JP2015506672A - 抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体およびその使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＸ型分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２−Ｘ）に対する新規な抗体ならびに診断および治療方法でのその使用に関する。

分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）は、リン脂質のｓｎ−２位の脂肪酸アシル結合の加水分解を触媒して遊離脂肪酸およびリゾリン脂質を放出する構造的に関連する酵素のファミリーを形成している。この反応を触媒することにより、ｓＰＬＡ２酵素は、細胞膜の恒常性、脂質消化、宿主防衛、シグナル伝達ならびにエイコサノイドおよびリゾリン脂質誘導体などの脂質メディエーターの産生などの様々な生物学的プロセスで重要な役割を担っている（Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｂｉｏｃｈ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔ． ５９−７０； Ｌａｍｂｅａｕ， Ｇ．， ａｎｄ Ｇｅｌｂ， Ｍ． Ｈ． ２００８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７７， ４９５−５２０）。このファミリーは、ｓＰＬＡ２−ＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＡ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＣ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＤ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＥ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＦ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＩ、ｓＰＬＡ２−Ｖ、ｓＰＬＡ２−Ｘ、ｓＰＬＡ２−ＸＩＩＡおよびｓＰＬＡ２−ＸＩＩＢと称される１１種のメンバー／イソ型を含む。

酵素活性が類似し、かつイソ型特異的ｓＰＬＡ２抗体が存在しないことから、タンパク質レベルでの特異的イソ型の定量化は難しいことが分かっている。

Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎらは、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）で使用するためのｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を開発した。組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質でウサギを免疫して、このポリクローナル抗体を得た。ＴＲ−ＦＩＡの分析感度は２ｎｇ／ｍｌであると記載されていた。敗血症性ショック患者および健康な血液ドナーからの血清試料中のｓＰＬＡ２−Ｘレベルを分析し、著者らは、ｓＰＬＡ２−Ｘの血清濃度が両種の試料において試験の分析感度よりも低いことを見い出した。

Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社は、参照番号ｓｃ−３６５７３０でＨ−９モノクローナル抗体を提供している。本発明者らによって得られた実験結果によれば、Ｈ−９抗体は、約９×１０^−９ＭのヒトｓＰＬＡ２−Ｘへの結合に関するＫｄを有する（実施例を参照）。

血清試料などの生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘのより正確で高感度な検出を可能にするｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体が現在必要とされている。

本発明の目的の１つは、１０^−９Ｍ未満のヒトｓＰＬＡ２−Ｘへの結合に関するＫｄを有する、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体である。

一実施形態では、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する前記単離された抗体は、以下のＣＤＲ：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＴＮ（配列番号２）、
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹ（配列番号３）もしくはＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴ（配列番号４）、および
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＰＱＬＧＰ（配列番号５）もしくはＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹ（配列番号６）
のうちの少なくとも１つ、または配列番号１〜６と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含むか、
あるいは、以下のＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号７）もしくはＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡ（配列番号８）、
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＹＭＳＮＬＡＳ（配列番号９）もしくはＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１０）、および
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＭＱＳＬＥＹＰＬＴ（配列番号１１）もしくはＱＨＦＹＶＴＰＹＴ（配列番号１２）、
のうちの少なくとも１つ、または配列番号７〜１２と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する前記単離された抗体は、上に定義したＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域と、上に定義したＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域とを含む。

別の実施形態では、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する前記単離された抗体は、上に定義したＣＤＲを含む重鎖可変領域と、上に定義したＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む。

別の実施形態では、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する前記単離された抗体は、以下のＣＤＲ：ＧＦＴＦＳＮ（配列番号１）、ＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹ（配列番号３）およびＰＱＬＧＰ（配列番号５）または前記配列番号１、３、５と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む重鎖可変領域と、以下のＣＤＲ：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号７）、ＹＭＳＮＬＡＳ（配列番号９）およびＭＱＳＬＥＹＰＬＴ（配列番号１１）または前記配列番号７、９、１１と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む。

別の実施形態では、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する前記単離された抗体は、以下のＣＤＲ：ＧＹＴＦＴＮ（配列番号２）、ＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴ（配列番号４）およびＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹ（配列番号６）または前記配列番号２、４、６と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む重鎖可変領域と、以下のＣＤＲ：ＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡ（配列番号８）、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１０）およびＱＨＦＹＶＴＰＹＴ（配列番号１２）または前記配列番号８、１０、１２と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む。

別の実施形態では、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する前記単離された抗体は、配列番号１３もしくは配列番号１５である重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列および配列番号１４もしくは配列番号１６である軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列、または前記配列番号１３〜１６と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意の配列を含む。

本発明の別の目的は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０のうちの少なくとも１つ、または前記配列番号１７〜２０と少なくとも６０％の同一性を共有する核酸配列を有する任意の配列を含む発現ベクターである。

本発明の別の目的は、ＣＮＣＭ Ｉ−４５２３およびＣＮＣＭ Ｉ−４５２４として登録されているヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

本発明の別の目的は、本明細書の上に定義したヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を含む組成物である。

本発明の別の目的は、内因性ｓＰＬＡ２−Ｘの活性を阻害する、ｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患を治療するための本明細書の上に定義したヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体である。

本発明の別の目的は、生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘを検出するための本明細書の上に定義したヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体である。

本発明の別の目的は、本明細書の上に定義したヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を用いて生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘの存在を判定するための生体外での診断もしくは予後アッセイである。

一実施形態では、前記生体外での診断もしくは予後アッセイは、被覆抗体として８Ｄ９抗体を用い、かつ顕色抗体として９Ｃ１２抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡである。

本発明の別の目的は、本明細書の上に定義したヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する少なくとも１種の抗体を含むキットである。

一実施形態では、前記キットは、８Ｄ９抗体および９Ｃ１２抗体を含む

間接ＥＬＩＳＡにおけるｓＰＬＡ２−Ｘ抗体の希釈曲線 ビオチン化抗体と非ビオチン化抗体との親和性比較 ９Ｃ１２および８Ｄ９−ｂｉｏｔ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ試験 サンドイッチＥＬＩＳＡ試験から得られた典型的な較正曲線および３−ＳＤ評価 ｓＰＬＡ２−Ｘ酵素活性の阻害

本発明者らは、実施例に示すように、既存の抗体よりもｓＰＬＡ２−Ｘに対して良好な親和性を示し、かつ生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘをより正確かつ高感度に検出することができる、ｓＰＬＡ２−Ｘに対する新しい抗体を開発した。

また、本発明者らは、（ｉ）ポリクローナル抗体よりも特異的であり、かつ（ｉｉ）モノクローナル性に関係している結果の再現性により、前記抗体の工業的使用を可能にするという利点を示す、ｓＰＬＡ２−Ｘに対するモノクローナル抗体を提供する。

定義
ｓＰＬＡ２−Ｘは、ｓＰＬＡ２ファミリーのイソ型である。ヒトｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質の完全なアミノ酸配列（配列番号２１）（ジェンバンク受入番号ＮＰ００３５５２）は、
ＭＧＰＬＰＶＣＬＰＩＭＬＬＬＬＬＰＳＬＬＬＬＬＬＬＰＧＰＧＳＧ（シグナルペプチド）
ＥＡＳＲＩＬＲＶＨＲＲ（プロペプチド）
ＧＩＬＥＬＡＧＴＶＧＣＶＧＰＲＴＰＩＡＹＭＫＹＧＣＦＣＧＬＧＧＨＧＱＰＲＤＡＩＤＷＣＣＨＧＨＤＣＣＹＴＲＡＥＥＡＧＣＳＰＫＴＥＲＹＳＷＱＣＶＮＱＳＶＬＣＧＰＡＥＮＫＣＱＥＬＬＣＫＣＤＱＥＩＡＮＣＬＡＱＴＥＹＮＬＫＹＬＦＹＰＱＦＬＣＥＰＤＳＰＫＣＤ（成熟タンパク）
である。

本明細書で使用する「抗体」（Ａｂ）という用語は、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と同義で使用する。

「単離された抗体」は、その自然環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分は、抗体の診断もしくは治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性もしくは非タンパク性成分が挙げられる。好ましい実施形態では、上記抗体は、（１）ローリー法によって測定した場合に抗体が９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されているか、（２）スピニングカップシークエネーターを用いて、Ｎ末端基の少なくとも１５個の残基または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されているか、あるいは（３）還元もしくは非還元条件下でクマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性が示されるまで精製されている。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１種の成分が存在していないため、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。但し、単離された抗体は通常、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

基本的な４本鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とからなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常領域（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖と称される２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常領域（ＣＨ）のアミノ酸配列に基づいて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つのクラスすなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれアルファ（α）鎖、デルタ（δ）鎖、イプシロン（ε）鎖、ガンマ（γ）鎖およびミュー（μ）鎖と称される重鎖を有する。γ鎖およびα鎖のクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的僅かな差異に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を発現する。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に結合し、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合により互いに結合している。ＨおよびＬ鎖はそれぞれ、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖はＮ末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その後にα鎖およびγ鎖ではそれぞれ３つの定常領域（ＣＨ）を有し、μおよびεアイソタイプでは４つのＣＨ領域を有する。各Ｌ鎖はＮ末端に可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常領域（ＣＬ）をその他端に有する。ＶＬはＶＨと並んでおり、ＣＬは、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に界面を形成していると考えられている。ＶＨとＶＬの対合は一緒になって単一抗原結合部位を形成している。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドと共に５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、従って１０個の抗原結合部位を含むが、分泌型ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２〜５つの基本的な４鎖単位からなる多価の集まりを形成している。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般に約１５０，０００ダルトンである。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｔｅｓ， Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｌｏｗ （ｅｄｓ．）， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎ．， １９９４， ｐａｇｅ ７１， ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。

「可変」という用語は、Ｖ領域の特定の部分が抗体間で配列において広範囲に異なることを意味する。Ｖ領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定める。但し、可変性は、可変領域の１１０個のアミノ酸全長にわたって均等に分配されていない。その代わり、Ｖ領域は、それぞれが９〜１２個のアミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５〜３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的変化の少ない部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）からなる。天然の重鎖および軽鎖可変領域はそれぞれ、ループ結合を形成し、かつ場合によってはβシート構造の一部を形成している３つの超可変領域によって結合された、大部分がβシート構造の形をとる４つのＦＲを含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって他の鎖の超可変領域と非常に近接して一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）を参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。

「超可変領域」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、カバット番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に従って番号を付した場合、ＶＬでは、およそ２４〜３４位（Ｌ１）、５０〜５６位（Ｌ２）および８９〜９７位（Ｌ３）、ＶＨでは、およそ３１〜３５位（Ｈ１）、５０〜６５位（Ｈ２）および９５〜１０２位（Ｈ３）の残基）、および／または「超可変ループ」からのそれらの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７ （１９８７））に従って番号を付した場合、ＶＬでは２４〜３４位（Ｌ１）、５０〜５６位（Ｌ２）および８９〜９７位（Ｌ３）、ＶＨでは２６〜３２位（Ｈ１）、５２〜５６位（Ｈ２）および９５〜１０１位（Ｈ３）の残基）、および／または「超可変ループ」／ＣＤＲからのそれらの残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：２０９−２１２ （１９９９）， Ｒｕｉｚ， Ｍ． ｅ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２１９−２２１ （２０００））に従って番号を付した場合、ＶＬでは２７〜３８位（Ｌ１）、５６〜６５位（Ｌ２）および１０５〜１２０位（Ｌ３）、ＶＨでは２７〜３８位（Ｈ１）、５６〜６５位（Ｈ２）および１０５〜１２０位（Ｈ３）の残基）を含む。任意に、本抗体は、ＡＨｏ（Ｈｏｎｎｅｇｅｒ， Ａ． ａｎｄ Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ， Ａ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９：６５７−６７０ （２００１））に従って番号を付した場合、ＶＬでは２８位、３６位（Ｌ１）、６３位、７４〜７５位（Ｌ２）および１２３位（Ｌ３）、ＶＨでは２８位、３６位（Ｈ１）、６３位、７４〜７５位（Ｈ２）および１２３位（Ｈ３）のうちの１つ以上の位置に対称的な挿入を有していてもよい。

本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体群から得られた抗体を指し、すなわち、微量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いてその群に含まれる個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向づけられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して方向づけられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向づけられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成できるという点で有利である。「モノクローナルの」という修飾語は、任意の特定の方法によって抗体を産生する必要があるものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明で有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒらによって最初に記載されたハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５））によって調製してもよく、あるいは細菌細胞、真核性動物細胞または植物細胞における組換え型ＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を用いて調製してもよい。また、「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８ （１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７ （１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。

本明細書中のモノクローナル抗体としては、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する、すなわち特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、残りの鎖は別の種に由来する、すなわち別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体および所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体の断片が挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１−６８５５ （１９８４）を参照）。本発明は、ヒト抗体に由来する可変領域抗原結合配列を提供する。従って、本明細書における主たる目的のキメラ抗体としては、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有し、かつ非ヒト抗体に由来する１つ以上の配列、例えば、ＦＲもしくはＣ領域配列を含む抗体が挙げられる。また、本明細書における主たる目的のキメラ抗体としては、ある抗体クラスもしくはサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列と、別の抗体クラスもしくはサブクラスに由来する別の配列、例えば、ＦＲもしくはＣ領域配列とを含む抗体が挙げられる。本明細書における目的のキメラ抗体としては、本明細書に記載されている抗体に関連する、すなわち非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）などの異なる種に由来する可変領域抗原結合配列を含む抗体も挙げられる。キメラ抗体としては、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体およびヒト化抗体も挙げられる。さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に存在しない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するために行う。さらなる詳細については、Jｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５ （１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９ （１９８８）およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３−５９６ （１９９２）を参照されたい。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、二重特異性抗体、直鎖抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（米国特許第５，６４１，８７０号、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７−１０６２ ［１９９５］を参照）、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。抗体の「機能性断片もしくは類似体」という語句は、全長抗体と同じように定性的生物学的活性を有する化合物のことである。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能性断片もしくは類似体とは、高親和性受容体であるＦｃεＲＩに結合するというその分子の能力を阻害または実質的に低下させるように、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができる機能性断片もしくは類似体である。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片および残りの「Ｆｃ」断片（この名称は、容易に結晶化する能力を反映している）が生成される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）および１本の重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と共にＬ鎖全体で構成されている。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に対して一価であり、すなわち単一抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片におよそ対応し、かつさらに抗原に架橋結合することができる単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨ１領域のカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有することで、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は最初に、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

「ヒト化」または「ヒト」抗体とは、１種以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲに融合されている抗体を指す。そのような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計されている。そのような抗体は、抗原攻撃に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子操作」されている遺伝子導入マウスまたは他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３； Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６； Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９を参照されたく、その教示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。完全ヒト抗体は、遺伝子もしくは染色体形質移入法ならびにファージ提示法によって構築することもでき、それらは全て当該技術分野で知られている（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３を参照）。ヒト抗体は、生体外で活性化されたＢ細胞によって産生することもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたく、それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従って、「霊長類化」抗体とは、１種以上の霊長類の免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が非霊長類免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲに融合されている抗体を指す。

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるか変化したクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域あるいはキメラ抗体に新しい特性を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに結合されるように、定常領域またはその一部が変化、置換または交換されている抗体分子、または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるか変化した抗原特異性を有する可変領域により変化、置換または交換されている抗体分子である。

「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドにより一緒に保持されている両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、特定の種類の細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもあるＦｃ領域内の配列によって決まる。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識／結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、堅固な非共有結合性会合状態の１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域からなる二量体で構成されている。これらの２つの領域の折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、かつ抗体に抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖のそれぞれから３つのループ）が生じる。但し、単一の可変領域（すなわち抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を有する。

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」としても省略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結合されたＶＨおよびＶＬ抗体領域を含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨ領域とＶＬ領域との間に、抗原結合にとって望ましい構造をｓＦｖに形成させることができるポリペプチドリンカーをさらに含むことが好ましい。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５、以下を参照されたい。

「二重特異性抗体」という用語は、Ｖ領域の鎖間であるが鎖内でない対形成が達成され、それにより二価の断片すなわち２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨ領域とＶＬ領域との間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を有するｓＦｖ断片（上記パラグラフを参照）を構築して調製された小さい抗体断片を指す。二重特異性抗体は、２つの「交差」ｓＦｖ断片からなるヘテロ二量体であり、そこでは、２つの抗体のＶＨ領域とＶＬ領域が異なるポリペプチド鎖上に存在する。二重特異性抗体については、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）により完全に記載されている。

本明細書で使用するように、抗体は、好ましくは約１０^４Ｍ^−１以上、約１０^５Ｍ^−１以上、約１０^６Ｍ^−１以上、約１０^７Ｍ^−１以上、１０^８Ｍ^−１以上、１０^９Ｍ^−１以上または１０^１０Ｍ^−１以下の親和定数Ｋａにより、検出可能なレベルで抗原と反応した場合に、抗原に対して「免疫特異性である」「特異的である」または「特異的に結合する」と言う。また、抗体のその同種抗原に対する親和性は一般に解離定数Ｋｄとしても表され、特定の実施形態では、抗体は、１０^−４Ｍ以下、約１０^−５Ｍ以下、約１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、５．１０^−９Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下または５．１０^−１０Ｍ以下のＫｄで結合する場合に、抗原に特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄらによって記載されている技術（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５１：６６０ （１９４９））を用いて容易に決定することができる。抗体のその抗原、細胞または組織に対する結合特性は一般に、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光系アッセイなどの免疫検出法を用いて決定および評価することができる。

「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列から実質的に分離された核酸ならびに天然配列に当然に付随するリボソームおよびポリメラーゼなどのタンパク質または複合体である。この用語は、その天然に生じる環境から取り出された核酸配列を包含し、組換え型もしくはクローン化ＤＮＡ単離体および化学合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸としては、核酸の単離された形態が挙げられる。当然ながら、これは、最初に単離された核酸を指すが、人為的に単離された核酸に後で追加された遺伝子または配列を除外するものではない。

「ポリペプチド」という用語は、その従来の意味で、すなわちアミノ酸配列として使用する。ポリペプチドは、産物の特定の長さに限定されない。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれ、そのような用語は、特に具体的に指示しない限り、本明細書では同義で使用してもよい。また、この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの修飾ならびに当該技術分野で知られている他の修飾（天然に生じるものと天然に生じないもの両方）を意味せず、すなわちそれらを除外する。ポリペプチドは、タンパク質全体またはその部分配列であってもよい。本発明の文脈において目的となる特定のポリペプチドは、ＣＤＲを含み、かつ抗原に結合することができるアミノ酸部分配列である。「単離されたポリペプチド」は、同定および分離され、かつ／またはその自然環境の成分から回収されたものである。好ましい実施形態では、単離されたポリペプチドを、（１）ローリー法で測定した場合にポリペプチドが９５重量％を超え、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されているか、（２）スピニングカップシークエネーターを使用してＮ末端基または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで精製されているか、あるいは（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性が得られるまで精製されている。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの自然環境の少なくとも１種の成分が存在しないため、組換え細胞内の原位置のポリペプチドを含む。但し、単離されたポリペプチドは通常、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

「天然配列」ポリヌクレオチドは、自然由来のポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。「天然配列」ポリペプチドは、自然由来の（例えば、任意の種に由来する）ポリペプチド（例えば抗体）と同じアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドである。そのような天然配列ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、自然から単離したり、組換えもしくは合成手段によって産生したりすることができる。

本明細書で使用するポリヌクレオチド「変異体」という用語は、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で本明細書に具体的に開示されているポリヌクレオチドとは典型的に異なるポリヌクレオチドである。そのような変異体は、天然に生じたものであってもよく、あるいは、例えば、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド配列を修飾し、本明細書に記載されているようにコードされるポリペプチドの１つ以上の生物活性を評価し、かつ／または当該技術分野でよく知られている複数の技術のいずれかを用いて合成により産生したものであってもよい。本明細書で使用するポリペプチド「変異体」という用語は、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で本明細書に具体的に開示されているポリペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。そのような変異体は、天然に生じたものであってもよく、あるいは、例えば、本発明の１つ以上の上記ポリペプチド配列を修飾し、本明細書に記載されているようにポリペプチドの１つ以上の生物活性を評価し、かつ／または当該技術分野でよく知られている複数の技術のいずれかを用いて合成により産生したものであってもよい。修飾は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行ってもよく、望ましい特性を有するポリペプチド変異体もしくは誘導体をコードする機能性分子がなお得られる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて、本発明のポリペプチドの均等物またはさらに改良された変異体または一部を産生したい場合、当業者は典型的に、コード化ＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変化させる。例えば、他のポリペプチド（例えば抗原)または細胞に結合するその能力を大きく損失することなく、特定のアミノ酸とタンパク質構造中の他のアミノ酸とを置換してもよい。タンパク質の生物学的機能活性を定めるのはタンパク質の結合能力および性質であるため、特定のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列および当然ながらその基礎をなすＤＮＡコード配列において行うことができ、それにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が得られる。従って、本開示の組成物のペプチド配列または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物学的有用性もしくは活性を大きく損失することなく、様々な変化をなし得ることが想定される。多くの例では、ポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および親水性／疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化されないことを期待するように、あるアミノ酸と同様の特性を有する別のアミノ酸とを置き換える置換である。従って、上に概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどの相対的類似性に基づいている。上記特性の様々なものを考慮した例示的な置換は当業者によく知られており、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギンならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する荷電していない極性の頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミンならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。変異体は、さらにまたは代わりとして、非保存的変化を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチド変異体は、５つ以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、天然配列とは異なる。変異体は、さらに（または代わりとして）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および親水性／疎水性に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって修飾してもよい。

「同一性」または「同一の」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列間の関係において使用する場合、２つ以上のアミノ酸残基からなる配列間の一致数によって決定されるポリペプチド間の配列関連性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度を指す。「同一性」とは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（存在すれば）を有する２つ以上の配列のより短い配列間の完全な一致率の尺度である。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． ４８， １０７３ （１９８８）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記述されている。好ましいコンピュータプログラムによる２つの配列間の同一性の決定方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １２： ３８７ （１９８４）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３−４１０ （１９９０））などのＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ， メリーランド州ベセズダ, ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）から公的に入手可能である。また、周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。

本明細書で使用する「哺乳類」とは、ヒト、家畜、動物園の動物、スポーツ用動物またはペット用動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどのあらゆる哺乳類を指す。哺乳類はヒトであることが好ましい。

「治療する」または「治療」または「緩和」とは、治療的処置および予防的措置の両方を指し、ここでは、その目的は、標的とされる病理学的疾患もしくは障害を予防または遅らせる（和らげる）ことである。治療を必要とするものとしては、障害に既に罹患しているものならびに障害に罹患しやすいものまたは障害が予防されるべきものが挙げられる。対象すなわち哺乳類は、本発明の方法に係る治療量の抗体が投与された後に、その患者が、病原性細胞の数の減少、総病原性細胞の割合の減少および／または特定の疾患または病気に付随する１つ以上の症状のある程度の軽減、罹患率および死亡率の低下ならびに生活の質の問題の改善のうちの１つ以上の観察可能および／または測定可能な減少または不存在を示す場合に、感染に対して「治療」が成功となる。治療の成功をおよび疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通している日常的な手順によって容易に測定可能である。

「治療的有効量」という用語は、対象すなわち哺乳類における疾患または障害を「治療する」のに有効な抗体または薬物の量を指す。

本発明
本発明は、ｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体に関する。

抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体
本発明の目的の１つは、１０^−９Ｍ未満、好ましくは６×１０^−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０^−１０Ｍ未満、さらにより好ましくは４×１０^−１０ＭのヒトｓＰＬＡ２−Ｘへの結合に関するＫｄを有する、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体である。

試験Ａの条件でＫｄを測定する。すなわち、マイクロプレートウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に入れた５０ｎｇの組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘで、室温で一晩被覆する。次いで、試料ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄する。最後の洗浄後に、試料ウェルを、ＰＢＳ緩衝液中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液で、室温で６０分間処理する。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ヒトＰＬＡ２−Ｘに対して方向づけられる漸増量（０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）のｍＡｂを、抗原で被覆したウェルに添加し、室温で１２０分間インキュベートする。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製ａｂ７０６８）で室温で６０分間処理して、ｍＡｂの結合を検出する。ＴＭＢを添加し、ＨＣｌを添加して反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定する。データを単一部位飽和モデルに当てはめ、相対的Ｋｄ値をモデルから推定する。

本発明の目的の１つは、重鎖可変領域が以下のＣＤＲ：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮ（配列番号１）またはＧＹＴＦＴＮ（配列番号２）、
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹ（配列番号３）またはＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴ（配列番号４）、および
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＰＱＬＧＰ（配列番号５）またはＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹ（配列番号６）、
のうちの少なくとも１つを含む、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体である。

ＣＤＲの番号付けおよび定義は、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従っている。

本発明の別の目的は、軽鎖可変領域が以下のＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号７）またはＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡ（配列番号８）、
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＹＭＳＮＬＡＳ（配列番号９）またはＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１０）、および
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＭＱＳＬＥＹＰＬＴ（配列番号１１）またはＱＨＦＹＶＴＰＹＴ（配列番号１２）、
のうちの少なくとも１つを含む、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体である。

本発明の一実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、その重鎖に、ＧＦＴＦＳＮ（配列番号１）またはＧＹＴＦＴＮ（配列番号２）の中の１つのＶＨ−ＣＤＲ１と、ＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹ（配列番号３）またはＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴ（配列番号４）の中の１つのＶＨ−ＣＤＲ２と、ＰＱＬＧＰ（配列番号５）またはＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹ（配列番号６）の中の１つのＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。

本発明の別の実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、その軽鎖に、ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号７）またはＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡ（配列番号８）の中の１つのＶＬ−ＣＤＲ１と、ＹＭＳＮＬＡＳ（配列番号９）またはＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１０）の中の１つのＶＬ−ＣＤＲ２と、ＭＱＳＬＥＹＰＬＴ（配列番号１１）またはＱＨＦＹＶＴＰＹＴ（配列番号１２）の中の１つのＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。

本発明の別の実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、その重鎖に、配列番号１、配列番号３および配列番号５の３つのＣＤＲを含む。

本発明の別の実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、その重鎖に、配列番号２、配列番号４および配列番号６の３つのＣＤＲを含む。

本発明の別の実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、その軽鎖に、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の３つのＣＤＲを含む。

本発明の別の実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、その軽鎖に、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２の３つのＣＤＲを含む。

本発明によれば、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のうちのいずれかを、対応する配列番号に列挙されている特定のＣＤＲまたはＣＤＲの組み合わせと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴付けてもよい。

本発明の別の実施形態では、本抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、
− （ｉ）配列番号１、３および５に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号７、９および１１にそれぞれ示されている軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列とを有する抗体と、
− （ｉ）配列番号２、４および６に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号８、１０および１２にそれぞれ示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列とを有する抗体と、
からなる群から選択され、
ここでは任意に、前記配列のいずれかの中の１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換されていてもよい。

本発明の別の実施形態では、本抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体（８Ｄ９抗体）は、配列番号１３の重鎖可変領域と、配列番号１４の軽鎖可変領域とを含む。
（配列番号１３）：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＰＭＳＷＶＲＱＴＰＡＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＣＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＰＱＬＧＰＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（配列番号１４）：
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＰＶＴＰＧＤＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＲＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＳＬＥＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ

本発明の別の実施形態では、本抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体（９Ｃ１２抗体）は、配列番号１５の重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域とを含む。
（配列番号１５）：
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴＹＡＥＥＦＫＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（配列番号１６）：
ＤＩＱＭＳＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＭＴＣＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＡＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＦＹＶＴＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ

本発明によれば、重鎖もしくは軽鎖可変領域の１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換されていてもよい。

本発明によれば、重鎖可変領域は、配列番号１３または配列番号１５と６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を包含する。

本発明によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１４または１６と６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を包含する。

本発明の抗体のいずれか、例えば８Ｄ９および９Ｃ１２では、指定された可変領域およびＣＤＲ配列は、保存的配列修飾を含んでいてもよい。保存的配列修飾とは、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えたり変化させたりしないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当該技術分野で知られている標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は典型的に、アミノ酸残基が同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。指定された可変領域およびＣＤＲ配列は、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含んでいてもよい。置換がなされている場合、好ましい置換は保存的修飾である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性の側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐鎖側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変化した抗体を、本明細書に記載されているアッセイを用いて、保持されている機能（すなわち本明細書に記載されている特性）について試験することができる。

一実施形態では、本発明は、８Ｄ９もしくは９Ｃ１２抗体と本質的に同じエピトープに結合する抗体も提供する。

本発明の別の目的は、配列番号１３の重鎖可変領域をコードする単離された核酸配列である。好ましくは、前記核酸配列は、配列番号１７（ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＧＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＧＴ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＣＡ）である。

本発明の別の目的は、配列番号１４の軽鎖可変領域をコードする単離された核酸配列である。好ましくは、前記核酸配列は、配列番号１８（ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＴＡ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＴＣＴ ＡＧＴ ＡＡＧ ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＡＴ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＴＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＡＴＣ ＡＧＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＴＧ ＣＡＡ ＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＧＧ）である。

本発明の別の目的は、配列番号１５の重鎖可変領域をコードする単離された核酸配列である。好ましくは、前記核酸配列は、配列番号１９（ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ＡＡＣ ＴＡＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＧＧＴ ＴＴＡ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＧＧ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＴＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＡ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＣＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＣＡ）である。

本発明の別の目的は、配列番号１６の軽鎖可変領域をコードする単離された核酸配列である。好ましくは、前記核酸配列は、配列番号２０（ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＴＴ ＴＡＣ ＡＧＴ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＣＡＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＴＡ ＡＡＡ ＣＧＧ）である。

本発明の別の目的は、本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。

本発明の別の目的は、前記ベクターを含む単離された宿主細胞である。前記宿主細胞を、本発明の抗体の組換え産生のために使用してもよい。

本発明の別の目的は、本発明の前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

本発明に係る好ましいハイブリドーマ細胞株を、パスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５０１４パリ）に寄託した。

本発明の一実施形態では、本抗体は、モノクローナル抗体である。

本発明の抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２様抗体の断片および誘導体（特に明記しない限りあるいは文脈に明らかに矛盾しない限り、本出願で使用されている「抗体」という用語に包含される）は、当該技術分野で知られている技術によって産生することができる。「断片」は、インタクトな抗体の一部、一般に抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、二重特異性抗体、隣接するアミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「単鎖抗体断片」または「単鎖ポリペプチド」という）、例えば、限定されるものではないが、（１）単鎖Ｆｖ分子、（２）１つの軽鎖可変領域のみを含む単鎖ポリペプチドまたは関連する重鎖部分を含まない軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むその断片、（３）１つの重鎖可変領域のみを含む単鎖ポリペプチドまたは関連する軽鎖部分を含まない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むその断片、ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。本抗体の断片は、標準的な方法を用いて得ることができる。例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技術に従って、単離された抗体のプロテアーゼ消化により産生してもよい。当然のことながら、例えば、生体内クリアランスを遅延させ、かつより望ましい薬物動態学的プロファイルを得るための公知の方法を用いて、免疫反応性断片を修飾することができ、上記断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾してもよい。ＰＥＧをＦａｂ’断片にカップリングし、かつ部位特異的にコンジュゲートさせる方法は、例えば、Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ， １６ （３）： １０６−１１９ （２００１）およびＤｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３ （２）： １７５−１８２ （１９９６）に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

あるいは、本発明の抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを、本発明の断片をコードするように修飾してもよい。次いで、修飾したＤＮＡを発現ベクターに挿入し、適当な細胞を形質転換するか形質移入されるように使用し、次いで、所望の断片を発現させる。

特定の実施形態では、本発明の抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、例えば、相同な非ヒト配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を置換することにより（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ｐｐ． ６８５１ （１９８４））、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、発現ベクターに挿入する前に修飾することができる。そのようにして、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」もしくは「ハイブリッド」抗体を調製する。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドと本発明の抗体の定常領域とを置換する。

従って、別の実施形態によれば、本発明の抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２様抗体をヒト化する。本発明に係る抗体の「ヒト化」型は、マウスの免疫グロブリンに由来する最小配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換されているが元の抗体の所望の特異性、親和性および能力を維持しているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置換されていてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列内に存在しない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善および最適化するために行う。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが元の抗体のそれらに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むと最適である。さらなる詳細は、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１， ｐｐ． ５２２ （１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２， ｐｐ． ３２３ （１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２， ｐｐ． ５９３ （１９９２）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９， ｐｐ． １５３４および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたく、それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の抗体のヒト化方法は当該技術分野でよく知られている。

ヒト化抗体を調製する際に使用されるヒト可変領域（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「最適な」方法に従って、本発明の抗体の可変領域の配列を、公知のヒト可変領域配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、マウスの配列に最も近いヒトの配列をヒト化抗体のヒトのフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１， ｐｐ． ２２９６ （１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． １９６， ｐｐ． ９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８９， ｐｐ． ４２８５ （１９９２）； Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５１ （１９９３））。ｓＰＬＡ２−Ｘに対する高い親和性と他の好ましい生物学的特性とを保持しながら抗体をヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従い、親の配列およびヒト化配列の３次元モデルを用いる親の配列および様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって、ヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性の高い３次元構造を図示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能性のある役割の分析すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、ＦＲ残基をコンセンサスから選択して組み合わせ、標的抗原に対する親和性の増加などの所望の抗体特性が達成されるように配列を移入することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関与する。「ヒト化」モノクローナル抗体の別の調製方法は、ゼノマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ社、カリフォルニア州フリーモント）を、免疫化のために使用されるマウスとして使用することである。ゼノマウスは、その免疫グロブリン遺伝子が機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置換されている本発明に係るマウス宿主である。従って、このマウスによって、あるいはこのマウスのＢ細胞から調製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体は、既にヒト化されている。ゼノマウスについては、米国特許第６，１６２，９６３号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

また、ヒト抗体は、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように遺伝子操作されている他のトランスジェニック動物を用いる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２ （１９９３） ２５５）か、あるいはファージ提示法を用いて抗体レパートリーを選択するなどの様々な他の技術に従って産生してもよい。そのような技術は当業者に知られており、本出願に開示されているモノクローナル抗体から開始して実施することができる。

また、本発明の抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２様抗体を、重鎖／軽鎖の一部が元の抗体内の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残部は、別の種に由来するか別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）ならびに所望の生物学的活性および結合特異性を示す限りそのような抗体の断片に誘導体化してもよい（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、上記、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， ｐｐ． ６８５１ （１９８４））。

組成物および治療における使用
本発明の目的の１つは、少なくとも１種の本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２抗体を含む組成物である。

本発明の別の目的は、少なくとも１種の本明細書の上に記載した本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体、好ましくは８Ｄ９もしくは９Ｃ１２抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。

本発明の別の目的は、ｓＰＬＡ２−Ｘ活性を阻害するか阻害に使用するため、またはｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患を治療するか治療に使用するための本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体である。

本発明の別の目的は、有効量の本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体をそれを必要としている対象に投与することを含む、対象におけるｓＰＬＡ２−Ｘ活性の阻害方法である。

本発明の別の目的は、有効量の本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体をそれを必要としている対象に投与することを含む、対象におけるｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患の治療方法である。

これらの組成物に使用し得る薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒトの血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。

対象への投与に使用するために、本組成物を対象への投与のために製剤化する。本発明の組成物を、経口投与、非経口投与、吸入スプレー投与、局所投与、直腸内投与、経鼻投与、口腔内投与または膣内投与しても、埋込型容器を介して投与してもよい。本明細書で使用されるものとしては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射もしくは注入技術が挙げられる。

本発明の組成物の無菌注射剤は、水性もしくは油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用する当該技術分野で知られている技術に従って製剤化してもよい。無菌注射剤は、非経口的に許容される非毒性希釈剤もしくは溶媒に入れた無菌注射溶液もしくは懸濁液であってもよい。用いることができる許容可能な媒体および溶媒としては、水、リンガー液および等張の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。また、無菌固定油は、従来通りに溶媒または懸濁媒として用いられる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドなどのあらゆる無刺激性固定油を用いてもよい。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射剤の調製に有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えば、特にそれらのポリオキシエチル化された形態のオリーブ油またはヒマシ油も有用である。また、これらの油溶液もしくは懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、または乳濁液および懸濁液などの薬学的に許容される剤形の製剤に通常使用される同様の分散剤を含有していてもよい。また、製剤のために、Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび他の乳化剤などの他の一般に使用される界面活性剤または薬学的に許容される固体、液体もしくは他の剤形の製造に一般に使用される生物学的利用能増強剤を使用してもよい。

本発明の組成物は、限定されるものではないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液などの任意の経口的に許容される剤形で経口投与してもよい。経口用錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセルの形態での経口投与に有用な希釈剤としては、例えば、ラクトースが挙げられる。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる場合、有効成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせてもよい。また、所望であれば、特定の甘味料、着香料または着色料を添加してもよい。

本発明の医薬組成物中の抗体の投与のためのスケジュールおよび投与量は、これらの製品のための公知の方法に従い、例えば、製造業者の説明書を用いて決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ)または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てのバイアルに入れて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。本製品を、静脈内（ＩＶ）投与のために、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０および無菌注射用水に入れて製剤化する。ｐＨは６．５に調整する。当然のことながら、これらのスケジュールは例示であり、最適なスケジュールおよび投与計画は、臨床試験で判断しなければならない特定の抗体の医薬組成物中での親和性および忍容性を考慮して調整することができる。

本発明の方法を使用することができる疾患または病気としては、ｓＰＬＡ２−Ｘの阻害が有益となり得る全ての疾患が挙げられる。

前記ｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患の例としては、炎症性疾患、癌、敗血症、深刻な創傷部を伴う大規模な外科手術もしくは他の損傷、糖尿病性機能障害、急性肝不全、膵炎、神経変性疾患、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、骨関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーブス病、尋常性乾癬、拡張型心筋症、糖尿病、ベヒテレフ病、炎症性胆汁疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、再生不良性貧血、特発性拡張型心筋症（ＩＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、グッドパスチャー病、動脈および静脈の慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、前記ｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患は、心血管疾患および／または心血管系イベントである。前記心血管疾患および／または心血管系イベントの例としては、虚血性イベント、虚血、心臓発作、メタボリックシンドローム、Ｘ症候群、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠動脈疾患、安定および不安定狭心症、脳卒中、大動脈およびその分岐部の疾患（大動脈弁狭窄症、血栓症または大動脈瘤など）、末梢動脈疾患、末梢血管障害、脳血管障害、およびあらゆる急性の虚血性心血管系イベントが挙げられるが、これらに限定されない。

組成物および診断および予後における使用
本発明の別の目的は、生体外または生体内において、試料中、好ましくは生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘを検出するための少なくとも１種の本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体の使用である。

本発明の抗体を使用することができるアッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、免疫組織化学、ウエスタンブロットおよび免疫沈降が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の別の目的は、試料を本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体と接触させて、試料中のｓＰＬＡ２−Ｘの存在を示すｓＰＬＡ２−Ｘに結合した抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体を検出することを含む、試料中のｓＰＬＡ２−Ｘの検出方法である。

本発明の一実施形態では、当該試料は生体試料である。生体試料の例としては、体液、好ましくは血液、より好ましくは、血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢液および肺胞マクロファージ、組織溶解物および罹患組織から調製した抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態では、「試料」という用語は、任意の分析前に個体から採取した試料を意味するものとする。

本発明の一実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は、検出可能な標識で直接標識されており、直接検出することができる。別の実施形態では、抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体は標識されておらず（第１の抗体／一次抗体と呼ぶ）、二次抗体すなわち抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体に結合することができる他の分子が標識されている。当該技術分野でよく知られているように、二次抗体は、一次抗体の特異的な種およびクラスに特異的に結合することができるように選択する。

試料中の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ／ｓＰＬＡ２−Ｘ複合体の存在は、標識されている二次抗体の存在を検出することにより検出および測定することができる。例えば、結合していない二次抗体を、一次抗体／抗原複合体を含むウェルまたは複合体を含む膜（ニトロセルロース膜またはナイロン膜など）から洗い流した後に、結合した二次抗体を可視化し、例えば標識の化学発光に基づいて検出することができる。

抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体または二次抗体のための標識の例としては、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性物質および放射性物質が挙げられるが、これらに限定されない。そのような酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されず、補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシン（ｄａｎｓｙｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）またはフィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。発光物質の例としてはルミナールが挙げられるが、これに限定されない。磁性物質の例としてはガドリニウムが挙げられるが、これに限定されない。好適な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが挙げられるが、これに限定されない。

本発明の別の目的は、対象試料中のｓＰＬＡ２−Ｘのレベルを検出することによる生体外診断アッセイのための本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体の使用である。そのようなアッセイは、ｓＰＬＡ２−Ｘの過剰発現を伴う疾患の診断に有用であり得る。

本発明の別の目的は、対象がｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患を発症するリスクを生体外で判定するための、本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体の使用である

一実施形態では、前記疾患は炎症性疾患である。

ｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患の例としては、炎症性疾患、癌、敗血症、深刻な創傷部を伴う大規模な外科手術または他の損傷、糖尿病性機能障害、急性肝不全、膵炎、神経変性疾患、自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥ、骨関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーブス病、尋常性乾癬、拡張型心筋症、糖尿病、ベヒテレフ病、炎症性胆汁疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、再生不良性貧血、特発性拡張型心筋症（ＩＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、グッドパスチャー病、動脈および静脈の慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、前記ｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患は、心血管疾患および／または心血管系イベントである。心血管疾患および／または心血管系イベントの例としては、虚血性イベント、虚血、心臓発作、メタボリックシンドローム、Ｘ症候群、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠動脈疾患、安定および不安定狭心症、脳卒中、大動脈およびその分岐部の疾患（大動脈弁狭窄症、血栓症または大動脈瘤など）、末梢動脈疾患、末梢血管障害、脳血管障害、およびあらゆる急性の虚血性心血管系イベントが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の別の目的は、対象がｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患、好ましくは心血管疾患および／または心血管系イベントを発症するリスクを生体外で判定するための本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体の使用である。心血管疾患および／または心血管系イベントの例としては、虚血性イベント、虚血、心臓発作、メタボリックシンドローム、Ｘ症候群、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠動脈疾患、安定および不安定狭心症、脳卒中、大動脈およびその分岐部の疾患（大動脈弁狭窄症、血栓症または大動脈瘤など）、末梢動脈疾患、末梢血管障害、脳血管障害、およびあらゆる急性の虚血性心血管系イベントが挙げられるが、これらに限定されない。

対象試料中に存在するｓＰＬＡ２−Ｘの濃度または量は、存在するｓＰＬＡ２−Ｘの量を特異的に測定する方法を用いて測定することができる。そのような方法としては、例えば、本発明の抗体を従来通りにポリマーマトリックスなどの不溶性マトリックスに固定化することができるＥＬＩＳＡ法が挙げられる。あるいは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を本明細書の上に記載したように使用することができる。また、免疫組織化学的染色アッセイを使用してもよい。

進行または治療の各段階に対して統計的に有意な結果が得られる試料群を用いて、疾患の各段階の特性とみなすことができるｓＰＬＡ２−Ｘの濃度範囲を指定することができる。

一実施形態では、血液もしくは血清試料を対象から採取し、試料中に存在するｓＰＬＡ２−Ｘの濃度を測定して、調査中の対象における疾患の段階を評価するか、治療過程における対象の応答を特徴づける。そのようにして得られた濃度を使用して、値がどの濃度範囲に該当するかを確認する。そのようにして確認した範囲は、診断される対象の様々な集団における疾患の進行段階または治療段階と相関しているため、調査中の対象における段階が得られる。

本発明の目的の１つは、対象から得られた試料中の結合したｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質のレベルを閾値レベルと比較して、対象がｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患を有しているかを判定するために使用することができるサンドイッチＥＬＩＳＡ法である。

本明細書で使用する「閾値レベル」とは、それを超える対象試料を「陽性」であるとみなし、それを下回る試料を疾患に対して「陰性」であると分類するｓＰＬＡ２−Ｘの発現レベルを指す。特定のバイオマーカー（例えば、ｓＰＬＡ２−Ｘ）についての閾値発現レベルは、健康な対象の試料（すなわち、健康な対象群）からのデータの編集によるものであってもよい。例えば、閾値発現レベルは、健康な対象からの試料の分析に基づいて、平均的なｓＰＬＡ２−Ｘ発現レベル＋標準偏差の２倍として確立してもよい。当業者であれば、発現の閾値レベルを確立するための様々な統計学的および数学的方法が当該技術分野で知られていることを分かっているであろう。

当業者であれば、捕獲および顕色抗体を上記のように試料と連続的または同時に接触させることができることをさらに分かっているであろう。さらに、試料を固定化捕獲抗体と接触させる前に、最初に顕色抗体を試料と共にインキュベートすることができる。本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体を本明細書に開示されているサンドイッチＥＬＩＳＡ法で使用する場合、８Ｄ９もしくは９Ｃ１２抗体のいずれか一方を捕獲抗体または顕色抗体として使用してもよい。特定の一実施形態では、捕獲抗体は８Ｄ９モノクローナル抗体であり、顕色抗体は９Ｃ１２抗体、より詳細にはＨＲＰで標識されている９Ｃ１２抗体である。本発明の抗体を、限定されるものではないがマルチプレックスビーズ系アッセイなどのｓＰＬＡ２−Ｘを検出するための任意のアッセイ形式で使用してもよい。

同じバイオマーカー（すなわち、ｓＰＬＡ２−Ｘ）に対して２種類の抗体を使用する上記サンドイッチＥＬＩＳＡ形式に関しては、捕獲抗体と顕色抗体は、異なる抗原部位を有していなければならない。「異なる抗原部位」とは、一方の抗体の結合が、他方の抗体のバイオマーカータンパク質への結合を著しく妨げないように抗体が目的のバイオマーカータンパク質（すなわち、ｓＰＬＡ２−Ｘ）上の異なる部位に特異的であることを意図している。相補的でない抗体は、上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法での使用には適していない。

本発明の別の目的は、少なくとも１種の本発明の抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体を含むキットである。

「キット」とは、ｓＰＬＡ２−Ｘの発現を特異的に検出するための少なくとも１種の試薬すなわち抗体を含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）を意図している。本キットは、本発明の方法を行うための単位として宣伝、流通または販売してもよい。さらに、本キットの試薬のいずれかまたは全てを密封容器などのそれらを外部環境から保護する容器に入れて提供してもよい。また、本キットは、本キットおよびその使用方法について記載した添付文書を含んでいてもよい。

本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行うためのキットは一般に、固体担体（例えば、マイクロタイタープレート）上に任意に固定化された捕獲抗体と、例えば、ＨＲＰ、蛍光標識、放射性同位体、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの検出可能な物質に結合させた顕色抗体とを含む。

特定の実施形態では、捕獲抗体および顕色抗体は、抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体、特に８Ｄ９および９Ｃ１２と称される抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための本発明の１つのキットでは、捕獲抗体は、マイクロタイタープレートに固定化された抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体である８Ｄ９であり、顕色抗体はＨＲＰで標識された９Ｃ１２である。固体担体に結合させた顕色抗体のレベル（試料中のｓＰＬＡ２−Ｘのレベルと直接相関する）を検出および定量するための化学薬品が本キットに任意に含まれていてもよい。また、精製したｓＰＬＡ２−Ｘを抗原標準として提供してもよい。

別の実施形態では、ｓＰＬＡ２−Ｘを発現している組織および臓器を突き止めるために、本発明の抗体を生体内で使用してもよい。

上記方法は、検出可能に標識された抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体またはその医薬組成物をそのような診断試験を必要としている患者に投与する工程と、患者を画像解析にかけてｓＰＬＡ２−Ｘを発現している組織に結合した抗体または断片の位置を判定する工程とを含む。画像解析は医療技術分野ではよく知られており、Ｘ線分析、磁気共鳴画像（ＭＲＩ)またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記方法の別の実施形態では、患者を画像解析にかけずに患者から生検を得て、目的の組織がｓＰＬＡ２−Ｘを発現しているか否かを判定する。上述したように、本発明の一実施形態では、本抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体を、患者の体内で造影することができる検出可能な薬剤で標識する。例えば、本抗体をＸ線分析で使用することができるバリウムなどの造影剤、またはＭＲＩまたはＣＴで使用することができるガドリニウムキレートなどの磁気造影剤で標識してもよい。他の標識薬剤としては、（９９）Ｔｃなどの放射性同位体または本明細書中に記載されている他の標識が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法を使用して、例えば、ｓＰＬＡ２−Ｘ媒介性疾患を診断するか、そのような疾患に対する治療の進行を追跡してもよい。

以下の実施例により、本発明をさらに例示する。

実施例１：ヒト組換え型ｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質の産生
以下に記載する修飾と共に、公開されている手順（Ｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９６， １３０３ ：９２−１０２、Ｂｅｚｚｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００， ２７５ ： ３１７９−３１９１、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２， ２７７ ： ４８５３５−４８５４９）を用いて、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘを産生した。

１．ヒトｓＰＬＡ２−Ｘ−ｃＤＮＡのｐＥＴ２１ａベクターへのサブクローニング
成熟酵素をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ２１ａ発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中に存在するＮｄｅＩ部位によってコードされる開始Ｍｅｔコドンにインフレームでクローニングした。従って、このベクターにより、非融合タンパク質として、すなわち、さらなるアミノ酸を全く用いずに、ヒトｓＰＬＡ２を産生することができる。この戦略により、再折り畳み工程の収率が高められると共に、全収率を通常低下させる因子Ｘ_ａまたはトリプシンのようなプロテアーゼによる切断工程が回避され得る。

２．大腸菌ＢＬ２１ ＲｏｓｅｔｔａまたはＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）の転換およびタンパク質発現
ｐＥＴ２１ａ構築物を化学的にコンピテントな大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬＹＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社)またはＢＬ２１ ＤＥ３ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に転換し、かつＬ培地／寒天／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むプレート上のコロニーを選択した後に、タンパク質の発現を行った。単一のアンピシリン耐性コロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ／Ａ）培地中で増殖させ、３７℃で約４時間撹拌しながらインキュベートした。次いで、前培養物を２リットルのＴＢ／Ａになるまで希釈し、約１．０のＯＤ_{６００ｎｍ}になるまでさらに増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を添加して、タンパク質発現を３７℃で一晩誘発させた。翌日、細菌をペレット化し、溶解し、封入体を精製した。

３．封入体の調製
表１に記載するように、界面活性剤を含めた溶解緩衝液と界面活性剤を含めない溶解緩衝液を調製した。

ＩＰＴＧで誘導した細菌からなる一晩培養物（２リットル）を回収し、４℃および５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次いで、細菌ペレットを、界面活性剤を含む１００ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。５ｍｇのリゾチーム、１．５ｍｇのＤＮＡｓｅ Ｉおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ_２を添加して溶菌を行い、広範囲な超音波処理後に、水浴中で穏やかに撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。場合によっては、界面活性剤を含まない溶解緩衝液（リゾチーム、ＤＮＡｓｅ ＩおよびＭｇＣｌ_２を含有する）に再懸濁し、かつフレンチプレス装置で均質化した（１，２００ｐｓｉ、２回の通過）後に、細菌の溶解を行った。溶菌後、この溶液を４℃および１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、タンパク質ペレットを、界面活性剤を含む溶解緩衝液中で１回、界面活性剤を含まない溶解緩衝液中で少なくとも２回、広範囲に洗浄した。各洗浄のために、ペレットを加圧型細胞破砕装置を用いて溶解緩衝液に再懸濁し、次いで、４℃および１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。最後の遠心分離後に、上澄みを捨て、精製したｓＰＬＡ２タンパク質封入体を含むペレットを−２０℃で保存した。これらのペレットを、カオトロピック緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、８Ｍの尿素または７Ｍのグアニジン、１０ｍＭのＤＴＴ）中で可溶化および還元した後に、期待される成熟ｓＰＬＡ２タンパク質の存在および純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。この工程において、全収率は通常、１リットルの細胞培養液中に折り畳まれていないｓＰＬＡ２タンパク質が約５０〜１００ｍｇである。

４．封入体の還元およびスルホン化
ｓＰＬＡ２−Ｘ（最大１００ｍｇ）を含む封入体ペレットを、７Ｍのグアニジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．３Ｍの亜硫酸ナトリウムを含む緩衝液４０ｍｌに可溶化した。１時間後、１０〜２０ｍｌのＮＴＳＢ試薬（ｓＰＬＡ２中のＮＴＳＢ／システイン比＞５）を添加し、タンパク質の溶解性に応じて２５℃で最長一晩インキュベートした（場合によっては、グアニジンの代わりに尿素を使用した）。溶液の色が僅かに黄色に変わったときに（この溶液は最初に赤みがかった橙黄色である）、反応は終了している。可溶化および還元後に、このタンパク質溶液を遠心分離して不溶性の凝集物を除去し、２時間ごとの緩衝液の交換を３回行いながら、上澄みを０．１％の酢酸４Ｌに対して透析した（８ｋＤａの分画分子量を有する管状膜）。スルホン化および沈殿したｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質（白色の粉末）を回収し、遠心分離して乾燥したペレットを得、これを再折り畳み前に−２０℃で保存した。

５．再折り畳み手順
スルホン化したｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質（５０〜１００ｍｇのタンパク質）を、室温で２時間または４℃で一晩撹拌して、７Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に１０ｍｇ／ｍｌになるまで溶解した（この緩衝液および全てのその後に使用する緩衝液ならびにＨＰＬＣ溶媒は、１ｍＭのＬ−メチオニンも含有していた）。この試料を、４℃および１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、未溶解のタンパク質を除去した。タンパク質溶液（５〜１０ｍｌ）を、１〜２リットルの室温の再折り畳み緩衝液（０．９Ｍのグアニジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．８ＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＬ−システイン、５ｍＭのＳＢ１２、５ｍＭのＬ−メチオニン、１０ｍＭのＣａＣｌ_２）に滴下した（急速希釈法、連続的に撹拌しながら再折り畳み緩衝液に約１滴／秒）。再折り畳みを４℃で２〜３日間行った。この時点で、ｓＰＬＡ２活性アッセイを実行して、再折り畳みが成功したかを確認した。このタンパク質溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ベッドカラムおよび低タンパク質吸収０．４５μｍフィルターシリンジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で連続的に濾過し、次いで、ＹＭ−１０膜を有するＡｍｉｃｏｎ社製撹拌式セルを用いて最終体積が２０〜３０ｍｌになるまで室温で濃縮した。濃縮したタンパク質溶液を、２０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に対して４℃で透析した（３サイクル、各サイクルで４０体積の緩衝液を使用）。透析した溶液を濾過し、ＯＤ_{２８０ｎｍ}によりタンパク質量について定量し、溶媒Ａ中に２０％の溶媒Ｂ（溶媒Ａ：Ｈ_２Ｏ／０．１％のＴＦＡ／１ｍＭのＬ−メチオニン、溶媒Ｂ：ＡＣＮ／０．１％のＴＦＡ／１ｍＭのＬ−メチオニン）で事前に平衡化したＣ１８半分取逆相ＨＰＬＣカラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、１００オングストローム、Ｃ_２エンドキャッピング、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）に数回に分けて充填した。注入後、７５分で２０％のＢから４５％のＢ、次いで２０分で９５％のＢ（流速３ｍｌ／分）の溶媒勾配を開始した。ＨＰＬＣ画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、ｓＰＬＡ２酵素活性および分子量について確認した。成熟した適切に折り畳まれた非酸化ｈＧＸが、ｓＰＬＡ２活性を含む主要なピークの開始時に溶離した。ｈＧＸ折り畳み成熟タンパク質を含む活性な画分を１つにまとめ、凍結乾燥し、２０％のＡＣＮ／０．１％のＴＦＡに再懸濁し、Ｌ−メチオニンを含まない溶媒ＡおよびＢと、１００分で２０％〜４０％のＡＣＮでのＡＣＮ水溶液の直線勾配（流速１ｍｌ／分）とを用いるＣ１８対称シールド（ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｓｈｉｅｌｄ）分析カラムに充填した。ＯＤ_{２８０ｎｍ}に従って画分を手動で回収した。適切に折り畳まれた活性な画分（上記のとおり識別）を１つにまとめ、凍結乾燥し、３０％のＡＣＮ／０．１％のＴＦＡに再懸濁し、タンパク質の量（ＯＤ_{２８０ｎｍ}およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質の品質（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および特異的酵素活性）について分析した。純粋な再折り畳みされたｈＧＸの全収率は、細菌培養物が約３ｍｇ／リットルである。１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより、このタンパク質は９８％を超えて純粋であると判断した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定した、観察された分子量（マトリックスとしてのシナピン酸およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−Ｐｒｏ装置を用いて線形モードで測定した質量）は、計算した質量（１３，６１５．５Ｄａ）とは１Ｄａ未満の差である。リン脂質基質として放射性標識および加熱滅菌した大腸菌膜を用いて、特異的酵素活性を測定した（９）。組換え型タンパク質を等分し、凍結乾燥し、２０℃で保存した。

実施例２：抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体の産生および間接ＥＬＩＳＡによる抗体の直接比較
実施例１と同様に産生した組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘでマウスを免疫して、３種類の異なる抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体（＃７Ｆ１１、＃８Ｄ９および＃９Ｃ１２のクローン）を産生した。ｍＡｂをタンパク質Ａの親和性により精製して定量した。

間接ＥＬＩＳＡにより、異なるｍＡｂの直接比較を行った。

マイクロプレートウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に入れた５０ｎｇの組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘで、室温で一晩被覆した。試料ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後に、試料ウェルをＰＢＳ緩衝液中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液で、室温で６０分間処理した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対して方向づけられる漸増量（０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）のｍＡｂを、抗原で被覆したウェルに添加し、室温で１２０分間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製ａｂ７０６８）で、室温で６０分間処理して、ｍＡｂの結合を検出した。ＴＭＢを添加し、反応を停止し、Ｏｐｔｉｍａ ＦｌｕｏＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）で、吸光度を４５０ｎｍで測定した。

得られた希釈曲線を図１に示す。

データを単一部位飽和モデルに当てはめ、このモデルから相対的Ｋｄ値を推定した（以下の表２）。

上の表に示すように、これらの結果から、３種類のｍＡｂすなわち＃７Ｆ１１、＃８Ｄ９および＃９Ｃ１２は、組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対して、市販されているＨ９モノクローナル抗体（参照番号ＳＣ−３６５７３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）よりも非常に高い親和性を示すことが明らかに分かった。

実施例３：抗ｓＰＬＡ２−Ｘ抗体のビオチン化およびサンドイッチＥＬＩＳＡの開発
１ｍｇの各モノクローナル抗体＃７Ｆ１１、＃８Ｄ９および＃９Ｃ１２を、Ｐｉｅｒｃｅ社製キット（参照番号２１４３５）を用いてビオチン化した。標識した抗体を−２０℃で保存した。

組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する特異的免疫反応性を、間接ＥＬＩＳＡを用い、ビオチン化ｍＡｂ（＃７Ｆ１１、＃８Ｄ９および＃９Ｃ１２）と非ビオチン化ｍＡｂとで比較した。

マイクロプレートウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に入れた５０ｎｇの組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘで、室温で一晩被覆した。試料ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後に、試料ウェルをＰＢＳ緩衝液中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液で、室温で６０分間処理した。

０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対して方向づけられる漸増量（１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のｍＡｂおよびビオチン化ｍＡｂを、抗原で被覆したウェルに添加し、室温で６０分間インキュベートした。

０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製ａｂ７０６８)または高感度ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ２１１３０）で、室温で６０分間処理することにより、ｍＡｂの結合を検出した。ＴＭＢを添加し、反応を停止し、Ｏｐｔｉｍａ ＦｌｕｏｒｏＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）で吸光度を４５０ｎｍで測定した。

データを単一部位飽和モデルに当てはめ、このモデルからＫｄ値を推定した（以下の表３）。図２および表３に示すように、これらの結果から、異なるｍＡｂのビオチン化が、組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する親和性プロファイルに著しく影響を及ぼさないことが分かった。ストレプトアビジン−ＨＲＰでの顕色により、シグナルが増幅した。

上記試薬を用いて、ヒトｓＰＬＡ２−ＸのサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。標識されていない被覆抗体（１μｇ／ｍＬ）と顕色ビオチン化抗体（３０ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの範囲）との異なる単一ペアを最初に試験した。

マイクロプレートの種類、ウェル中の最終体積、インキュベーションの時間および温度、ストレプトアビジン−ＨＲＰの性質および濃度、アッセイ緩衝液の組成、添加される界面活性剤の性質および濃度などの異なるパラメータを調査して、アッセイを最適化した。

＃８Ｄ９抗体は、顕色を＃９Ｃ１２−Ｂｉｏｔで行った場合に、試料中のｓＰＬＡ２−Ｘを捕獲するのに最も有効な被覆抗体であるように見えた。＃８Ｄ９エピトープおよび＃９Ｃ１２エピトープは、実際に、有効なサンドイッチおよび認識を引き起こすのに十分に遠位にあるように見えた。顕色抗体の混合物または被覆抗体の混合物は保持しなかった。混合物は相乗効果を全く示さず、逆に、陽性シグナルが最も良好な単一ペアのシグナルに限定された場合は、バックグラウンドが追加された。混合物ペアに関する陽性シグナルは、単一のペアのシグナルと類似していた。

結論として、保持したペアは、７．５μｇ／ｍＬの＃９Ｃ１２および３００ｎｇ／ｍＬの＃８Ｄ９−Ｂｉｏｔであった。

典型的なアッセイ条件は以下のとおりである。９６ウェルマイクロプレート（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｅｉｎｅｒ社、参照番号６５５０６１）を、５０μＬの＃９Ｃ１２（７．５μｇ／ｍＬ）と共に、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中、室温で一晩インキュベートした。その後、ウェルを吸引し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後に、試料ウェルを、ＰＢＳ緩衝液中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液で、３７℃で６０分間処理した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘ標準液（１×ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０からなるアッセイ緩衝液中に様々な濃度のタンパク質）をウェルに添加して、較正曲線を生成した。５μＬの血清もしくは血漿試料を、１×ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡを含む緩衝液４５μＬで希釈し、それらのそれぞれのウェルに添加し、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間インキュベートした。吸引後、ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルの＃８Ｄ９−Ｂｉｏｔ（３００ｎｇ／ｍＬ）を３７℃で１時間かけてウェルに添加した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、２５ｎｇ／ｍＬのＳｔｒｅｐｔａ−Ｐｏｌｙ ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社、参照番号２１１４０）で３７℃で３０分間処理して、ｍＡｂの結合を検出した。ＴＭＢを添加し、反応を停止し、Ｏｐｔｉｍａ ＦｌｕｏｒｏＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）で、吸光度を４５０ｎｍで測定した。

実施例４：アッセイ性能の評価
アッセイの特異性
組換え型ヒトｓＰＬＡ２−ＸのためのＥＬＩＳＡ試験の特異性を評価するために、組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＡ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＤ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＦ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＩおよびｓＰＬＡ２−Ｖ、組換え型マウスｓＰＬＡ２−ＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＡ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＤ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＦ、ｓＰＬＡ２−ＶおよびｓＰＬＡ２−Ｘ、および精製したハチ毒ｓＰＬＡ２（ｂｖ−ＰＬＡ２）を、最大１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で試験した。ＥＬＩＳＡ試験は、非常に高い特異性を示し、ヒトｓＰＬＡ２−ＩＩＡ、ヒトｓＰＬＡ２−Ｖおよびｂｖ−ＰＬＡ２（図３）も、組換え型ヒトｓＰＬＡ２−ＩＩＤ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＦ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＩおよびｓＰＬＡ２−Ｖも、組換え型マウスｓＰＬＡ２−ＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＡ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＤ、ｓＰＬＡ２−ＩＩＦ、ｓＰＬＡ２−ＶおよびｓＰＬＡ２−Ｘも認識しなかった（データは示さず）。

アッセイ感度
図４は、上に記載した最終的なＥＬＩＳＡ分子配向で得られた典型的な較正曲線を示し、ここでは、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質を１０μＭの濃度で調製し、連続希釈して較正曲線を作成した。５μＬの全ての希釈物をウェルに添加した。

ゼロ較正物質からの３−ＳＤ評価に基づいて、ＥＬＩＳＡの定量化の限界が０．２５ｎｇ／ｍＬであることが判明した。

アッセイの変形形態
２通りの０〜３０ｎｇ／ｍＬの範囲の４つの標準的な較正曲線または４通りの０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲の８つの標準的な較正曲線から平均変動係数（ＣＶ）を計算して、２人のオペレータにより、アッセイ内ＣＶを評価した。濃度に関して平均的な光学濃度および関連する標準偏差（ＳＤ）を計算し、かつアッセイ内ＣＶに関して平均ＣＶを計算して、アッセイ内ＣＶを決定した。いくつかのアッセイからのデータを検討すると、アッセイ内およびアッセイ間ＣＶはそれぞれ、４．３％±０．０１５および１０．７％±０．０４７であった。

アッセイ回収
ヒト血清中に存在するヒトｓＰＬＡ２−Ｘの回収を評価するために、検出不可能な濃度の内因性ｓＰＬＡ２−Ｘを含む３種類の異なるヒトＥＤＴＡ血漿試料に、ヒト組換え型ｓＰＬＡ２−Ｘタンパク質を１ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。次いで、これらの試料を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて分析し、平均的な（ＳＤ）結果は０．９（１％）ｎｇ／ｍＬ、１．０（９％）ｎｇ／ｍＬおよび０．７（２％）ｎｇ／ｍＬであり、それぞれ９２％、９８％および６８％の回収が得られた。

実施例５：ヒト血漿試料中のｓＰＬＡ２−Ｘ濃度の測定
上記ＥＬＩＳＡサンドイッチを使用して、様々な提供源：健康な個体（ｎ＝１００）、敗血症に罹患している患者（ｎ＝１０）、関節リウマチに罹患している患者（ｎ＝５０）または急性胸痛を有する患者（ｎ＝３１８）からのヒトの血漿試料をアッセイした。健康な個体では、ｓＰＬＡ２−Ｘレベルは低く、ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界を超えた血清中濃度は、１００人中たった５人の個体でしか観察されなかった。これらの５つの試料の平均濃度は６．７ｎｇ／ｍＬであった。

敗血症、関節リウマチおよび急性胸痛を有する患者からの血清試料中のｓＰＬＡ２−Ｘレベルをアッセイした。これらの分析から、ｓＰＬＡ２−Ｘは、少ない割合でしか、敗血症に罹患している患者（１０人中１人の患者、１５ｎｇ／ｍＬ）、関節リウマチに罹患している患者（５０人中４人の患者、平均２２ｎｇ／ｍＬ）、および胸痛を有する患者（３１８人中２４人の患者、平均５．７ｎｇ／ｍＬ）を検出できないことが分かった。

実施例６：酵素活性の阻害
異なるｍＡｂによるｓＰＬＡ２−Ｘ酵素活性の阻害を以下のように試験した。組換え型ヒトｓＰＬＡ２−Ｘ（１０ｎＭ）を、漸増量の精製したモノクローナル抗体（０、１、２、５、１０、２０、３０、５０および１００ｎＭ）と共に３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、選択的蛍光測定法（ＡｔｅｒｏＤＸ（登録商標）ｓＰＬＡ２ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ａｔｅｒｏｖａｘ社、フランスのパリ）を用いて、ｓＰＬＡ２酵素活性を測定した。結果は、試料１ｍＬ当たりの単位（Ｕ／ｍＬ）として表し、ここで１単位は、１分ごとに１ｎｍｏｌの産物の放出を触媒するｓＰＬＡ２酵素の量として定義する。アッセイの検出限界は１７Ｕ／ｍＬであり、この際の線形分析範囲の上限は２３２Ｕ／ｍＬであり、機能感度（２０％）は２１Ｕ／ｍＬである。平均的な分析内（ｗｉｔｈｉｎ−ｒｕｎ）変動性および平均的なアッセイ内変動性はそれぞれ５．９％および８．９％である。

酵素活性を、抗体を含めずにインキュベートしたｓＰＬＡ２−Ｘ（ｍＡｂを含まない対照）の活性と比較し、抗体を含まない対照に対する阻害率（％）として表す。ｓＰＬＡ２−Ｘに対して方向づけられる１種類の非特異的モノクローナル抗体を陰性対照として使用した。

以下の表４に結果を示す。

上記表４および図５に示すように、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対して方向づけられる非特異的ｍＡｂと共にインキュベートすることにより、ｓＰＬＡ２−Ｘ酵素活性の非常に限られた阻害が生じた。

逆に、抗ｓＰＬＡ２−Ｘモノクローナル抗体のｓＰＬＡ２−Ｘへの結合により、ｓＰＬＡ２−Ｘ活性が強く阻害された。３０ｎＭおよび５０ｎＭのｍＡｂ＃８Ｄ９を用いた場合に最大の阻害が観察された（それぞれ７０％および６９％）。

Claims (16)

1. １０^−９Ｍ未満のヒトｓＰＬＡ２−Ｘへの結合に関するＫｄを有する、ヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
2. 重鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：
   ＶＨ−ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＴＮ（配列番号２）、
   ＶＨ−ＣＤＲ２：ＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹ（配列番号３）もしくはＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴ（配列番号４）、および
   ＶＨ−ＣＤＲ３：ＰＱＬＧＰ（配列番号５）もしくはＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹ（配列番号６）
   のうちの少なくとも１つ、または配列番号１〜６と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含むか、
   あるいは、軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：
   ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号７）もしくはＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡ（配列番号８）、
   ＶＬ−ＣＤＲ２：ＹＭＳＮＬＡＳ（配列番号９）もしくはＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１０）、および
   ＶＬ−ＣＤＲ３：ＭＱＳＬＥＹＰＬＴ（配列番号１１）もしくはＱＨＦＹＶＴＰＹＴ（配列番号１２）のうちの少なくとも１つ、または配列番号７〜１２と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む、
   請求項１に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
3. 前記重鎖可変領域は、請求項２に定義されているＣＤＲのうちの少なくとも１つを含み、かつ前記軽鎖可変領域は、請求項２に定義されているＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
4. 前記重鎖可変領域は、請求項２に定義されているＣＤＲを含み、かつ前記軽鎖可変領域は、請求項２に定義されているＣＤＲを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
5. 前記重鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＧＦＴＦＳＮ（配列番号１）、ＴＩＳＳＧＧＤＤＴＹ（配列番号３）およびＰＱＬＧＰ（配列番号５）または前記配列番号１、３、５と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含み、かつ前記軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号７）、ＹＭＳＮＬＡＳ（配列番号９）およびＭＱＳＬＥＹＰＬＴ（配列番号１１）または前記配列番号７、９、１１と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
6. 前記重鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＧＹＴＦＴＮ（配列番号２）、ＷＩＫＴＮＴＧＥＰＴ（配列番号４）およびＧＮＹＹＲＰＲＲＹＦＤＹ（配列番号６）または前記配列番号２、４、６と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含み、かつ前記軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＲＡＳＥＮＬＹＳＮＬＡ（配列番号８）、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１０）およびＱＨＦＹＶＴＰＹＴ（配列番号１２）または前記配列番号８、１０、１２と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
7. 前記重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列は、配列番号１３もしくは配列番号１５、または前記配列番号１３もしくは配列番号１５と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意の配列であり、かつ前記軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列は、配列番号１４もしくは配列番号１６、または前記配列番号１４もしくは配列番号１６と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意の配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する単離された抗体。
8. 配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０のうちの少なくとも１つ、または前記配列番号１７〜２０と少なくとも６０％の同一性を共有する核酸配列を有する任意の配列を含む発現ベクター。
9. CNCM I-4523およびCNCM I-4524として登録されているヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を含む組成物。
11. 内因性ｓＰＬＡ２−Ｘの活性を阻害する、ｓＰＬＡ２−Ｘ関連疾患を治療するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体。
12. 生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘを検出するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体。
13. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する抗体を用いて、生体試料中のｓＰＬＡ２−Ｘの存在を判定するための生体外での診断もしくは予後アッセイ。
14. 被覆抗体として請求項５に記載の抗体を用い、かつ顕色抗体として請求項６に記載の抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項１３に記載の生体外での診断もしくは予後アッセイ。
15. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒトｓＰＬＡ２−Ｘに対する少なくとも１種の抗体を含むキット。
16. 請求項５に記載の抗体および請求項６に記載の抗体を含む、請求項１５に記載のキット。

Images