CN109096359B - 三萜三聚体衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

三萜三聚体衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开三萜三聚体衍生物及其制备方法，以及在用于制备预防或治疗流感的药物及阻止或抑制流感病毒进入细胞的药物的应用。

Description

三萜三聚体衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及三萜三聚体衍生物及其制备方法与应用，属于药物化学领域。
背景技术
流感是由流感病毒(influenza virus)引起的一种急性，传染性呼吸系统疾病。根据其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原性不同，流感病毒可分为A型、B型、C型和D型。A型(又称甲型)流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(Virology Journal.2007,4,1-5)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(EmergingInfectious Diseases.2006,12,9-14；Journal of the American Medical Association,2007,18,2025-2027)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(New England Journalof Medicine.2009,370,1335-1342)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据统计，全世界平均每年有30-50万人死于流感(Southern Medical Journal.2007,57,1-60)。
迄今，FDA批准的抗流感药物主要有两类：第一类，达菲(Oseltamivir)和乐感清(zanamivir)主要抑制流感病毒的神经氨酸酶(NA)，阻断流感病毒从感染细胞中释放出来(Nature Medicine.2004,10,82-87；Journal of the American Chemical Society.1997,119,681-690)；第二类，金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)主要破坏流感病毒M2蛋白离子通道活性，能够抑制流感病毒的脱衣壳过程(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America.2008,105,10967-10972)。然而，美国疾病预防控制中心抽样调查发现，2008/2009年的H3N2毒株和2009年大流行的H1N1病毒中，100％的毒株对金刚烷类药物都具有耐药性；99.6％的季节性H1N1流感病毒对达菲具有耐药性(http://www.cdc.gov/flu/weekly/weeklyarchives2008-2009/weekly35.htm)。
三萜类化合物是自然界中广泛存在的一类天然化合物，其结构包括A、B、C、D、E五个环，30个碳原子(Journal of the American Chemical Society,1996,35,8509-8509)。三萜类化合物由于其多种多样的生物及药理活性而引起越来越广泛的关注，如白桦脂酸及其衍生物已在临床试验中用作抗肿瘤和抗HIV的药物(U.S.Pat.Nos.5,679,828；6,689,767；6,369,109；U.S.App.Pub.No.2004/0204389)；齐墩果酸是保护肝脏防止化学试剂损伤和防治HIV感染的有效成份(Journal of Natural Products.1998,61,1090-1095)。北京大学周德敏教授课题组首次发现了自然界广泛存在的五环三萜天然产物与不同的环糊精偶联具有很强的抗流感病毒进入的活性，并对其机制进行了深入的研究(European Journalof Medicinal Chemistry.2017,134,133-139；Biomaterials.2016,78,74-85)。三萜三聚体衍生物对流感病毒的抑制作用则未见报道。
发明内容
本发明所述三萜三聚体衍生物包括具有通式(Ⅰ)所示结构的一类化合物，及其药学上可接受的盐(如盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐等)，以及它们(化合物及其盐)的水合物(如三水合物、六水合物、九水合物等)。
Figure BDA0001743560900000021
式中，虚线部分表示可有可无，即
Figure BDA0001743560900000022
为单键或双键；
R1为-NH-或-O-；
R2和R7各自独立选自H，卤素，羟基，氰基，硝基，巯基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基，氨基，NR11"R12"，其中R11"和R12"各自独立选自未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基。
优选地，R2独立选自H、OH、SH或NH2，更优选为OH。
优选地，R7独立选自H、OH、NH2或SH，更优选为OH。
R3、R4、R5、R6和R8各自独立选自H，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3、R4、R5、R6和R8各自独立选自甲基。
R9选自H，卤素，羟基，氰基，硝基，巯基，C1-C6硫烷基，羰基，肟基，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基；
R10为采用1,4-连接的1,2,3-三氮唑，n＝0-3；
A为取代或未取代的苯环，取代或未取代的哌嗪，三嗪，取代或未取代环己烷，其中可选的取代基包括C1-C6烷氧基、羟基、硝基或卤素。优选地，取代苯环、取代哌嗪、取代环己烷为1,2,3、1,2,4或1,3,5位取代；
Z为(-CH2-)m或(-O-CH2-CH2-)m，m＝1-12；
X和Y结合起来形成一个带有一个以上相同或不同取代基的五、六或七元环，取代基各自独立选自H，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基，未取代的C1-C6烷氧基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷氧基，卤素，羧基，羟基，硝基，氰基，巯基，C1-C6硫烷基或NHR9'，其中R9'是H，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基。
优选地，X和Y结合起来形成一个带有1-5个相同或不同取代基的六元环，其中取代基各自独立选自H，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基，羧基，羟基，硝基，氰基或NHR9'；其中R9'是H，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基，巯基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基。
更优选地，取代六元环为：
Figure BDA0001743560900000031
其中R11、R12、R13、R14和R15各自独立选自H、OH、未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基、NHR9'；其中R9'是H、未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基，巯基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基。
更进一步优选地，R11、R12、R13、R14和R15各自独立选自H、羟基、氨基。
最优选地，R11是H。
最优选地，R12和R13各自独立选自H或甲基。
最优选地，R14和R15各自独立选自H、OH或NH2。
另一个优选地，X和Y结合起来形成一个带有1-4个相同或不同取代基的五元环，其中所述取代基各自独立选自H，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基，羧基，羟基，硝基，氰基，或NHR9'；其中R9'是H，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基，巯基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基。
更优选地，取代五元环为：
Figure BDA0001743560900000041
其中R11'、R12'、R13'和R14'各自独立选自H、OH、NHR9'；其中R9'是H、未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基，巯基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基。
最优选地，R11'、R12'、R13'和R14'各自独立选自H，羟基，氨基，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基。
最优选地，R11'是-C(CH3)＝CH2，R12'、R13'和R14'各自独立选自H。
按照本发明的一个优选实施方案，其中R3、R4、R5、R6和R8各自独立选自甲基，R2和R7独立选自OH。
按照本发明的另一个优选实施方案，其中R3、R4、R5、R6和R8各自独立选自甲基，R2和R7独立选自OH，X和Y与其它碳原子一起形成一个未取代或取代的六元环，优选二取代的六元环，例如R11和R12各自独立选自甲基。
按照本发明的另一个优选实施方案，其中R3、R4、R5、R6和R8各自独立选自甲基，R2和R7独立选自OH，X和Y与其它碳原子一起形成一个未取代或取代的六元环，优选二取代的六元环，例如R12和R13各自独立选自甲基。
按照本发明的另一个优选实施方案，其中R3、R4、R5、R6和R8各自独立选自甲基，R7是OH，X和Y与其它碳原子一起形成一个未取代或取代的五元环，优选单取代的五元环，例如R11'是-C(CH3)＝CH2。
当上述化合物含有手性原子时，均包括R和S两种构型以及它们的混合物。
定义：
术语“C1-C3烷基”是指含有一到三个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基等。
术语“C1-C6烷基”是指含有一到六个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基等。
术语“三萜”是指由数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质，大部分为30个碳原子，少部分含27个碳原子的萜类化合物，例如齐墩果酸、白桦脂酸等。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“C1-C6硫烷基”是指其中一个氢原子被硫原子取代的C1-C6烷基。
所述三萜三聚体衍生物的制备方法：
1、通过酰胺键合成的以苯环为中心的三萜三聚体衍生物。
将1当量的三萜溶于THF中，依次加入1.2～1.5当量的TBTU和1.5～2当量的DIEA，反应获得三萜活泼酯中间体，将它溶于DMF，再加入10～20当量的不同碳链长度的二胺与1.5～2当量的TEA或Na2CO3反应，所得产物再与0.2～0.25当量的1,3,5-三氯甲酰基苯反应，得到目标三萜三聚体产物。
2、通过CuAAC反应合成的以苯环为中心的三萜三聚体衍生物。
将1当量的三萜溶于THF中，依次加入1.2～1.5当量的TBTU和1.5～2当量的DIEA，反应获得三萜活泼酯中间体，将它溶于DMF，再加入1.2～1.5当量不同碳链长度的氨基炔与1.5～2当量的TEA或Na2CO3反应，所得产物再与0.2～0.25当量的1,3,5-三叠氮甲基苯、0.6～1当量的硫酸铜、0.6～1当量的抗坏血酸钠进行CuAAC反应，得到目标三萜三聚体产物。
3、通过CuAAC反应合成的以sp3杂化碳原子为中心的三萜三聚体衍生物。
将1当量的三萜溶于THF中，依次加入1.2～1.5当量的TBTU和1.5～2当量的DIEA，反应获得三萜活泼酯中间体，将它溶于DMF，再加入1.2～1.5当量不同碳链长度的氨基炔与1.5～2当量的TEA或Na2CO3反应，所得产物再与0.2～0.25当量的3-叠氮基-2,2-(二叠氮甲基)丙基-1-醇、0.6～1当量的硫酸铜，0.6～1当量的抗坏血酸钠进行CuAAC反应，得到目标三萜三聚体产物。
所述三萜三聚体衍生物的应用：
所述三萜三聚体衍生物能够用于预防和治疗流感，因此可用于制备预防或治疗流感的药物，其机制是三萜三聚体衍生物与病毒外膜蛋白结合，阻挡病毒识别和进入细胞，因此，也可用于制备阻止或抑制流感病毒进入细胞的药物，但不仅局限于此机制。预防或治疗人或动物流感的方法，包括对人或动物施用有效量的三萜三聚体衍生物。
所述三萜三聚体衍生物可以直接施用，优选以组合物形式施用，所述组合物包括上述化合物和可药用载体，稀释剂或赋形剂。
可以通过任何适当的途径来施用活性剂进行治疗。适当的施用途径可以包括口服、直肠、鼻、气雾或颗粒吸入剂、局部(包括含化和舌)、经皮、阴道、膀胱内、伤口内和胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、胸骨内、膜内、硬膜外和真皮内)。
本发明也涉及组合物，包含本发明化合物或其药学可接受的盐，与一种或多种药学可接受的添加剂和任选的其他药物一起。药学可接受的添加剂可以是载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂的形式，可以包括所有常规的溶剂、分散剂、填充剂、固体载体、包衣剂、抗真菌或抗菌剂、皮渗透剂、表面活性剂、等张剂和吸收剂，和缓释或控释基质。活性剂可以以适合同时、分开或连续施用活性剂的组分的试剂盒的形式。在与组合物的其他成分相容和患者生理耐受的意义上，每种载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂必须是“药学可接受的”。该组合物可以方便地以单元剂型的形式存在，可以通过制药领域公知的方法来制备。这些方法包括将活性成分与载体相混合的步骤，其中载体是由一种或多种助剂组成的。一般地，制备该组合物，包括将活性成分与液体载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂或精细分离的固体载体或两者均匀和直接地混合，然后如果必要使产物成型。
适合口服的本发明的组合物可以是以每个都包含预定量的活性成分的分离单元例如胶囊、囊剂或片剂的形式存在；作为粉末或颗粒；作为水相或非水液体中的溶液或混悬液；或者作为水包油性液体乳剂或油包水性乳剂。活性成分也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂的形式存在。
可以通过任选与一种或多种助剂压片或成模来制备片剂。可以通过在适当的机器中压制自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分来制备压制片，任选与粘合剂(例如惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在适当的机器中将用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物成型来制备模印片。任选可以将片剂包衣或刻痕，可以通过配制来缓释或控释活性成分，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素来产生所需的释放性质。片剂任选可以具有肠溶衣，以在肠中而不是胃中释放。
适合胃肠外施用的组合物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与所预期的患者的血液等张的溶质；和水性和非水性无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和管中，可以贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前加入无菌液体载体例如注射用水。可以由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备无准备的注射溶液和混悬液。
适合局部施用于皮肤，即经皮施用的组合物可以包含溶解或悬浮在任何适当的载体或基质中的活性剂，可以是洗剂、凝胶、乳膏、糊剂、软膏等等的形式。适当的载体可以包括液状石蜡、丙二醇、蜡、聚氧乙烯和长链醇。也可以使用经皮装置例如贴剂，可以包含适当材料例如硝酸/乙酸纤维素、丙烯和聚碳酸酯制成的微孔膜。贴剂也可以包含适当的皮肤粘附性和基底材料。
本发明的活性化合物也可以以植入物的形式存在，其可以包含药物的聚合性装置，其中聚合物是生物相容性的和无毒性的。适当的聚合物可以包括水凝胶、硅酮、聚乙烯和生物可降解的聚合物。
本发明的化合物可以以持续(即控释)或缓释的形式施用。持续释放制剂是其中施用后活性成分在患者体内缓慢释放并在最小的时间里维持所需的药物浓度的制剂。持续释放制剂的制备是本领域技术人员公知的。剂型可以包括口服形式、植入物和经皮形式。对于缓释施用，活性成分可以作为例如缓释颗粒悬浮或在脂质体内。
依据选择的化合物的特定活性、患者状况以及要处理的病症选择本发明化合物适合的剂量范围。本领域技术人员可以根据其普通知识和在本领域的经验适合的剂量范围。例如对于流感病毒感染，人类适合的剂量范围可以为每人每天1-500mg，例如10-300mg，通常为30-150mg。
附图说明
图1A为OA的抗流感病毒IC50测定结果；
图1B为化合物51的抗流感病毒IC50测定结果；
图1C为化合物73的抗流感病毒IC50测定结果；
图2A为化合物51加药时间点实验过程及结果示意图；
图2B为化合物51加药时间点实验结果数据图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细描述，所述实施例是用作举例说明的，因此，不应当解释为对本发明保护范围的限制。
实施例1：通过酰胺键连接合成OA三聚体。
Figure BDA0001743560900000081
(1)OA活泼酯A1的合成：
在50mL圆底烧瓶中加入500mg OA(齐墩果酸)，加入15mL THF使其完全溶解。加入740mg 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)充分搅拌后，在白色悬浊液中滴加N-乙基二异丙胺(DIEA)0.8mL，常温反应12h，过滤，减压去除溶剂，得到的固体通过色谱柱分离纯化；洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝4:1，得到白色固体A1 600mg；收率95％。
(2)OA-丙二胺偶联物A2的制备：
取10mmol丙二胺，DMF溶解，冰浴下缓慢滴加1mmol的A1活泼酯DMF溶液，再加20mmol Na2CO3，1h后温度升至室温，反应8h。后处理：蒸干DMF，加入水，产生白色沉淀，抽滤，滤饼用1N盐酸洗涤，干燥，得目标产物A2，产率92％。
(3)目标产物的合成：
采用1,3,5-三苯甲酰氯苯/A2＝1:4的比例投料，以DMF为溶剂，加入过量三乙胺，在室温下反应12h，TLC监测反应完全。后处理：蒸干DMF，加入水，抽滤，滤饼办样柱分离。得白色固体产物(化合物51)，产率81％。
实施例2：通过CuAAC反应合成OA三聚体。
Figure BDA0001743560900000091
(1)化合物B1的合成：
将1.5eq的炔丙胺溶于DMF，加入化合物A1(A1的制备方法参照实施例1中步骤(1))及2eq的TEA，室温下反应，12h后TLC检测，反应完全。后处理：蒸干DMF，用乙酸乙酯混悬，水洗，有机相干燥后硅胶柱分离，得白色固体产物B1，产率91％。
(2)目标产物的合成：
将0.63mmol的化合物B1与0.2mmol的1,3,5-三叠氮甲基苯用二氯甲烷:水＝1:1混合溶剂20mL溶解，再加入0.80mmol抗坏血酸钠和0.80mmol五水硫酸铜，室温下快速搅拌反应，12h后TLC检测，反应完全。后处理：分离出有机相，干燥后硅胶柱分离，得白色固体目标产物(化合物73)，产率88％。
实施例3：通过CuAAC反应合成的以sp3杂化碳原子为中心的OA三聚体。
Figure BDA0001743560900000101
(1)目标产物的合成
将0.63mmol的化合物B1(B1的制备方法参照实施例2中步骤(1))与0.2mmol的3-叠氮基-2,2-(二叠氮甲基)丙基-1-醇用二氯甲烷:水＝1:1混合溶剂20mL溶解，再加入0.80mmol抗坏血酸钠和0.80mmol五水硫酸铜，室温下快速搅拌反应，12h后TLC检测，反应完全。后处理：分离出有机相，干燥后硅胶柱分离，得白色固体目标产物(化合物25)，产率83％。
本发明化合物抑制流感病毒进入细胞的生物活性评价方法：
1、细胞病变(CPE)抑制试验。流感病毒感染细胞后会导致细胞病变，使得细胞活力降低。如果药物能够抑制流感病毒复制，则会降低细胞病变数量，提高细胞活力。具体来说：
1)将犬肾上皮细胞(MDCK)以1:3的比例传代到白色的96孔板中，在37℃细胞培养箱中用含10％FBS的DMEM培养基培养24h。
2)将流感病毒[A/WSN/33(H1N1)，感染复数(MOI)＝1]与一定浓度的待检化合物加入到100μL含有2μg/mL TPCK处理的胰酶、1％FBS的DMEM中，充分混匀。化合物的阴性对照为1％DMSO(稀释化合物所用的溶剂)。同时设立一组只加各化合物不加病毒实验组，用来检测化合物对细胞活力的影响。
3)将96孔板中的MDCK细胞的培养基吸出，将混合有病毒和化合物的培养基加入到MDCK细胞中，37℃细胞培养箱中培养48h。每个样品三个复孔。
4)用CellTiter-Glo荧光细胞活性检测试剂盒(Cat.G7571，Promega)检测细胞活力。首先将细胞和CellTiter-Glo检测试剂放于室温环境，待其温度平衡至室温，将100μL/孔的CellTiter-Glo检测试剂加入到细胞的培养上清中，震动2min后，避光静置10min。用仪器Tecan InfiniteM2000 PROTM检测细胞活力。
5)IC50的计算方法：首先对化合物进行浓度系列稀释，然后利用上述方法测定出细胞活力。化合物对细胞病变的保护率＝100×(1-(Test compound–Median Virus1)/(Median Cells-Median Virus2)).其中Test compound表示只加待检化合物不加病毒组的细胞活力；Median Virus1表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力；Median Cells表示只加入1％DMSO组的细胞活力；Median Virus2表示加入1％DMSO和病毒组的细胞活力。将化合物浓度和相应的保护率输入到软件Prism，即可计算IC50。此方法已被广泛应用于抗病毒药物筛选领域。
6)CC50的计算方法：CellTiter-Glo也可以用来检测化合物对细胞的毒性。首先对化合物进行浓度系列稀释，然后将其加入到细胞中，方法同2)-4)，但不加入病毒。培养48h后，测定细胞活力。然后将对照组细胞活力(1％DMSO)定义为100％，将其他各化合物组细胞活力标准化，除以对照组1％DMSO的细胞活力，再乘以100％。将化合物的浓度和相应的标准化的细胞活力输入到软件Prism，即可计算出CC50。
2、加药时间点实验。用以分析化合物作用于病毒感染细胞的哪一阶段。具体步骤：
1)将MDCK细胞传代到六孔板中，在37℃细胞培养箱中用含10％FBS的DMEM培养基培养24h。
2)将A/WSN/33(H1N1)病毒(MOI＝1)稀释到不含血清的DMEM中，感染MDCK细胞。
3)流感病毒从吸附到子代病毒粒子释放，其复制周期约为6-8h。故在以下时间段将药物加入到细胞培养基中：0-10、0-2、2-5、5-8或8-10h。
4)感染10h后，用冰预冷的PBS清洗细胞一次，用200μL/孔的PIPA裂解液裂解细胞。用细胞刮将细胞刮下，吸入1.5mL EP管中，置于冰上15min。以12000rpm 4℃离心10min，将上清液转移到另一个1.5mL EP管中。
5)吸取30μL样品与等体积的2×蛋白上样缓冲液混合，100℃煮样10min。
6)将煮好的样品各20μL加入到12％的蛋白质凝胶加样孔中，进行SDS-PAGE电泳。
7)用免疫印迹法(Western blotting)检测流感病毒的NP蛋白的表达水平(以此来检测病毒在细胞内的复制情况)；同时以细胞蛋白GAPDH作为细胞内参(也可用于验证药物对细胞的毒性)。
3、血凝抑制试验。此方法用来检测药物是否影响病毒与细胞受体之间的结合。具体方法：
1)制备1％(v/v)的鸡红细胞悬液。选1-2只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中混匀，置4℃冰箱保存。以800-1000rpm离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm离心5min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4-5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液。放入4℃冰箱中可保存2-3天。使用时用1mL吸管吸取0.1mL红细胞，然后加入9.9mL的生理盐水，此即1％红细胞悬液。
2)确定病毒的血凝效价。将WSN流感病毒以2倍梯度做倍比稀释，稀释液为PBS。
3)将病毒液与1％红细胞悬液等体积(各50μL)混合加入到V底的96孔板中。置于微量振荡器上振荡1min，室温静置孵育30min。
4)将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，表明红细胞被病毒所凝集。在确定流感病毒的血凝效价后，确定合适的病毒使用量。
5)将药物、DMSO(阴性对照)或抗HA的特异性单克隆抗体(阳性对照)与病毒液混合后加入到细胞混悬液中。观察化合物对红细胞凝集有没有抑制效果。
下面为本发明部分化合物的抗流感病毒的实验结果。
1、化合物51和73能够有效抑制流感病毒的复制。通过CPE抑制试验和噬斑抑制实验证明化合物51和73对流感病毒有着明显的抑制作用，强于阳性药物利巴韦林。CPE抑制试验表明51和73对流感病毒的IC50(半数抑制浓度，即抑制一半细胞病变的化合物浓度)分别为5.66μM和11.09μM(见表1和图1A、1B)，而阳性药物达菲(磷酸奥司他韦，OSV-P)的IC50为45.6μM，利巴韦林(RBV)的IC50为42.7μM(见表1)，OA的IC50为72.27μM(见图1C)。化合物51和73在A549、MDCK以及293T细胞中的CC50(半数细胞毒性浓度)均大于100μM(见表1)，说明二者的细胞毒性很小。
表1 51和73抑制流感病毒(WSN)的活性及其细胞毒性分析
Figure BDA0001743560900000131
利用细胞病变(CPE)抑制实验计算化合物51和73的IC50明显低于利巴韦林和磷酸奥司他韦抗，说明化合物51和73抗流感病毒效果类强于于利巴韦林和磷酸奥司他韦。
2、化合物51和73能够抑制流感病毒进入细胞
通过加药时间点实验和血凝抑制实验可以初步断定，化合物51和73作用于病毒进入细胞过程中，且干扰了病毒与细胞受体之间的结合，通过干扰流感病毒进入宿主细胞这一过程达到抗病毒目的(化合物51加药时间点实验过程及结果见表2及图2A、2B)。
表2化合物51加药时间点实验结果
Figure BDA0001743560900000132
结果显示，在全程给药(0-10h)以及0-2h加药均能够有效地抑制流感病毒的复制。通过数据可知药物在病毒感染后0-2h内病毒NP水平为0.38，表明发挥了抑制作用，而在感染2h之后与DMSO对照值来看，再加药则无抑制效果。实验表明化合物51对HA有抑制作用，说明化合物51作用于病毒早期复制，在病毒与细胞结合阶段中发挥作用。
采用以上相同的实验方法，对本申请的其他化合物进行了相同或相关的实验测定，结果均表明它们均具有与上述化合物相同或类似的实验结果。由此表明申请的化合物具备较好的抗流感的治疗效果。

Claims (5)

1.一种三萜三聚体衍生物，其特征在于，包括下表中所列具体化合物：
Figure FDA0003157422130000011
Figure FDA0003157422130000012
Figure FDA0003157422130000021
Figure FDA0003157422130000031
Figure FDA0003157422130000041
Figure FDA0003157422130000051
Figure FDA0003157422130000061
Figure FDA0003157422130000071
Figure FDA0003157422130000081
2.权利要求1所述的三萜三聚体衍生物的制备方法，通过酰胺键合成的以苯环为中心的三萜三聚体衍生物，包括以下步骤：将1当量的三萜溶于THF中，依次加入1.2～1.5当量的TBTU和1.5～2当量的DIEA，反应获得三萜活泼酯中间体，将它溶于DMF，再加入10～20当量的不同碳链长度的二胺与1.5～2当量的TEA或Na2CO3反应，所得产物再与0.2～0.25当量的1,3,5-三氯甲酰基苯反应，得到目标三萜三聚体产物。
3.权利要求1所述的三萜三聚体衍生物的制备方法，通过CuAAC反应合成的以苯环为中心的三萜三聚体衍生物，包括以下步骤：将1当量的三萜溶于THF中，依次加入1.2～1.5当量的TBTU和1.5～2当量的DIEA，反应获得三萜活泼酯中间体，将它溶于DMF，再加入1.2～1.5当量不同碳链长度的氨基炔与1.5～2当量的TEA或Na2CO3反应，所得产物再与0.2～0.25当量的1,3,5-三叠氮甲基苯、0.6～1当量的硫酸铜、0.6～1当量的抗坏血酸钠进行CuAAC反应，得到目标三萜三聚体产物。
4.权利要求1所述的三萜三聚体衍生物的制备方法，通过CuAAC反应合成的以sp3杂化碳原子为中心的三萜三聚体衍生物，包括以下步骤：将1当量的三萜溶于THF中，依次加入1.2～1.5当量的TBTU和1.5～2当量的DIEA，反应获得三萜活泼酯中间体，将它溶于DMF，再加入1.2～1.5当量不同碳链长度的氨基炔与1.5～2当量的TEA或Na2CO3反应，所得产物再与0.2～0.25当量的3-叠氮基-2,2-(二叠氮甲基)丙基-1-醇、0.6～1当量的硫酸铜，0.6～1当量的抗坏血酸钠进行CuAAC反应，得到目标三萜三聚体产物。
5.权利要求1所述的三萜三聚体衍生物在用于制备预防或治疗流感的药物及阻止或抑制流感病毒进入细胞的药物的应用。
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