JP2015522156A - 干渉粒子を含有する流体の処理 - Google Patents

Abstract

本発明は、例えば、赤血球（Ｃ）を含む血液の処理のため等、干渉粒子を含有する流体の処理のための方法及び処理装置に関する。磁性粒子（ＭＰ）が、流体に添加され、さらに、ブロッキングゾーン（ＢＺ）を通る干渉粒子（Ｃ）の移動が妨げられる、好ましくは完全に防がれるように、磁場の助けをかりて、ブロッキングゾーン（ＢＺ）において分布される。従って、ブロッキングゾーン（ＢＺ）はフィルタ要素として作用し、ブロッキングゾーン（ＢＺ）によって、干渉粒子（Ｃ）を、例えば、処理チャンバの表面にある検出領域（１１７）から離すことができる。

Description

本発明は、流体の処理のための方法及び処理装置に関し、流体はその処理に干渉する粒子を含有する。

ＷＯ２００８／０４４２１４ Ａ１は、試料流体における標的成分の検出のためのバイオセンサを開示している。磁性粒子が、捕獲抗体を有する表面上の層に乾燥試薬として提供されている。試料流体が加えられると、磁性粒子は、磁性粒子上の結合部位が試料の標的成分に結合することができるように、急速に溶解され且つ流体全体に分布される。磁性粒子は、次に、磁力によって捕獲抗体まで引きつけられ、そこでさらなる結合が起こる。表面に結合した標的成分は、次に、例えば内部全反射（ＦＴＩＲ）によって検出される。

全血のような試料流体が処理される場合、標的成分は血漿の物質であり、血球は、検出プロセスを妨害する粒子であることが多い。従って、血液のような試料は、通常、検出前にフィルタをかけて、妨害粒子を除去しなければならない。

簡単且つ極めて効率的な流体の処理であって、その意図される処理に影響を与え得る粒子を含有する流体の処理を可能にする手段を提供することが、本発明の目的である。

この目的は、請求項１による方法、請求項３による処理装置、及び、請求項１５による使用によって達成される。好ましい実施形態が、従属請求項において開示される。

第１の態様によると、本発明は、粒子を含有する流体の処理のための方法に関する。前記粒子は、何らかの方法で、意図される流体の処理に干渉すると仮定されるため、参照の目的で以下において「干渉粒子」と呼ばれる。前記干渉は典型的には負である（処理を妨げる）けれども、本発明は、干渉粒子が意図される処理を支持し得るか又は前記処理の対象でさえもなり得る正の干渉も含むものとする。干渉粒子は、一般に、単一原子又は単一分子を含み得る。典型的には、干渉粒子は、しかし、約数ナノメートルからミリメートル（以上）の直径を有する、原子のより大きな集合体になる。干渉粒子は、化学的に均一な組成物を有してもよく、又は、生物学的細胞のような複雑な集合体であってもよい。流体の典型的な例は全血であり、処理は、血漿内の標的成分の検出を含み、細胞（例えば、赤血球及び白血球等）は、検出処理を妨害する「干渉粒子」を構成する。

本発明の方法は、以下の、
ａ）処理チャンバ内に処理されることになる流体を提供するステップであって、処理チャンバは、典型的に、空のキャビティ、又は、物質を吸収することができるゲルのようなある物質で満たされるキャビティであり、開いたキャビティ、閉じたキャビティ、又は、流体接続チャネルによって他のキャビティに接続されたキャビティであり得る、ステップと、
ｂ）前述の処理チャンバ内に磁性粒子を提供するステップであって、「磁性粒子」という用語は、永久磁性粒子も、例えば超常磁性ビーズ等の磁化可能粒子も含むものとし、磁性粒子のサイズは、典型的に、３ｎｍから５０μｍに及ぶ、ステップと、
ｃ）処理チャンバ内の、以下において「ブロッキングゾーン」と呼ばれる（二次元又は三次元）ゾーンにおいて前述の磁性粒子を、ブロッキングゾーンを通る干渉粒子の移動が妨げられる、好ましくは防がれるように分布させるステップと、
を含むものとする。

前述の方法のステップは、列挙された順で、又は、いかなる他の適切な順でも実行することができるということに留意されたい。特に、流体に先立ち磁性粒子を提供すること、又は、どちらの成分も同時に提供することが可能である。磁性粒子は、乾燥試薬として又は湿性試薬（すなわち、一部のキャリア流体において溶解されているもの）として提供されてもよい。磁性粒子がブロッキングゾーン内に分布される場合、その磁性粒子は、典型的には、流体において溶解されて処理される。

「ブロッキングゾーン内の磁性粒子の分布」は、
−（例えば、蓄積領域内の集合状態における等、特定の他の配置から始まる）分布された磁性粒子の配置の発生、及び／又は、
−長期間（おそらく、無限の期間）にわたる、特に、意図される処理の１つ又は複数のステップの間のそのような配置の維持、
を意味するものとする。

記載される方法は、処理チャンバ内の干渉粒子の分布が、干渉粒子の移動、従ってその空間分布に影響を与えるブロッキングゾーンを介して制御することができるという利点を有する。干渉粒子が、意図される流体の処理に否定的に影響を与える場合、例えば、処理の領域から離すことができる。干渉粒子が、処理に肯定的に影響を与えるか、又は、処理に対して必要とさえされる場合、その濃度は、それどころか処理の領域において上げてもよい。このように、一種の干渉粒子に関する流体のフィルタリングは、高価で空間浪費する従来のフィルタを必要とすることなく、ブロッキングゾーンによって達成することができる。

ブロッキングゾーン内の磁性粒子の分布は、例えば、拡散及び／又は重力によって駆り立てられてもよい。これは、特に、磁性粒子の濃度及び量が十分高い及び多い（さらに、磁性粒子が、迅速に拡散するように小さ過ぎない）場合に可能である。磁性粒子は、従って、干渉粒子の移動を妨げるのに十分密集した、及び、意図される処理に対して十分長く存在する雲に発展する。重力が磁性粒子を処理チャンバの一表面に向かって導く場合、これは、この表面の前のブロッキングゾーンを安定化させる。

本発明の好ましい実施形態によると、ブロッキングゾーンにおいて磁性粒子の分布を発生させる及び／又は維持する磁場が生じる。磁場は、直接的及び容易な磁性粒子の制御並びにブロッキングゾーンにおけるその分布を可能にする。さらに、この粒子分布の方法は、拡散及び重力とは無関係である。処理チャンバにおけるある表面の前のブロッキングゾーンは、従って、例えば重力が磁性粒子（及び干渉粒子）を前記表面から離れるように導く場合でさえも維持することができる。

第２の態様によると、本発明は、干渉粒子を含有する流体の処理のための処理装置に関し、当該処理装置は、以下の構成要素、
−流体及び磁性粒子を提供することができる処理チャンバ、
−処理チャンバにおいて磁場を発生させるための磁場発生器であって、前記磁場が処理チャンバ内のブロッキングゾーンにおいて磁性粒子を、ブロッキングゾーンを通る干渉粒子の移動が妨げられるように分布させ、例えば、永久磁石又は電磁石を含んでもよい磁場発生器、
を含む。

当該方法及び処理装置は、同じ発明理念、すなわち、磁性粒子のブロッキングゾーンによる干渉粒子の移動の制御における異なる具現化である。これらの具現化のうちの１つに対して提供される説明及び定義は、従って、もう一方の具現化に対しても有効である。

以下において、上記の方法にも処理装置にも関する、本発明の種々の好ましい実施形態が記載される。

ブロッキングゾーンは、干渉粒子の移動を、処理チャンバ内の流体の残りの箇所でのその移動（すなわち拡散又は重力）と比較して妨げるものとする。定量的用語において、これは、ブロッキングゾーンの外側（だが、処理チャンバ内）のある所与の領域を横切る干渉粒子の移行率（１秒あたりの粒子）は、ブロッキングゾーンの内側の同じサイズ及び形状の領域を横切る干渉粒子の移行率よりも大きいものとするということを意味する。ブロッキングゾーンの内側の移行率は、例えば、流体内の「自由な」移行率の約９０％未満、好ましくは約５０％未満であってもよい。最も好ましくは、ゼロの移行率に相当する、干渉粒子がブロッキングゾーンを通って全く移動することができない（流体の他の成分は移動することができる）という意味で、障害は最大か又は最大に近い。

一般に、干渉粒子の移動は、いかなる物理的及び／又は化学的効果によってもブロッキングゾーンにおいて妨げることができる。好ましい実施形態において、磁性粒子は、まさに、ポアを有する従来のフィルタであって、そのポアを介して干渉粒子は、そのサイズに応じて通過することができるか又はできない、従来のフィルタのように作用する。ブロッキングゾーンは、典型的には、磁性粒子の永久的な静的配置を有さないため、従来のフィルタのポアサイズは、ブロッキングゾーンにおける隣接する磁性粒子及び／又は磁性粒子のクラスター（鎖）間の平均距離に相当する。好ましくは、ブロッキングゾーンにおける隣接する磁性粒子及び／又は磁性粒子のクラスター間の平均距離「Δ」は、干渉粒子の平均直径「ｄ」の５倍よりも小さくあるべき（式では、Δ≦５ｄ）であり、最も好ましくは、ｄよりも小さくあるべき（Δ≦ｄ）である。この状況において、ブロッキングゾーンにおける隣接する磁性粒子及び／又は磁性粒子のクラスター間の平均距離は、例えば、隣接する磁性粒子／クラスター間の最短距離として定義し、単純立方晶構造におけるブロッキングゾーン上の全ての磁性粒子／クラスターの均質分布を仮定することができる。１つの干渉粒子の直径は、例えば、干渉粒子に完全に納まる最大の球の直径として定義することができ、「平均直径」は、これらの個々の粒子の直径全ての平均である。隣接する磁性粒子／クラスター間の平均距離Δが十分に小さい場合、ブロッキングゾーンは、干渉粒子に対するフィルタとして作用し、その移行を（ほぼ）完全にブロックする。処理されることになる流体として血液、及び、「干渉粒子」として赤血球がある場合、ブロッキングゾーンにおける磁性粒子間の平均距離Δは、例えば、約２μｍよりも小さくあるべきである。

大量の流体の成分の物理的及び／又は化学的変換若しくは操作を含むいかなる種類の処理も、処理チャンバにおいて流体を用いて行うことができる。好ましい実施形態において、処理のうち少なくとも一部が、処理チャンバの表面上の「処理領域」と呼ばれる領域において起きてもよく、この処理領域は、処理チャンバの全表面上、又は、限定して調製することができる制限された領域のみを延びてもよい。

処理領域を有する前述の実施形態において、ブロッキングゾーンは、前記処理領域の前に置かれ、従って、（ブロッキングゾーンのどちらの側に干渉粒子が捕獲されるかに応じて）処理領域に向かうか又は処理領域から離れる干渉粒子の移動に影響を与えてもよい。従って、処理領域の干渉粒子の濃度は、ブロッキングゾーンの助けをかりて制御することができる。

前述の処理領域は、好ましくは、重力に関してブロッキングゾーンの上に置かれる。干渉粒子の堆積は、従って、処理領域から離れるように向けられ、従って、前記領域からのその分離を支持する。処理領域から離れるようにブロッキングゾーンを動かす、磁性粒子に対する重力の効果は、例えば、磁力によって相殺することができる。

処理領域は、処理されることになる流体の標的成分に対する結合部位を含んでもよい。関心のある成分は、従って、さらなる（表面特異的）操作及び／又は検出ステップのために、処理領域において固定化することができる。

パラメータの検出又はセンシングは、流体の「処理」に対する１つの重要な例である。本発明の好ましい実施形態において、処理装置は、従って、流体の標的成分を検出するための検出ユニットを含んでもよい。上記の実施形態と組み合わせて、検出は、特に、処理チャンバの表面の処理領域において生じてもよく、さらに、特に、結合部位に結合される流体の標的成分に関してもよい。

前述の検出ユニットは、任意で、光学センサ、磁気センサ、メカニカルセンサ、音響センサ、熱センサ及び／又は電気センサを含んでもよい。磁気センサは、特に、コイル、ホールセンサ、プレーナーホールセンサ、フラックスゲートセンサ、ＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉装置）、磁気共鳴センサ、磁気抵抗センサ、又は、ＷＯ２００５／０１０５４３ Ａ１若しくはＷＯ２００５／０１０５４２ Ａ２において記載される種類、特に、ＧＭＲ（巨大磁気抵抗）、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗）若しくはＡＭＲ（異方性磁気抵抗）の磁気抵抗センサを含んでもよい。光学センサは、特に、センシング表面での標的粒子による内部全反射（ＦＴＩＲ）から生じる出力される光ビームにおける差異を検出するように適応されてもよい。この方法は、ＷＯ２００８／１５５７１６ Ａ１、ＷＯ２００９／０１６５３３ Ａ２又はＷＯ２００８／０７２１５６ Ａ２においてより詳細に記載されている。

ブロッキングゾーンは、処理チャンバの内部に置かれ、従って、その周囲にて（干渉粒子にとって）自由な通路を残してもよい。そのような漏れ孔のある構成は実現するのが容易であり、さらに、制限された期間、干渉粒子の所望の不均質な分布を達成するのに十分であり得る。ブロッキングゾーンは、所望の処理ステップが生じていながら干渉粒子を処理領域から効果的に離すように、例えば、一種の（大きな）傘を（小さい）検出領域の前に構成してもよい。

本発明の好ましい実施形態において、ブロッキングゾーンは、処理チャンバを２つの非連結の体積に分けるように、処理チャンバの壁の間を延びる（「非連結」は、ブロッキングゾーンを横断することなく処理チャンバを通る接続通路がないということを意味する）。この方法で、前記２つの体積間の干渉粒子の不均質な分布を、任意に長い間、維持することができる。体積のうち１つが、例えば、上記の処理領域を含む場合、これから干渉粒子を永久に離すことが可能である。

本発明の一実施形態において、処理されることになる流体が加えられる前に、磁性粒子を処理チャンバの表面上に乾燥試薬として配置させてもよい。この方法は、特に、処理チャンバが、例えば、ある検出装置において生物学的試料の調査に使用される使い捨てのカートリッジ等、ある予め作製された要素によって含まれている場合に適している。ユーザは、従って、手近の試料流体を予め作製されたカートリッジに加えなくてはならないだけであり、磁性粒子を添加する別のステップは必要ではない。

前述の実施形態において、処理チャンバがその表面にて処理領域を含む場合、磁性粒子は、特に、前記処理領域上に乾燥試薬として配置されてもよい。流体がこの構成に加えられる場合、処理領域は、磁性粒子が溶けるまで流体から遮蔽されている。しかし、干渉粒子に関する処理領域の遮蔽は、溶けている磁性粒子がすぐに、処理領域の前のブロッキングゾーンに分布される場合に維持されてもよい。

別の実施形態において、磁性粒子は、処理領域の隣に乾燥試薬として配置されてもよい。処理チャンバに添加される流体は、従って、磁性粒子のブロッキングゾーンがおそらく後に処理チャンバ内の干渉粒子の分布に影響を与えることができるまで、処理領域に接触することができる。

ブロッキングゾーンは、処理チャンバ内で静止した位置にて確立させてもよい。或いは、ブロッキングゾーンは、ある所望の干渉粒子の分布を生じるために、処理チャンバ内で動かしてもよい。ブロッキングゾーンの静止した位置も所望の移動も、状況に応じて処理チャンバにおける磁場を制御することによって容易に達成することができる。

ブロッキングゾーンは、例えば、処理チャンバの特定のサブボリュームにおいて干渉粒子を収集する及び／又はその濃度を上げるために使用してもよい。磁性粒子が処理領域の隣に乾燥試薬として最初に配置される場合、（流体の添加及び磁性粒子の溶解後に作られる）ブロッキングゾーンを処理領域の前に動かして、そこから干渉粒子を押し退けてもよい。

本発明の別の実施形態において、処理されることになる流体が導入される前に、磁性粒子のブロッキングゾーンが処理チャンバにおいて生じる。これは、磁性粒子が（例えば、湿性試薬として提供されたため、及び／又は、溶剤が、乾燥試薬として磁性粒子を含む処理チャンバに加えられたため）、あるキャリア又は溶剤においてすでに動くことができるということを要求する。早期の磁性粒子のブロッキングゾーンの発生は、始めから、すなわち、流体が添加される瞬間から干渉粒子の分布を制御することができるという利点を有する。

本発明の別の実施形態において、処理されることになる流体の標的成分に対する結合部位を有する磁気ラベル粒子が提供される。従って、前記標的成分は、磁気ラベル粒子に特異的に結合して、磁力によってそれらを操作すること、及び／又は、付けられた磁性粒子の特性を介してそれらを検出することを可能にしてもよい。磁気ラベル粒子は、任意で、ブロッキングゾーンを構成する磁性粒子と同じであってもよい。より一般的には、単にブロッキングゾーンを確立するために使用される磁性粒子、及び、標的成分に結合するために使用される磁気ラベル粒子があってもよく、磁気ラベル粒子のうち一部若しくは全てを、加えて使用して又は使用しないで、ブロッキングゾーンを作ってもよい。

処理されることになる流体は、特に、例えば唾液、血液又は尿等の生物学的流体を含んでもよい。そのような生物学的流体は、典型的には、莫大な数の成分を含み、これらの成分のうち一部が、他の成分によって妨害されるアッセイの標的である。本発明の方法を用いて、妨害成分、すなわち「干渉粒子」を、その妨害効果が減らされるように制御することができる。

本発明は、さらに、分子診断、生物学的試料の分析、化学的試料の分析、食べ物の分析及び／又は法医学的分析に対する上記の処理装置の使用に関する。分子診断は、例えば、標的分子に直接若しくは間接的に付けられる磁気ビーズ又は蛍光粒子の助けをかりて成し遂げることができる。

本発明の前記及び他の態様が、以下に記載の実施形態から明らかになり、さらに、以下に記載の実施形態を参考にして説明される。

同じ参照番号は、図において、同じ又は類似の要素を意味している。

内部全反射による試料における標的成分の検出のための処理装置を概略的に示した図である。 処理領域の結合部位上に最初に堆積される磁性粒子からのブロッキングゾーンの発生を概略的に例示した図である。 処理領域の結合部位の隣に最初に堆積される磁性粒子からのブロッキングゾーンの発生を概略的に例示した図である。 処理チャンバの壁の間で延びる磁性粒子のブロッキングゾーンの発生を概略的に例示した図である。 処理領域を遮蔽する磁性粒子のブロッキングゾーンを概略的に例示した図である。 ブロッキングゾーンを作製するための磁性粒子の適用、及び、磁気ラベル粒子の適用を概略的に例示した図である。 検出表面に平行な磁場の印加、及び、磁性粒子のクラスターを用いたブロッキングゾーンの作製を概略的に例示した図である。 全血におけるアッセイ後の結合領域に結合した磁性粒子の顕微鏡画像を示した図である。 試料における標的成分の検出のためのアッセイにおいて得られた用量作用曲線を示した図である。

多くのバイオセンサが、電磁場を用いて作動させることができるナノ粒子ラベル、特にナノ粒子（ビーズ）に基づいている。典型的には、磁気ビーズは、特異的な分析物の分子に結合することができる抗体で官能性を持たされる。ビーズは、センサ表面に付着し、そこで粒子は、（捕獲された分析物によって）間接的に又は直接、表面上に印刷された（例えば抗体等の）捕獲プローブに結合する。結合したビーズの数は、試料に存在する分析物の分子の量に直接又は逆比例して関係する。ビーズは、従って、表面に近いビーズにより感受性を持ついかなる技術を使用しても検出することができる。例えば、検出技術は、出願人によって開発されたＭａｇｎｏｔｅｃｈ（登録商標）技術においてそうであるように、例えば内部全反射（ＦＴＩＲ）等、エバネッセント光学場に基づき得る。別の例は、暗視野顕微鏡（ＤＦＭ）の適用である。

図１は、血液に対して検査するために使用することができるＦＴＩＲに基づくバイオセンサ器具１００の概略側面図を示している。処理装置又はセンサ器具１００は、読取り装置１５０及び使い捨てのカートリッジ１１０を含む。カートリッジ１１０は、例えば、ガラス又はポリスチレンのような透明なプラスチックから作製することができ、（例えば、心筋トロポニン、薬物、抗体、ＤＮＡ、副甲状腺ホルモンＰＴＨ等の）検出されることになる標的成分を有する血液の試料を提供することができる処理チャンバ１１１を含む。試料は、例えば超常磁性ビーズ等の磁性粒子ＭＰをさらに含んでもよく、これらの粒子は、通常、ラベルとして前述の標的成分に結合される。

カートリッジ１１０は、例えばテープの層１１３によって隔てられたカバー１１２及びボトムユニット１１４を含む。カートリッジは透明であり、（部分的に）処理チャンバ１１１の境界をなす検出表面１１５を有する。複数の処理領域１１７（図２〜６）が、検出表面１１５の上に配置されており、例えば抗体等の、標的成分に特異的に結合することができる結合部位１１６を含む。

読取り装置１５０は、「入力される光ビーム」Ｌ１を放つための光源１５１、「出力される光ビーム」Ｌ２を検出及び測定するための光検出器１５２、並びに、光検出器の信号を評価するための評価ユニット（図示せず）を含む。光源１５１によって生じる入力される光ビームＬ１は、全反射（ＴＩＲ）の臨界角よりも大きい角度にて検出表面１１５に到達し、従って、出力される光ビームＬ２として、完全に内部に反射される。出力される光ビームＬ２は、カートリッジ１１０を離れ、さらに、例えばカメラ１５２の光電性ピクセルによって等、光検出器によって検出される。

読取り装置１５０は、検出表面１１５にて、及び、処理チャンバ１１１の隣接する空間において磁場を制御可能に生じるために、カートリッジの底部及び／又は上部に配置される、例えばコイル及び磁心を有する電磁石１５３、１５４等の磁場発生器をさらに含む。電磁石１５３、１５４は制御装置１５５に結合され、制御装置１５５によって、電磁石１５３、１５４には、適切な電流を供給することができる。生じた磁場の助けをかりて、磁性粒子を操作する、すなわち、磁化することができ、特に、（勾配を有する磁場が使用される場合に）動かすことができる。従って、例えば、検出表面１１５まで磁性粒子を引きつけて、前記表面に対する付随した標的成分の結合を促進することが可能である。

器具１００を用いる典型的なアッセイは、以下の、（１）標的成分に対して作られた一次抗体で被覆された磁気ビーズが試料液体内に分散する且つ標的に結合するステップ、（２）上部及び底部のコイルが、パルス状様式で磁性粒子を作動させ、センサ表面への結合を生じ、そこでは、結合される標的分子に二次抗体が結合することができるステップ、（３）結合していないビーズが、センサ表面から取り除かれ、さらに、結合されたビーズが、エバネッセント場を使用して検出されるステップ、を含む。この手順のさらなる詳細は、参照により本明細書に援用するＷＯ２００８／１１５７２３ Ａ１において見つけることができる。

血液試料は、上記の種類のバイオセンサを用いて調査されるものとする場合、フィルタリングステップが、通常、標的成分を含む血漿を血球から分離するために必要とされる。アッセイが行われる使い捨てのカートリッジ１１０は、例えば、赤血球を血漿から分離するフィルタユニットを含有してもよく、血漿は、磁性粒子を有する処理チャンバまで運ばれる。そのようなフィルタユニットは、その組立に要求される多数の材料及びプロセスのため、カートリッジのうち比較的に高価な部分である。しかし、ｉ）磁性粒子は赤血球に非特異的に結合することができる、並びに、ｉｉ）赤血球は、磁性粒子を立体的に邪魔し、粒子の移動及びセンサ表面に対するその結合を抑制するため、アッセイは赤血球の存在下で行うことができない。さらに、マイクロ流体チャネル及び処理チャンバの毛細血管充填を伴うフィルタリングプロセスは、ゆっくりしたプロセスであり（５分の全アッセイ時間のうち１分までとり得る）、不正確さを（充填時間及び分析物の分子の保有における差異を介して）生じ、さらに、効率の悪い（２５μＬの血液入力で、２μＬのみの血漿出力を生じる）ものである。

上記の問題に取り組むために、フィルタとして磁性粒子を使用し、その結果、別の高価なフィルタユニットに対する必要性を回避することが示唆される。検出領域の近くに高密度の磁性粒子を有する層（多数の粒子層）を提供することによって、赤血球又は他の「干渉粒子」が検出領域に到達するのが防がれ、その結果、アッセイを抑制している。

図２は、フィルタとして機能する磁性粒子ＭＰの概略図を含む。磁性粒子ＭＰは、センサ表面１１５上の「処理領域」又は「結合領域」１１７において被覆される捕獲分子１１６（抗体層）の上部に密な層で乾燥した形で供給される。処理チャンバが全血で満たされると、磁性粒子は再分散することになる。

図２ａ）は、処理されることになる流体、すなわち血液の試料の添加後すぐの処理チャンバを示している。血液試料は、赤血球Ｃ、及び、血漿内の標的分子Ｔを含む。

図２ｂ）は、磁性粒子ＭＰの再分散後の状況を示している。磁性粒子は、以下において「ブロッキングゾーン」ＢＺと呼ばれる磁性粒子ＭＰの密な層に分配される。赤血球Ｃは、このブロッキングゾーンを貫入することはできず、標的分子Ｔを含有する血漿は貫入することができる。その後は、磁性粒子を作動させることができ、その間に、一番上の粒子は、底部の粒子を用いて行われるアッセイと赤血球が相互作用するのを防ぐ。

図２ｂ）において、干渉粒子Ｃの（平均）直径ｄ、並びに、ブロッキングゾーンＢＺにおける隣接する磁性粒子ＭＰ間の（平均）距離Δが示されている。Δ≦ｄである場合、すなわち、ブロッキングゾーンの「ポア」が、干渉粒子よりも小さい場合、干渉粒子Ｃがブロッキングゾーンを通過するのを完全に防ぐことが可能である。

磁気ビーズは、典型的には、外部磁場において鎖（クラスター）を形成し、その鎖間には特定の間隙の大きさがあるということに留意するべきである。図面における「磁性粒子ＭＰ」（円形）は、従って、いくつか個々の磁性粒子の鎖と代えることもできる。これらの鎖間の間隙の大きさは、従って、前述の「距離Δ」の役割を果たすことになる（図７を参照されたい）。

図２ａ）は、乾燥試薬層としての磁性粒子ＭＰの適用を示しているけれども、湿性試薬を使用することも可能であり、まず、磁性粒子を含有する流体が処理チャンバに供給される。磁性粒子は、次に、表面まで磁気作用によって引き寄せられ、その後、血液が処理チャンバに加えられる。

磁性粒子は、結合領域内の捕獲プローブの上部とは異なる位置にて蓄積させることもできる。図３ａ）は、磁性粒子が、最初に、捕獲分子を有する結合領域１１７の隣の位置１１８において供給される場合を示している。再分散の間に、（例えば、磁場を印加することによって、又は、短い再分散時間で）磁性粒子ＭＰが密な層で残ると、結果として生じる磁性粒子の「栓」又はブロッキングゾーンＢＺを、捕獲プローブを含有する検出領域１１７に向かって横に動かし、その結果、検出領域から赤血球を押し出すことができる。

図４ａ）〜ｃ）は、アッセイに対して使用することができる試料流体の量を増やす方法を例示している。結合領域の結合部位上に（例えば）最初に蓄積される磁性粒子ＭＰは、密なブロッキングゾーンＢＺとして、（磁場の助けをかりて）赤血球の層に対して押され、その結果、赤血球が除かれたより多くの量を生じることができる（図４ｂ）。その後、アッセイを行うことができる（図４ｃ）。赤血球が磁性粒子の下に移動するのを防ぐために、これは、磁性粒子と壁（破線）との間に空間がない（例えば小さいチャンバ等の）制限された領域において行われた場合に最良に機能する。

別の選択肢が、図５において示されている。ここで、磁性粒子ＭＰのブロッキングゾーン又は層ＢＺの大きさは、捕獲プローブ層１１７よりもはるかに大きく、一部の赤血球Ｃが磁性粒子層ＢＺの下のその縁に着く場合でさえも、いかなる赤血球もその中心に、すなわち、捕獲プローブを有する検出領域１１７に存在しないようにしている。

フィルタとして、及び、センサ表面に結合することができる捕獲粒子として同じ磁性粒子を使用する代わりに、２つの異なる種類の磁性粒子を使用することができる。これは、図６において例示されており、図６によると、「磁気ラベル粒子」ＭＰの層は、ブロッキングゾーンＢＺを構成する（官能性を持たされていない）磁性粒子ＭＰＢの１つ又は複数の層の下に配置されている。この方法は、例えば粒子の数、粒子のサイズ等の、赤血球Ｃに近い磁性粒子ＭＰの上の層の特性を独立して選ぶことができるという利点を有する。さらに、これらの磁性粒子は、抗体で官能性を持たせる必要がなく、従って、標的分子に結合することはなく、検出に有効なより多くの標的分子をもたらす。

これら２つの磁性粒子ＭＰ、ＭＰＢの層は、まず、第１の磁気ラベル粒子ＭＰの第１の層を堆積させ、次に、第２の磁性粒子ＭＰＢの第２の層を堆積させることによって乾燥試薬として適用することができる。或いは、これらを、湿性試薬として適用することができ、まず、磁気ラベル粒子ＭＰの第１のセットを、表面に向かって引きつけ、次に、磁性粒子ＭＰＢの第２のセットを加え且つ表面に引きつける。

図７は、上記の原理が、単一の磁性粒子の代わりに磁性粒子のクラスター又は鎖を用いて同等に機能するということを概略的に例示している（磁性粒子のクラスターは、実際に、ほとんどの場合に観察される）。さらに、印加される磁場Ｂは、検出表面１１５に平行であるということが仮定される。

図７ａ）においては、底部の磁石１５３のみが活動中である。これは、検出表面１１５に対して平行に向けられる（引き寄せる面に対して垂直の）磁場Ｂを提供する（極が、引き寄せる面に垂直に互いに後ろにある）Ｕ字形磁石１５３であるということが仮定される。これは、磁場Ｂがオンに切り替えられると、磁気ビーズＭＰが、検出面１１５に平行な鎖ＣＬを形成することになるということを意味する。図は、鎖ＣＬを断面で示している。同時に、鎖を表面１１５に引きつける磁力が生じている。

基本的に、磁気鎖ＣＬは、その間に（平均）幅Δのわずかな隙間を有することになる。結果として生じる構成は、一次元の格子に似ている。鎖間の隙間が、干渉粒子Ｃの最小の大きさｄよりも小さい限り、いかなる粒子Ｃも通過しない。

図７ｂ）においては、底部の磁石１５３はオフに切り替えられ、且つ、上部の磁石１５４がオンに切り替えられている。上部の磁石が円筒形の磁石である場合、磁性粒子の鎖の縦の配置が生じ、干渉粒子をブロックすることにおいてより効果的ではないと証明している。従って、上部の磁石１５４としてもＵ字形磁石を使用することが好ましい。この場合、ビーズクラスターの一次元の格子は、カートリッジの上部まで動かして、干渉粒子Ｃを「押しつける」ことができながら維持される。このように、ブロッキングゾーンＢＺは効果的に動かすことができる。

上記の方法を使用して、（赤血球の代わりに）他の大きな微粒子が磁性粒子アッセイに干渉するのを防ぐこともできるということに留意するべきである。さらに、アッセイは、検出表面が上部にあるよう、及び、重力が干渉粒子（例えば赤血球等）を検出表面から実質的に離れるように動かすことができるように、逆にした配置（重力に関して図１〜７の機構をひっくり返すこと）から利益を得ることができる。

本発明は、特に、急性心筋梗塞の診断に対する血液中の心筋トロポニンの検出等、生物学的試料におけるバイオマーカーの検出に対して、例えばＰｈｉｌｉｐｓ Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ（登録商標）技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ診断（免疫）アッセイにおいて使用することができる。

以下において、図８及び９に関する実施例が記載される。抗心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗体を、上記のＦＴＩＲ又はＤＦＭ検出と共に使用するのに適したプラスチックカートリッジの表面に加えた。これらの抗体の上部に、抗ｃＴｎＩ抗体で官能性を持たせた多量の磁性粒子を加え且つ乾燥させ、その結果、密な層を形成した。１０ｐＭのｃＴｎＩが添加された（又は、負の対照としてｃＴｎＩなしの）血液を、磁場を使用して粒子を表面の近くに保ちながら、カートリッジに加えた。次に、磁性粒子に、ｃＴｎＩ分子を捕獲させ、さらに、表面に結合させた。磁気洗浄ステップを使用して、結合していない磁性粒子を表面から取り除き、さらに、表面上に結合した磁性粒子の量を、ＤＦＭ検出技術を使用して計数した（ＷＯ２０１１／０３６６３４ Ａ１を参照されたい）。

図８は、全血において１０ｐＭのｃＴｎＩを用いたアッセイの後に表面に結合したＤＦＭ検出粒子の例を示している。抗ｃＴｎＩ抗体が印刷された領域（上部の円形領域）の外側に多くの粒子が結合するけれども、（検出領域に基準化される）外側の信号は、捕獲スポットの内側の粒子の量から引くことができる。アッセイは最適化されていないけれども、１０ｐＭは、バックグラウンドの結合と明確に区別することができ、推定される検出の限界は、約１ｐＭのｃＴｎＩである。

図９は、結果として生じる用量作用曲線を示しており、０又は１０ｐＭのｃＴｎＩを含有する試料における粒子の検出された量Ｎを示している。上のポイントは、直接の（訂正されていない）結果を表しており、下のポイントは、抗ｃＴｎＩ抗体を有する領域の外側の結合に対して訂正されたデータを表している。

本発明は、図面及び上記の説明において詳細に例示及び記述されてきたけれども、そのような例示及び記述は、例示的又は例証的であり、拘束性はないと考慮されることになる。本発明は、開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態に対する他の変化は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解する及びもたらすことができる。特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。特定の手段が互いに異なる従属項において記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを役立つよう使用することができないと示しているわけではない。特許請求の範囲におけるいかなる参照番号も、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。

Claims (15)

1. 干渉粒子を含有する流体を処理するための方法であって、前記干渉粒子は、前記流体の処理に何らかの方法で干渉すると仮定され、当該方法が、
   ａ）処理チャンバ内に前記流体を提供するステップと、
   ｂ）前記処理チャンバ内に磁性粒子を提供するステップと、
   ｃ）前記処理チャンバ内のブロッキングゾーンにおいて前記磁性粒子を、前記ブロッキングゾーンを通る前記干渉粒子の移動が前記流体の処理の間に妨げられるように分布させるステップと、
   を含む、方法。
2. 前記ブロッキングゾーンにおいて前記磁性粒子の分布を発生させる及び／又は維持する磁場が生じる、請求項１に記載の方法。
3. 干渉粒子を含有する流体を処理するための処理装置であって、前記干渉粒子は、前記流体の処理に何らかの方法で干渉すると仮定され、当該装置が、
   ａ）前記流体及び磁性粒子を提供することができる処理チャンバ、
   ｂ）該処理チャンバ内のブロッキングゾーンにおいて前記磁性粒子を、前記ブロッキングゾーンを通る前記干渉粒子の移動が前記流体の処理の間に妨げられるように分布させる磁場を発生させるための磁場発生器、
   を含む、処理装置。
4. Δが、前記ブロッキングゾーンにおける磁性粒子及び／又は磁性粒子のクラスター間の平均距離であり、さらに、ｄが、前記干渉粒子の平均直径であり、以下の関係、Δ≦５ｄ、好ましくはΔ≦ｄが保たれる、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
5. 前記処理チャンバの表面が、前記流体の処理が起こり得る処理領域を含む、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
6. 前記処理領域は、重力に関して前記ブロッキングゾーンの上に置かれる、請求項５に記載の方法又は処理装置。
7. 前記処理領域は、前記流体の標的成分に対する結合部位を含む、請求項５に記載の方法又は処理装置。
8. 検出ユニットが、前記流体の標的成分を検出するために提供される、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
9. 前記ブロッキングゾーンは、前記処理チャンバの壁の間を延び、前記処理チャンバを２つの非連結の体積に分ける、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
10. 前記磁性粒子は、前記流体の添加の前に、前記処理チャンバの表面上に乾燥試薬として配置される、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
11. 前記ブロッキングゾーンは、前記処理チャンバ内で動かされる、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
12. 前記ブロッキングゾーンは、前記処理チャンバに対する前記流体の導入に先立ち生じる、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
13. 前記流体の標的成分に対する結合部位を有する磁気ラベル粒子が提供される、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
14. 前記流体は、生物学的流体、特に血液を含む、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
15. 分子診断、生物学的試料の分析、化学的試料の分析、食べ物の分析、及び／又は、法医学的分析に対する、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の処理装置の使用。

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