JP2015507007A

JP2015507007A - 抗ウイルス性の特性を有する小分子

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Publication number: JP2015507007A
Application number: JP2014557606A
Authority: JP
Inventors: チュパクヒン、オレグ、ニコライェビッチ; キシレヴ、オレグ、イヴァノヴィッチ; ルシノヴ、ヴラジミル、レオニドヴィッチ; チャルシン、ヴァレリー、ニコラヴィッチ; トゥゴヴァ、ニーナ、パブロヴナ; メドヴェデラ、ナタリア、ロセイヴナ; ウロムスキー、イヴジェニー、ハーツィソヴィッチ; エヴァンス、デイヴィッド、マーク; ディエヴァ、エラ、ジャーマノヴナ
Original assignee: ジーアールエル
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2015-03-05
Also published as: WO2013122575A3; EP2819517A2; WO2013122575A2

Abstract

【解決手段】本特許開示は、抗ウイルス性の特性を有する小分子の新規の骨格を記載する。低い毒性が示された抗ウイルス性の特性を有する分子を開示する。【選択図】図２

Description

本発明は、動物およびヒトのウイルス感染の治療および予防のための抗ウイルス性の特性を有する生物活性化合物に関するものである。本発明は、家畜および家禽のみならず病院、研究所において用いることが可能である。

（ＯＮＣｈｕｐａｋｈｉｎ，ＶＬＲｕｓｉｎｏｖ，ＥＮＵｌｏｍｓｋｙおよび他の２００９年１２月２０日からのＲＦ特許２３７６３０７）に加えて、抗ヘルペス作用の証拠がある（ＶＬ，Ｒｕｔｈｅｎｉａｎｓ，ＯＮＣｈｕｐａｋｈｉｎ，Ｅ．ＨＵｌｏｍｓｋｙおよび他の２００９年１月２７日からのＲＦ特許２３４５０８０）。インフルエンザウイルスタイプＡおよびＢに対する抗ウイルス性活性は、Ｒ＝Ｈ、ＣＨ_３、ＳＣＨ_３を有する（Ｖ．Ｌ．Ｒｕｓｉｎｏｖ，Ｅ．Ｎ．Ｕｌｏｍｓｋｙ，Ｓ．Ｄｅｅｖ．および他の２００８年１２月１０日からのＲＦ特許２３４０６１４；ＶＬＲｕｓｉｎｏｖ，ＯＮＣｈｕｐａｋｈｉｎ，Ｃ．Ｌ．Ｄｅｅｖ，ＴＳＳｈｅｓｔａｋｏｖａ，ＥＮＵｌｏｍｓｋｙ，ＬＩＲｕｓｉｎｏｖ，ＯＩＫｉｓｅｌｅｖ，ＥＧＤｅｅｖａＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅａｎａｌｏｇｕｅｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆ１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｏ［３，２−ｃ］［１，２，４］ｔｒｉａｚｉｎｅ−７（４Ｈ）−ｏｎｅｓＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｅｍｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ，２０１０，Ｎｏ１，ｐ．１３５−１４２．）。

このシリーズ（１）から本請求項に係る化合物への構造で最も近いものは、プロトタイプとして考えることが可能である。インビトロ実験において４０ｕｇ／ｍｌの濃度の化合物（１）を用い、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２およびインフルエンザウイルスＡ／Ｇｏｎｋｏｎｇ／１／６８Ａ／Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｄｕｃｋ／ＳｉｎｇａｐｏｒｅＲ／Ｆ１１９−３／９７の感染力価は、０．５〜３．０ｌｇまで減少した。しかしながら、この化合物はより高い濃度で細胞障害性を示した。細胞の５０％が死滅する濃度（ＣＣ５０）は８０ｕｇ／ｍｌである。

本発明は抗ウイルス性活性を有する小分子（２）である。

小分子（２）は低い毒性を示した。

図１は、小分子のための骨格を表す。図２は、図１の骨格に基づく小分子を表す。

合成

溶媒としてエタノールにおいてシステインの１等価物の溶液であるＤＭＦを０．０５モル用いて−１，２，４−トリアゾロ［５，１−ｃ］１，２，４−トリアジン−７−１ジ水和物のｈｌｏｒｍｅｔｉｌｐｉｖａｌａｔａ作用のナトリウム塩の０．０５モルから得た。反応の後、真空内で溶媒を除去し、結果として生じる沈殿物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（溶離剤―アセトニトリル：水＝８：１）。

化合物（２）の収率は、５１％である。

化合物（２）の提案されたスキームの化学合成は、以下の物理化学的な特徴を有する。ＴＰＬ＝２０４ＯＳ、Ｄ２Ｏδにおける１ＨＮＭＲスペクトル、ｐｐｍ：５．１８（ｄ、１Ｈ、ＣＨ２）、５．１３（ｄ、１Ｈ、ＣＨ２）、４．１９（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、３．９１（ｍ、１Ｈ、ＳＳＮ２）、３．３９（ｍ、１Ｈ、ＳＳＮ２）、２．６９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１１８（ｄ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ３）３）。実測値：Ｃ−４０．５６、Ｈ−４．７７、Ｎ−２０．３２。総化学式−Ｃ_１４Ｈ_２０Ｎ_６Ｏ_５Ｓ_２。計算値：Ｃ−４０．３８、Ｈ−４．８４、Ｎ−２０．１８％。

この合成から作成される化合物は淡黄色の結晶性固体であり、水、メタノール、ジメチルスルホキシドに溶解し、ベンゼン、エーテルおよび大部分の他の溶媒に不溶性である。化合物は経口で摂取可能であり、インフルエンザウイルスを含むウイルスに対し有効性を示す。

図２の分子の抗ウイルス性の特性

インフルエンザウイルス細胞に対する化合物の毒性および抗ウイルス性活性。上皮細胞ＭＤＣＫ（イヌ腎臓）ウイルスの一日単層培養を用いた。ウイルスの抗ウイルス性活性を評価するために、（いわゆるウイルス「豚インフルエンザ」Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９に類似している）汎発性インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ｖＡ／Ｓａｎｋｔ−Ｐｅｔｅｒｂｕｒｇ／２／０９のみならず、標準Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４を用いた。

化合物の最大許容濃度は細胞培養ＭＤＣＫにおけるＭＴＴテストにより決定した。

毒性のテストは、以下の通り行った。無菌の試験管に５ｍｇを量り取り、１ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう細胞ＭＤＣＫのための成長培地（α−ＭＥＭ、Ｂｉｏｌｏｔ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）５ｍｌで希釈し、このように基本的な溶液を得る。８連続のバイナリの希釈（それぞれ５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．１３、７．５６および３．７８ｍｇ／ｍｌ）のほぼ同じ培地を作成し、毒性テストに用いた。実験はそれぞれの濃度ごとに４つ平行しセットする。９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）で一日増殖させた細胞培養ＭＤＣＫの単層の完全性を倒立顕微鏡で視覚的に確認した。プレートを無血清培養液で２回洗浄し、その後、各ウェルにおいて１００ｍｌ量で、適切な濃縮でテスト化合物を作成した。プレートを５％ＣＯ_２存在下で、３７℃で７２時間インキュベートし、その後、コントロール細胞と比較し、ｔａｂｌｅｔｒｅａｄｅｒＨｙｄｅｘＣｈａｍｅｌｅｏｎを用い（細胞の生存率を定量的に評価する）ＭＴＴにより視覚的に単層の完全性を評価する実験の結果を記録した。統計分析は、プログラムＳｔａｔｉｓｔｉｃａ６．０を用い実行した。

抗ウイルス性活性の評価は２つの濃度、単層細胞の１００％が生存した最大濃度（バイナリの希釈）および先のものの半分に等しい濃度において行った。ウイルスの抗ウイルス性活性を評価するため標準Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４を用いた。９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）で一日増殖させた細胞培養ＭＤＣＫの単層の完全性を倒立顕微鏡で視覚的に確認した。次に、（−１から−６まで）トリプシンを追加した維持成長培地でウイルスの１０倍希釈を準備する。細胞の単層を有するプレートを無血清培養液で２回洗浄し、その後、ウイルスの増殖を５０ｍｌ量において適切なウェルで行った。コントロールウェルは等量の成長培地で満たした。プレートを５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で６０分間インキュベートし、その後、細胞に結合していないウイルス粒子を除去するため、培養液で洗浄した。適切な濃度の１００ｍｌでウイルス希釈を有するウェルにおいて薬剤を作成することを継続する。テスト化合物の各々の濃度を、ウイルス希釈ごとに４つ平行してセットした。コントロールウェルを等量の成長培地で満たした。また、ウェルは、用いた濃度の毒性を再テストするためそのまま残した。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、その後、コントロール細胞と比較した単層の完全性および細胞培養におけるウイルスの細胞変性効果の程度を視覚的に評価する実験の結果を記録し、赤血球凝集反応を評価し、ｔａｂｌｅｔｒｅａｄｅｒＨｙｄｅｘＣｈａｍｅｌｅｏｎを用い細胞生存率を定量化するためＭＴＴ法を用いた。

統計分析は、回帰分析［ＲｏｋｉｔｓｋｉｉＰＦＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．−Ｍｉｎｓｋ，１９６７．−Ｓ．１５５］を用い、プログラムＳｔａｔｉｓｔｉｃａ６．０を用い実行した［ＢｏｒｏｖｉｋｏｖＶＰ，ＩＰＢｏｒｏｖｉｋｏｖＳｔａｔｉｓｔｉｃａ．ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄａｔａｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｉｎＷｉｎｄｏｗｓ．−Ｍ．，１９９７．−Ｓ．３３−３４］。結果は線形回帰式に由来するグラフを用い示され、それは一般的な形ｙ＝ｋ＋ｂ＊ｘを有し、ｙは定数ｋおよび変数ｘを掛けた角度係数ｂにより表される。同時に、グラフ上で、決定係数ｒ２を示し、値の全体的な分布と比較して回帰直線近辺の値の分布を表すことが示された。ｒ２の値がより１に近いほど、変数のばらつきを説明するより良いモデルとなる。すべての回帰式に対する信頼区間は、９５％と等しかった。

本願請求項の化合物の毒性の評価
３つの方法により生産される薬剤の抗ウイルス性作用の評価のみならず毒性の評価：
１）倒立顕微鏡下の単層細胞の完全性のモニタリングおよび評価は、コントロールウェルの細胞形態と実験したものとの比較、および作用因子（薬剤、ウイルスなど）の影響下における変化の記録を意味する。形態の変化は、ウイルス感染における単層の完全性、細胞形の変化、細胞変性効果の発現を妨害することを含む可能性がある。

２）チキン赤血球（０．７５％）の懸濁によるウイルス血球凝集素が認められる場合における記録。サンプルにおけるウイルスの定性的な存在を評価する赤血球凝集反応（ＲＨＡ）。

３）ＭＴＴ法。薬剤感受性の評価に用いられ、無色３−４，５−ジメチルチアゾール２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ試薬）の形態をＤＭＳＯまたは９６％アルコールに溶解する青色結晶のホルマザンに戻すという、生きている細胞のデヒドロゲナーゼの能力に基づく方法。色素の飽和は細胞における代謝プロセスの強度、すなわち、生存率が正常レベルであることを示す。色素強度は分光光度計で記録され、得られる吸収度値を統計データ処理に用いることが可能である。

ＭＤＣＫ細胞のテストにおいて単層細胞の５０％を死滅させる間の薬剤濃度は１７７ｐｇ／ｍｌであった。すべての単層細胞が生存する薬剤濃度は、６２．５マイクログラム／ｍｌであり、薬剤の抗ウイルス性活性をテストするのに用いられた。

このテストでは、コントロールにおける細胞の生存率は０．５７１±０．０４４であった。このように、生存している細胞単層が５０％である吸収度は０．２８６である。図１に示されるｙ軸グラフにこの値を入れ、ｘ軸と平行して線を引き、その後、表を用いこの線の交点からｘ軸と垂直の生存率まで線を引く場合、細胞の単層の５０％を死滅される本請求項に係る化合物の濃度と一致する値を得る（表２参照）。

抗ウイルス性活性の評価
３つの評価方法のすべてで提案された関連（濃度＝６２．５ｍｇ／ｍｌ）は顕著な抗ウイルス性活性を有し、感染性ウイルス活性のコントロールと比較して３ｌｇでウイルス価を減少させた。

本請求項に係る化合物の作用と一致するグラフの作図において、決定係数ｒ２は０．８６と等しく、それはこのモデルがテストした変数、すなわち、インフルエンザウイルスに感染している細胞に対するテスト化合物の効果の変化をよく説明することを示唆するものである。垂直軸の単層細胞の５０％生存率である吸光度と一致する点と薬剤における細胞の生存率と一致する直線と垂直に交わる交点との間で垂線を引く場合、我々は表３に示すように以下の表を有する。

表３から、ｘ軸と垂直である交点がウイルスｌｇが−３．５と等しい希釈と一致するという結果になる。細胞単層がない場合、ウイルスが１０〜６．５（ウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の生物学的特性をテストする個別のテストにおいて明らかにしたウイルスの感染性）と等しい値にまで薬剤に感染するという事実から判断すると、インビトロ条件下の薬剤の使用が感染性ウイルス活性を３ｌｇ減少させると言うことが可能である。

上で示されるデータは、プロトタイプ化合物（１）が（関連（１）＝８０ｍｋｇ／ｍｌのＳＣ５０であり、本請求項に係る化合物に対するＳＣ５０＝１７７ｕｇ／ｍｌであるため）本請求項に係る関連より有毒であることを示す。化合物（１）は、汎発性インフルエンザウイルスＡ／Ｈ１Ｎ１ｖ株−Ａ／Ｓａｎｋｔ−Ｐｅｔｅｒｂｕｒｇ／２／０９（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９−ｐｏｄｏｂｎｙ）に対し活性がある。それと同時に、はるかにより低い濃度の主張がなされている接続（２）は、有毒なものと比較すると、顕著な抗ウイルス性活性を有し、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４ウイルスおよび汎発性インフルエンザＨ１Ｎ１ｖＡ／Ｓａｎｋｔ−Ｐｅｔｅｒｂｕｒｇ／２／０９（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９−ｐｏｄｏｂｎｙ）のウイルスの力価を、３．０ｌｇに向かいそれぞれ濃度を６２．５および１２５ｕｇ／ｍｌに減少させ、その後、プロトタイプでの活性よりもより活性のある抗ウイルス性化合物が存在する。

Claims

図１で示される分子骨格。
抗ウイルス性の特性を有する図２で示される小分子。
ヒトおよび動物におけるインフルエンザ感染症の治療に用いられる、経口で摂取可能な形態の請求項２記載の小分子。
ウイルス感染症の治療に用いられる、経口で摂取可能な形態の請求項２記載の小分子。