RU2455304C1 - 6-(2'-АМИНО-2'-КАРБОКСИЭТИЛТИО)-2-МЕТИЛТИО-4-ПИВАЛОИЛОКСИМЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОН - Google Patents
6-(2'-АМИНО-2'-КАРБОКСИЭТИЛТИО)-2-МЕТИЛТИО-4-ПИВАЛОИЛОКСИМЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОН Download PDFInfo
- Publication number
- RU2455304C1 RU2455304C1 RU2011114747/04A RU2011114747A RU2455304C1 RU 2455304 C1 RU2455304 C1 RU 2455304C1 RU 2011114747/04 A RU2011114747/04 A RU 2011114747/04A RU 2011114747 A RU2011114747 A RU 2011114747A RU 2455304 C1 RU2455304 C1 RU 2455304C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- triazolo
- compound
- methylthio
- triazin
- carboxyethylthio
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Описывается новое соединение - 6-(2'-Амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-он формулы (2)
обладающее противовирусным действием и низкой токсичностью. Данное соединение может найти применение в медицине. 1 пр., 3 ил.
Description
1. Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-она, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики вирусных инфекционных заболеваний животных и человека. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.
2. Уровень техники
Имеются данные о противогерпетическом действии 6-фенил-4-гидроксибутил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она (В.Л. Русинов, О.Н.Чупахин, Е.Н.Уломский и др., патент РФ №2345080 от 27.01.2009), а также 4-((Z)-4'-Гидроксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (О.Н.Чупахин, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский и др., патент РФ №2376307 от 20.12.2009 г.). Противовирусным действием в отношении вирусов гриппа типов А и В обладают 2-R-6-нитро-4-аллилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-оны, R=Н, CH3, SCH3 (В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, С.Л.Деев. И др., патент РФ №2340614 от 10.12.2008; В.Л.Русинов, О.Н.Чупахин, С.Л.Деев, Т.С.Шестакова, Е.Н.Уломский, Л.И.Русинова, О.И.Киселев, Э.Г.Деева. Синтез и противовирусная активность аналогов нуклеозидов на основе 1,2,4-триазоло[3,2-с][1,2,4]триазин-7(4Н)-онов. Известия АН, Серия химическая, 2010, №1, с.135-142). Наиболее близкое по структуре к заявляемому соединению из этой серии 2-метильтио-6-нитро-4-аллилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-он (1) можно рассматривать в качестве прототипа. При использовании соединения (1) в концентрации 40 мкг/мл в опытах in vitro инфекционный титр вируса гриппа A/H3N2 А/Гонконг/1/68 и вируса гриппа A/H5N1 A/Duck/Singapore R/F119-3/97 снижается на 0,5-3,0 lg. Однако данное соединение при повышении концентрации проявляло цитотоксичность. Концентрация, при которой гибнут 50% клеток (CC50), составляет 80 мкг/мл.
3. Сущность изобретения
Сущность изобретения составляет 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-он формулы (2)
обладающий противовирусным действием.
4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
4.1. Синтез 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-она
Пример 1. К 2-метилтио-6-нитро-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-ону, полученному из 0,05 моль натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7-она, дигидрата действием 0,05 моль хлорметилпивалата с использованием диметилформамида в качестве растворителя, прибавляют раствор 1 эквивалента цистеина в этаноле. По окончании реакции растворитель удаляют в вакууме, а полученный осадок очищают с помощью хроматографической колонки (элюент - ацетонитрил: вода = 8:1).
Выход соединения (2) составляет 51%.
Химическая схема синтеза заявляемого соединения 6-(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4Н)-он (2) имеет следующие физико-химические характеристики: Тпл=204°C; 1H ЯМР спектр в D2O δ, м.д.: 5,18 (д., 1H, CH2), 5,13 (д, 1H, СН2), 4,19 (м., 1H, CH), 3,91 (м., 1H, SCH2), 3,39 (м, 1Н, SCH2), 2,69 (с., 3H, CH3), 1,18 (д., 9H, C(CH3)3). Найдено: С - 40,56, H - 4,77, N - 20,32. Брутто-формула - C14H20N6O5S2. Вычислено: C - 40,38, H - 4,84, N - 20,18%.
Заявляемое соединение представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, метаноле, диметилсульфоксиде, нерастворимое в бензоле, эфире и большинстве других растворителей.
4.2. Противовирусные свойства 6(2'-амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7-она (2)
Пример 2. Определение токсичности и противовирусной активности соединений в отношении вируса гриппа
Клетки. Использовали односуточную монослойную эпителиальную культуру клеток MDCK (почка собаки).
Вирусы. Для оценки противовирусной активности использовали эталонный вирус A/Puerto Rico/8/34, а также пандемический вирус гриппа H1N1v А/Санкт-Петербург/2/09 (подобный так называемому вирусу «свиного гриппа» A/California/7/09).
Максимальные переносимые концентрации соединений определяли с помощью МТТ-теста в культуре клеток MDCK.
Проверка токсичности осуществлялась по следующей схеме: навеска весом 5 мг отвешивалась в стерильную пробирку объемом 5 мл и разводилась ростовой средой для клеток MDCK (α-МЕМ, Биолот, Санкт-Петербург) до концентрации 1 мг/мл, получая таким образом базовый раствор. Далее этой же средой делали 8 последовательных двоичных разведении (500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,13; 7,56 и 3,78 мкг/мл соответственно), которые и использовали для проверки токсичности. Опыт ставили в 4 параллелях для каждой концентрации. Односуточную культуру клеток MDCK, выращенных на 96-луночных планшетах (Costar), проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. Планшеты дважды отмывали средой, не содержащей сыворотки, после чего вносили испытуемое соединение в соответствующей концентрации в объеме 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали 72 часа при 37°C в присутствии 5% CO2, после чего регистрировали результаты опыта визуально, оценивая целостность монослоя по сравнению с контролем клеток, и методом МТТ (количественно оценивающем жизнеспособность клеток) с использованием планшетного ридера Hydex Chameleon. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
Оценку противовирусной активности проводили для 2 концентраций: максимальной концентрации (из двоичных разведении), при которой выживало 100% клеток монослоя, и концентрации, равной половине предыдущей. Для оценки противовирусной активности использовали эталонный вирус A/Puerto Rico/8/34. Односуточную культуру клеток MDCK, выращенных на 96-луночных планшетах (Costar), проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. Далее готовили десятикратные вирусные разведения на поддерживающей ростовой среде с добавлением трипсина (с -1 по -6). Планшеты с монослоем клеток дважды отмывали средой, не содержащей сыворотки, после чего вносили вирусные разведения в соответствующие лунки планшета в объеме 50 мкл. Контрольные лунки заполняли ростовой средой в равном объеме. Планшеты инкубировали 60 мин при 37°C в присутствии 5% CO2, после чего отмывали средой для того, чтобы удалить не связывающиеся с клетками вирусные частицы. Далее вносили препарат в лунки с вирусными разведениями по 100 мкл в соответствующей концентрации. Каждая концентрация исследуемого соединения была поставлена в четырех параллелях для каждого вирусного разведения. Контрольные лунки заполняли ростовой средой в том же объеме. Также оставляли лунки для повторной проверки токсичности используемых концентраций. Планшеты инкубировали 72 часа при 37°C, после чего регистрировали результаты опыта визуально, оценивая целостность монослоя по сравнению с контролем клеток и степень цитопатического действия вируса на культуру клеток, ставили реакцию гемагглютинации и использовали метод МТТ для количественной оценки жизнеспособности клеток с использованием планшетного ридера Hydex Chameleon.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0 [Боровиков В.П., Боровиков И.П. Statistica. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. - М., 1997. - С.33-34], применяя регрессионный анализ [Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. - Минск, 1967. - С.155]. Результаты представлены с помощью графиков, полученных на основе уравнения линейной регрессии, имеющего общий вид y=k+b*x, в котором переменная у выражена через константу k и угловой коэффициент b, умноженный на переменную х. При этом на графике указывается коэффициент детерминации, обозначенный как r2 и выражающий разброс значений около линии регрессии по отношению к общему разбросу значений. Чем ближе значение r2 к 1, тем лучше данная модель объясняет изменчивость соответствующих переменных. Доверительный интервал для всех регрессионных уравнений был равен 95%.
Оценка токсичности заявляемого соединения
Оценка токсичности, как и оценка противовирусного действия препаратов, производилась тремя методами:
1) Наблюдение и оценка целостности монослоя клеток под инвертированным микроскопом. Подразумевает сравнение морфологии клеток контрольных лунок с опытными и регистрацию изменений под воздействием агента (препарата, вируса и т.д.). Изменение морфологии может включать нарушение целостности монослоя, изменения формы клеток, проявление цитопатического действия при вирусной инфекции.
2) Регистрация присутствия вируса в реакции гемагглютинации со взвесью куриных эритроцитов (0,75%). Реакция гемагглютинации (РГА) позволяет оценить качественное присутствие вируса в пробе.
3) Метод МТТ. Метод, используемый при оценке лекарственной чувствительности, основанный на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде или 96% спирте. Насыщенность окраски свидетельствует об интенсивности метаболических процессов в клетках, т.е. о нормальном уровне жизнеспособности. Интенсивность окраски фиксируется с помощью спектрофотометра, и получаемые значения оптической плотности могут быть использованы для статистической обработки данных.
Установлено, что концентрация препарата при которой гибнет 50% клеток монослоя в условиях тестирования на клетках MDCK, составила 177 мкг/мл. Концентрация препарата, при которой выживают все клетки монослоя, составила 62,5 мкг/мл, которая и была использована для проверки антивирусной активности препарата.
В условиях данного тестирования жизнеспособность клеток в контроле составила 0,571±0,044. Таким образом, значение оптической плотности, при которой выживает 50% клеточного монослоя, составляет 0,286. Если отложить данное значение на оси ординат графика, представленного на рис.1, провести через него прямую, параллельную оси абсцисс, а затем из точки пересечения этой прямой с графиком жизнеспособности провести перпендикуляр на ось абсцисс, то мы получим значение, соответствующее концентрации заявляемого соединения, при котором гибнет 50% клеток монослоя (см. рис.2).
Оценка противовирусной активности
Заявляемое соединение по всем трем методам оценки (концентрация = 62,5 мкг/мл) обладало выраженной противовирусной активностью, снижая вирусные титры на 3 lg относительно контроля инфекционной активности вируса.
При построении графика, соответствующего действию заявляемого соединения, коэффициент детерминации r2 был равен 0,86, что говорит о том, что данная модель хорошо объясняет изменчивость тестируемых переменных, а именно эффект тестируемого соединения на клетки, инфицированные вирусом гриппа. При построении перпендикуляров через точки, соответствующие оптической плотности, при которой выживают 50% клеток монослоя, на оси ординат и через точку пересечения данного перпендикуляра с прямой, соответствующей жизнеспособности клеток в условиях применения препарата, имеем следующий график, представленный на рис.3.
Из рисунка 3 следует, что точка пересечения перпендикуляра с осью абсцисс соответствует значению lg вирусного разведения, равного -3,5. С учетом того, что вирус в отсутствии препарата инфицирует клеточный монослой до значения, равного
10-6,5 (инфекционная активность вируса, выясненная в отдельном тестировании при проверке биологических свойств вируса A/PR/8/34), можно говорить о том, что применение данного препарата в условиях in vitro снижает инфекционную активность вируса на 3lg.
Из данных, приведенных выше, видно, что соединение-прототип (1) более токсично, чем заявляемое соединение (для соединения (1) СС50=80 мкг/мл, а для заявляемого соединения CC50=177 мкг/мл). Соединение (1) практически не активно в отношении пандемического вируса гриппа A/H1N1v, штамм - А/Санкт-Петербург/2/09 (A/California/7/09-подобный). В то же время заявляемое соединение (2) в значительно меньших концентрациях, в сравнении с токсическими, обладает выраженной противовирусной активностью, снижая титры вирусов A/Puerto Rico/8/34 и вируса пандемического гриппа H1N1v А/Санкт-Петербург/2/09 (A/California/7/09-подобный) на 3,0 lg в концентрациях 62,5 и 125 мкг/мл соответственно, то есть является более активным противовирусным соединением по сравнению с соединением-прототипом.
Claims (1)
- 6-(2'-Амино-2'-карбоксиэтилтио)-2-метилтио-4-пивалоилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]1,2,4-триазин-7(4H)-он формулы (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011114747/04A RU2455304C1 (ru) | 2011-04-14 | 2011-04-14 | 6-(2'-АМИНО-2'-КАРБОКСИЭТИЛТИО)-2-МЕТИЛТИО-4-ПИВАЛОИЛОКСИМЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОН |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011114747/04A RU2455304C1 (ru) | 2011-04-14 | 2011-04-14 | 6-(2'-АМИНО-2'-КАРБОКСИЭТИЛТИО)-2-МЕТИЛТИО-4-ПИВАЛОИЛОКСИМЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОН |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2455304C1 true RU2455304C1 (ru) | 2012-07-10 |
Family
ID=46848530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011114747/04A RU2455304C1 (ru) | 2011-04-14 | 2011-04-14 | 6-(2'-АМИНО-2'-КАРБОКСИЭТИЛТИО)-2-МЕТИЛТИО-4-ПИВАЛОИЛОКСИМЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОН |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2455304C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2790376C1 (ru) * | 2021-12-28 | 2023-02-17 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина" | Диметил 7-метил-2-(пирролидин-1-ил)-4-фенилпирроло[2,1-ƒ][1,2,4]триазин-5,6-дикарбоксилат и диметил 7-метил-2-(4-R1-фенил)-4-(4-R2-фенил)пирроло[2,1-ƒ][1,2,4]триазин-5,6-дикарбоксилаты, обладающие противовирусной активностью |
-
2011
- 2011-04-14 RU RU2011114747/04A patent/RU2455304C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Rusinov V.L. et al. Russian Chemical Bulletin, 59(1), 136-143 (English) 2010. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2790376C1 (ru) * | 2021-12-28 | 2023-02-17 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина" | Диметил 7-метил-2-(пирролидин-1-ил)-4-фенилпирроло[2,1-ƒ][1,2,4]триазин-5,6-дикарбоксилат и диметил 7-метил-2-(4-R1-фенил)-4-(4-R2-фенил)пирроло[2,1-ƒ][1,2,4]триазин-5,6-дикарбоксилаты, обладающие противовирусной активностью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Heiser et al. | Identification of potential treatments for COVID-19 through artificial intelligence-enabled phenomic analysis of human cells infected with SARS-CoV-2 | |
| Yang et al. | Synergistic antiviral effect of curcumin functionalized graphene oxide against respiratory syncytial virus infection | |
| Dong et al. | The natural compound homoharringtonine presents broad antiviral activity in vitro and in vivo | |
| Stefanska et al. | Antimicrobial and anti-biofilm activity of thiourea derivatives incorporating a 2-aminothiazole scaffold | |
| CN107073120A (zh) | 抗流感病毒剂及抗流感病毒剂的筛选方法 | |
| Yadav et al. | 4-[1-(Substituted aryl/alkyl carbonyl)-benzoimidazol-2-yl]-benzenesulfonic acids: Synthesis, antimicrobial activity, QSAR studies, and antiviral evaluation | |
| Song et al. | Identifying the risk of SARS-CoV-2 infection and environmental monitoring in airborne infectious isolation rooms (AIIRs) | |
| Sirakanyan et al. | A new microtubule-stabilizing agent shows potent antiviral effects against African swine fever virus with no cytotoxicity | |
| Duguay et al. | Photodynamic inactivation of human coronaviruses | |
| Ibba et al. | Inhibition of enterovirus A71 by a novel 2-phenyl-benzimidazole derivative | |
| RU2404182C2 (ru) | НАТРИЕВАЯ СОЛЬ 2-ЭТИЛТИО-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]-1,2,4-ТРИАЗИН-7-ОНА ДИГИДРАТ | |
| Baloch et al. | Avian flavivirus enters BHK-21 cells by a low pH-dependent endosomal pathway | |
| Cagno et al. | Methylene blue has a potent antiviral activity against SARS-CoV-2 in the absence of UV-activation in vitro | |
| Yang et al. | Largemouth bass virus infection induced non-apoptotic cell death in MsF cells | |
| RU2455304C1 (ru) | 6-(2'-АМИНО-2'-КАРБОКСИЭТИЛТИО)-2-МЕТИЛТИО-4-ПИВАЛОИЛОКСИМЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОН | |
| WO2013122575A2 (en) | Small molecule having antiviral properties | |
| Justice et al. | Quantitative proteomic analysis of enriched nuclear fractions from BK polyomavirus-infected primary renal proximal tubule epithelial cells | |
| Li et al. | A physiologically based in silico tool to assess the risk of drug-related crystalluria | |
| Chao-Pellicer et al. | Cyanomethyl vinyl ethers against naegleria fowleri | |
| CN106038536A (zh) | 二氢欧山芹素在制药中的应用 | |
| Swaroop et al. | Discovery of immunomodulators from plant kingdom targeting IL-6 for the effective management therapy of SARS-CoV-2. | |
| Chianese et al. | Synthetic frog-derived-like peptides: a new weapon against emerging and potential zoonotic viruses | |
| RU2775551C2 (ru) | 3-Нитро-4-гидрокси-7-пропаргилтио-[1,2,4]триазоло[5,1c][1,2,4]триазин и 3-нитро-4-гидрокси-7-этилтио-[1,2,4]триазоло[5,1c][1,2,4]триазин, обладающие противовирусной активностью | |
| Briestenská et al. | Recombinant luciferase-expressing murine gammaherpesvirus 68 as a tool for rapid antiviral screening | |
| Gridina et al. | The effect of the structure of derivatives of nitrogen-containing heterocycles on their anti-influenza activity |