有するが、その含有量も特に限定されず、例えば、0.012質量%以上含有するカゼイン加水分解物を得られるように、各酵素の添加量などを工夫することができる。
本技術に係るカゼイン加水分解物の製造方法は、アスペルギルス属微生物由来の酵素と、パンクレアチンと、を用いてカゼインを分解することを特徴とする。
本技術は、アスペルギルス属微生物由来の酵素及びパンクレアチンを併用することで、Lys−Pro−Val配列からなるペプチド(以下、「KPV配列からなるトリペプチド」ともいう。)をトリペプチドの状態で含むカゼイン加水分解物を、効率よく、かつ、安定的に製造することができる。
原料であるカゼインは、乳由来の蛋白質を主成分とするものであり、該カゼインは特に限定されないが、例えば、市販の各種カゼイン、カゼイネート等が利用することができる。
具体的には、乳酸カゼイン、硫酸カゼイン、塩酸カゼイン、ナトリウムカゼイネート、カリウムカゼイネート、カルシウムカゼイネート、マグネシウムカゼイネート又はこれらの任意の混合物等が挙げられる。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から常法により精製したカゼイン等を利用することもできる。
本技術に係る製造方法において用いることが可能なアスペルギルス属微生物由来の酵素としては、通常、医薬品・食品分野において用いることができるアスペルギルス属微生物由来の酵素を、1種又は2種以上自由に選択して用いることができる。例えば、Aspergillus oryzae、Aspergillus glaucus、Aspergillus sojae、Aspergillus tamari、Aspergillus awamoriなどを挙げることができる。本技術においては、この中でも特に、Aspergillus oryzaeを用いることが好ましい。
パンクレアチンは、哺乳類の膵臓から得られる様々な生理活性成分の混合物であり、トリプシン、キモトリプシン、リパーゼ、アミラーゼ、その他多くの酵素を含み、デンプン、脂肪、タンパク質のすべてに有効な消化酵素の混合物である。古くから、消化機能障害時などに、安全性が高い治療剤として医薬品組成物などに使用されている。通常、パンクレアチン製剤は、ウシやブタなどの膵臓から抽出されたパンクレアチンが用いられており、本技術においても、医薬品・食品分野において用いることができるパンクレアチンを自由に選択して用いることができる。
しかし、KPV配列からなるトリペプチドを切り出すことが不可能なパンクレアチンを、アスペルギルス属微生物由来の酵素と併用してカゼインを分解することにより、意外にも、KPV配列からなるトリペプチドを、高効率で切り出すことが可能であることを突き止めた。
本技術に係るカゼイン加水分解物の製造方法は、アスペルギルス属微生物由来の酵素と、パンクレアチンと、を用いてカゼインを分解し、KPV配列からなるペプチドを、トリペプチドの状態で含むカゼイン加水分解物を製造できれば、詳細な工程については特に限定されず、公知のカゼイン加水分解物の製造方法で用いられる様々な工程を自由に選択して採用することができる。以下、製造方法の一例について、具体的に説明する。
まず、原料(カゼイン)を水などの溶媒に溶解又は分散させ、カゼイン溶液を調製する。
溶媒は特に限定されないが、蒸留水を用いることが好ましい。
また、前記溶解液の濃度は特に限定されないが、通常、蛋白質換算で5〜15質量%前後の濃度範囲とすることが、効率性及び操作性の点から好ましい。
本技術においては、少なくともアスペルギルス属微生物由来の酵素とパンクレアチンとを併用することを特徴とするため、前記溶解液のpHを、両者の至適pH付近に調整することが考えられる。
具体的には、pH5〜10に調整することが好ましく、pH7〜8に調整することがより好ましい。
次に、前記基質溶液にアスペルギルス属微生物由来の酵素と、パンクレアチンを添加する。
本技術において、アスペルギルス属微生物由来の酵素とパンクレアチンは、同時又はどちらか一方を先に添加することも可能であるが、特に、同時又はパンクレアチンを添加後にアスペルギルス属微生物由来の酵素を添加することが好ましく、同時に添加することがより好ましい。これにより、カゼイン加水分解物中のKPV配列からなるトリペプチドの収率が向上するからである。
その他の蛋白質分解酵素としては、細菌由来、動物由来、植物由来の蛋白質分解酵素等があり、本技術においては、いずれのものも使用することができる。
動物由来の蛋白質分解酵素は特に限定されないが、例えば、トリプシンを主成分とするPTN(ノボザイムズ社製)、トリプシンV(日本バイオコン社製)等が挙げられる。
植物由来の蛋白質分解酵素は特に限定されないが、パパイン(天野エンザイム社製)、ブロメライン(天野エンザイム社製)等が挙げられる。
また、これらの蛋白質分解酵素は、単独又は2種類以上を組み合わせて使用することもできる。
なお、活性単位は、使用するその他の蛋白質分解酵素の種類に応じて測定することが可能である。
本技術においては、少なくともアスペルギルス属微生物由来の酵素とパンクレアチンとを併用することを特徴とするため、両者の作用を十分に発現可能な温度範囲を反応系の温度として決定することが考えられる。
具体的には、反応系の温度を、40〜60℃とすることが好ましく、45〜55℃とすることがより好ましい。
したがって、酵素反応をモニターすることにより、カゼイン加水分解物の理化学的性質が所望の値となるように反応継続時間を決定する。
本技術においては、少なくともアスペルギルス属微生物由来の酵素とパンクレアチンとを併用することを特徴とするため、反応継続時間は、1〜48時間の間で決定することが好ましく、4〜18時間の間で決定することがより好ましい。
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素を失活させることにより行われる。失活処理は、常法、例えば、加熱失活処理等により実施することができる。
加熱失活処理の条件(加熱温度、加熱時間等)は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができる。
本技術においては、アスペルギルス属微生物由来の酵素及びパンクレアチンを併用していることから、例えば、80〜130℃の温度範囲で30分間〜2秒間の保持時間で、これらの酵素を失活させることができる。
酵素反応停止後、得られた加水分解失活液を、(a)濾過、(b)精密濾過、限外濾過膜等の膜分離処理、(c)樹脂吸着分離、(d)カラムクロマトグラフィーからなる群から選択される、いずれか1種又はこれらの2種以上の組合せによって精製することが好ましい。
濾過を行うことにより、前記加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び/又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
なお、濾過の方法には、分子篩いの効果を有するゲル濾過樹脂を用いたゲル濾過クロマトグラフィーも含まれる。
この場合、膜分離処理後の膜透過画分としてカゼイン加水分解物を含有する溶液が得られる。
膜分離処理を行うことにより、(a)の濾過と同様、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び/又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
樹脂吸着分離は、これらの樹脂をカラムに充填して前記加水分解失活液を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記加水分解失活液中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、加水分解失活液と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。
加水分解失活液中には、保存期間中に混濁、沈殿、凝集及び褐変等を惹起する因子(例えば、疎水性アミノ酸を多く含むペプチド等)が残存している可能性があり、樹脂吸着分離を行うことにより、これらの因子を除去できる。
また、精製後、得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液を殺菌してもよい。
殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。
加熱処理時の加熱温度と保持時間は、充分に殺菌できる条件を適宜設定すればよく、例えば、70〜140℃で2秒間〜30分間加熱処理することにより殺菌できる。
加熱殺菌の方式は、バッチ方式、連続方式のいずれの方式も可能であり、連続方式においてもプレート熱交換方式、インフュージョン方式、インジェクション方式等の方式を用いることができる。
更に、得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、該溶液を公知の方法により、濃縮した濃縮液として使用することもできる。また、該濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末にして使用することもできる。
本技術に係る製造方法により得られたカゼイン加水分解物は、様々な医薬品、飲食品、飼料等に配合して使用することができる。本技術に係る製造方法により得られたカゼイン加水分解物は、乳由来の原料を用いているため、生体への安全性が高く、長期間、連続的な摂取にも適している。加えて、生体材料として比較的安価な乳由来の原料から生産しているため、安定して簡便に、しかも大量に製造することができ、需要者に対して安価に提供することも可能である。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル(穀物加工品)等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
本実施例においては、まず、カゼイン加水分解物を調製し、その後、該カゼイン加水分解物について、KPV配列からなるトリペプチドの含有率を測定した。
牛乳由来の乳酸カゼイン(フォンテラ社製)、67.5gを、約60℃に調整した蒸留水430.5gに加えて充分に撹拌した後、水酸化ナトリウム(関東化学社製)を添加してpH8.0に調整し、基質溶液とした。
得られた基質溶液に、アスペルギルス属微生物由来の酵素:Aspergillus oryzae由来酵素プロテアーゼAアマノ(天野エンザイム社製)と、パンクレアチン:豚膵臓由来酵素パンクレアチン×4.0滅菌品(天野エンザイム社製)とを、後述する表1に示す質量比で添加して、55℃で4時間反応させ、次いで85℃で10分間加熱して酵素を失活させ、カゼイン酵素分解物溶液を得た。
得られた酵素分解物溶液を、更に凍結乾燥により乾燥し、粉末状のカゼイン加水分解物を調製した。
得られた粉末状のカゼイン加水分解物を、1mg/mLとなるように、0.2%ギ酸水溶液に希釈溶解し、10分間超音波破砕した後、0.22μm口径のPVDFフィルター(Millipore社製)でろ過し、カゼイン加水分解物溶液を調製した。
また、このカゼイン加水分解物溶液とは別に、KPV配列からなるトリペプチドを有する化学合成標準ペプチド(東レリサーチセンター社製)の、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL溶液をそれぞれ調製し、これらの溶液を下記条件によるLC/MSにより分析した。
・質量分析計:TSQ Quantum Discovery MAX(サーモフィッシャーサイエンス社製)
<高速液体クロマトグラフの構成>
・システムコントローラー:CBM−20A
・オートインジェクター:SIL−20AC
・送液ポンプ:LC−20AD×2
・カラムオーブン:CTO−20AC
・UV/VIS検出器:SPD−20A
・オンラインデガッサ:DGU−20A5(以上、全て島津製作所社製)
・カラム:TSKgel ODS−100V 5μm(2.0mm I.D.×250mm L)(東ソー社製)
<測定条件>
・移動相A:0.2質量% ギ酸−水溶液
・移動相B:0.2質量% ギ酸−アセトニトリル溶液
・タイムプログラム:1% B(0分)〜2% B(7分)〜80% B(10分)〜80% B(15分)〜1% B(17分)〜STOP(20分)
・試料注入量:10μL
・カラム温度:40℃
・イオン化モード:ESI(+)
・液体流量:200μL/min
・スプレー電圧:+4.5kV
・キャピラリー温度:320℃
・シースガス圧:30(Arb)
・補助ガス圧:4(Arb)
・分析モード:SRM測定
・分析範囲:m/z=215.1、226.1(parent m/z=343)
標準ペプチドのピークとピーク面積とを対比することにより、前記粉末溶液中にKPVトリペプチドが含まれる割合を求めた。
アスペルギルス属微生物由来の酵素とパンクレアチンの添加量、及び、各カゼイン加水分解物中のKPVトリペプチド含量の測定結果について、下記表1に示す。
アスペルギルス属微生物由来の酵素とパンクレアチンとを併用することにより生産したカゼイン加水分解物は、KPV配列からなるペプチドをトリペプチドの状態で含むことが明らかとなった。
Claims (7)
- アスペルギルス属微生物由来の酵素と、
パンクレアチンと、
を用いてカゼインを分解することにより、Lys−Pro−Val配列からなるペプチドを、トリペプチドの状態で含むカゼイン加水分解物を製造する、カゼイン加水分解物の製造方法。 - 前記パンクレアチンと同時、又は、前記パンクレアチンを添加後に、前記アスペルギルス属微生物由来の酵素を用いる、
請求項1に記載のカゼイン加水分解物の製造方法。 - 前記アスペルギルス属微生物由来の酵素を、カゼインに対して3.0質量%以上用いる、
請求項1又は2に記載のカゼイン加水分解物の製造方法。 - 前記パンクレアチンを、カゼインに対して0.02質量%以上用いる、
請求項1から3のいずれか一項に記載のカゼイン加水分解物の製造方法。 - 前記アスペルギルス属微生物由来の酵素を、カゼインに対して20.0質量%以下用いる、
請求項1から4のいずれか一項に記載のカゼイン加水分解物の製造方法。 - 前記パンクレアチンを、カゼインに対して15.0質量%以下用いる、
請求項1から5のいずれか一項に記載のカゼイン加水分解物の製造方法。 - 前記カゼイン加水分解物は、前記ペプチドをトリペプチドの状態で0.012質量%以上含有する、
請求項1から6のいずれか一項に記載のカゼイン加水分解物の製造方法。
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