JP2015514397A - シトシンとこれの修飾物とを識別するための、およびメチローム分析のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

シチジンデアミナーゼおよび／またはオキシゲナーゼを用いてシトシンとこれの修飾物とを区別するための組成物および方法を提供する。シトシンの上流の隣接ヌクレオチドに対するバイアス低下を示す野生型シチジンデアミナーゼの変異体を記載する。本方法は、メチロームを得るための酵素の迅速で好都合な使用を提供する。

Description

関連出願に対する参照
次の特許出願の各開示全体が本願に参照により組み込まれる：Ｕ．Ｓ．６１／６１１，２９５、２０１２年３月１５日出願；米国特許出願第６１／７２２，９６８号、２０１２年１１月６日出願；米国特許出願第６１／７２３，４２７号、２０１２年１１月７日出願；米国特許出願第６１／７２４，０４１号、２０１２年１１月８日出願；米国特許出願第１３／８０４，８０４号、２０１３年３月１４日出願；米国特許出願第１３／８２６，３９５号、２０１３年３月１４日出願；および米国特許出願第１３／８２７，０８７号、２０１３年３月１４日出願。

シチジンデアミナーゼには、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）およびアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）が含まれる。これらの酵素は、シチジンを脱アミノ化してウリジンを形成させることによってＤＮＡおよびＲＮＡに突然変異を挿入することができるＤＮＡ変異誘発物である。これらの酵素は、抗原−駆動型抗体多様性過程およびレトロウイルスに対する自然防御系に関与する。ヒトＡＰＯＢＥＣファミリーは、１１種類のメンバー：ＡＰＯＢＥＣ−１（Ａｐｏ１）、ＡＰＯＢＥＣ−２（Ａｐｏ２）、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａ、−３Ｂ、−３Ｃ、−３ＤＥ、−３Ｆ、−３Ｇ、−３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ−４（Ａｐｏ４）からなる。ＡＰＯＢＥＣ−３Ａファミリーのメンバーは、シングル（Ａ３Ａ、Ａ３Ｃ、Ａ３Ｈ）またはダブル（Ａ３Ｂ、Ａ３ＤＥ、Ａ３Ｆ，およびＡ３Ｇ）亜鉛依存性デアミナーゼドメイン（ＺＤＤ）のいずれかを含有する。

ＡＩＤを用いることによって、亜硫酸水素ナトリウムメチローム配列決定（Ｆｒｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８９．５：１８２７−１８３１（１９９２））に代わるものを見付けようとする試みが行われてきた（Ｌａｒｉｊａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４２．５：５９９−６０４（２００５））。しかし、非天然宿主細胞における毒性ゆえに精製活性酵素を得ることが困難であること、酵素活性が低いことおよび基質バイアスから生じるシトシンからウラシルへの不完全変換およびメチローム配列決定に適切なＡＩＤを選択するために適したインビトロアッセイの欠如を含め、ネイティブＡＩＤの使用に伴う問題が認められた。このため、複数の生化学的段階の使用、メチルとヒドロキシメチルシトシンとの識別が不可能なこと、ＤＮＡを変性させるために熱を要すること、化学的処理によるＤＮＡの小断片へのさらなるせん断および配列決定され得るＤＮＡの長さの制限を含む、この方法に付随する問題にもかかわらず、メチローム配列決定が亜硫酸水素ナトリウム配列決定により行われ続けている。

Ｆｒｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８９．５：１８２７−１８３１（１９９２） Ｌａｒｉｊａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４２．５：５９９−６０４（２００５）

一般に、ある態様において、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対して少なくとも９０％の配列相同性または同一性を有するタンパク質を含み、少なくとも１つの突然変異を有する、タンパク質変異体、例えばネイティブシチジンデアミナーゼの変異体が提供される。ある実施形態において、（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の配列相同性または同一性を有し、配列番号１の２５、４５、１０９、１２３および１８０からなる群から選択されるアミノ酸位置に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含むか；または（ｂ）配列番号２と少なくとも９０％の配列相同性または同一性を有し、配列番号２の２３、２５、２９、４５、６９、１０４または１２３に対応するアミノ位置で少なくとも１つの突然変異を含むか、または（ｃ）配列番号３（ＡＩＤ）と少なくとも９０％の配列相同性または同一性を有し、配列番号４の１１７での欠失に対応する少なくとも１つの突然変異を有する、タンパク質が提供される。

実施形態は、タンパク質変異体と、精製オキシゲナーゼ、ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのプライマーおよびｄＮＴＰのうち少なくとも１つを組み合わせることを含む。

一般に、別の態様において、シチジンデアミナーゼおよび精製オキシゲナーゼを含むインビトロ混合物が提供される。

この混合物の実施形態は、次の特性の１以上を含み得る：シチジンデアミナーゼは、ＡＩＤもしくはこれの突然変異体；ＡＰＯＢＥＣもしくはこれの突然変異体；ＡＰＯＢＥＣ−３Ａもしくはこれの突然変異体；または上記の組成物を含み得ること；および／またはオキシゲナーゼは、メチルピリミジンオキシゲナーゼ、例えば、ｍＹＯＸ（例えばｍＹＯＸ１）またはＴＥＴ（例えばＴＥＴ１またはＴＥＴ２またはＴＥＴ３）であり得ること、ＤＮＡポリメラーゼ；および／または少なくとも１つのプライマーおよびｄＮＴＰ。

一般に、ある態様において、シチジンデアミナーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを含むインビトロ混合物が提供される。このインビトロ混合物は、ポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのプライマーおよびｄＮＴＰをさらに含み得る。

一般に、ある態様において、シチジンデアミナーゼに対して、隣接ヌクレオチドによるシトシン選択性を決定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）シトシンを含有するポリヌクレオチド(場合により一本鎖の）をシチジンデアミナーゼと反応させてシトシンをウラシルに変換し、このシトシンはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかと隣接し得；（ｂ）ウラシルにおいてポリヌクレオチドを切断するために（ａ）の生成物をグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼと反応させ；（ｃ）Ａ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＣのいずれかに隣接するシトシンに対するシチジンデアミナーゼの活性を決定するために（ｂ）からの切断生成物を検出することを含む。

実施形態は、次の１以上の特性を含み得、例えばシチジンデアミナーゼは、ＡＩＤもしくはこれの突然変異体、ＡＰＯＢＥＣもしくはこれの突然変異体、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａもしくはこれの突然変異体または上記の組成物を含み得、および／またはポリヌクレオチドは１本鎖であり得、一方の末端で標識され得る。

一般に、ある態様において、非メチル化シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５−ｆＣ）、５−カルボキシシトシン（５−ＣａＣ）または５−グリコシル化ｈｍＣ（５−ｇｈｍＣ）と区別するための方法は、Ｃ、５−ｍＣ、５−ｈｍＣ、５−ｆＣ、５−ＣａＣおよび／または５−ｇｈｍＣを場合により含有するポリヌクレオチドをシチジンデアミナーゼと反応させ、ここで５−ｍＣがＴに変換され、ＣのみがＵに変換され；（ｂ）ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの変換ヌクレオチドの位置を同定するためにポリヌクレオチドを増幅させるかまたは切断することを含む。

本明細書中に記載の本発明の態様に対して、シチジンデアミナーゼは、上記のようなタンパク質変異体であり得；ポリヌクレオチドは１本鎖であり得、オキシゲナーゼは、メチルピリミジンオキシゲナーゼ、例えばｍＹＯＸ１など、または５−ｍＣオキシゲナーゼ、例えばＴＥＴ１、ＴＥＴ２およびＴＥＴ３など、例えば、ＴＥＴ１であり得る。

本方法の実施形態において、Ｃのみがウラシル（Ｕ）に変更されている配列を生成させるために、（ａ）の前にポリヌクレオチドをオキシゲナーゼとさらに反応させることによって、５−ｍＣがＣと区別され得る。

さらなる実施形態は、ＣがＵのみ変換されているポリヌクレオチドの配列を決定することおよびＣがＵに変換され、５−ｍＣがＴに変換されている（ａ）で得られるポリヌクレオチドの配列を決定することおよび、ポリヌクレオチド中の５−ｍＣの特徴を調べるために配列を比較することまたは、（ａ）からの脱アミノ化ポリヌクレオチドの配列を未処理ポリヌクレオチドの配列と比較することを含む。

さらなる段階は、第一の配列を生成させるためのオキシゲナーゼおよびシチジンデアミナーゼとの反応後に、ポリヌクレオチドの第一の試料の配列を決定すること；第二の配列を生成させるための、オキシゲナーゼではなくシチジンデアミナーゼとの反応後に、ポリヌクレオチドの第二の試料の配列を決定すること；および場合により、シチジンデアミナーゼまたはオキシゲナーゼとの反応を行わずに、ポリヌクレオチドの第三の試料の配列を決定すること；および、シトシンおよび５−ｍＣを検出するために、第一と、第二および第三の試料配列のうち少なくとも１つとを比較すること、または第二の試料配列を第一および第三の試料配列のうち少なくとも１つと比較することを含み得る。

別の実施形態において、ポリヌクレオチドを切断することは、Ｕにおいてグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼでポリヌクレオチドを切断すること、またはポリヌクレオチドでのＣからＴへの変換後に部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡ増幅後にポリヌクレオチドを切断することをさらに含む。

ｍＹＯＸ１は、１本鎖ポリヌクレオチド基質においてオキシゲナーゼとして作用するので、オキシゲナーゼ反応後に、基質を操作する必要なく、および場合により緩衝液または反応容器を変えることなく、１本鎖ポリヌクレオチドにおいても作用するシチジンデアミナーゼを添加し得る。５−ｍＣの存在についてポリヌクレオチド分析中に上記のインビトロ混合物を形成させることが望ましい場合があり得るか、または、シチジンデアミナーゼが作用する前にオキシゲナーゼがポリヌクレオチド基質上で作用するように条件が変更される反応の前にオキシゲナーゼおよびシチジンデアミナーゼのインビトロ混合物を形成させることが望ましい場合があり得る。

本方法の実施形態において、上記のタンパク質の特徴を有するシチジンデアミナーゼが、酸化反応終了後にオキシゲナーゼを含有する反応混合物に添加される。

一般に、ある態様において、第一のポリヌクレオチドを亜硫酸ナトリウム反応試薬と反応させ、続いてオキシゲナーゼ非存在下でシチジンデアミナーゼで処理して、これによって５−ｍＣをＴに変換し、ＣをウラシルＵに変換し；シチジンデアミナーゼへのその後の曝露を行わずに、同一であるヌクレオチド配列を含む第二のポリヌクレオチドを亜硫酸水素ナトリウム配列決定試薬と反応させ、これによってＣをＵにのみ変換することを含む、メチル５−ｍＣをＣと区別するための方法が記載される。

実施形態は、ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの変換ヌクレオチドの位置を同定するために、この第一および第二のポリヌクレオチドを増幅または切断することを含み得る。

実施形態は、次の特性の１またはを含み得る：シチジンデアミナーゼがＡＰＯＢＥＣ−３Ａまたはこれの変異体であること；シチジンデアミナーゼが、（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の配列相同性を有し、配列番号１の２５、４５ １０９、１２３および１８０からなる群から選択されるアミノ酸位置に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含むか；（ｂ）配列番号２と少なくとも９０％の配列相同性を有し、配列番号２の２３、２５、２９、４５、６９、１０４または１２３に対応するアミノ位置で少なくとも１つの突然変異を含むか、または（ｃ）配列番号３（ＡＩＤ）と少なくとも９０％の配列相同性を有し、配列番号４の１１７での欠失に対応する少なくとも１つの突然変異を有するタンパク質であること；５−メチルシトシンオキシゲナーゼが、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２またはＴＥＴ３であること；メチルピリミジンオキシゲナーゼがｍＹＯＸ１であること、および／またはポリヌクレオチドが１Ｋｂを超えるこの長さを有すること。

実施形態は、次の特性のうち１以上を含み得る：酸化反応終了後にオキシゲナーゼを含有する反応混合物にシチジンデアミナーゼを添加すること；および／または６０℃未満の温度で本方法を行うこと。

上記の実施形態は、メチロームマップを構築するために使用され得る。

図１は、ゲル電気泳動により測定した場合に検出可能な量のタンパク質を産生しなかったＡＰＯＢＥＣ−３ＡをコードするＤＮＡで形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）と比較して、細胞を含まない転写翻訳系（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中で、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａが良好に発現することを示す。レーン１：タンパク質ラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）矢印はゲル上の２５ｋｄバンドにほぼ相当する。レーン２から７：ヒトＡＰＯＢＥＣ−３ＡをＴ７ファージプロモーター（２クローン、Ａ３Ａ−１およびＡ３Ａ−２）下でサブクローニングし、Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）において発現させた。Ｕ＝非誘導性、Ｔ＝０．５ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導および３０℃で３時間培養後、Ｓ＝０．５ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導および３０℃で３時間培養後の可溶性分画。ＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対応する明瞭なバンドは観察されなかった。レーン８から９：ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓを用いて同じクローン（Ａ３Ａ−１およびＡ３Ａ−２）を発現させた；黒矢印はＡＰＯＢＥＣ−３Ａタンパク質を指す。レーン１０は、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓにおいてプラスミド（Ａ３Ａ−１またはＡ３Ａ−２）が添加されていない対照試料を含有する。ＡＩＤまたはＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対応するバンドは観察されなかった。レーン１１：ヒトＡＩＤに対する遺伝子をＴ７ファージプロモーター下でサブクローニングし、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓを用いて発現させ、予想よりもＡＰＯＢＥＣ−３Ａと比較して僅かに大きい分子量を有するバンドが生じた。 図２Ａは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを用いてＣからＵへの変換を調べるためのアッセイを示す。図２Ａは、Ｔに隣接する内部非修飾Ｃを有する４４ｂｐの１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）基質および３’−ＦＡＭマーカーを示す。ＣからＵへ変換するＡＰＯＢＥＣ−３ＡおよびＵＳＥＲ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）とＤＮＡを反応させる。ＵＳＥＲは、Ｕで除去し、次に切断し、従って標識断片が２６ｂｐである２個の断片が生じる。 図２Ｂは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを用いてＣからＵへの変換を調べるためのアッセイを示す。図２Ｂは、Ａ３Ａと反応させず、ゆえに未切断の４４ｂｐバンドのみが見られ得る対照を除き、全試料において２６ｂｐ断片の存在を明らかにする尿素ゲルを示す。 図２Ｃは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを用いてＣからＵへの変換を調べるためのアッセイを示す。図２Ｃは、ＰｕｒｅＥｘｐｒｅｓｓ系におけるインビトロ転写−翻訳により得られたＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対する切断パターンを示す。この迅速で簡便なアッセイにより、様々な濃度でＡＣ基質に対するＡＰＯＢＥＣ−３Ａの脱アミノ化度が示される。 図２Ｄは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを用いてＣからＵへの変換を調べるためのアッセイを示す。図２Ｄは、ＰｕｒｅＥｘｐｒｅｓｓ系におけるインビトロ転写−翻訳により得られたＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対する切断パターンを示す。この迅速で簡便なアッセイにより、様々な濃度でＣＣ基質に対するＡＰＯＢＥＣ−３Ａの脱アミノ化度が示される。 図２Ｅは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを用いてＣからＵへの変換を調べるためのアッセイを示す。図２Ｅは、ＰｕｒｅＥｘｐｒｅｓｓ系におけるインビトロ転写−翻訳により得られたＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対する切断パターンを示す。この迅速で簡便なアッセイにより、様々な濃度でＧＣ基質に対するＡＰＯＢＥＣ−３Ａの脱アミノ化度が示される。 図２Ｆは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを用いてＣからＵへの変換を調べるためのアッセイを示す。図２Ｆは、ＰｕｒｅＥｘｐｒｅｓｓ系におけるインビトロ転写−翻訳により得られたＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対する切断パターンを示す。この迅速で簡便なアッセイにより、様々な濃度でＴＣ基質に対するＡＰＯＢＥＣ−３Ａの脱アミノ化度が示される。 図３は、霊長類ＡＰＯＢＥＣ−３Ａファミリーメンバーが標的配列選択性の点で異なることを示す：左から右へ：ヒトＡ３Ａ、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）Ａ３Ａ、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）Ａ３Ａおよびボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）Ａ３Ａ。 図４は、霊長類ＡＰＯＢＥＣ−３Ａファミリーメンバーが標的配列選択性の点で異なることを示す：左から右へ：オランウータン（Ｐａｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）Ａ３Ａ、アクツス・トリビゲーツス（Ａｃｔｕｓ ｔｒｉｖｉｇａｔｕｓ）Ａ３Ａ、シロテテナガザル（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ ｌａｒ）Ａ３Ａおよびコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）Ａ３Ａ。 図５Ａは、ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａポリペプチドにおける突然変異が標的配列選択性を変化させることを示す。図５Ａは、標的配列選択性を変化させるヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａポリペプチド配列における突然変異を示す。 図５Ｂは、ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａポリペプチドにおける突然変異が標的配列選択性を変化させることを示す。図５Ｂは、突然変異体酵素の活性を示し、突然変異を左に記しており、アッセイは図２Ａに記載のとおりである。 図５Ｃは、配列選択性を変化させるチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＡＰＯＢＥＣ−３Ａにおける突然変異を示す。 図５Ｄは、突然変異体酵素の活性を示し、突然変異を左に列挙し、図２Ａで示されるアッセイを用いて、左から右に１個のＡＣ、ＣＣ＜ＧＣおよびＴＣを含有するオリゴヌクレオチドに対して切断が示される。 図６Ａは、野生型配列（配列番号３）および突然変異体配列（配列番号４）を示す。 図６Ｂは、図６Ａに記載のＡＩＤ野生型およびＡＩＤ突然変異体ならびに、尿素ゲル電気泳動および、すぐ前がＡであるＣが１個あるオリゴヌクレオチドである基質を用いた、標的切断選択性の変化におけるこの突然変異の影響を示す。 図７Ａは、ポリヌクレオチドにおける５−ｍＣの検出のためのアッセイを示す。図７Ａは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａと反応する内部Ｔ^ｍＣＴＡＡを有する７１塩基のｓｓＤＮＡ基質を示す。ＡＰＯＢＥＣ−３Ａおよびその後のＰＣＲ増幅による^ｍＣからＴへの変換の結果、（ＴＴＡＡを認識する）制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）により、３９塩基対断片および７７塩基対断片の２つの断片へと切断され得るＴＴＴＡＡ配列を含有するＰＣＲの２本鎖生成物への配列の変換が起こる。これらのバンドはゲル電気泳動を用いて容易に同定され得る。 図７Ｂは、ポリヌクレオチドにおける５−ｍＣの検出のためのアッセイを示す。図７Ｂは、ゲル上での２本の低分子量バンドの形態の切断生成物の存在を明らかにするゲルを示す。 図７Ｃは、デアミナーゼの５ｍからＴへの変換能が、隣接Ｕ（このＵは、亜硫酸水素配列決定反応によるＣからＵへの変換後に生じ得る。）の存在下で変化しないことを示す。 図７Ｄは、図７Ｃに記載の反応におけるＡＰＯＢＥＣ−３Ａの２倍連続希釈を示す。レーン３から９は、７７ｂｐおよび３９ｂｐ断片を示し、１１６ｂｐＤＮＡはなく、このことから５−ｍＣからＴへの完全な変換が明らかとなる。 図８Ａは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａの存在下で５−ｈｍＣがＣとして認識されることを示す。図８Ａは、５−ｈｍＣまたはヒドロキシメチルウラシル（５−ｈｍＵ）を用いて合成された標識化１本鎖ポリヌクレオチドを提供する。 図８Ｂは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａの存在下で５−ｈｍＣがＣとして認識されることを示す。図８Ｂは、ＵＳＥＲの存在下で５−ｈｍＵを含有する対照ポリヌクレオチドのみが２個の断片に切断されたことを示すゲルである。５−ｈｍＣがあるポリヌクレオチドは試験した全酵素濃度で無傷のままであった。 図９Ａは、基質ＤＮＡ中の５−ｍＣおよび５−ｈｍＣ残基を同定するための先行技術の方法を示す。図９Ａは、ＯｘＢＳ−Ｓｅｑと呼ばれる方法を示す（Ｂｏｏｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３６．６０８３：９３４−９３７（２０１２））。この方法は、２つの亜硫酸水素配列決定段階を要する。第一の配列決定段階において、ＤＮＡに対して破壊性である試薬であるＫＲｕＯ４によってゲノムＤＮＡ中の５−ｈｍＣをホルミルシトシン（５−ｆＣ）に酸化する。その後、亜硫酸水素ナトリウム処理によって５−ｆＣをＴに変換する。第二の亜硫酸水素配列決定段階において、ＫＲｕＯ４処理せずにゲノムＤＮＡを亜硫酸水素処理に供する。第一の配列決定段階から、５−ｍＣの部位が明らかになり；この情報を第二の従来からの亜硫酸水素配列決定段階によって提供される５−ｍＣプラス５−ｈｍＣ部位から差し引く。 図９Ｂは、基質ＤＮＡ中の５−ｍＣおよび５−ｈｍＣ残基を同定するための先行技術の方法を示す。図９Ｂは、ＴＡＢ−Ｓｅｑ（Ｙｕら、Ｃｅｌｌ，１４９：１３６８−１３８０（２０１２））と呼ばれる方法を示す。この方法によって、１回の亜硫酸水素配列決定段階後に５−ｈｍＣを５−ｍＣと区別し得る。しかし、複数の連続的な酵素反応が必要である。５−ｈｍＣは、５−ｈｍＣのグリコシル化５−ｈｍＣへのβＧＴ−触媒グルコシル化による、ＴＥＴが介在する酸化および亜硫酸水素変換から、選択的に保護される。次に、５−ｍＣはＴＥＴによって５−ｃａＣに酸化され、その後亜硫酸水素処理およびＰＣＲ後にＴに変換される。従ってＴＡＢ−Ｓｅｑから、ゲノムＤＮＡ中の５−ｈｍＣの部位が明らかとなる。 図１０Ａは、亜硫酸水素変換ＤＮＡにおける５−ｍＣｓと５−ｈｍＣとの遺伝子座特異的な区別の概要を示す。図１０Ａは、Ｃ、５−ｍＣおよび５−ｈｍＣがある基質を示す。亜硫酸水素ナトリウム配列決定はＣをＵに変換するが、５−ｍＣまたは５−ｈｍＣには影響を与えない。 図１０Ｂは、亜硫酸水素変換ＤＮＡにおける５−ｍＣｓと５−ｈｍＣとの遺伝子座特異的な区別の概要を示す。図１０Ｂは、５−ｍＣがＴに変換され、ＣがＵに変換され、５−ｈｍＣが変化しないようにＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤを用いて試料が脱アミノ化されていることを除き、図１０Ａにおけるものと同じ最初の基質を示す。 図１０Ｃは、亜硫酸水素変換ＤＮＡにおける５−ｍＣｓと５−ｈｍＣとの遺伝子座特異的な区別の概要を示す。図１０Ｃは、図１０Ａと同じ最初の基質を示すが、この場合は５−ｍＣおよび５−ｈｍＣを５−ｃａＣに変換するために、ＴＥＴ１またはメチルピリミジンオキシゲナーゼ（ｍＹＯＸ１）を用いて５−ｍＣおよび５−ｈｍＣの酸化が達成される。配列決定によってこれらの塩基がＣであることが同定される。 図１１は、最初に亜硫酸水素ナトリウムを利用し、その後に試料を２つのアリコートに分け、一方のアリコートはさらに処理せず、他方のアリコートを脱アミノ化する２段階法において５−ｈｍＣおよび５−ｍＣを検出するための方法を示す。配列の比較から、脱アミノ化アリコートには存在しない非脱アミノ化アリコート中のこれらのＣが、５−ｍＣであることが明らかとなる。酵素による脱アミノ化によってＣからＵへの変換が達成されるので、この亜硫酸水素ナトリウム段階は、続いて酵素による脱アミノ化段階がある場合は任意である。 図１２ＡからＤは、配列の例および図１０に記載の方法においてこれらが利用される場合のこれらの最終的結果を示す。図１２Ａは３８９ｂｐ基質を示し、メチルＣｐＧには下線を付す。図１２Ｂは３８９ｂｐ基質を示し、ここでは、亜硫酸水素ナトリウム変換後、ＣｐＧ部位のメチルを除き、全ＣがＵに変換された。図１２Ｃは３８９ｂｐ基質を示し、ここでは、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａ酵素で処理した後、ＣｐＧ部位の５−ｍＣがＴに変換された。図１２Ｄは、ＰＣＲ増幅後に全ＵがＴになることを示す。 図１３は、亜硫酸水素配列決定段階を行わずに、Ｃ、５−ｍＣおよび５−ｈｍＣを検出するための方法を示す。オリゴヌクレオチドは、オキシゲナーゼ（例えば、ＴＥＴ１またはｍＹＯＸＩ）およびデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤ）またはデアミナーゼ単独のいずれかと反応させ、次いで増幅させ、配列決定を行う。ＡＰＯＢＥＣ−３Ａは、ＣからＵへ変換するが、５−ｍＣおよび５−ｈｍＣは、配列決定中にＣとして同定されるであろう５−ｃａＣに酸化される。従って、ＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤとオキシゲナーゼとの組み合わせは、亜硫酸水素ナトリウム配列決定と同じ影響を有する。同じオリゴヌクレオチドをＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤのみで処理する場合、５−ｍＣがＴに変換される。Ｃおよび５−ｍＣの量が分かっている場合、５−ｈｍＣ＋５−ｆＣ＋５−ｃａＣの合計を計算し得る。

「シチジンデアミナーゼ」という用語は、天然の酵素、または野生型酵素と少なくとも８５％、９０％、９５％および９９％の配列類似性もしくは同一性を有する天然であることが知られていない酵素を包含するものとするが、この酵素は突然変異誘導されているものであり得、この突然変異は場合により１以上の人工的に導入された点突然変異または欠失を含む。

多岐にわたるシチジンデアミナーゼが、配列相同性によってヒトおよび他の種から同定されている。ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａファミリーの１１種類のメンバーを表１に列挙する。この表はまた、ヌクレオチドモチーフの認識における選択性、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対するＤＮＡ基質選択性および酵素の生物学的機能も列挙する。ＺＤＤ（Ｈ／Ｃ）−ｘ−Ｅ−ｘ２５−３０Ｐ−Ｃ−ｘ−ｘ−Ｃの発生を通じてアミノ酸類似性検索においてタンパク質のシチジンデアミナーゼファミリーが同定され得る。ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａに対する配列は、図５（配列番号１）で提供され、ヒトＡＩＤが図６（配列番号３）で提供される。

「オキシゲナーゼ」という用語は、５−ｍＣおよび５−ｈｍＣから５−ｆＣへ、５−ｃａＣへの変換を触媒する酵素を含む。ｍＹＯＸＩを含むファミリーは、メチルピリミジンオキシゲナーゼ、シトシンオキシゲナーゼおよび５−メチルオキシゲナーゼと、様々な呼び方がある。ｍＹＯＸの例としては次のものが挙げられる：

「ポリヌクレオチド」という用語は、数ヌクレオチド（例えば１０ヌクレオチド）からゲノム長のサイズにわたる範囲を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、本明細書中で使用される場合、別段の断りがない限り、１ｋｂまたは２ｋｂまたは５ｋｂまたは１０ｋｂ長でもあり得る。

「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、等温または温度サイクル増幅法によってＤＮＡを増幅させるために適切なあらゆるポリメラーゼを含む。

一般に、「検出すること（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」、「決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」および「比較すること（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）」は、実施例に記載のＳＤＳゲルまたはＴＢＥ−尿素ゲルおよび当技術分野で周知の同等の方法など、標準的なゲルに基づく技術を指す。これらの用語は、配列決定に適用され得、ここでＤＮＡ配列が比較される。市販の多くの配列決定プラットフォームがあり、これらのいずれも、ポリヌクレオチドの配列を決定するかまたは比較するために使用され得る。

「亜硫酸水素ナトリウム配列決定試薬」という用語は、Ｆｒｏｍｍｅｒら、
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８９．５：１８２７−１８３１（１９９２）に記載されているように５−ｍＣを検出するための標準的方法を指す。

本実施形態を達成するために多くの問題が解決されなければならなかった。これらには、次のことが含まれる：
（ａ）脱アミノ化特異性に対して再現可能なように試験するのに十分な量の精製ＡＰＯＢＥＣ−３Ａ／ＡＩＤを生成させるための手段；
（ｂ）シチジンデアミナーゼまたはこれの相同体または誘導体の活性および特異性が所望の目的に適切であり得るか否かを判定するための、簡単で信頼性のあるアッセイを開発；および
（ｃ）天然源から得られる何らかの精製シチジンデアミナーゼが、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣに隣接するＣを脱アミノ化し得るか否かおよびこれがどの程度であるかの決定。

十分な量の精製ＡＰＯＢＥＣ−３Ａを生成させるための手段
合成遺伝子配列から精製活性ＡＰＯＢＥＣ−３ＡおよびＡＩＤを生成させるために、インビトロ転写および翻訳系がうまく利用された。次に、様々な配列関係において、修飾Ｃを含有する合成オリゴヌクレオチド基質において合成生成物を試験することができた。アッセイの実施形態において、Ｃのすぐ前にある代替的塩基により他に規定されない限り、本オリゴヌクレオチドの配列は、基本的に、Ｃまたは修飾Ｃを含有する何らかの配列であり得るが、本オリゴヌクレオチドは好ましくは１個のＣを有する。図８から１１は、インビトロ転写翻訳系においてＡＰＯＢＥＣ−３ＡおよびＡＩＤがよく発現することを示す。

シチジンデアミナーゼのためのアッセイ
１個の内部Ｃおよび３’標識（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を含有する合成オリゴヌクレオチド基質を調製した。図２に記載のアッセイにおいて複数の断片を生成させるために、複数の内部Ｃがある合成オリゴヌクレオチドも基質として使用され得る。合成オリゴヌクレオチドは、ＡＰＯＢＥＣ−３ＡおよびＡＩＤと反応させるのに適切な１本鎖断片を提供するために変性される天然のＤＮＡ断片によって置き換えられ得る。上述のように設計される基質を用いて、（ａ）ＡＰＯＢＥＣ−３ＡもしくはＡＩＤまたはこれらの変異体の特異性を分析し；（ｂ）Ｃと５−ｍＣとを区別し；および（ｃ）５−ｈｍＣと５−ｍＣとを区別するために、アッセイを設計した。

（ａ）シチジンデアミナーゼ修飾ヌクレオチドにおいてｓｓＤＮＡを２個の断片に分割するための切断試薬の使用
シチジンデアミナーゼの活性を調べるためのこのアッセイは、結果として試薬を用いて選択的な切断を引き起こすｓｓＤＮＡの変化に依存する。図２Ａおよび図２Ｂおよび実施例２で説明される検出可能なマーカーは蛍光標識であったが、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合可能であり、ゲルまたは他の分離装置上で検出可能である当技術分野で公知のあらゆる標識を使用し得る。オリゴヌクレオチドに対する検出標識および捕捉タグの例は、米国特許第６，３６８，８０１号明細書に記載されている。

グリコシラーゼ／エンドヌクレアーゼ混合物、例えば市販のＵＳＥＲまたは、ＵをＤＮＡから除去し、これによってこのオリゴヌクレオチドから、一方が蛍光標識を保持する２つの断片を生成させる同等物など、とオリゴヌクレオチドを反応させることによって、ＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤによるＣからＵへの変換を迅速に、簡単に検出し得る。標識付きの切断生成物は全長オリゴヌクレオチドよりも顕著に小さいので、ゲル電気泳動を用いて示されるなど、サイズ分離によって容易にこれを検出し得る。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ生成試料上での図２で示される迅速アッセイを用いて、図３および４は、８種類のヒトおよび類人猿ＡＰＯＢＥＣ−３Ａ酵素に対するアッセイ結果を示す。このアッセイおよびシチジンデアミナーゼを利用する他のアッセイの長所は、反応の温度が６０℃未満、例えば５０℃未満または４０℃未満であり得ることである。

（ｂ）シチジンデアミナーゼがＣからＴへの修飾を誘導した後のみの、ｄｓＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断
以前には存在しなかった特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を形成させるために、ＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤとの反応におけるＣからＴへの変化を設計した。この修飾オリゴヌクレオチドを増幅させた場合、得られるｄｓＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼによって切断され、以前には１個しか存在しなかったところ、２個の断片を生成させ得る。実施例３および図７ＡからＤはこの方法の一例を記載する。ここではＰＣＲ増幅を記載するが、様々な等温増幅法、例えば転写介在増幅、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡ技術のシグナル介在増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ＤＮＡのループ介在等温増幅、等温多置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅および環状ヘリカーゼ依存性増幅などを含め、あらゆる形態の増幅を使用し得る。

（ｃ）５−ｈｍＣから５−ｈｍＵへの変換
オリゴヌクレオチドをシチジンデアミナーゼと反応させて、５−ｈｍＣが５−ｈｍＵに変換されるようにした。グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼで５−ｈｍＵを切断できた。この例において、ＥｎｄｏＶＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）とともにＳＭＵＧ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、合成オリゴヌクレオチドを切断した。オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかでの標識によって切断断片を検出し得るが、オリゴヌクレオチド基質のいずれかの末端で、同じ、類似のまたは異なる標識を使用して、切断生成物の検出を促進し得る。実施例４および図８は、基質オリゴヌクレオチド中の配列ＴＣＴに位置し、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａで処理した１個の内部５−ｈｍＣがある合成オリゴヌクレオチドにおいて３’ＦＡＭ標識を用いて得た結果を示す。

両者とも本明細書中に記載の、タンパク質変異体を容易に作製する能力およびロバストなアッセイは、ｓｓＤＮＡ断片またはゲノムであり得るポリヌクレオチド基質のＣおよび５−ｍＣの触媒的変換を向上させるためにシチジンデアミナーゼの突然変異体を作製し、評価するための簡単な手段を提供する。本明細書中に記載の方法の長所は、これらが、亜硫酸水素配列決定などの場合のように、温度またはアルカリ変性段階が必要である際にまたは化学物質もＤＮＡを切断する場合に生じるせん断の問題がなく、大型片の、またはゲノム全体の分析にも適していることである。

ＣからＵまたは５−ｍＣからＴへの変換に対する何らかの特定の配列関係に対するバイアスが減少しているかまたはバイアスがない酵素を有するＡＰＯＢＥＣ−３ＡおよびＡＩＤの突然変異体を作製した。例えば、起始点としてヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａ配列を用いて、突然変異を遺伝子に導入し、これの突然変異体を上記のアッセイで試験した。２種類の野生型ＡＰＯＢＥＣ−３Ａの１２個の突然変異体に対する結果を図５ＡからＤで示し、ＡＩＤの１個の突然変異体を図６ＡからＢで示す。これらの突然変異は代表的なものであり、包括的なものであるものとする。本明細書中に記載の組成物および方法に基づき、配列データベースからのＡＰＯＢＥＣ−３Ａなどのシチジンデアミナーゼの配列を選択し、突然変異アミノ酸をタンパク質配列に導入し、本明細書に記載の方法の実施形態を用いて基質特異性の変化についてアッセイすることは容易であろう。

ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａの５個の突然変異体およびチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＡＰＯＢＥＣ−３Ａの７個の突然変異体の様々な組み合わせは、基質の切断バイアスが変化した実施例および図５ＡからＤで示される。例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａの場合、Ｅ１０９は、Ｇ２５、Ｓ４５、Ｒ１２３およびＤ１８０のいずれかの１以上と組み合わせ得、例えばＥ１０９Ａは、Ｇ２５Ｖ、Ｓ４５Ｗ、Ｒ１２３ＨおよびＤ１８０Ｅのいずれかの１以上と組み合わせ得る。同様に、Ｒ１２３は、Ｅ１０９ Ｇ２５、Ｓ４５およびＤ１８０のいずれかの１以上と組み合わせ得、例えば、Ｒ１２３Ｈは、Ｅ１０９Ｑ Ｇ２５Ｖ、Ｓ４５ＷおよびＤ１８０Ｅのいずれかの１以上と組み合わせ得る。同様に、Ｄ１８０は、Ｇ２５、Ｓ４５、Ｒ１２３およびＥ１０９のいずれかの１以上と組み合わせ得、例えばＤ１８０Ｅは、Ｇ２５Ｖ、Ｓ４５Ｗ、Ｒ１２３ＨおよびＥ１０９Ｑのいずれかの１以上と組み合わせ得る。同様に、Ｓ４５は、Ｇ２５、Ｅ１０９、Ｒ１２３およびＤ１８０のいずれかの１以上と組み合わせ得、例えばＳ４５Ｗは、Ｇ２５Ｖ、Ｅ１０９Ｑ、Ｒ１２３ＨおよびＤ１８０Ｅのいずれかの１以上と組み合わせ得る。同様に、Ｇ２５は、Ｅ１０９、Ｓ４５、Ｒ１２３およびＤ１８０のいずれかの１以上と組み合わせ得、例えばＧ２５Ｖは、Ｅ１０９Ｑ、Ｓ４５Ｗ、Ｒ１２３ＨおよびＤ１８０Ｅのいずれかの１以上と組み合わせ得る。ある例において、本方法の実施形態において、Ｅ１９０突然変異、例えばＥ１０９ＱがあるヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａを使用した。別の例において、Ｇ２５、Ｓ４５、Ｅ１０９、Ｒ１２３およびＤ１８０突然変異、例えばＧ２５Ｖ、Ｓ４５Ｗ、Ｅ１０９Ｑ、Ｒ１２３ＨおよびＤ１８０Ｅ突然変異があるヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａを使用した。

チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＡＰＯＢＥＣ−３Ａの場合、酵素に対する配列選択性を変化させるために、２３、２５、２９、４５、６９、１０４および１２３に対応する位置の突然変異の１以上を（配列番号２）に導入し得る。具体的な突然変異の例は、２３Ｎ、２５Ｖ、２９Ｈ、４５Ｗ、６９Ｒ、１０４Ｗおよび１２３Ｈに対応する。突然変異の組み合わせの例には、２５、２９、４５、６９、１０４および１２３に対応する位置の１以上のまたは２以上の突然変異と２３；または２９、４５、６９ １０４および１２３と２５、または４５、６９、１０４もしくは１２３と２９、または６９、１０４もしくは１２３と４５、または１０４もしくは１２３と６９、または１２３と１０４での突然変異を組み合わせることが含まれる。２３、２５、２９、４５、６９、１０４および１２３に対応する位置から選択される３以上または４個の突然変異が選択され得るか、または２３、２５、２９、４５、６９、１０４および１２３に対応する位置の５個の突然変異、例えば２３Ｎ、２５Ｖ、２９Ｈ、４５Ｗ、６９Ｒ、１０４Ｗおよび１２３Ｈを含む突然変異体が構築され得る。

開示されるアッセイによって、いずれかの部位でのあらゆるシチジンデアミナーゼに対して突然変異誘導を行い、部位選択性の変化について突然変異体を試験することができる。本発明のある実施形態において、標的核酸に存在する５−ｍＣ残基の一部の位置を決定するために、部位選択性があるシチジンデアミナーゼが選択される。

本発明の別の実施形態において、部位選択性があまりないかまたは全くないシチジンデアミナーゼが好ましい。従って、配列番号１からのＥ１０９ＱもしくはＳ４５Ｗまたは配列番号２におけるＣ６９Ｒ、Ｔ２３ＮもしくはＧ２５Ｖに対応する突然変異を有する突然変異ＡＰＯＢＥＣ−３Ａがこれらの特性とともに選択され得る。

野生型ＡＩＤ（配列番号３）の突然変異体を作製し、これは本明細書中に記載の方法の実施形態において使用され得る。例えば、位置１１７の突然変異、例えば図６Ａ（配列番号４）で示されるような欠失を導入し得る。

ある実施形態において、増幅された場合に、この結果Ｕの代わりにＴとなる複数の５−ｍＣを含有する基質における全５−ｍＣのＵへの完全な変換へと至る時間経過を示す方法が提供される（例えば図８Ａから８Ｂ参照）。ＡＰＯＢＥＣ−３Ａは、２時間を超える時間において５−ｍＣ全てをＵに変換するが、１時間後でも約９５％が変換されることが明らかとなった。ｐＨ、濃度および緩衝液および選択される１以上のＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤ変異体などの操作条件の結果、２時間未満の時間枠で実質的に１００％の変換が起こることが予想される。

メチローム配列決定
亜硫酸水素ナトリウム配列決定は、エピジェネティック研究の一部としてゲノムにおいて５−ｍＣのマップを作製するための有力な方法となっている。残念ながら、亜硫酸水素ナトリウム配列決定は、５−ｈｍＣ、５−ｆＣおよび５−ｃａＣなど、５−ｍＣと脱メチル化の中間体とを区別することができない。脳組織において、相当量の５−ｈｍＣならびに少量の５−ｆＣおよび５−ｃａＣがあるが、一方で、全組織にこれらの修飾塩基の少なくとも一部がある。亜硫酸水素ナトリウム配列決定に付随する別の問題は、この方法が標的ＤＮＡに損傷を与え、大規模な断片化が生じることである。これにより、メチロームに対するマップの組み立てが複雑となる。亜硫酸水素ナトリウム配列決定の別の問題は、これが複数の化学的段階を含み、従って本質的に効率的でなく、実施するコストが嵩むことである。それでもなお、亜硫酸水素ナトリウム配列決定を促進し、上記制限の１以上を改善する方法の実施形態が提供される。従って、１つの酵素段階によって、ｍＣを５−ｈｍＣと区別できるようになる（図１１参照）。脱アミノ化反応に先行する亜硫酸水素ナトリウム反応は、脱アミノ化反応を妨害しないことが示された（図１１参照）。

本発明の実施形態は、修飾塩基の出現だけでなく、ヒドロキシメチル塩基ではなくメチル塩基の出現を決定するための段階数を減少させながら、亜硫酸水素ナトリウム配列決定を利用し得るメチローム構築のための方法を含む。他の実施形態は、亜硫酸水素ナトリウム配列決定を全く利用しないが、むしろ２つの酵素反応、特にデメチラーゼ、例えばメチル−ピリミジンオキシゲナーゼまたはＴＥＴまたはこれらの類似体など、およびＡＩＤを利用する。これらのオキシゲナーゼ間の比較を下記で与える。メチルピリミジンオキシゲナーゼと呼ばれる酵素のクラスの例は、米国特許出願第１３／８２７，０８７号に記載のｍＹＯＸＩとして同定される酵素である。

図１０ＡからＣは、非修飾Ｃが脱アミノ化されて、Ｕが形成され、５−ｍＣはＣとしてそのまま検出される、亜硫酸水素ナトリウム配列決定（図１０Ａ）；非メチル化ＣがＵに変換され、５−ｍＣがＴに変換され、この配列決定反応においてＣとして読まれる５−ｈｍＣでは変化が観察されない、酵素による脱アミノ化単独（図１０Ｂ）；５−ｍＣおよび５−ｈｍＣが５−ｃａＣに変換され、これがＣとして認識され、これによって亜硫酸水素ナトリウム配列決定反応を反復するオキシゲナーゼ反応段階（図１０Ｃ）との比較を示す。試料＋／−酵素による脱アミノ化について平行反応を分析する場合、亜硫酸水素ナトリウム配列決定段階後、この結果から、サブトラクションによってＣ残基がメチルであり、これらがヒドロキシメチルであったことが明らかとなる（図１１）。

図１３の反応経路によって、亜硫酸水素ナトリウム配列決定反応が不要となる。この方法によって、亜硫酸水素ナトリウム配列決定に加えて２つの個別の酵素反応を必要とするＴＡＢ−ｓｅｑ（Ｙｕら（２０１２））との違いが明らかになる。ＴＡＢ−ｓｅｑでは、５−ｈｍＣをグルコシルトランスフェラーゼで最初に標識し、亜硫酸水素ナトリウム配列決定の前に５−ｍＣを５−ｃａＣに酸化し、これが次に５−ｃａＵに変換され、ゆえにＴに変換される（図９ＡからＢ参照）。

［実施例１］
ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓを用いたＡＰＯＢＥＣ−３Ａ、ＡＩＤおよびこれの突然変異体の合成
ＡＩＤおよびＡＰＯＢＥＣ−３Ａ ＤＮＡ配列をコドン最適化し、逆合成して遺伝子配列を生成させた。Ｔ７ファージプロモーター下で、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、合成ＤＮＡをサブクローニングし、ＮＥＢ５−ａｌｐｈａ Ｆ’Ｉ^ｑＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に挿入した。上述のようにサブクローニングする前に、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて突然変異体タンパク質を生成させた。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓを用いたＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａまたはこれらの突然変異体のインビトロ合成のための鋳型として２００ｎｇの各プラスミドを使用した。インビトロ反応物を３７℃で５時間温置し、合成タンパク質を３分間煮沸し、遠心による沈殿後、ＳＤＳゲル上に上清の試料を載せた。結果を図１で示す。

［実施例２］
シトシン脱アミノ化のための生化学的アッセイ（図２参照）

ＦＡＭ標識（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。反応混合物を３７℃で１時間温置し、０．５μＬ（０．５Ｕ）のＵＳＥＲを含有する１０μＬの１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ １を添加し、３７℃でさらに３０分間温置した。

ＸＣｅｌｌ Ｓｕｒｅｌｏｃｋ（登録商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、生成物を１５％ＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）上で分離した。

下記で示されるような固定比率（１：１、１：２、１：４、１：８など）でのＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａまたはこれらの突然変異体の活性を調べるために、試料に対して連続希釈を行った：

（約５０ｎｇのＤＮＡデアミナーゼ酵素を含有する）ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓを用いたインビトロ転写／翻訳後の１μＬのＡＰＯＢＥＣ−３ＡまたはＡＩＤ（野生型または突然変異体）を連続希釈（１：１）の第一の試験管に添加し、次いでデアミナーゼ（１ｘ溶液）とともに４０μＬの反応混合物を含有するようにした。望ましい数の希釈のために、第一の試験管からの２０μＬを第二の試験管中の酵素を含まない２０μＬの反応構成成分に入れ（１：２）、これを繰り返し、この結果、２０μＬの反応体積で２ｘ、４ｘ、８ｘ、１６ｘおよび３２ｘ希釈液（１ｘ）を得た。反応混合物を３７℃で１時間温置し、０．５μＬ（０．５Ｕ）のＵＳＥＲを含有する１０μＬの１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ １を添加し、３７℃でさらに３０分間温置した。ＸＣｅｌｌ Ｓｕｒｅｌｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌを用いて１５％ＴＢＥ−尿素ゲル上で生成物を分離した。

突然変異体の作製
ランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によってＡＰＯＢＥＣ３ＡまたはＡＩＤ突然変異体を作製した。

ランダム突然変異誘発の場合、Ｃｉｒｉｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３１：３−１０（２００３）によるエラープローンＰＣＲ法を使用したが；この反応においてＭｇＣｌ_２濃度を７ｍＭ濃度に向上させた。

部位特異的突然変異誘発の場合、製造者の説明書に従ってい、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用した。配列保存に従ってって標的残基を選択したかまたはループドメイン中の位置を推測した（Ｋｏｈｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８４．３４：２２８９８−２２９０４（２００９））。細胞を含まないＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）系（実施例１参照）において突然変異体タンパク質を製造し、実施例２および３で上述するように活性について試験した。

［実施例３］
５−ｍＣ含有基質上のＡＰＯＢＥＣ−３Ａ活性アッセイ
Ａ．５−ｍＣ脱アミノ化に対する生化学的アッセイ
１Ｘ溶液中で次の構成成分を合わせた。オリゴヌクレオチドにおいて５−ｍＣからＴ（およびＣからＵ）に変換するために１Ｘ溶液中で次の構成成分を合わせた。

反応混合物を３７℃で１２から１６時間または一晩温置し、ＰＣＲ反応を行い、次にＭｓｅＩ消化を行った。

反応混合物を３７℃で０．５時間温置し、２％アガロースゲル上でＤＮＡ消化生成物を分析した（図７ＡからＤ参照）。５−ｍＣをＴに変換し、この変換後に生成したＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩで切断し得た。

Ｂ．Ｕ ^５ｍ Ｃ含有基質におけるＡＰＯＢＥＣ−３Ａ活性アッセイ
ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ系抽出物からの１μＬのヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａを１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４に連続希釈し、ＲＮａｓｅＡ（１μｇ）の存在下でＮＥＢｕｆｆｅｒ １（１０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １ｍＭジチオスレイトールｐＨ７．０）中、１ｐＭ ｓｓＤＮＡ（ＴＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＴＡＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＴＡＧＡＡＴＧＡＴＵｍＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＴＧＧＧ（配列番号１７）と反応させた。反応物を３７℃で１４時間（一晩）温置した。実施例３に記載され、図７Ｃおよび７Ｄで示されるように、ＰＣＲ反応（ＦＷプライマー：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＴＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１８）、ＲＥＶプライマー：５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣ（配列番号１９））およびＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼでの消化を通じて脱アミノ化を検出した。

［実施例４］
５−ｈｍＣ含有基質におけるＡＰＯＢＥＣ−３Ａ活性アッセイ
ＲＮａｓｅＡ（１μｇ）の存在下で、ＮＥＢｕｆｆｅｒ １（１０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １ｍＭジチオスレイトールｐＨ７．０）中で、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ抽出物からの１μＬのＡＰＯＢＥＣ−３Ａを、１ｐＭフルオレセイン（Ｆ）標識ｓｓＤＮＡと反応させた。反応物を３７℃で６０分間温置した。０．５μＬの各ＳＭＵＧ１（５Ｕ／μＬ）およびＥｎｄｏＶＩＩＩ（１０ｕ／μＬ）酵素により生じる脱塩基部位のＤＮＡの分割を通じて、脱アミノ化を検出した。この結果は尿素ゲル上で示され、第二のバンドを生じさせる５−ｈｍＵおよびＳＭＵＧ１／ＥｎｄｏＶＩＩＩを含有する対照オリゴヌクレオチドを用いた場合に用いることを除き、５−ｈｍＣからＵへの変換を示さない。この結果を図８ＡからＢで示すが、ここで５−ｈｍＣが５−ｈｍＵに変換されないことが観察される。

［実施例５］
ＡＰＯＢＥＣ−３Ａは、亜硫酸水素変換ＤＮＡにおいて、５ｍ−Ｃを脱アミノ化するが、５−ｈｍＣを脱アミノ化しない。

インビトロでのＳｓｓＩメチラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）による、位置８０、１７４、２３９および３５６に４個のＣｐＧ配列を含有する４８９ｂｐ長のＤＮＡ基質は、メチルであった。メチル基質は、ＥｐｉＭａｒｋ亜硫酸水素変換キットを用いて亜硫酸水素変換し、ＦＷ ＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧ（配列番号２０）およびＲＥＶ ＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣ（配列番号２１）プライマーおよびＥｐｉＭａｒｋ ＨＳ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅させた。ＰＣＲ断片をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇベクターに挿入し、ＮＥＢ５−ａｌｐｈａ Ｆ’Ｉ^ｑＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。配列決定によって試験したところ、５−ｍＣの１００％がＣとして同定されたことが分かった。

シチジンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼの混合物で４時間、亜硫酸水素変換ＤＮＡ試料のアリコートを処理し、全５−ｍＣをＴに変換した（実施例１に記載）。反応が完了した後、ＦＷ ＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧ（配列番号２０）およびＲＥＶ ＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣ（配列番号２１）プライマーおよびＥｐｉｍａｒｋ ＨＳ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、脱アミノ化ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ断片をＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターに挿入し、ＮＥＢ５−ａｌｐｈａ Ｆ’Ｉ^ｑＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。配列決定により試験したところ、１００％の５−ｍＣがＴと同定されたことが分かった。この結果を図１１および１２で示す。

［実施例６］
シチジンデアミナーゼおよびＤＮＡオキシゲナーゼ酵素を用いた５−ｍＣと５−ｈｍＣとの区別
ここで、実施例５の亜硫酸水素配列決定の代わりに連続的なオキシゲナーゼおよびデアミナーゼ処理を行った。

Ａ．オキシゲナーゼとしてのＴＥＴの使用
次のとおりオキシゲナーゼ反応を行った：１００ｎｇのＮＩＨ３Ｔ３マウスゲノムＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を５０μＬの反応混合物中で３時間、ＴＥＴ１（ＷｉｓｅＧｅｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）とともに温置した。Ｚｙｍｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＤＮＡを除去した。

ＴＥＴは、ｄｓＤＮＡにおいて活性である。２本の個別の試験管中の５０μＬのＴＥＴ処理および未処理ＮＩＨ３Ｔ３マウスゲノムＤＮＡを９９℃まで５分間加熱し、短時間沈降させ、氷上に置いた。

Ｂ．オキシゲナーゼとしての、ＴＥＴに代わるｍＹＯＸ１の使用
この実施例において、５−ｍＣを含有する２本鎖基質をｍＹＯＸ１で酸化した。ｍＹＯＸ１はｓｓＤＮＡ上で活性である。

基質の配列は：
ＣＧＧＣＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＸＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ（Ｘ＝５−ｍＣ）（配列番号２２）であった。

ｍＹＯＸ１に対する配列は次のとおりである：

反応混合物を３４℃で１時間温置した。１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ^−１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を反応混合物に添加し、５０℃で１時間温置した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを単離し、ＬＣ／ＭＳによって試料を分析した。これらの条件により、５−ｍＣが５−ｈｍＣに酸化される。

マウスＮＩＨ３Ｔ３ゲノムＤＮＡのｍＹＯＸ１での酸化

ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａ（実施例１から１００ｎｇ）、ＲＮａｓｅＡ（１μｇ）をｓｓＤＮＡ基質（個別の試験管中の酸化および非酸化ＮＩＨ３Ｔ３マウスゲノムＤＮＡ）と合わせ、反応緩衝液（ＮＥＢｕｆｆｅｒ １、（１０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ １ｍＭジチオスレイトールｐＨ７．０））中で３７℃にて１２から１６時間温置した。８０℃で１０分間温置することによって、反応を終了させた。

酸化および脱アミノ化ＤＮＡまたは脱アミノ化単独ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、クローニングした。Ｅｐｉｍａｒｋ ＨＳ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応に対して、各試料（ＴＥＴ１＋デアミナーゼおよびデアミナーゼ単独）からの２μＬを使用した。脱アミノ化ＤＮＡ（酸化５ｍ−Ｃまたは５ｈｍ−Ｃを除き、全ＣがＴとなる。）に対してプライマーを設計した。１．５％アガロースゲル上でＰＣＲ生成物を可視化し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターにクローニングし、ＮＥＢ５−ａｌｐｈａ Ｆ’Ｉ^ｑＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。ＤＮＡを個々のコロニーから単離し、ネステッドプライマーを用いて配列決定した。

配列結果は次のとおり解釈された：
（ａ）元の配列：ＧＧＧＴｍＣＧＧＡＣＣＧｈｍＣ（配列番号７）
（ｂ）ＴＥＴおよびデアミナーゼ処理後：ＧＧＧＴＣＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号１１）
（ｃ）デアミナーゼ単独処理後：ＧＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号１２）
配列のアラインメント後、ＴＥＴおよびデアミナーゼ処理（ｂ）およびデアミナーゼ単独処理（ｃ）は、Ｃではなく５−ｈｍＣに対応するＣを示す。ＴＥＴおよびデアミナーゼ処理のみの後、Ｃは５−ｍＣにも対応するが、デアミナーゼ処理のみの後では、５−ｍＣはＴに対応する。

Claims (39)

1. ポリヌクレオチド中のシトシンと５−メチルシトシンとを区別するための、適切なシチジンデアミナーゼおよび精製したオキシゲナーゼを含むインビトロ混合物。
2. 前記オキシゲナーゼが、メチルピリミジンオキシゲナーゼまたは５−メチルシトシンオキシゲナーゼである、請求項１に記載のインビトロ混合物。
3. 前記メチルピリミジンオキシゲナーゼが、ｍＹＯＸである、請求項２に記載のインビトロ混合物。
4. 前記５−メチルシトシンオキシゲナーゼが、ＴＥＴ１である、請求項３に記載のインビトロ混合物。
5. ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載のインビトロ混合物。
6. シチジンデアミナーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを含む、インビトロ混合物。
7. ポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのプライマーおよびｄＮＴＰをさらに含む、請求項５または６に記載のインビトロ混合物。
8. （ａ）配列番号１と少なくとも９０％の配列相同性を有し、配列番号１の２５、４５、１０９、１２３および１８０からなる群から選択されるアミノ酸位置に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含み；および／または（ｂ）配列番号２と少なくとも９０％の配列相同性を有し、配列番号２の２３、２５、２９、４５、６９、１０４または１２３に対応するアミノ位置で少なくとも１つの突然変異を含み、および／または（ｃ）配列番号３と少なくとも９０％の配列相同性を有し、配列番号４の１１７での欠失に対応する少なくとも１つの突然変異を有する、変異体シチジンデアミナーゼを含む、組成物。
9. 精製オキシゲナーゼ、ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのプライマーおよびｄＮＴＰのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載の組成物。
10. シチジンデアミナーゼに対して、隣接ヌクレオチドによるシトシン選択性を決定するための方法であって、
    （ａ）シトシンを含有するポリヌクレオチドをシチジンデアミナーゼと反応させてシトシンをウラシルに変換し、シトシンがアデニン、グアニン、チミン、ウラシルまたはシトシンのいずれかと隣接し得；
    （ｂ）ウラシルにおいてポリヌクレオチドを切断するために（ａ）の生成物をグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼと反応させ；
    （ｃ）アデニン、グアニン、チミン、ウラシルまたはシトシンのいずれかに隣接するシトシンに対するシチジンデアミナーゼの活性を決定するために（ｂ）からの切断生成物を検出することを含む、方法。
11. 前記シチジンデアミナーゼが、請求項８に記載のとおりの特徴を有する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ポリヌクレオチドが、１本鎖である、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 前記ポリヌクレオチドが、一方の末端で標識される、請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
14. ５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５−ｆＣ）、５−カルボキシシトシン（５−ＣａＣ）または５−グリコシル化ヒドロキシメチルシトシン（５−ｇｈｍＣ）を非メチル化シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５−ｍＣ）と区別するための方法であって、
    （ａ）Ｃ、５−ｍＣ、５−ｈｍＣ、５−ｆＣ、５−ＣａＣおよび／または５−ｇｈｍＣを場合により含有するポリヌクレオチドをシチジンデアミナーゼと反応させ、５−ｍＣがチミン（Ｔ）に変換され、Ｃがウラシル（Ｕ）に変換され；および
    （ｂ）ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの変換ヌクレオチドの位置を同定するために、ポリヌクレオチドを増幅させるかまたは切断すること
    を含む、方法。
15. 前記シチジンデアミナーゼが、請求項８に記載のとおりの特徴を有する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ポリヌクレオチドを切断することが、ウラシル（Ｕ）においてグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼでポリヌクレオチドを切断することまたは、ポリヌクレオチド中の非メチル化シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変換後に部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡ増幅後にポリヌクレオチドを切断することをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記ポリヌクレオチドが、合成オリゴヌクレオチドである、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記オリゴヌクレオチドが、一方の末端で標識される、請求項１７に記載の方法。
19. Ｃのみがウラシル（Ｕ）に変更される配列を生成させるために、（ａ）の前にポリヌクレオチドをオキシゲナーゼと反応させることによって、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を非メチル化シトシン（Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）、５−グリコシル化ヒドロキシメチルシトシン（５−ｇｈｍＣ）、５−カルボキシシトシン（５−ＣａＣ）および５−ホルミルシトシン（５−ｆＣ）と区別することをさらに含む、請求項１４から１８のいずれかに記載の方法。
20. 非メチル化シトシン（Ｃ）がウラシル（Ｕ）に変換されているポリヌクレオチド配列を、ＣがＵに変換され、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）がチミン（Ｔ）に変換されている（ａ）で得られたポリヌクレオチド配列と比較することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. （ａ）におけるポリヌクレオチドが１本鎖である、請求項１４から２０のいずれかに記載の方法。
22. （ａ）からの脱アミノ化ポリヌクレオチドの配列を未処理ポリヌクレオチドの配列と比較することをさらに含む、請求項１４から２１のいずれかに記載の方法。
23. メチロームマップを構築することをさらに含む、請求項１４から２２のいずれかに記載の方法。
24. ポリヌクレオチド中で、非メチル化シトシン（Ｃ）を５−メチルシトシン（５−ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５−ｆＣ）、５−カルボキシシトシン（５−ＣａＣ）および／または５−グリコシル化ヒドロキシメチルシトシン（５−ｇｈｍＣ）と区別するための方法であって、
    （ａ）Ｃ、５−ｍＣ、５−ｈｍＣ、５−ｆＣ、５−ＣａＣおよび／または５−ｇｈｍＣを場合により含有するポリヌクレオチドの第一の試料をオキシゲナーゼと反応させ、続いてシチジンデアミナーゼで処理し、これによってＣをウラシル（Ｕ）に変換し、５−ｍＣを５−ｈｍＣおよび５−ＣａＣに変換し；および
    （ｂ）ポリヌクレオチド中のＵの位置を同定するためにポリヌクレオチドを増幅させるかまたは切断すること
    を含む、方法。
25. 段階（ａ）からのポリヌクレオチドが１本鎖である、請求項２４に記載の方法。
26. 第一の配列を生成させるための酸化および脱アミノ化反応後にポリヌクレオチドの第一の試料の配列を決定し；
    第二の配列を生成させるための脱アミノ化反応のみの後にポリヌクレオチドの第二の試料の配列を決定し；
    場合により酸化または脱アミノ化反応のないポリヌクレオチドの第三の試料の配列を決定し；
    非メチル化シトシン（Ｃ）および５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を検出し、区別するために、第一の試料配列を第二の試料配列および場合により第三の試料配列と比較すること
    をさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 前記オキシゲナーゼがメチルピリミジンオキシゲナーゼまたは５−メチルシトシンオキシゲナーゼである、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記５−メチルシトシンオキシゲナーゼが、ＴＥＴ１である、請求項２７に記載の方法。
29. ５−メチルピリミジンオキシゲナーゼが、ｍＹＯＸである、請求項２７に記載の方法。
30. ５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を非メチル化シトシン（Ｃ）と区別する方法であって、
    ポリヌクレオチドの第一の試料を亜硫酸水素ナトリウム配列決定試薬と反応させ、続いてオキシゲナーゼ非存在下でシチジンデアミナーゼで処理し、これによって５−ｍＣをチミン（Ｔ）に変換し、Ｃをウラシル（Ｕ）に変換し；および
    シチジンデアミナーゼへのその後の曝露を行わずにポリヌクレオチドの第二の試料を亜硫酸水素ナトリウム配列決定試薬と反応させ、これによってＣをＵに変換する一方で５−ｍＣを５−ｍＣのままにしておくこと
    を含む、方法。
31. ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの変換ヌクレオチドの存在および関連位置を同定するための配列決定のために、ポリヌクレオチドの第一および第二の試料を増幅することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記シチジンデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ−３Ａまたはこれの変異体である、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 前記シチジンデアミナーゼが、請求項８に記載のとおりの特徴を有する、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
34. 前記オキシゲナーゼが、５−メチルシトシンオキシゲナーゼまたは５−メチルピリミジンオキシゲナーゼである、請求項３０から３３のいずれかに記載の方法。
35. 前記５−メチルシトシンオキシゲナーゼが、Ｔｅｔ１である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記５−メチルピリミジンオキシゲナーゼが、ｍＹＯＸである、請求項３４に記載の方法。
37. 酸化反応の完了後に、前記シチジンデアミナーゼが、オキシゲナーゼを含有する反応混合物に添加される、請求項３０から３６のいずれかに記載の方法。
38. ６０℃未満の温度で行われる、請求項３０から３７のいずれかに記載の方法。
39. 前記ポリヌクレオチドが、１ｋｂを超える長さを有する、請求項３０から３８のいずれかに記載の方法。

Images