JP2015226536A - Ｈｓｐ９０阻害剤に対する感受性 - Google Patents

Ｈｓｐ９０阻害剤に対する感受性 Download PDF

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Abstract

【課題】ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する方法、亦、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する哺乳動物腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を判定するための方法の提供。【解決手段】ａ）細胞、組織又は細胞培養物中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定する段階；（ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異を有する細胞、組織又は細胞培養物を選択する段階（ｃ）前記細胞、組織又は細胞培養物とＨＳＰ９０阻害剤を接触させる段階；及び（ｄ）ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた前記細胞、組織又は細胞培養物の生存度を評価する段階を含むＨＰＳ９０阻外剤に対する、腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を判定する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する方法に関する。また、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する哺乳動物腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を判定するための方法を本明細書に記載する。詳細には、本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答者(responder)又は感度の高い患者を同定するためのインビトロ法に備えるものであり、及びＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異（１つ又はそれ以上）を検出することができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用を提供する。本発明は、ＫＡＲＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の効力を監視する方法にも関する。加えて、癌治療の効力を予測する方法を、特に、ＫＡＲＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌に関して記載する。また、前記癌の治療のための医薬品のスクリーニング及び／又はバリデーションのための、ＫＡＲＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異を有する（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞の使用を記載し、並びに本明細書に記載する方法を実施するために有用なキットを提供する。
すべての主要な癌タイプのゲノムを完全に注釈するためにずっと続いている努力の原動力は、ヒトゲノム計画（Human Genome Project）のものを髣髴とさせる。例えば、癌に随伴する体細胞遺伝子コピー数変化及び遺伝子突然変異（両方を本明細書では損傷（lesion）と呼ぶ）の分析は、近未来における人間の癌の遺伝学的展望をもたらすだろう。これらの真剣な努力の医学的影響は、遺伝学的に定義された腫瘍における分子ターゲット癌療法の成功によって例証される：ＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２をターゲットにする抗体トラスツズマブはＥＲＢＢ２増幅乳癌を有する女性において腫瘍を収縮させる（Slamon et al.,2001)；ＡＢＬ／ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ阻害剤イマチニブは、ＢＣＲ／ＡＢＬ転座を有する慢性骨髄性白血病を有する患者において応答を誘導する（Druker et al., 2001a；Druker et al., 2001b）並びにＫＩＴ又はＰＤＧＦＲＡ（Heinrich et al., 2003）の突然変異を有する胃腸間質腫瘍及び黒色腫において応答を誘導する（Hodi et al NEJM 2008 参照）；最後に、ＥＧＦＲ−突然変異体肺腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブ及びエルロチニブに対して非常に感度が高い（Lynch et al., 2004；Paez et al., 2004；Pao et al.,2004)。殆どの場合、そのような発見は、臨床試験完了後にされており；患者を参加させる臨床試験の開始前に治療に関連した癌遺伝子依存性の原因となる損傷の系統的同定を可能にする確固たるメカニズムは、現在まだ存在しない。それ故、癌における体細胞遺伝子変化（損傷）は、活性化された発癌性シグナリング経路への特異的依存性を顕示することが多いので、因果関係的にターゲット療法に対する応答と結びつけられている。しかし、そのような損傷を治療脆弱性に系統的に結びつけるツールは現在存在しない。
Ｋ−Ｒａｓタンパク質は、細胞分裂の調節に関与するＧＴＰアーゼである。ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を有する癌（例えば、非小細胞肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍、肉腫）に罹患している患者は、不良な予後及び特に、非常に低い生存率を有する。これらの疾患を有効に治療することができないので、前記ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍／腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）が感受性である薬物／化合物の同定は、非常に望ましい。特に、人間を参加させる試験を避けて、臨床試験の開始／完了前の同定が望ましい。本明細書において用いる場合の用語「ＫＲＡＳ」は、Ｋ−Ｒａｓ、ｋ−ｒａｓ及びこれらに類するものに関し、それらの用語を同義語として用いる。しかし、用語「ＫＲＡＳ」は、主にＫ−Ｒａｓ ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子に関するのに対し、用語「Ｋ−ｒａｓ」、「Ｋ−Ｒａｓ」又は「Ｋ−ＲＡＳ」は、主にコードされたタンパク質を意味する。
癌細胞株は、上述のＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍／腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）が感受性である薬物／化合物の同定のために対応するインビトロ実験において使用されることがあるが、これらの広く用いられているモデルの妥当性及び臨床的解釈は、疑問視されている。加えて、細胞株は、ゲノム的に無秩序であり、不安定であり、従って、原発性腫瘍の良い代表とはならない可能性が高いと、多くの場合、考えられる。さらに、組織病理学的に定義された腫瘍クラスの遺伝的多様性が実在することが多い；例えば、臨床的腫瘍エンティティ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、ＥＧＦＲ−及びＫＲＡＳ−突然変異体肺腺癌並びにＫＲＡＳ−突然変異体扁平上皮肺癌を含む。このように、いずれの代表的な前臨床モデルにも、原発性腫瘍の損傷の性質並びに組織病理学的に定義されたコホートにおけるそれらの分布を捕捉する必要があるだろう。
最近の報告は、前臨床薬ターゲットバリデーション実験における癌細胞株の使用を認証した（Lin et al., 2008；McDermott et al., 2007；Neve et al., 2006；Solit et al., 2006）。しかし、混合癌系統の細胞株コレクションを利用した（Solit et al., 2006）これらの研究は、いずれも癌細胞株コレクションの大規模ゲノム解析に焦点を合せた（Lin et al., 2008）、又はゲノム解析を用いずに鋭敏な阻害剤感度を有する細胞株を定義するためのハイスループット細胞株プロファイリングを確立した（McDermott et al., 2007）。それ故、癌における体細胞遺伝子変化（損傷）は、活性化された発癌性シグナリング経路への特異的依存性を顕示することが多いので、因果関係的にターゲット療法への応答と関係づけられている。しかし、そのような損傷を治療脆弱性に系統的に結びつける手段は現在存在しない。従って、腫瘍が感受性である化合物／薬物の同定は、臨床試験完了後にしかこれらの化合物／薬物を同定できないので、多くの場合、時間がかかり、多大な費用を要する。また、特定の腫瘍エンティティ（例えば、「肺癌」）は、異なるゲノム及び／又は転写プロフィールを特徴とする様々な腫瘍タイプを含むことがある。従って、「同じ」腫瘍（肺癌などの、同じ腫瘍エンティティに属する腫瘍）であっても、同じ薬物（１つ又はそれ以上）／化合物（１つ又はそれ以上）で治療できないことがある。それ故、同じ腫瘍エンティティに属する腫瘍を有する多くの患者が、一定の薬物／化合物に対する特定の腫瘍タイプの感受性についてのマーカー／予測因子の同定の恩恵を受けるだろう。
Slamon et al.,2001 Druker et al., 2001a Druker et al., 2001b Heinrich et al., 2003 Hodi et al MEJM 2008 Lynch et al., 2004 Paez et al., 2004 Pao et al.,2004 Line et al., 2008 McDermott et al., 2007 Neve et al., 2006 Solit et al., 2006
このように、本発明の基礎をなす技術的問題は、細胞、特に腫瘍細胞、を抗癌治療に対するそれらの感受性又は応答性について評価するための手段及び方法の提供である。
この技術的問題は、本特許請求範囲において特徴を述べる実施形態の提供によって解決される。
従って、本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する方法に関し、この方法は、ａ）前記細胞、組織又は細胞培養物中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定する段階；及び（ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する段階を含む。前記方法は、（ｉ）前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）とＨＳＰ９０阻害剤を接触させる段階；及び（ｉｉ）ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）の生存度を評価する段階をさらに含む。段階（ｉ）及び（ｉｉ）は、段階（ａ）の前に行われることがあるが、段階（ａ）の後又は、場合によっては、段階（ｂ）の後に行われることもある。前記段階（ｉ）及び（ｉｉ）は、活性化ＫＲＡＳ突然変異（１つ又はそれ以上）を含む選択された細胞、組織又は細胞培養物がその生存率に関してＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性であることのさらなる実験的証拠として特に役立つ。従って、及び好ましくは、前記ＫＲＡＳ突然変異（１つ又はそれ以上）は、「活性化突然変異」である。
ＮＳＣＬＣ細胞株コレクションを示す図である。 ＮＳＣＬＣ細胞株コレクションを示す図である。 肺癌における有意な損傷を示す図である。 肺癌における有意な損傷を示す図である。 ８４のＮＳＣＬＣ細胞株のゲノムバリデーションを示す図である。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株の染色体コピー数変化を３７１の原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍のものに対してプロットする。 ８４のＮＳＣＬＣ細胞株のゲノムバリデーションを示す図である。（Ｂ）原発性肺腫瘍と比較してＮＳＣＬＣ細胞株に存在する癌遺伝子突然変異をそれらの相対頻度に従ってプロットする。 ８４のＮＳＣＬＣ細胞株のゲノムバリデーションを示す図である。（Ｃ）クラスタの距離測定及び群平均法のような、ＧＩＳＴＩＣ及び相互共起率を用いる癌遺伝子突然変異によって定義された有意な損傷の階層的クラスタリング。 ８４のＮＳＣＬＣ細胞株のゲノムバリデーションを示す図である。（Ｄ）腎初代組織及び細胞株；肺癌初代組織及び細胞株；リンパ腫初代組織及びリンパ腫細胞株からの転写プロフィールを、階層的クラスタリングによって分析した。 神経膠腫、黒色腫及び肺癌における異常のプロフィールを示す図である。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株の染色体コピー数変化を原発性神経膠腫のものに対してプロットする。 神経膠腫、黒色腫及び肺癌における異常のプロフィールを示す図である。（Ｂ）ＮＳＣＬＣ細胞株の染色体コピー数変化を原発性黒色腫のものに対してプロットする。 神経膠腫、黒色腫及び肺癌における異常のプロフィールを示す図である。（Ｃ）ＮＳＣＬＣ細胞株と、表示した癌エンティティ原発性肺癌、卵巣癌、神経膠腫、黒色腫細胞サンプル、正常組織及びランダムに分割したＮＳＣＬＣ細胞株サブセットとの間のそれぞれのＳＮＰについてのＧＩＳＴＩＣのｑ値の相関をコンピュータ計算することによってゲノム類似性を分析した。 突然変異ＥＧＦＲ肺癌細胞のインビトロでの表現型特性の頑強性を示す図である。 原発性腫瘍の表現型特性が、エルロチニブに対する感度の高い肺癌細胞において保存されることを示す図である。 スクリーニングされた化合物についての生感度データを示す図である。各細胞株及び各化合物についての死滅曲線下のそれぞれのプレイメージのスクリーニング及び分析に基づくハイスループット細胞株から導出した半最大阻害濃度（ＩＣ５０値；［μＭ］）に関する概要。 スクリーニングされた化合物についての生感度データを示す図である。各細胞株及び各化合物についての死滅曲線下のそれぞれのプレイメージのスクリーニング及び分析に基づくハイスループット細胞株から導出した半最大阻害濃度（ＩＣ５０値；［μＭ］）に関する概要。 多重損傷感度予測因子を示す図である。 多重損傷感度予測因子を示す図である。 多重損傷感度予測因子を示す図である。 多重損傷感度予測因子を示す図である。 スクリーニングにおいて用いた化合物の特性表示を示す図である。 スクリーニングにおいて用いた化合物の特性表示を示す図である。 ハイスループット細胞株スクリーニングによって判定した化合物の感度プロフィールを示す図である。 化合物活性の階層的クラスタリングが突然変異ＥＧＦＲをダサチニブ活性についてのターゲットとして暴露することを示す図である。（Ａ）すべての化合物（ｘ軸）及びすべての細胞株（ｙ軸）について対数変換及びそれぞれのプロフィールの平均値での正規化後のＩＣ５０値を表示する。 化合物活性の階層的クラスタリングが突然変異ＥＧＦＲをダサチニブ活性についてのターゲットとして暴露することを示す図である。（Ｂ）染色体獲得（ａｍｐ）及び消失（ｄｅｌ）に対する対数変換後のＩＣ５０値の相関係数ならびに癌遺伝子突然変異（ｍｕｔ）；ＧＩＳＴＩＣによって定義された領域内のコピー数変化を二分し、２進突然変異データとマージした。 化合物活性の階層的クラスタリングが突然変異ＥＧＦＲをダサチニブ活性についてのターゲットとして暴露することを示す図である。（Ｃ）上のパネル：野生型ＥＧＦＲへのエルロチニブの結晶学により判定した結合方式。下のパネル： 患者における二次的ＥＧＦＲ阻害剤耐性に関連した、ＡＴＰポケットのゲートキーパー位置でのＴ７９０Ｍ突然変異が、キナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットからエルロチニブとダサチニブの両方をはずす。 化合物活性の階層的クラスタリングが突然変異ＥＧＦＲをダサチニブ活性についてのターゲットとして暴露することを示す図である。（Ｄ）上のパネル：突然変異体ＥＧＦＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、表示濃度のダサチニブ又はエルロチニブのいずれかで１２時間治療し、全細胞溶解産物をホスホ−ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲについて免疫ブロットした。下のパネル：ダサチニブ又はエルロチニブのいずれかでの９６時間の治療後の用量依存性成長阻害を細胞ＡＴＰ含量の測定により評定した。 バンデタニブ活性についてのターゲットとしての突然変異ＥＧＦＲを示す図である。 １７−ＡＡＧ、ＵＯ１２６及びダサチニブの活性についての損傷に基づく予測を示す図である。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株コレクション及びＮＣＩ−６０細胞株パネルにおける１７−ＡＡＧ−感度プロフィール（ＩＣ５０値）全体にわたってのＫＲＡＳ突然変異（黒色の柱）の分布。（Ｂ）異なる濃度の１７ＡＡＧで治療したＫＲＡＳ野生型（ｗｔ）及びＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｃ）細胞株の溶解産物を、ｃ−ＲＡＦ、ＫＲＡＳ、サイクリンＤ１及びＡｋｔについて免疫ブロットした。 １７−ＡＡＧ、ＵＯ１２６及びダサチニブの活性についての損傷に基づく予測を示す図である。（Ｃ）ＮＳＣＬＣ細胞株コレクションにおけるＵＯ１２６−感度プロフィール（ＩＣ５０値）及びＮＣＩ−６０細胞株パネルにおけるハイポセマイシン(hypothemycin)−感度プロフィール全体にわたっての１ｑ２１．３でのコピー数増加（黒色の柱）の分布。（Ｄ）細胞株を、ダサチニブ（ＩＣ５０＜１μＭ；淡灰色）に対するそれらの感度に従ってソートした。 ダサチニブ感度のゲノム予測因子を生じさせたターゲット強化感度予測方法のバリデーションを示す図である。 Huang et al., (2007) によって発表された６遺伝子シグネチャーを使用するダサチニブに対するＮＳＣＬＣ細胞株のクラスタ画像を示す図である。 ダサチニブ感度に関連した前立腺／乳癌−遺伝子シグネチャーを示す図である。 前立腺癌におけるダサチニブ感度に関連したすべての遺伝子を示す図である。 ＮＳＣＬＣ細胞株パネルを示す図である。図１８は、最初に試験したＮＳＣＬＣ細胞パネルのリスト、それらのそれぞれのＫＲＡＳ突然変異、及び対応する半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。 細胞株を示す図である。 細胞株を示す図である。 ＫＲＡＳ−突然変異体肺癌のトランスジェニックのマウスモデルを示す図である。 ＨＳＰ９０阻害剤でのＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＫＲＡＳＧ１２Ｄマウスの治療を示す図である。
本明細書において用いる場合、用語「細胞、組織及び細胞培養物」は、単離された細胞、組織及び培養物にだけに限定されず、サンプル、すなわち、そのような細胞、組織又は細胞培養物を含む流体からなる生体、医療又は病理サンプルの使用も含む。そのような流体は、体液である場合があり、又は排泄物である場合もあり、及び培養細胞又は培養組織からの培養基のような培養サンプルである場合もある。前記体液は、血液、血清、血漿、尿、唾液、滑液、髄液、脳髄液、涙、糞便及びこれらに類するものを包含し得るが、これらに限定されない。
従って、本発明の要旨は、ＨＳＰ９０阻害剤での抗癌又は増殖抑制治療に対する所与の細胞、組織又は組織内の細胞（又は細胞培養物若しくはそのような細胞培養物中の個々の細胞、又は下で説明するような、生体／医療／病理サンプル中の細胞（１つ又はそれ以上））の感受性の判定が可能になる方法を提供する事実に見出される。付属の実施例において詳述するように、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異を含む細胞がＨＳＰ９０阻害剤での治療に対して特に感受性であることを驚くべきことに発見した。本明細書に提供する実施形態は、ＨＳＰ９０阻害剤がＫＲＡＳ関連／ＫＲＡＳ誘発癌、例えば、ＫＲＡＳ誘発肺腺癌、すなわちＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異を有する癌、の治療にうまく利用できることも証明する。
従って、本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性である細胞／組織／細胞培養物を選択するための方法に備えるばかりでなく、個体、すなわち人間又は動物の患者、をＨＳＰ９０阻害剤での抗癌又は増殖抑制治療に対するその潜在的応答性について評定するためのインビトロ法にも備えるものである。本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤治療に対して感受性である細胞、組織及び細胞培養物を選択する可能性（すなわち、例えば新規ＨＳＰ９０阻害剤を試験することができる又はＨＳＰ９０阻害剤として機能すると推測される化合物についてのスクリーニング法に有用である、研究ツールの選択）に備えるばかりでなく、増殖性疾患の予防もだが治療が必要とされる所与の患者、好ましくは人間の患者、がＨＳＰ９０阻害剤治療の応答者であるかどうかを評価する方法にも備えるものである。最も好ましくは、次のＨＳＰ９０阻害剤に対する所与の患者の応答性を試験する：ゲルダナマイシン又はその誘導体、特に１７−ＡＡＧ又はＩＰＩ−５０４。試験することができるこれらの及びさらなるＨＳＰ９０阻害剤は、本明細書において下でさらに詳細に説明する。
ＨＳＰ９０阻害剤応答細胞又は応答患者の選択方法は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する段階を含む。前記細胞／組織は、ヒトサンプルから採取されることもあり、又はそのような細胞、例えば癌細胞、を含む体液から採取されることもある。前記活性化突然変異は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を示唆する。本明細書において用いる用語「活性化突然変異」は、対応する遺伝子産物、すなわちタンパク質、特にＫＲＡＳタンパク質、の活性増加をもたらす、遺伝子の、特にＫＲＡＳ遺伝子の、突然変異を指す。タンパク質、特にＫＲＡＳタンパク質、の活性（増加）を測定するための方法は、当分野において公知であり、本明細書においても下で説明する。ＫＲＡＳ遺伝子の例示的（活性化）突然変異も本明細書において下で説明する。さらにまた、（活性化）突然変異は、本発明に関して好ましい。
上で指摘したように、及び代替え実施形態において指摘するように、本発明は、詳細には、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する哺乳動物腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を判定するための方法に関し、前記方法は、前記腫瘍細胞中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を判定することを含み、この場合、前記突然変異は、その細胞がその治療に応答する可能性が高いかどうか、又は応答するかどうかを示唆する。そのような判定を個々の、単離された腫瘍細胞に対して行うことができる。そのような評価を、生体／医療／病理サンプル、例えば、体液、単離された体組織サンプル及びこれらに類するものに関して行うこともでき、この場合、前記サンプルは、好ましくは、分析すべき細胞又は細胞破壊片を含む。
上で技術的問題に関して指摘したように、ＨＳＰ９０阻害剤での抗癌療法の転帰を治療前及び治療中に予測することができるマーカーが、当分野において必要とされている。ＨＳＰ９０阻害剤での抗癌治療を受けることとなる又は受けている患者の層別化、及びＨＳＰ９０阻害剤「応答者」と「非応答者(non-responder)」との区別が必要とされている。
本発明の主題は、抗癌治療又は増殖抑制治療を受けることとなる又は受けている個体を診断して、ＨＳＰ９０阻害剤治療前、中及び／又は後にＨＳＰ９０阻害剤に対する応答性を評定する方法であり、この方法は、（ａ）生体／医療／病理サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの（活性化）突然変異を検出する段階（この場合、前記ＫＲＡＳ遺伝子の前記少なくとも１つの（活性化）突然変異の存在が、ＨＳＰ９０阻害剤治療に対するそのようなＨＳＰ９０阻害剤での治療前、中及び後の応答性を示唆する）；及び（ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の前記少なくとも１つの（活性化）突然変異の検出に基づいて個体を応答者又は非応答者に区分する段階を含む。好ましくは、ＫＲＡＳ遺伝子の前記少なくとも１つの突然変異は、本明細書において定義するとおりの活性化突然変異である。
従って、本発明は、治療中及び／又は後に加えて治療前にＨＳＰ９０阻害剤での抗癌／増殖抑制治療の転帰を予測することができるマーカーを初めて提供する。
本明細書において下で及び付属の実施例において実証するように、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）中の（又は細胞若しくは細胞破壊片を含む生体サンプル中の）ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在が、ＨＳＰ９０阻害剤に対する前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）（又は前記生体サンプルを提供した個体）の感受性を高度に予示することを驚くべきことに発見したので、本発明は、上で特定した技術的問題を解決する。
現在、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする腫瘍は、該腫瘍のための特異的療法が存在しないので、有効に治療することができない。従って、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌又は新生物疾患に罹患している患者は、著しく不良な予後を有する；Eberhardt (2005a), J. Clin. Oncol.参照。前記新生物疾患又は癌の非限定的な例は、とりわけ、非小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃腸癌（胃及び食道癌を含む）、腎細胞癌、尿路癌腫、白血病、前立腺癌、リンパ腫、黒色腫、脳腫瘍、小児腫瘍又は肉腫である。これらの疾患すべてが当分野において周知である。一般に、当業者は、さらなる例示的新生物疾患／疾病、例えば、神経内分泌腫瘍、奇形腫又は任意の他のタイプの新生物疾患／疾病を承知しているだろう。本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤での悪性新生物疾患／疾病の治療成功の評定に限定されず、ＨＳＰ９０阻害剤での非悪性新生物疾患の評定に関しても考えられる。非悪性、新生物疾患は、例えば、脂肪腫、線維腫、筋腫、ポリープ、疣贅、コンジローム及びこれらに類するものである。さらに、本発明の特別な焦点は、悪性新生物疾病／癌／悪性腫瘍におけるＨＳＰ９０阻害剤での潜在的治療成功の評定である。
本発明では、驚くべきことに、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性又はＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についてのマーカー／予測因子として同定した。用語「マーカー」及び「予測因子」は、交換可能に用いることができ、突然変異の存在を特徴とする、遺伝子、特にＫＲＡＳ遺伝子並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子、の特定の対立遺伝子変異体を指す。これらの遺伝子の例示的突然変異を本明細書において下で説明する。本明細書において定義するとおりのこれらのマーカー／予測因子の存在は、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性／ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性と有意に（ｐ＜０．０５）相関する。特定の実施形態において、いずれの活性化ＫＲＡＳ突然変異も、ＨＳＰ９０阻害剤での新生物成長（例えば、癌におけるもの）の好結果の治療（又は予防）を予示する。
ＨＳＰ９０阻害剤、特に１７−ＡＡＧ、に対する腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）の感受性についてのマーカーとしてのＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の同定は、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異（１つ又はそれ以上）の存在を特徴とする癌に罹患している患者のための治療アプローチを初めて提供するものである。ＨＳＰ９０阻害剤での患者の治療は、例えば少なくとも８０％の臨床応答率の増加、及び生存率の約１００％増加をもたらすことができる。応答率及び生存率のそのような増加は、ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブ及びゲフィチニブで治療したＥＧＦＲ突然変異肺癌腫に関連して先行技術で証明されている。
ＨＳＰ９０は、突然変異癌遺伝子、例えば突然変異ＢＲＡＦ及び突然変異ＥＧＦＲ、の成熟に関与する（Shimamura (2005) Cancer Res; Grbovic (2005) PNAS）。先行技術では、ＲＡＳ−ＲＡＦ経路の活性化突然変異を有する腫瘍細胞がＨｓｐ９０の随伴（chaperonage）に依存するという仮定（Banerji et al, 2008: Hostein el al, 2001）を実証するために研究が行われた。ＢＲＡＦ遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を有する腫瘍は、これらの腫瘍の成長及び発達がこれらの突然変異ＢＲＡＦ及びＥＧＦＲタンパク質の成熟におけるＨＳＰ９０活性に依存するので、ＨＳＰ９０阻害剤に対して非常に感度が高い。先行技術により、ＢＲＡＦ遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子の突然変異の存在をＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての予測マーカーと考えることができると推測された。
臨床試験（ＮＣＴ００４３１０１５）により、非小細胞肺癌に罹患している患者のＨＳＰ９０阻害剤ＩＰＩ−５０４治療の安全性及び効力が調査されている Ｓｍｉｔｈ（Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies, 2008）。しかし、ＫＲＡＳ突然変異は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）／腫瘍（１つ又はそれ以上）の感受性についてのマーカーとして当分野において記載も、提案もされていない。そうではなく、ＫＲＡＳ突然変異は、単独で又はＥＧＦＲ阻害剤（Pao et al., 2005b）、例えばエルロチニブ（Eberhard (2005) J Clin Oncol 23, 5900-5909）、との組み合わせで、化学療法での癌の治療における治療耐性についての予測マーカーとして記載されているに過ぎない。すなわち、当分野によって説明されているＫＲＡＳ突然変異は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性についての陰性マーカーとして説明されている。言い換えると、当分野は、ＫＲＡＳ突然変異の存在を特徴とする腫瘍細胞／腫瘍が、ＥＧＦＲ阻害剤、例えばエルロチニブ又はゲフィチニブ、での治療に対して耐性であると考えている。
ＨＳＰ９０が突然変異ＫＲＡＳタンパク質の突然変異に関与することでさえ公知ではない。ＨＳＰ９０がＫ−ＲＡＳ依存性シグナリングの活性化をそのクライアントタンパク質ＢＲＡＦ（クライアントタンパク質は、ＨＳＰ９０によって安定化されるタンパク質である）によって調節できることしか当分野では公知でない。しかし、ＨＳＰ９０は、多数のそのような「クライアントタンパク質」を安定させる。
黒色腫患者に関して試みられた以前の研究（Banerji U el al : Mol Cancer Ther, Apr； 7(4):737-9 2008）は、ＮＲＡＳ−及びＢＲＡＦ−突然変異をＨＳＰ９０阻害剤に対する応答についての潜在的バイオマーカーとして関係づけた。しかし、６人の患者しか研究していないため、そのデータの解釈は限られている。詳細には、転移性黒色腫を有する２人の患者がＨＳＰ９０阻害剤に応答したことが報告されている。前記腫瘍のうちの一方は、ＢＲＡＦの突然変異を有したが、他方の腫瘍はＮＲＡＳ突然変異を有した（Banerji et al., Mol Cancer Ther, Apr; 7(4):737-9 2008）。しかし、すべての黒色腫のおおよそ４５〜６０％（ＢＲＡＦ）及び２０〜３０％（ＮＲＡＳ）において発生するＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ突然変異の広範にわたる分布を考えると、２人の患者がこの治療に応答したということが、ＨＳＰ９０阻害剤に応答する患者の亜集団にそのような腫瘍が多く存在するという結論の裏付けにはならない。対照的に、本発明の発見、すなわち、ＫＲＡＳ突然変異体腫瘍がＨＳＰ９０阻害に対してとりわけ感度が高いという発見は、肺癌における遺伝子異常の正規分布を表す１セットの癌の評価に基づく。この腫瘍セットにおいて、ＫＲＡＳ突然変異体腫瘍は、ＨＳＰ９０阻害に対して感度の高かった癌の亜集団に多く存在する。
さらに、ＫＲＡＳが新規ＨＳＰ９０クライアントタンパク質であるという本発明の発見は、予想外であり、驚くべきものである。典型的なＨＳＰ９０クライアントタンパク質は、大量のフォールディング及びプロセッシングを必要とする複雑な三次構造を有する大きなタンパク質である。突然変異体ＢＲＡＦキナーゼが前述の原型的な例である。対照的に、ＫＲＡＳタンパク質は、活性化状態になるために大量の構造リモデリングを必要としない非常に小さいタンパク質である。ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳは、たとえ構造的類似性を共有したとしても、独立したタンパク質であることに留意しなければならない。実際、これらのタンパク質の突然変異体形のいずれか一方による発癌性形質転換は、特定の細胞状況を必要とする。例えば、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２（すなわち、非常に複雑なタンパク質）は、そのような大きく複雑なタンパク質の正しいフォールディングにはシャペロンが必要不可欠であるので、公知シャペロンターゲットである。しかし、ＫＲＡＳ、比較的単純な三次構造を有する小タンパク質、は、潜在的ＨＳＰ９０クライアント／基質として当分野において説明されていない（推測さえされていない）。
ＨＳＰ９０クライアントタンパク質として突然変異体ＫＲＡＳを突然変異体ＢＲＡＦ又はＥＧＦＲと一緒に分類することはできず、それ故、当業者は、突然変異体ＫＲＡＳを推定ＨＳＰ９０クライアントタンパク質と考えなかったのであろうということを、下で説明する。
さらに、突然変異体ＫＲＡＳと突然変異体ＢＲＡＦ又はＥＧＦＲに関して公表されている結果（Shimamura T et al Can Res 2005; Grbovic OM et al., PNAS 2006）との間に有意な差が存在することを本明細書において証明する。これは、ＨＳＰ９０クライアントタンパク質として突然変異体ＫＲＡＳを突然変異体ＢＲＡＦ又はＥＧＦＲと一緒に分類することができないことを立証する。そうではなく、ＫＲＡＳが、Ｈｓｐ９０の新規、非典型的クライアントであるようであることは、本明細書でしかわからない。付属の実験セクションにおいて、突然変異体ＫＲＡＳがＨｓｐ９０に結合され、ＨＳＰ９０阻害剤（１７−ＡＡＧ）での処理によってその複合体から枯渇されないことを立証する。付属の実施例において示すように、突然変異していないＫＲＡＳばかりでなく突然変異ＫＲＡＳもＨｓｐ９０に結合するが、ＨＳＰ９０への結合は、１７−ＡＧＧなどのＨＳＰ９０阻害剤によって阻害されない。同じ条件を用いて、突然変異体ＥＧＦＲは、前に示唆されているように（Shimamura T et al.; Can Res 2005）、１７−ＡＡＧ処理によって複合体から枯渇されることがこの中で判明した。さらに、その複合体以外のＫＲＡＳレベルも修飾されない。
しかし、ｃ−ＲａｆレベルとＡＲＫＴレベルの両方がＨＳＰ９０阻害剤（１７−ＡＡＧ）によって修飾される。これは、理論により拘束されないが、ＨＳＰ９０阻害剤がＫＲＡＳの下流の２つの主要シグナリング経路（ｃ−Ｒａｆ及びＡＫＴ）を枯渇させるので、ＫＲＡＳ−突然変異体細胞はＨＳＰ９０阻害によって殺される可能性が高いことを示唆している。
理論により拘束されないが、ＫＲＡＳタンパク質（及び特に、本明細書に記載するような活性化突然変異を有するＫＲＡＳタンパク質）は、（活性化された）ＫＲＡＳタンパク質のフォールディングを助長する、ＨＳＰ９０のクライアント／基質であると考えられる。ＨＳＰ９０は、そのシャペロン活性によって突然変異ＫＲＡＳタンパク質（すなわち、活性化突然変異を有するＫＲＡＳ）が分解されることを防止すると考えられ；それ故、活性化されたＫＲＡＳタンパク質（１つ又はそれ以上）のレベル増加が維持される。活性化されたＫＲＡＳタンパク質（１つ又はそれ以上）のこのレベル増加は、本明細書に記載する癌の発達及び／又は増進（例えば、腫瘍数の増加又は腫瘍成長増進）の一因となり得る。上述のことに従って、本明細書に開示するＨＳＰ９０阻害剤は、活性化された／突然変異したＫＲＡＳタンパク質の正しいフォールディングを、ＨＳＰ９０シャペロン活性への干渉により妨げ、活性化された／突然変異したＫＲＡＳタンパク質のレベルをこのようにして増加させると考えられる。従って、ＨＳＰ９０阻害剤が、本明細書に開示する癌の治療に、並びに本明細書において提供する手段及び方法に有用であることは、明らかである。
さらにまた、突然変異ＫＲＡＳタンパク質がＨＳＰ９０クライアントとして記載されていないこと、従って、活性化ＫＲＡＳ突然変異がＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍／癌の感受性と関連していると記載又は提案されていないことは周知である。例えば、Ｓｍｉｔｈ（（Drug Discovery Today: Ther Strategies, 2008）は、阻害剤が、広範なＨＳＰ９０クライアントタンパク質及びＨＳＰ９０の多岐にわたる細胞に関する役割の結果として多面発現性変化を示すことを記載している。以前の研究は、原癌遺伝子ＡｋｔのＨＳＰ９０依存性成熟の分析に焦点をあてたが、これらの研究はいずれも、ＨＳＰ９０阻害に対するＫＲＡＳ突然変異体細胞の感度を系統的に研究していない。さらに、たくさんの遺伝学的注釈が施されている大きな細胞株コレクションがないことが、遺伝子型−表現型関係への大規模前臨床分析を実行できる妨げになっている。それが、本明細書に記載する手段及び方法の原動力であり、該手段及び方法は、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する感受性／応答性についてのマーカーの同定を可能にする、徹底的に特性づけされた、１つの特定の腫瘍タイプの腫瘍細胞株の大きなコレクションを伴う。
例えば、Ｓｍｉｔｈ（Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies, 2008）は、ＮＱＯ１発現と１７−ＡＡＧ感度との正の相関を説明している。Ｓｏｌｉｔ（(2008) Drug Discovery Today 13, 38-43）は、ＨＳＰ９０阻害剤試験の設計における患者選択の妥当性を説明している。Ｓｏｌｉｔは、話を続けて、ＨＳＰ９０阻害剤を用いて限られた動物研究だけしか行っていないこと、及び予測ＨＳＰクライアントを分解する１７−ＡＡＧ又は他のＨＳＰ９０阻害剤の想定能力をまだインビボ実験によって確認していないと言っている。
従って、ＫＲＡＳ突然変異は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性に関連して決して述べられておらず、突然変異ＫＲＡＳタンパク質は、ＨＳＰ９０のターゲットとして公知でない。従って、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についてのマーカーとしてのＫＲＡＳ突然変異（１つ又はそれ以上）の同定は、意外であり、先行技術によって予想されなかった。
述べたように、ＫＲＡＳ遺伝子（１つ又はそれ以上）の突然変異を有する癌に罹患している患者は、特に低い生存率及び不良な予後を有し、公知の療法は有効でない。従って、これらの患者は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についてのマーカーとしてのＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の本明細書に記載する同定から多大な恩恵を受けるであろう。さらに、本明細書に記載する方法は、患者を参加させる臨床試験の開始前にＨＳＰ９０に対する応答／患者の感度を同定することができる。
付属の実施例において説明する実験によって本発明を例証する。それらの実験は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する、特にゲルダナマイシン誘導体、例えば１７−ＡＡＧ、に対する感度の予測因子としてのＫＲＡＳ突然変異（１つ又はそれ以上）の驚くべき同定を証明する。付属の実施例において立証するように、代表ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）細胞株コレクションを使用して前記ＫＲＡＳ突然変異（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての予測因子（１つ又はそれ以上）／マーカー（１つ又はそれ以上）として同定した。この発見を公的に入手できるＮＣＩ−６０細胞株コレクション（Garraway et al., 2005；Shoemaker, 2006）において独立してバリデートした（ｐ＜０．０５）。前記ＮＣＩ−６０細胞株コレクションは、多岐にわたる腫瘍の細胞株を含み、大部分のヒト腫瘍タイプの代表となる。従って、ＫＲＡＳ突然変異（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性／ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性についての一般的な予測因子／マーカーである。従って、ＮＳＣＬＣ癌ばかりでなく、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の存在を特徴とする任意の癌（例えば、非小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍、肉腫）を本発明に従って治療することができる。好ましくは、ＫＲＡＳ遺伝子の前記突然変異（１つ又はそれ以上）は、活性化するものである。従って、本明細書に記載する実施形態では、活性化されたＫＲＡＳ遺伝子突然変異を探索、同定及び／又は評価することが最も好ましい。
活性化突然変異が実際にＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を示唆することを立証する動物データを付属の実施例に提供する。下の実験セクションではトランスジェニックマウスモデルを用いる；これらのトランスジェニックｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＫＲＡＳＧ１２Ｄマウスは、肺における突然変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子の発現により進行性肺腺癌を発現する（Jackson EL et al.; Genes Dev 2001）。これらの肺腫瘍保有ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＫＲＡＳＧ１２Ｄマウスを（本明細書において説明及び定義する）例示的ＨＳＰ９０阻害剤１７−ＤＭＡＧ、より可溶性の１７−ＡＡＧ誘導体、で治療した。一週間の治療が４匹のうち３匹のマウスにおいて腫瘍退縮をもたらしたことに注目される。応答は一過性であったが、これらの結果は、活性化ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答するという、細胞株を使用する本明細書に記載の発見を裏付ける。これは、ゲノム的注釈が施されている細胞株パネルを伴う大規模な細胞ベースのスクリーニング実験に基づく発見がインビボで裏付けられることを示している。
本発明の１つの利点は、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性を有する／ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対して応答する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物のインビトロ選択が可能になるということである。本明細書において実証するとき、原発性ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）の遺伝的多様性、転写プロフィール及び表現型特性を代表する、ゲノム的注釈が施されているＮＳＣＬＣ細胞株を使用する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のゲノムが、遺伝子コピー数、癌遺伝子突然変異及び遺伝子発現空間の点で、患者から外科手術によって単離された幾つかの原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍を大いに象徴することを世界的規模の統合ゲノムプロファイリングによって本明細書において証明する。従って、本発明に関連して前記ＮＳＣＬＣ細胞株コレクションを使用することにより、動物試験又は癌患者でのボランティア試験を回避することができ；同時に、前記細胞株コレクションの使用は、当分野において公知の方法とは対照的に、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についてのマーカーとしてのＫＲＡＳ突然変異の信頼できる同定を可能にする。原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍を、特に、遺伝子コピー数、癌遺伝子突然変異及び遺伝子発現空間に関して、大いに象徴するものであるのであれば、他の細胞株コレクションをここで用いることができると考えられる。また、本明細書に記載する及び付属の実施例において用いるコンピュータ利用アプローチを、本発明に関連して、実験データの評価、並びに／或いはＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての（腫瘍）細胞（１つ又はそれ以上）、（腫瘍）組織（１つ又はそれ以上）又は（腫瘍）細胞培養物の予測因子／マーカーの同定に用いることができる。そのようなコンピュータ利用アプローチは、当分野において公知であり、とりわけ、Ｋ−近傍法及び統計的検定、例えばフィッシャの正確確率検定を含む。当業者は、本発明に関連してこれらのアプローチをどのように使用するかを知っている。当業者は、本発明に従って使用できるさらなるコンピュータアプローチも承知しているであろうし、彼の一般知識に基づいて該アプローチを適応させることができる。本明細書における下の説明及び付属の実施例は、薬物感受性についてのマーカーの評定の際に実験的セットとして用いることができる細胞株又は細胞株の組み合わせの特定の選択物に備えるものである。
ＮＳＣＬＣ細胞株の大きなパネルのゲノムの系統的注釈を行って、そのようなコレクションが原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍の遺伝的多様性を反映するかどうかを判定した。付属の実施例において説明するように、このコレクションの表現型の妥当性を立証し、そのようにして、小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のゲノムが原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍を大いに象徴することを確認した。それに応じて、前記細胞株を、本明細書に記載するような系統的なやり方でゲノム損傷の関数としての薬物活性の分析において使用した。
付属の実施例において説明する系統的類似性プロファイリングを用いて、ＥＧＦＲ突然変異が、先行技術の観察と一致するＥＧＦＲ阻害剤（エルロチニブ、ＰＤ１６８３９３、バンデタニブ）に対する感度（Arao et al., 2004；Lynch et al., 2004；Paez et al., 2004；Pao et al., 2004；Sos et al., 2008）を予示することを確認した。ＥＧＦＲ−突然変異体ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＧＦＲ阻害剤の高い活性は、先行技術において説明されている（McDermott et al., 2007；Paez et al., 2004；Tracy et al., 2004）。述べたように、ここでは、先行技術のこれらの発見をゲノム損傷の系統的包括的測定を利用する不偏コンピュータアプローチを用いて確認した。ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性の予測因子／マーカーとしてのＥＧＦＲ突然変異の同定に関して先行技術において説明されているこれらの発見を本発明において確認し、そのようにして、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての予測因子／マーカーとしてＫＲＡＳ突然変異を同定するために付属の実施例において用いるコンピュータ利用アプローチの総合的な機能的生物学的妥当性を立証した。例えば、系統的な細胞ベースの化合物スクリーニング、その後、損傷プロフィールに基づく感度のコンピュータ予測を用いて、ＥＧＦＲ−突然変異をＥＧＦＲ阻害に対する感受性のマーカー／予測因子として同定した（ｐ＜０．０００１）。しかし、ＥＧＦＲ−突然変異をＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性についての予測因子／マーカーとして同定し、確認したばかりでなく、思いがけず、ＫＲＡＳ突然変異もＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての予測因子／マーカーとして同定した。腫瘍細胞における癌療法の活性の綿密な前臨床分析には、単一腫瘍エンティティの大きな細胞株コレクションの徹底的なゲノム分析と、ハイスループット細胞株プロファイリング、その後の本明細書において説明及び立証するような化合物の活性のゲノム予測の両方が必要であることは理解されるはずである。
ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての予測因子／マーカーとしてのＫＲＡＳ突然変異の同定の精度を、ＥＧＦＲキナーゼドメイン内のバンダチニブ／エルロチニブ結合に関しての付属の実施例に示すようなＨＳＰ９０への化合物結合の構造モデリングによって、さらに裏付けることができた。Ｔ７９０Ｍ耐性対立遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞におけるこの化合物の活性の欠如を立証することによって、バンダチニブ／エルロチニブもＥＧＦＲ阻害剤として正式に確認した。この中でＥＧＦＲ突然変異をＳＲＣ／ＡＢＬ阻害剤ダサチニブに対する感受性についての予測因子／マーカーとしても同定した。理論により拘束されないが、この発見は、突然変異体ＥＧＦＲがダサチニブの実際のターゲットであること（Song et al., 2006）を正式に証明するものである。
用語「ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性」及び「ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性」は、本発明に関連して交換可能に用いている。「ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性」に関して本明細書に与える説明は、必要な変更を加えて、「ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性」にも当てはまり、逆もまた同じである。
薬物に対する感受性を判定するための技術的手段及び方法は、当分野において周知である。そのような方法は、とりわけ、細胞又は組織培養実験を含む。あまり好ましくはないが、２つ又はそれ以上の異なるＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）（すなわち、異なる化学式を有するＨＳＰ９０、場合によっては構造的関連性のないＨＳＰ９０阻害剤）を同時に試験することもここでは考えられる。しかし、１度に１つのＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）だけを試験するほうがここでは好ましい。本発明において使用及び試験することができる好ましいＨＳＰ９０阻害剤を本明細書において下で説明する。
本明細書に提供するＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を判定するための選択方法は、本明細書において下でより詳細に説明する接触段階／暴露段階を含む。本明細書において用いる場合の用語「ＨＳＰ９０阻害剤での治療」は、例えば該阻害剤と／に哺乳動物細胞又は癌細胞を、接触させること／暴露することを含意する。勿論、本明細書において下で説明する他の細胞をＨＳＰ９０阻害剤で治療することもできる。
これらの上述の方法は、評価／判定段階も含むことがあり、この評価／判定段階は、例えば、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた／に暴露した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）或いはＨＳＰ９０阻害剤阻害剤で治療した哺乳動物細胞（１つ又はそれ以上）の生存度を判定することを含むことがある。例えば、本明細書において上に記載した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤との接触／に暴露／での治療によって生存度低下を示すことがある。好ましくは、前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤と接触していない／に暴露されていない／で治療されていない対照細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）と比較して、生存度の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは９０％低下を示すことがある。好ましくは、前記対照細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、その対照（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤と接触させない／に暴露しないことだけを除き、本明細書において説明するように試験する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）と同一であるだろう。
従って、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた／に暴露した／で治療した、例えば、本明細書において上で説明したような増殖減少を示す、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性であるとみなすことができる。相応じて、そのような増殖減少を示すＨＳＰ９０阻害剤で治療した哺乳動物細胞（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に応答するとみなすことができる。ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在及びＫＲＡＳ遺伝子の対応する突然変異を判定する段階は、本明細書において下で説明する。上で既に述べたように、ＫＲＡＳ遺伝子のそのような突然変異の存在が、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた／で治療した又はＨＳＰ９０阻害剤に暴露した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）が、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性であるかどうか、又はＨＳＰ９０阻害剤での治療に応答するかどうかを示すことを、本発明に関連して、驚くべきことに発見した。生存度の低下は、例えば、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させていない／に暴露していない／で治療していない対照細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）と比較して増殖減少、例えば増殖の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは９０％減少、に反映され得る。例えば、標準的な技術を用いて全細胞容積、組織容積又は細胞培養物容積を測定することにより、増殖減少を定量することができる。
本明細書において定義するような接触させた／暴露した／治療した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）と対応する対照との増殖の差を、例えば、標準的な技術を利用して該細胞、組織又は細胞培養物の容積を測定することによって評価／判定してもよい。前記評価／判定は、様々な時点で、例えば、前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤と接触させた／で治療した、或いは前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤に暴露した、１５分、３０分、６０分、２時間、５時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日及び／又は７日後に行うことができる。前記評価／判定を繰り返し行う、例えば、前記接触／暴露／治療後１５分、３０分及び６０分の時点で行うことができることも考えられる。前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を、１回ばかりでなく、様々な条件（例えば、同じ阻害剤濃度、異なる阻害剤濃度、異なる安定剤、希釈剤及び／又は担体並びにこれらに類するものと共に組成物に含まれる阻害剤）のもとで数回（例えば、２回、３回、５回、１０回又は２０回）、前記ＨＳＰ９０阻害剤と接触させる／で治療する又は前記ＨＳＰ９０阻害剤に暴露することができることに留意する。従って、前記場合によっては繰り返される評価／検出は、前記ＨＳＰ９０阻害剤との最終接触／での最終治療又は前記ＨＳＰ９０阻害剤への最終暴露後に行うこともでき、或いは上に挙げた前記様々な接触／暴露／治療段階間に行うこともできる。ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた／に暴露した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）の増殖を判定することを含む例示的判定／評価段階に関して本明細書において上で与えた説明は、本明細書に記載する他の判定／評価段階（例えば、ＨＳＰ９０発現レベルの判定）及びさらなる判定／評価段階にあてはまり、当業者は、アポトーシス細胞死、老化、又は腫瘍細胞の生存率若しくは増殖減少と関係づけられる任意の他の細胞生物学表現型の誘導を定量するようなアッセイを承知しているだろう。
ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を判定するためのこれらの選択方法は、ＨＳＰ９０活性レベルの判定も含むことがあり、この場合、ＨＳＰ９０の活性は、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）が、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性であるかどうか、又はＨＳＰ９０阻害剤での治療に応答するかどうかを示す。ＫＲＡＳの並びに場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの活性の判定に関連して本明細書において下で説明するように、本明細書において用いる用語「活性」は、例えば、タンパク質レベルでの酵素活性の判定、及び／又は発現レベル（例えば、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質）の判定を含む。本明細書において定義するような活性を判定するための方法は、当分野において周知であり、本明細書においても下でそれらを説明する。
本発明に関連して用いる場合の用語「ＨＳＰ９０」（「熱ショックタンパク質９０」）は、真核生物の生存力に不可欠である分子シャペロンを指す。熱ショックタンパク質９０は、ミスフォールディングされたタンパク質の修正の役割を担い、従って、健常細胞において重要な分子制御機能を発揮する、分子シャペロンである。腫瘍細胞において、突然変異により活性化される癌遺伝子、例えばＢＲＡＦ又はＥＧＦＲは、ＨＳＰ９０による適切な成熟に依存することが判明した。ＨＳＰ９０がその本来の機能として細胞の保護を有するという事実にもかかわらわず、腫瘍細胞は、発癌性形質転換を誘発している癌遺伝子を安定させるためにこれらの能力を活用する。
ヒトＨＳＰ９０の様々な転写産物変異体の核酸配列及びＨＳＰ９０アイソフォームの対応するアミノ酸配列を配列番号：１３７、１３９、１４１、１４３及び１４５、並びに配列番号：１３８、１４０、１４２、１４４及び１４６にそれぞれ示す。ＨＳＰ９０ＡＡ２をコードする核酸配列（配列番号：１４５）は偽遺伝子であり得ると当分野では推測されている。一般に、本明細書において用いる用語ＨＳＰ９０は、本明細書に記載するような（部分的）ＨＳＰ９０活性を有する任意のアミノ酸配列、及びそのようなアミノ酸配列（１つ又はそれ以上）をコードする核酸配列（１つ又はそれ以上）を指す。
当分野において公知の方法を用いて、用語「ハイブリダイゼーション」及び相同度の定義に関連して、本明細書において下で述べる、例えば、核酸シークエンシング若しくはハイブリダイゼーションアッセイを用いて、又は手作業若しくはコンピュータプログラムを使用することによるアラインメントを用いることにより、本明細書で提供するヒトＨＳＰ９０の配列以外の哺乳動物種又は非哺乳動物種（特に、ラット、チンパンジー、マカク、Ｃ．エレガンス（C. elegans）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））のＨＳＰ９０の核酸配列を同定することができる。１つの実施形態において、ヒトＨＳＰ９０のオルソログをコードする核酸配列は、配列番号：１３７、１３９、１４１、１４３及び１４５で示すような核酸配列と少なくとも４０％相同である。さらに好ましくは、ヒトＨＳＰ９０のオルソログをコードする核酸配列は、配列番号：１３７、１３９、１４１、１４３及び１４５で示すような核酸配列と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％相同であり、この場合、高い値の方が好ましい。最も好ましくは、ヒトＨＳＰ９０のオルソログをコードする核酸配列は、配列番号：１３７、１３９、１４１、１４３及び１４５で示すような核酸配列と少なくとも９９％相同である。
公知核酸配列／プロモーターのオルソログの特性づけのためのハイブリダイゼーションアッセイは、当分野において周知である；例えば、Sambrook. Russell "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring HarborLaboratory. N. Y. (2001): Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology ", Green Publishing Associates and Wiley Interscience. N. Y. (1989) 参照。本明細書において用いる場合の用語「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを指すこともあり、又は非ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションを指すこともある。さらなる指定がない場合、前記条件は、好ましくは、非ストリンジェントである。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook (2001) loc. cit.； Ausubel (1989) loc. cit.；又は Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford. Washington DC. (1985) に記載されている従来のプロトコルに従って確立することができる。条件の設定は、十分に当業者の技能の範囲内であり、当分野において記載されているプロトコルに従ってそれを決定することができる。従って、特異的にハイブリダイズする配列だけを検出するには、例えば０．１×ＳＣＣ、６５℃で０．１％ＳＤＳ又は２×ＳＣＣ、６０℃、０．１％ＳＤＳの高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件などの、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件が通常は必要であろう。相同の又は厳密には相補的でない配列の検出のための低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば、６×ＳＳＣ、６５℃で１％ＳＤＳに設定されることがある。周知であるように、プローブの長さ及び判定される核酸の組成がハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。
本発明に従って、２つ又はそれ以上の核酸配列に関連しての用語「相同性」又は「相同パーセント」又は「同一の」又は「同一パーセント」又は「同一率」又は「配列同一性」は、当分野において公知であるような配列比較アルゴリズムを用いて比較ウインドウにわたって、すなわち指定領域にわたって測定して、又は手作業でのアラインメント及び目視検査によって、比較し、最大対応のためにアラインしたとき、同じである、又は同じであるヌクレオチドの指定百分率（好ましくは少なくとも４０％同一性、さらに好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％同一性、最も好ましくは少なくとも９９％同一性）を有する、２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を指す。例えば７５％から９０％又はそれより大きい配列同一性を有する配列は、実質的に同一であるとみなすことができる。そのような定義は、試験配列の補体にもあてはまる。好ましくは、記載する同一性は、長さが少なくとも約１５から２５ヌクレオチドである領域にわたって、長さが少なくとも約５０から１００ヌクレオチドである領域にわたって、及び最も好ましくは長さが少なくとも約８００から１２００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。当業者は、例えば、当分野において公知であるような、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson Nucl.Acids Res. 2(1994), 4673-4680）又はＦＡＳＴＤＢ（Brutlag Comp. App. Biosci. 6(1990), 237-245）に基づくものなどのアルゴリズムを用いて、２配列間／３以上の配列間の同一パーセントを決定する方法を知っているだろう。
ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは、概して、配列内の内部ノンマッチング欠失又は付加、すなわちギャップ、をその計算の際に考慮しないが、これを手作業で補正して同一％の過剰推定を避けることができる。しかし、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、は、その同一性計算の際に配列ギャップを考慮に入れる。当業者は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（Altschul, (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）も利用できる。核酸配列のためのＢＬＡＳＴＩＮプログラムは、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff (1989) PNAS 89:10915）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
核酸配列内のヌクレオチド残基が、例えば配列番号：１３７、１３９、１４１、１４３及び１４５のヌクレオチド配列内の一定の位置に対応するかどうかを判定するために、当業者は、当分野において周知の手段及び方法、例えば、手作業での、又は本明細書において述べるものなどのコンピュータプログラムを使用することによる、アラインメントを用いることができる。例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ＢＬＡＳＴ（Altschul (1997), loc. cit.；Altschul (1993), loc. cit.；Altschul (1990), loc. cit）を表すＢＬＡＳＴ ２．０を使用して、局所配列アラインメントについて検索することができる。上で論じたようなＢＬＡＳＴは、配列類似性を判定するためにヌクレオチド配列のアラインメントを生成する。それらのアラインメントの局所性のため、ＢＬＡＳＴは、正確なマッチの判定に又は類似配列の同定に特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムアウトプットの基本単位は、ハイスコアセグメント対（High-scoring Segment Pair）（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、等しいが任意の長さの２つの配列フラグメントからなり、それらのアラインメントは、局所的に最大になり、そのアラインメントスコアは、使用者によって設定される閾値又はカット・オフ・スコアを満たす、又は超える。ＢＬＡＳＴアプローチは、問い合わせ配列とデータベース配列の間のＨＳＰを捜して、見つかった任意のマッチの統計的有意性を評価する、及び有意性の使用者選択閾値を満たすマッチだけを報告するアプローチである。パラメータＥは、報告するデータベース配列マッチについての統計的に有意な閾値を確立する。Ｅは、全データベース検索のコンテキストの中でＨＳＰ（又はＨＳＰのセット）が偶然起こる予想頻度の上限と解釈される。マッチがＥを満たす任意のデータベース配列がプログラムアウトプットで報告される。
ＢＬＡＳＴを用いる類似のコンピュータ技術（Altschul (1997), loc. cit.；Altschul (1993), loc. cit.；Altschul (1990), loc. cit.）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベースにおいて同一又は関連分子を検索することができる。この分析は、多層膜に基づくハイブリダイゼーション（multiple membrane-based hybridizations）よりはるかに速い。加えて、コンピュータ検索の感度を調節して、任意の特定のマッチが完全マッチとして類別されるか、又は類似マッチとして類別されるかを判定することができる。この検索の基礎は、
Figure 2015226536
 として定義される生成スコアであり、２配列間の類似度と配列マッチ長の両方を考慮に入れる。例えば、４０の生成スコアの場合、そのマッチは１〜２％の誤差の範囲内で完全マッチであるだろう；７０で、そのマッチは、完全マッチであろう。類似分子は、通常、１５と４０の間の生成スコアを示すものを選択することによって同定されるが、より低いスコアによって関連分子が同定されることがある。配列アラインメントを生成することができるプログラムについてのもう１つの例は、当分野において公知であるような、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson (1994) Nucl. Acids Res. 2:4673-4680）又はＦＡＳＴＤＢ（Brutlag (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245）である。
従って、この文脈での用語「ＨＳＰ９０阻害剤」は、本明細書において上で定義した「ＨＳＰ９０」の発現及び／又は活性を阻害することができる化合物を意味する。ＨＳＰ９０阻害剤は、例えば、ＨＳＰ９０遺伝子の転写、その遺伝子産物のプロセッシング（例えば、スプライシング、核外輸送、及びこれらに類するもの）及び／又はその遺伝子産物の転座（例えば、成熟ｍＲＮＡ）に干渉することができる。ＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０遺伝子によってコードされたポリペプチド／タンパク質のさらなる修飾（例えば、グリコシル化）にも干渉することができ、従って、本明細書において上で説明したＨＳＰ９０タンパク質の活性を完全に又は部分的に阻害することができる。さらに、ＨＳＰ９０阻害剤は、他のタンパク質とＨＳＰ９０阻害剤の相互作用に、特に、ＨＳＰ９０活性によって安定化される突然変異体タンパク質に、干渉することができる。
また、ＨＳＰ９０をコードする核酸分子に対して方向づけられたｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ、アンチセンス分子及びリボザイムは、本発明の使用及び方法にとってＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）と考えられる。ＨＳＰ９０の上で述べたアンタゴニスト／阻害剤は共抑制性核酸である場合もある。
ｓｉＲＮＡアプローチは、例えば、Elbashir ((2001), Nature 411, 494-498) に開示されている。例えば短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を医薬組成物として本発明に従って利用することも、本明細書に従って考えられる。遺伝子サイレンシングのためのｓｈＲＮＡアプローチは、当分野において周知であり、ｓｔ（短鎖一過性）ＲＮＡの使用を含む場合がある；とりわけ、Paddison (2002) Genes Dev. 16, 948-958参照。
上で述べたように、遺伝子サイレンシングのためのアプローチは、当分野において公知であり、ＲＮＡｉ（ｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡのような「ＲＮＡ」アプローチを含む。そのようなアプローチの好結果の使用は、Paddison (2002) loc. cit., Elbashir (2002) Methods 26, 199-213; Novina (2002) Mat. Med. June 3, 2002; Donze (2002) Nucl. Acids Res. 30, e46; Paul (2002) Nat. Biotech 20. 505-508; Lee (2002) Nat. Biotech. 20, 500-505; Miyagashi (2002) Nat. Biotech. 20, 497-500; Yu (2002) PNAS 99, 6047-6052 又は Brummelkamp (2002), Science 296, 550-553 に示されている。これらのアプローチは、ベクター、例えば、ｐＳＵＰＥＲベクターに基づく場合があり、又はとりわけ、Yu (2002) loc. cit.; Miyagishi (2002) loc. cit.若しくは Brummelkamp (2002) loc. cit.に例示されているようにＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩベクターを利用する場合がある。
さらなるＨＳＰ９０阻害剤は、当分野において周知であり、例えば、（Sharp and Workman, 2006; Solit and Rosen, 2006）に記載されている。しかし、本発明によるＨＳＰ９０阻害剤の使用は、公知のＨＳＰ９０阻害剤に限定されない。従って、未だ知られていないＨＳＰ９０阻害剤も本発明に従って使用することができる。そのような阻害剤を、本明細書に記載する及び提供する方法、並びにＨＳＰ９０の阻害についての生化学アッセイを用いるハイ・スループット・スクリーニング（Sharp and Workman, 2006; Solit and Rosen, 2006）などの当分野において公知の方法によって同定することができる。当業者は、彼の一般知識に基づき、阻害剤を容易に同定することができ、又はＨＳＰ９０阻害剤である疑いのある化合物の阻害活性を容易に検証することができる。付属の実施例に記載する細胞（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）に対してこれらの試験を用いることができるが、さらなる細胞（１つ又はそれ以上）／組織（１つ又はそれ以上）／組織培養物（１つ又はそれ以上）、例えば、生検材料から採取した細胞（１つ又はそれ以上）／組織（１つ又はそれ以上）／組織培養物（１つ又はそれ以上）も使用することができる。
本発明の好ましい実施形態において、ＨＳＰ９０阻害剤は、ゲルダナマイシン又はその誘導体である。ゲルダナマイシン（ＩＵＰＡＣ名（[１８Ｓ−（４Ｅ，５Ｚ，８Ｒ＊，９Ｒ＊，１０Ｅ，１２Ｒ＊，１３Ｓ＊，１４Ｒ＊，１６Ｓ＊）］−９−［（アミノカルボニル）オキシ]−１３−ヒドロキシ−８，１４，１９−トリメトキシ（trimetoxy）−４，１０，１２，１６−テトラメチル−２−アザビシクロ［１６．３．１］ドコサ−４，６，１０，１８，２１−ペンタン−３，２０，２２トリオン））は、細菌ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）によって生産され得る、ベンゾキノンアンサマイシン抗生物質である。ゲルダナマイシンは、ＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質９０）に特異的に結合し、その機能を改変する。Ｈｓｐ９０が、一般に、タンパク質のフォールディング、並びに特に、腫瘍細胞において、ｖ−Ｓｒｃ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ及びｐ５３などの過剰発現／突然変異体タンパク質のフォールディングを安定させる一方で、Ｈｓｐ９０阻害剤ゲルダナマイシンは、そのようなタンパク質の分解を誘導する。
ゲルダナマイシンの個別の式を本明細書において下に与える：
Figure 2015226536
ゲルダナマイシンは、強い抗腫瘍剤ではあるが、ゲルダナマイシンの使用は、多少の負の副作用（例えば、肝毒性）も示し、それが、ゲルダナマイシン類似体／誘導体、特に、１７位での誘導体化を含む類似体／誘導体の開発につながった。理論により拘束されないが、ゲルダナマイシンの１７位での修飾は、肝毒性低下をもたらすことができる。従って、１７位が修飾されているゲルダナマイシン類似体／誘導体、例えば、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）は、本発明に関連して、好ましい。水溶性である、又は水に完全に（少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、及び最も好ましくは９９％）溶解させることができる、本発明に従って使用されるゲルダナマイシン誘導体もここでは好ましい。１７−ＡＡＧ（［（３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｅ，１０Ｒ，１１Ｓ，１２Ｅ，１４Ｅ）−２１−（アリルアミノ）−６−ヒドロキシ−５，１１−ジメトキシ−３，７，９，１５−テトラメチル−１６，２０，２２−トリオキソ−１７−アザビシクロ［１６．３．１］ドコサ−８，１２，１４，１８，２１−ペンタエン−１０−イル]カルバマート）は、上で述べたように、ゲルダナマイシンの好ましい誘導体である。１７−ＡＡＧは、例えば（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより取得された）Ｋｏｓａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから、商品名「タネスピマイシン（Tanespimycin）」（ＫＯＳ−９５３としても公知）で市販されている。タネスピマイシンは、現在、多発性骨髄腫及び乳癌について第ＩＩ相臨床試験で研究されており、通常、静脈内投与される。
１７−ＡＡＧの個別の式を本明細書において下に与える：
Figure 2015226536
本発明に関連して用いられる好ましいゲルダナマイシン誘導体（ＨＳＰ９０阻害剤）は、ＩＰＩ−５０４（レタスピマイシン（retaspimycin）又はＭｅｄｉ−５６１としても公知；Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｃｌｓ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｃａ））である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び乳癌の治療における（通常は静脈内投与される）ＩＰＩ−５０４の使用に関して臨床試験が行われる。塩酸アルベスピマイシン（alvespimycin）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより取得された、Ｋｏｓａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）も、本発明に関連して好ましく使用されるゲルダナマイシンの非常に強力な、水溶性で経口活性の誘導体である。
Figure 2015226536
本発明に従って使用されるさらなるゲルダナマイシン誘導体は、とりわけ、ＡＢＩ０１０（Ａｂｒａｘｉｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩＩ））であり、これは、ｎａｂ技術及び塩酸レタスピマイシンを使用して開発されたｎａｂ−１７ＡＡＧ、１７−ＡＡＧの高可溶性ヒドロキノン塩酸塩（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ（ＩＮＦＩ））である。
本発明に従って使用することができるゲルダナマイシンの他の例示的誘導体は、１７−ＤＭＡＧ（１７−ＮＮ−ジメチルエチレンジアミン−ゲルダナマイシン）、及びＣＮＦ１０１０（ゲルダナマイシンのアンサマイシン系半合成類似体（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ（ＢＩＩＢ）／（Ｃｏｎｆｏｒｍａ））である。１７−ＤＭＡＧの抗腫瘍活性は、例えば、Hollingshead (2005) Cancer Chemother Pharmacol 56, 115-125に記載されている。１７−ＤＭＡＧ（アルベスピマイシンとしても公知）の個別の式を本明細書において下に示す：
Figure 2015226536
本発明に関連して使用されるさらなるゲルダナマイシン様ＨＳＰ９０阻害剤は、ＩＰＩ−４９３（ＨＳＰ９０の経口摂取可能な阻害剤（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌｓ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））である。ＩＰＩ−４９３の第Ｉ相臨床試験が２０１０年に予定されている。
非ゲルダナマイシン様ＨＳＰ９０阻害剤（すなわち、上で説明したゲルダナマイシン誘導体ではないＨＳＰ９０阻害剤）の使用も、本発明に関連して、考えられる。ここで使用される非ゲルダナマイシン様ＨＳＰ９０阻害剤は、イソアキソール（isoaxole）、特に、４，５−ジアリール−イソアキソールＨＳＰ９０阻害剤、例えばＮＶＰ−ＡＵＹ９２２である。イソアキソール化合物は、熱ショックタンパク質の阻害剤として当分野において公知である；国際公開第２００４／０７２０５１号及び国際公開第２００８／１０４５９５号参照。ＶＥＲ−５２２９６（ベルナリス（Vernalis））又はＡＵＹ９２２としても公知である、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ（ＮＶＳ））は、強力なＨＳＰ９０阻害剤として公知であり、（例えば、乳癌モデルにおける又はヒト大腸癌異種移植モデルにおける）その抗腫瘍活性も記載されている；Brough (2008) J. Med. Chem (2008) 51(2), 196-218 及び Jensen (2008) Breast Cancer Res 10:R33 参照。最近、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２は、乳癌第Ｉ相臨床試験に入った。
Figure 2015226536
ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２を静脈内投与することができるが、経口投与も考えられる。
さらに、本発明に従って使用することができるＨＳＰ９０阻害剤の非限定的な例は、ＸＬ８８８（経口摂取可能なＡＴＰ競合阻害剤（エクセレキス（Exelexis））ＡＲＱ２５０ＲＰ（ＡｒＱｕｌｅ Ｉｎｃ（ＡＲＱＬ）、ＡＴ１３３８７（経口及び静脈内投与用の非アンサマイシン阻害剤；Ａｓｔｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（プライベート））、ＢＨＩ００１（水溶性ポリケチド；Ｂｉｏｔｉｃａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（プライベート））、ＢＩＩＢ０２１（ＣＮＦ２０２４）（現在、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）について第ＩＩ相臨床研究中の経口摂取可能なＨＳＰ９０阻害剤；Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ（ＢＩＩＢ）／Ｃｏｎｆｏｒｍａ）、ＨＢＰ−３７４（経口摂取可能なものであり、ヒペリシンを活性成分として含有し、脳の癌及び血液学的癌について第Ｉ／ＩＩ相臨床研究において試験中である；Ｈｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｉｎｃ．（プライベート））、ＫＷ−２４７８（静脈内投与されるものであり、現在、Ｂ細胞悪性疾患について第Ｉ相臨床研究中；協和発酵キリン株式会社（Kirin/Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.））、ＭＰＣ３１００（Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ（ＭＹＧＮ））、ＭＰＣ３１６０（経口投与されるものであり、第Ｉ相臨床研究中；Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＳＡＲ５６７５３０（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ（ＳＮＹ））、ＳＮＸ−５５４２（経口投与されるものであり、乳癌について第Ｉ相臨床研究中；プロドラッグ；水溶性、経口活性小分子；活性形態：ＳＮＸ−２１２２；Ｐｆｉｚｅｒ／Ｓｅｒｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．（プライベート））、ＳＲＮ００５（ＫｅｙＮｅｕｒｏｔｅｋ ＡＧ（プライベート））、及びＳＴＡ−９０９０（静脈内投与；ゲルダナマイシン又はその関連化合物ファミリーに無関係の注射可能な小分子；血液学的癌について第Ｉ相臨床試験中；Ｓｙｎｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．（ＳＮＴＡ））である。抗生物質のＨＳＰ９０阻害剤としての使用も、本発明に関連して考えられる。例えば、ＨＳＰ９０阻害剤「マイコグラブ（Mycograb）」を使用することができ、これは、ヒト遺伝子組み換え抗体であり、免疫優性真菌性抗原熱ショックタンパク質９０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ（ＮＶＳ））に結合する。
本明細書において上で説明したように、驚くべきことに、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性またはＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を示唆することをここで発見した。ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、当分野において周知であり、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベース（www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/）において説明されている。ＫＲＡ遺伝子の好ましい突然変異は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ及びＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆである。これらの突然変異、及びＫＲＡＳ遺伝子のそのような突然変異を有する／ＫＲＡＳ遺伝子のそのような突然変異を特徴とする対応する細胞株も、図１８に示す。上で述べたＫＲＡＳ突然変異のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号：３から７８に示し、これに対して「野生型」（すなわち、ＫＲＡＳ突然変異を有さない）ＫＲＡＳヌクレオチド配列の核酸配列を配列番号：１及び１５７（ＫＲＡＳ遺伝子の２つのアイソフォームを表す）に示す。この情報を用いて、当業者は、ＫＲＡＳ遺伝子産物の上で述べた突然変異を容易に演繹することができる。（ＫＲＡＳの２つのアイソフォームの）アミノ酸配列を配列番号２及び１５８に提供する。従って、上で述べた突然変異を、配列番号２及び１５８に提供する２つの野生型配列から演繹することもできる。特に、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異は、本明細書に提供する実施形態において重要なものである。
本明細書の１つの実施形態では、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異（１つ又はそれ以上）（特に、活性化突然変異）の存在を判定するばかりでなく、さらなる選択肢として、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の突然変異も追加で判定する。判定されるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異は、例えば、ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１＞ＡＧＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＮ：ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｇ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｈ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｋ：ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｖ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ：ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｔ７５１Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｉ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅＩ，Ｓ７５２Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｓ７５２Ｄ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７Ｉ９Ｓ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ：ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＞ＮＰＹ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ，Ａ７５０Ｐ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｐ７５３Ｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｑ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｔ７５０ｄｅｌ，Ｐ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｔ７５１ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ：ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ＿Ｍ７６６＿Ａ７６７ｉｎｓＡＩ：ＥＧＦＲ＿Ｐ７７２＿Ｈ７７３ｉｎｓＶ；ＥＧＦＲ＿Ｓ７５２＿Ｉ７５９ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｓ７６８Ｉ；ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ：ＥＧＦＲ＿Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ；ＥＧＦＲ＿Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ：及びＥＧＦＲ＿Ｖ７７４＿Ｃ７７５ｉｎｓＨＶである。
ＥＧＦＲの突然変異が、アミノ酸が挿入される又は欠失される複雑な突然変異を含むことは公知である。場合により、そのような事象は、置換突然変異と共に発生する。欠失の場合、突然変異式中の第二の下線（「＿」）の前から下線の後ものまでのアミノ酸が欠失される（例えば、「ＥＧＦＲ＿Ｄ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ」は、アミノ酸７４６から７５０までが欠失される、ＥＧＦＲの突然変異体バージョンを指す）。挿入の場合、下線によって隔てられた２つのアミノ酸の間で挿入が発生する（例えば、「ＥＧＦＲ＿Ｐ７７２＿Ｈ７７３ｉｎｓＶ」は、アミノ酸Ｖが野生型配列のＰ７７２とＨ７７３の間に挿入される、ＥＧＦＲの突然変異体バージョンを指す）。置換又は挿入が、挿入又は欠失の後に起こる場合、置換される又は挿入されるアミノ酸の前、挿入または欠失の記載の後にカンマ（「，」）を置く。例えば、突然変異「ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ」は、アミノ酸Ｅ７４６からＴ７５１までが欠失され、そのすぐ後にＶが挿入される、ＥＧＦＲの突然変異バージョンを指す。或いは、「ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｔ７５１Ａ」は、アミノ酸７４６から７５０までの欠失後にＴ７５１がＡで置換される、ＥＧＦＲの突然変異体バージョンを指す。
「野生型」（すなわち、ＥＧＦＲ突然変異を有さない）ＥＧＦＲヌクレオチド配列の核酸配列を配列番号：１４９、１５１、１５３及び１５５（ＥＧＦＲの４つのアイソフォームを表す）に示す。この情報を用いて、当業者は、ＥＧＦＲ遺伝子産物の上で述べた突然変異を容易に演繹することができる。「野生型」ＥＧＦＲのアミノ酸配列も配列番号：１５０、１５２、１５４及び１５６に提供する。従って、上で述べた突然変異を、配列番号：１５０、１５２、１５４及び１５６に提供する野生型配列からも演繹することができる。
ＢＲＡＦ遺伝子の好ましい突然変異は、ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｇ、ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｆ４６８Ｃ、ＢＲＡＦ＿Ｆ５９５Ｌ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ａ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ａ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｓ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ５９６Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｎ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｑ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｓ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｔ５９９Ｉ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｌ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｒである。
上で述べたＢＲＡＦ突然変異のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号：７９から１３６に示し、これに対して「野生型」（すなわち、ＢＲＡＦ突然変異を有さない）ＢＲＡＦヌクレオチド配列の核酸配列を配列番号：１４７に示す。この情報を用いて、当業者は、ＢＲＡＦ遺伝子産物の上で述べた突然変異を容易に演繹することができる。ＢＲＡＦのアミノ酸配列を配列番号：１４８に提供する。従って、上で述べた突然変異を、配列番号：１４８に提供する野生型配列からも演繹することができる。
（突然変異）ＫＡＲＳ遺伝子産物、（突然変異）ＥＧＦＲ遺伝子産物及び（突然変異）ＢＲＡＦ遺伝子産物のアミノ酸配列における上で述べた突然変異を注釈するための１（又は３）文字コードは、当分野では周知であり、標準的な教科書（例えば、"The Cell", Garland Publishing, Inc. 第３版）から演繹することができる。アミノ酸及び１（又は３）文字コードを用いるそれらのそれぞれの省略形の固有リストの総合的リストを本明細書において下に与える：
Figure 2015226536
上で述べたように、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の突然変異（１つ又はそれ以上）を有する腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）／腫瘍（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する感度が高い。従って、ＫＲＡＳ遺伝子の並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、突然変異（１つ又はそれ以上）を有する腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）／腫瘍（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対して特に感度が高いだろうと考えられる。従って、ＫＲＡＳ遺伝子の並びにＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異を用いて本発明に従って選択される細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、ＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）に対して特に感受性だろう。従って、患者（ＫＲＡＳ遺伝子の並びにＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌に罹患している患者）のＨＳＰ９０阻害剤での治療は、例えば予後又は生存率の点で、特に成功するだろう。
ＫＲＡＳ遺伝子の及び（さらなる選択肢として）、追加で、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の突然変異（１つ又はそれ以上）に加えて、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についての他のマーカーの存在の判定も、ここでは考えられる。勿論、他の化合物／薬物（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤及びこれらに類するもの）に対する感受性のマーカーの存在も、本発明に従って判定することができる。これは、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する際に、或いはＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）に対して感受性である／感度が高いばかりでなく、他の化合物／薬物（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）に対しても感受性である／感度が高い患者／応答者の同定の際に価値がある。これらの細胞（１つ又はそれ以上）／組織（１つ又はそれ以上）／細胞培養物（１つ又はそれ以上）／患者（１人又はそれ以上）／応答者（１人又はそれ以上）を、例えば、ＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）及びさらなる化合物／薬物（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）での共同療法／共同治療に付すことがある。
或いは、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ遺伝子並びに／又は場合によっては、本明細書において上で示したさらなる遺伝子の突然変異ではなく、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異（１つ又はそれ以上）のみの存在を特徴とする、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物を選択する、又は患者／応答者を同定することができる。例えば、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異（１つ又はそれ以上）及びさらなる遺伝子（例えば、ＥＧＦＲ）の突然変異の存在を特徴とする癌に罹患している患者をＨＳＰ９０阻害剤で治療することができるばかりでなく、その患者がそのようなＥＧＦＲ阻害剤に耐性であることがわかっている場合にはＥＧＦＲ及びＨＳＰ９０阻害剤での共同療法で治療することができる。勿論、本発明に関連して用いられる共同療法／併用療法は、放射線療法、従来の化学療法及びこれらに類するものも含むことがある。
ＫＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子並びに場合によってはさらなる遺伝子の突然変異を、当分野において公知の方法によって検出することができる。そのような方法は、例えば、（Papadopoulos et al., 2006；Shendure et al., 2004）に記載されている。当業者は、上で挙げた文献に記載に記載されている遺伝子の突然変異を検出するための方法を、本明細書に記載するＫＲＡＳ−、ＥＧＦＲ−及び／又はＢＲＡＦ−突然変異、並びに当分野において公知のこれらの遺伝子のさらなる突然変異に適応させることができる。本明細書に記載しないが当分野において公知の前記遺伝子の突然変異、又はこれから同定される突然変異も本発明に関連して用いることができることは、当業者には容易に理解されるであろう。ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、突然変異の検出において用いられる例示的、非限定的方法は、核酸のシークエンシング（例えば、サンガ―・ジデオキシ・シークエンシング(Sanger di-deoxy sequencing)）法、「次世代」法、単一分子シークエンシング、変異体対立遺伝子／突然変異の検出を可能ならしめる方法、例えばリアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ（Cancer Research 59 (1999), 5169-5175 参照）、質量分析遺伝子型判定法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＨＰＬＣ、酵素的方法及びＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型分析；Pathol Int (1996) 46, 801-804 参照）である。
特に、そのような方法としては、ｐｃｒによるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン又はイントロン部分に特異的にハイブリダイズするオレゴヌクレオチドを用いるＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントの酵素的増幅を挙げることができる。ＫＲＡＳ遺伝子のすべての突然変異のうちの大部分（＞９５％）がエキソン２又は３で発生することを考えると、ゲノムＤＮＡを用いる時には二反応でそのような増幅を行うことができ、又はｃＤＮＡを用いる時には単一反応で行うことさえできる。結果として生ずるＰＣＲ産物を、従来のサンガ―法を基礎としたのジデオキシヌクレオチドシークエンシング法に付すことができ、又はＲｏｃｈｅ（４５４技術）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ技術）若しくはＡＢＩ（Ｓｏｌｉｄ技術）によって市販されているものなどの新規平行シークエンシング法（「次世代シークエンシング」の利用に付すことができる。公的に利用できる遺伝子配列データベースとの比較による配列読取りから突然変異を同定することができる。或いは、酵素的検出反応、蛍光、質量分析又は他のものを用いて検出することができる、プローブの対立遺伝子特異的組み込みによって、突然変異を同定することができる；Vogester (2007) Dtsch Arztebl 104 (31-32), A2194-200 参照。
パラフィン包埋臨床材料をＫＲＡＳ突然変異の検出に用いることができる。検出は、腫瘍が存在することを保証するために、試験するサンプルの組織病理学(histolopathology)再調査を含むことがある。この検出方法で用いることができる特別なアッセイが、ＫＲＡＳ遺伝子の７つの最頻出活性化突然変異を検出するように設計されているＤｘＳ Ｌｔｄ Ｔｈｅｒａｓｃｒｅｅｎ（商標）ＫＲＡＳ Ｍｕｔａｔａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｋｉｔである。この検出方法で用いることができるもう１つの市販のキットは、ＤｘＳ Ｋ−ＲＡＳ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔである。製造業者によると、このキットは、大腸内のＣＯＳＭＩＣ Ｒｅｌｅａｓｅ ３５に登録されている突然変異、すなわち、次のＫ−ＲＡＳ突然変異：１２Ａｓｐ（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）、１２Ｖａｌ（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、１２Ｃｙｓ（ＧＧＴ＞ＴＧＴ）、１２Ｓｅｒ（ＧＧＴ＞ＡＧＴ）、１２Ａｌａ（ＧＧＴ＞ＧＣＴ）、１２Ａｒｇ（ＧＧＴ＞ＣＧＴ）及び１３Ａｓｐ（ＧＧＣ＞ＧＡＣ）の９８．５％をカバーする。これらの突然変異も、本明細書において、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性又はＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を示唆するＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異として説明する。上のキットにおいて用いられている及び本明細書において用いるＫ−ＲＡＳ突然変異の呼称の相関関係を下の表に与える：
Figure 2015226536
当業者は、上のキットにおけるような形式で呼ばれるこれらの及びさらなるＫＲＡＳ−突然変異を容易に識別することができ、これらの突然変異を本明細書に記載する活性化ＫＲＡＳ突然変異に容易に相関させることができる。
ＫＲＡＳ突然変異の例示的検出は、次のように行うことができる：パラフィンブロックから連続切片を切り取り、ＤＮＡを抽出する。次に、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）技術とＡＲＭＳ（商標）（対立遺伝子特異的ＰＣＲ）技術を併用してそのＤＮＡを増幅して、７つの最頻出ヌクレオチド置換、すべてＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及び１３に存在する、を検出する。そのような種類のアッセイは、好ましくは、野生型ゲノムＤＮＡのバックグラウンドで突然変異体ＤＮＡの１％に対して感度が高い。
上で説明した検出方法における陽性結果は、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異の存在を示す(Mitudomi T and Yatabe Y (2007) Cancer Sci 98:1817-24；Massarelli E et al (2007 Clin Cancer Res 13:2890-96；Finocchiaro G et al (2007) J Clin Oncol, ASCO Annual Meeting Proceedings 25 (18S):4021 も参照）。
ＫＲＡＳ突然変異を検出するために使用されるさらなるキットは、例えば英国、マンチェスター州、Ｇｒａｆｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ ４８のＤｘＳ Ｌｔｄから、市販されている。そのようなキットを、癌遺伝子の突然変異の検出に使用することができる。特に、ＴｈｅｒａＳｃｒｅｅｎは、ＥＧＦＲ及びＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を検出するために使用することができる。ＥＧＦＲ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＢＣＲ−ＡＢＬ及び他の遺伝子のための、バリデートされたさらなるバイオマーカーキットが市販されている。
本明細書において上で説明し、付属の実施例において証明するように、ＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）に対する感受性／ＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）での治療に対する応答性を判定するためのこれらの方法は、第一段階に、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤と接触させること、或いは細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤に暴露することを含む。当業者は、ＨＳＰ９０阻害剤との接触／への暴露をどのように行うべきかを知っている。例えば、適切な希釈剤、安定剤及び／又は担体と共に組成物に含まれているＨＳＰ９０阻害剤と共に、前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をインキュベートしてもよい。（例えば、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）とＨＳＰ９０阻害剤のインキュベーションを含む）接触／暴露段階において使用されるＨＳＰ９０阻害剤のモル濃度は、勿論、そのＨＳＰ９０阻害剤の性質に依存する。その接触／暴露段階において場合によっては添加される希釈剤、安定剤及び／又は担体も、そのＨＳＰ９０阻害剤の性質に依存するであろう。しかし、当業者は、どの希釈剤、安定剤及び／又は担体並びにこれらに類するものを添加すべきであるかを知っているであろうし、本発明の選択方法／応答性を判定するため方法において使用することができる希釈剤、安定剤及び／又は担体並びにまたＨＳＰ９０阻害剤（１つ又はそれ以上）の適切な濃度も承知しているであろう。ＨＳＰ９０阻害剤に細胞を暴露するための他の方法は、細胞−マトリックス又は化合物アレイの使用であり得、この場合の細胞は、アレイ形式でマトリックスに結合しており、従って、多数の阻害剤若しくは多数の阻害剤濃度に同時に暴露することができ、又はこの場合の化合物は、アレイ形式でマトリックスに結合しており、従って、多数のタイプの細胞若しくは細胞のアリコートに同時に暴露することができる。
本発明に関連して、ハイ・スループット・スクリーニング（ＨＴＳ）、特に、ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答性／感度についての細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）のスクリーニング法、も考えられる。適する（ＨＴＳ）アプローチは、当分野において公知である。そのようなスクリーニング法の例示的プロトコルも付属の実施例に提供する；当業者は、このプロトコル又は公知ＨＴＳアプローチを本発明の方法の実施に容易に適応させることができる。
スクリーニング−アッセイは、通常、液相で行われ、この場合、試験すべきそれぞれの細胞／組織／細胞培養物について少なくとも１つの反応バッチが作られる。使用される典型的な容器は、例えば３８４、１５３６又は３４５６ウエル（すなわち、「原型」９６反応器の倍数）を有するマイクロタイタープレートである。
ロボット、データ処理及び制御ソフトウェア、並びに感知検出器は、ＨＴＳ装置のさらなる一般に使用される構成要素である。サンプル（１つ又はそれ以上）及び試薬（１つ又はそれ以上）の添加および混合のためのステーションからステーションへのマイクロタイタープレートの移送、それらの試薬のインキュベーション、並びに最終読み出しには、多くの場合、ロボットシステムが使用される。通常、多くのプレートの同時調製、インキュベーション及び分析にＨＴＳを用いることができる。
前記アッセイを単一反応で行うことができる（これが通常好ましい）が、洗浄及び／又は移送段階も含むことがある。放射活性、発光又は蛍光、例えば蛍光−共鳴−エネルギー移動（ＦＲＥＴ）及び蛍光分極（ＦＰ）及びこれらに類するものを利用して検出することができる。本明細書に記載する生体サンプルをそのような状況で使用することもできる。特に、細胞アッセイ及びインビボアッセイをＨＴＳに利用することができる。細胞アッセイは、細胞抽出物、すなわち、細胞、組織及びこれらに類するものからの抽出物、も含むことがある。しかし、生体サンプル（特に、癌に罹患している又は罹患しやすい患者／被験者から得たサンプル）として細胞（１つ又はそれ以上）又は組織（１つ又はそれ以上）の使用がここでは好ましいが、（適する動物モデル、例えば本明細書に記載するマウスモデル、を利用する）インビボアッセイは、ＨＳＰ９０阻害剤での治療のバリデーション／監視に特に有用である。最初のアッセイの結果によっては、絞り込まれたセット（例えば、最初のアッセイにおいて「陽性」と判明したサンプル）に関してさらなるデータを収集するために、追跡アッセイを、その実験の再実行、観察結果の確認及び精製によって行うことができる。
ＨＴＳは、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性の／応答する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）及び／又は動物（１又はそれ以上）の同定に、或いは本明細書に記載するような癌の治療の効力の監視に利用できるばかりでなく、ＨＴＳは、ここで使用することができるさらなるＨＳＰ９０阻害剤の同定にも有用である。通常数十万の物質を有する化合物ライブラリのスクリーニングには、通常、数日と数週間の間、かかる。実験的ハイ・スループット・スクリーンをバーチャルスクリーンによって補足ことが（又は置換することさえ）できる。例えば、ターゲット分子（例えば、ＨＳＰ９０）の構造が判っている場合、用語「ドッキング」で知られている方法を用いることができる。幾つかのターゲット結合分子（例えば、本明細書に記載するＨＳＰ９０阻害剤）が判っている場合、そのターゲット分子にも結合する新たな物質の開発を目指してファーマコフォア−モデリングのための方法を用いることができる。動物（インビボ）モデルにおける適する読み出しは、腫瘍成長（又はそれぞれ腫瘍成長の完全若しくは部分阻害及び／又はその寛解）である。
突然変異（例えば、ＫＲＡＳ）の検出のためのハイスループット法は、大規模平行シークエンシングアプローチ、例えば「ピコタイター・プレート・パイロシークエンシング」を含む。このアプローチは、マイクロメートルサイズのビーズに適応させたＤＮＡライブラリのエマルジョンＰＣＲに基づくクローン増幅、そしてその後の、１実験あたり２００，０００を超える固有クローンシークエンシング読取りを生じさせる、ピコタイタープレートでのそれぞれのクローン増幅テンプレートの、合成によるパイロシークエンシング(Thomas RK et al. Nature Med 2007)に依存する。さらに、質量分析遺伝子型判定アプローチ(Thomas RK et al.；Nat Gen 2007)及び他の次世代シークエンシング法(Marguerat S et al.；Biochem Soc Trans 2008)。
用語「細胞」（１つ又はそれ以上）、「組織」（１つ又はそれ以上）及び「細胞培養物」（１つ又はそれ以上）の意味は、当分野において周知であり、例えば、「Ｔｈｅ Ｃｅｌｌｓ」(Garland Publishing, Inc., 第３版)から演繹することができる。一般に、本明細書において用いる用語「細胞」（１つ又はそれ以上）は、単個細胞又は多数の細胞を指す。本発明に関連して、用語「多数の細胞」は、単個細胞より多くの細胞を含む細胞群を意味する。それに関して、前記細胞群からの細胞は、類似した機能を有し得る。前記細胞は、連結細胞である場合もあり、及び／又は別個の細胞である場合もある。本発明に関連して、用語「組織」は、類似した機能を行う細胞の１群を特に意味する。本発明に関連して、用語「細胞培養物」（１つ又はそれ以上）は、制御条件下で成長／培養される、本明細書において上で定義したとおりの細胞を意味する。細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、詳細には、多細胞真核生物、好ましくは、本明細書中の他の場所で定義するとおりの動物、からの（から採取された／得られた）細胞を含む。本明細書において用いる場合の用語「細胞培養物」が、「組織培養物（１つ又はそれ以上）並びに／又は「器官培養物（１つ又はそれ以上）」（「器官」は、同じ機能を行う組織の１群である）を指すことは理解されるはずである。
好ましくは、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させる／に暴露する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）を含む、又は腫瘍細胞から採取される。前記腫瘍細胞は、例えば、生検材料、詳細には、非小細胞肺癌、肺癌腫、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍若しくは肉腫に罹患している患者／被験者、又はあまり好ましくはないが、前記疾患に罹患しやすい患者／被験者からの生検材料、から得ることができる。前記被験者がヒトであることが、ここでは好ましい。本明細書において用いる用語「哺乳動物腫瘍細胞」（１つ又はそれ以上）は、哺乳動物からの腫瘍より採取される、又は哺乳動物からの腫瘍である、腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）を指し、用語哺乳動物は、本明細書において下で由来を明らかにする。細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）に関して本明細書において上で説明したように、「哺乳動物腫瘍細胞」は、生検材料、詳細には、非小細胞肺癌、肺癌腫、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍若しくは肉腫に罹患している患者／被験者、又はあまり好ましくはないが、前記疾患に罹患しやすい患者／被験者からの生検材料、から得ることができる。用語「腫瘍細胞」は、「癌細胞」にも関する。
一般に、前記腫瘍細胞又は癌細胞は、任意の生物学的ソース／生物、詳細には、上述の非小細胞肺癌、肺癌腫、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍又は肉腫に罹患している任意の生物学的ソース／生物、から得ることができる。
好ましくは、接触させる（腫瘍）細胞（１つ又はそれ以上）又は（癌）細胞を動物から得る／採取する。さらに好ましくは、前記（腫瘍）／（癌）細胞（１つ又はそれ以上）を哺乳動物から採取する。用語「動物」又は「哺乳鉱物」の意味は、当分野において周知であり、例えば、Wehner und Gehring(1995; Thieme Verlag)から演繹することができる。哺乳動物の非限定的な例は、偶蹄類、例えば羊、ウシ及びブタ、奇蹄類、例えばウマ、ならびに肉食動物(carnivors)、例えばネコ及びイヌである。本発明に関連して、経済的に、農業経済学的に又は科学的に重要である生物からＤＮＡサンプルを採取することが、特に考えられる。科学的に又は実験的に重要な生物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びブタが挙げられるが、これらに限定されない。
キツネザル、サル及び類人猿を含む霊長類から腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）を得ることもできる。用語「霊長類」、「キツネザル」、「サル」及び「類人猿」の意味は公知であり、当業者は、例えば、Wehner und Gehring(1995; Thieme Verlag)からその意味を演繹することができる。上で述べたように、腫瘍又は癌細胞（１つ又はそれ以上）は、最も好ましくは、上で述べた非小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病に罹患しているヒトから採取される。従って、本発明に関連して、特に有用な細胞、詳細には腫瘍又は癌細胞、は、ヒト細胞である。これらの細胞を、例えば生検材料から、又は生体サンプルから得ることができるが、用語「細胞」は、インビトロ培養細胞にも関する。
付属の実施例においても使用する好ましい細胞（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を添付の図１８に示す。前記細胞（１つ又はそれ以上）／細胞培養物（１つ又はそれ以上）としては、Ｈ２０３０、Ｈ３５８、ＳＫＬＵ１、ＨＣＣ４４、Ｈ１９４４、Ｈｌ５７、Ｈ１３５５、Ｈ２１２２、Ｈ４４１、ＨＣＣ４６１、Ａ４２７、Ｈｌ７３４、Ｈ１７９２、Ｈ４６０、ＤＶ−９０、Ｃａｌｕ１、Ｈ２００９、Ａ５４９、ＬＣＬＣ９７ＴＭ１、ＨＣＣ５１５、ＨＯＰ６２、Ｃａｌｕ６、Ｈ６４７、ＨＣＣ１１７１、Ｈ２４４４及びＨ２８８７が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株は、当分野において周知であり、並びにＡＴＣＣ及び／若しくはＤＳＭＺから、並びに／又は米国国立癌センター(U.S.National Cancer Institute)から癌細胞株のＮＣＩ６０コレクションの一部として得ることができる(www.lgcpromochem-atcc.com/;www.dsmz.de/；dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html)。
ＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を判定するためのこれらの選択方法は、ＨＳＰ９０の活性／発現レベルの判定も含むことがあり、この場合、ＨＳＰ９０の活性／発現レベルは、細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）が、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性であるかどうか、又はＨＳＰ９０阻害剤での治療に対して応答するかどうかを示唆する。本明細書において用いる用語「ＨＳＰ９０の活性」は、ＨＳＰ９０タンパク質（ｈｓｐ９０遺伝子によってコードされたタンパク質）の活性を指す。用語「ＨＳＰ９０の発現」は、本明細書では「ＳＨＰ９０遺伝子の発現」と交換可能に用いており、ｈｓｐ９０遺伝子の発現を指す。「ＨＳＰ９０の活性」／「ＨＳＰ９０の発現」に関して本明細書において上で与えた定義は、必要な変更を加えて、「ＫＡＲＳの活性」／「ＫＲＡＳの発現」、「ＥＧＦＲの活性」／「ＥＧＦＲの発現」及び「ＢＲＡＦの活性」／「ＢＲＡＦの発現」にあてはまる。ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた又はＨＳＰ９０阻害剤に暴露した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）において判定するＨＳＰ９０の活性／発現レベルを、対照細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）、すなわち、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させていない又はＨＳＰ９０阻害剤に暴露していない細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）、におけるＨＳＰ９０の活性／発現レベルと比較することは、理解されるはずである。当業者は、そのような試験を行うための、又適切な対照を選択するための手段及び方法を承知しているだろう。好ましくは、対照細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、該対照細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）をＨＳＰ９０阻害剤と接触させない又はＨＳＰ９０阻害剤に暴露しないことだけを除き、本明細書に記載するように試験する細胞、組織又は細胞培養物と同一であろう。
好ましくは、ＨＳＰ９０タンパク質／ポリペプチド及び／又はＨＳＰ９０ポリヌクレオチド／核酸分子のＨＳＰ９０活性／発現レベル減少は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を又はＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を示唆する。ＨＳＰ９０活性／発現レベルは、対照細胞（１つ又はそれ以上）、対照組織（１つ又はそれ以上）又は対照細胞培養物（１つ又はそれ以上）と比較して、ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた又はＨＳＰ９０阻害剤に暴露した細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）において少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは少なくとも９０％減少されることが、ここでは好ましい。ＨＳＰ９０活性は、その発現レベルと必ずしも相関しないことは公知である。従って、ＨＳＰ９０発現が増加されるにもかかわらず、ＨＳＰ９０活性がＨＳＰ９０阻害剤の存在下で減少することがある。しかし、当業者は、これを承知しているであろうし、好ましくは、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性又はＨＳＰ９０阻害剤での治療に対する応答性を判定するときにＨＳＰ９０活性（すなわち、ＨＳＰ９０タンパク質の活性／機能）を評価するであろう。
述べたように、当業者は、ＨＳＰ９０活性／発現レベルを検出及び評価するための対応する手段及び方法を承知しているであろう。用いることができる例示的方法としては、分子評価、例えば、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ及びこれらに類するものが挙げられるが、これらに限定されない。
遺伝子産物がＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡ（例えば、スプライシングされていない、部分的にスプライシングされた、又はスプライシングされたｍＲＮＡ）であるとき、ノーザンブロッティング技術、ｍＲＮＡ転写産物に特異的な１つ若しくはそれ以上のプローブ若しくはプローブセットを装備したマイクロアレイ若しくはＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション、又は例えば、定量的ＰＣＲ技術、例えばリアルタイムＰＣＲ、のような、上で言及したＰＣＲ技術を利用することによって、判定を行うことができる。（特定の）ｍＲＮＡを結合するためのこれらの及び他の適する方法は、当分野において周知であり、例えば、Sambrook and Russell(2001, loc. cit.)に記載されている。当業者は、検出シグナルの強度と決定する遺伝子産物の量の間の相関、好ましくは線形相関、を利用することにより、成分、特に前記遺伝子産物、の量を決定することができる。
成分が、ポリペプチド／タンパク質である場合、上で言及した技術、特にウエスタンブロッティング技術を利用することによって定量を行うことができる。一般に、当業者は、ポリペプチド（１つ又はそれ以上）／タンパク質（１つ又はそれ以上）の定量方法を知っている。溶液中の精製ポリペプチドの量を、物理的方法、例えば光度計測法、によって決定することができる。混合物中の特定のポリペプチドを定量する方法は、例えば抗体の、特異的結合に依存する。抗体の特異性を活用する特異的検出及び定量方法は、例えば、免疫組織化学（インサイチュー）を含む。ウエスタンブロッティングは、電気泳動によるタンパク質の混合物の分離と抗体での特異的検出を併用する。電気泳動は、多次元、例えば２Ｄ電気泳動、である場合がある。通常、ポリペプチドを１つの次元に沿ってそれらの見掛けの分子量により、及び他の方向に沿ってそれらの等電点により、２Ｄ電気泳動で分離する。或いは、タンパク質定量法は、質量分析法又は酵素免疫測定法を含むことができるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答者又は感度の高い患者の同定のためのインビトロ法に関し、該方法は、次の段階：（ａ）ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異（特に、活性化突然変異）並びに、場合により、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異（さらに、特にＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異）の存在を特徴とする癌に罹患している疑いのある又は罹患しやすい患者からサンプルを得る段階；及び（ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を評価する段階を含み；単独での、又はＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ遺伝子の突然変異に加えての、ＫＲＡＳ遺伝子の前記突然変異が、ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答患者を示唆する、又はＨＳＰ９０阻害剤に対する前記患者の感度を示唆する。本明細書において指摘するように、特に、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異は、本明細書に提供する実施形態において重要である。
前記サンプルを、例えば、生検（１つ又はそれ以上の）によって得ることができる。好ましくは、癌に罹患している疑いのある又は癌に罹患しやすい患者から前記サンプルを得る。詳細には、前記癌は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする疑いのあるものであり得る。前記癌は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在に加えて、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする場合がある。前記サンプルが、腫瘍（１つ又はそれ以上）から得られる、及び従って、腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）又は腫瘍組織（１つ又はそれ以上）であることが、ここでは好ましい。サンプルを得ることができる好ましい腫瘍は、上で既に説明した、非小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍又は肉腫である。当業者は、当分野において公知の標準的技術及び本明細書に記載する方法を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌を容易に同定することができる。
本発明のもう１つの実施形態は、本明細書において上で定義したとおりのＨＳＰ９０阻害剤に対する感度を診断するための、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異のうちの突然変異（１つ又はそれ以上）を検出することができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用に関する。好ましくは、前記オレゴヌクレオチド（１つ又はそれ以上）は、長さが約１５から１００ヌクレオチドである。当業者は、彼の一般的な知識及び本明細書に提供する教示に基づき、ＫＲＡＳ遺伝子の並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子及び／又はさらなる遺伝子の、少なくとも１つの突然変異を検出することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを容易に同定及び／又は調製することができる。詳細には、これらのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを本明細書に記載する検出方法においてプローブ（１つ又はそれ以上）として使用することができる。当業者は、例えば、ここで用いることができる対応するプローブの同定に有用であり得るコンピュータプログラムを知っているだろう。例えば、これに関連して、ＫＲＡＳ核酸配列（配列番号：１又は１５７）を、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を検出するための特異的プローブの同定に使用することができる。同様に、ＥＧＦＲ（配列番号：１４９、１５１、１５３、１５５）及びＢＲＡＦ（配列番号：１４７）をコードする対応する配列をそれぞれ使用して、プローブを同定することができる。例示的ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及びＢＲＡＦ核酸配列は、対応するデータベース、例えば、ＮＣＢＩデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)で入手することができる。従って、このデータベースにおいて番号「Ｇｅｎｅ ＩＤ：３８４５」でＫＲＡＳ核酸配列を見つけることができる。対応するＥＧＦＲ及びＢＲＡＦ配列は、それぞれ、番号「Ｇｅｎｅ ＩＤ １９５６」及び「Ｇｅｎｅ ＩＤ：６７３」で見つけることができる。述べたように、ＫＲＡＳ核酸配列、ＥＧＦＲ核酸配列及びＢＲＡＦ核酸配列の例示的配列を、それぞれ配列番号：１及び１５７、配列番号：１４９、１５１、１５３、１５５並びに配列番号：１４７にも示す。
特定の実施形態において、癌の治療の効力を監視する方法であって、前記癌が、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在によって特性づけられるものである方法を、本明細書に開示し、前記方法は、
ａ）前記被験者／患者から得た細胞または組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳの、並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの、活性／発現レベルを判定する段階と；
ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性／発現レベルと、ＫＲＡＳの、並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの、基準又は対照活性／発現レベルと比較する段階と
を含み、この場合、ａ）において判定した前記活性／発現レベルと前記基準活性／発現レベルとの差の程度が、前記癌の治療の前記効力を示唆する。
本明細書において用いる場合の用語「活性」は、本明細書における他の場所で説明するようなタンパク質の活性を指し、その一方で、用語発現レベルは、タンパク質レベルでの発現レベル（例えば、ウエスタンブロット及びこれらに類するものによって判定される）又は転写レベルでの発現（例えば、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ及びこれらに類するものによって判定することができる、スプライシングされた、スプライシングされていない若しくは部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ）を指す。治療の監視方法又は治療の効力を予測する方法に関連して言及するマーカー遺伝子は、特に、ＫＲＡＳ遺伝子、並びに、場合によってはＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子である。さらにまた、特に、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異は、本明細書に提供する実施形態において重要である。
癌の治療の効力を監視する方法は、前記癌に罹患している被験者／患者（例えば、生検材料）から得た細胞または組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を判定する段階を含むことがある。前記監視方法は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の判定に加えて、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在の判定を含むことがある。例えば、ＫＲＡＳ遺伝子の（ならびに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の）突然変異は、癌の治療の開始前のサンプルに存在することがある。癌の治療中又は後、ＫＲＡＳ遺伝子の（ならびに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の）突然変異を有する腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）は、消去又は別様に減滅される。従って、癌の治療中または後に被験者／患者から得たサンプル（細胞サンプル／生検サンプル及びこれらに類するもの）におけるＫＲＡＳ遺伝子の（ならびに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の）検出可能な突然変異の不在は、その治療の効力を示唆する。
本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌の治療の、該疾患に罹患している又は罹患しやすい被験者／患者に対する効力を予測する方法にも関し、この方法は、ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子活性／ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦからなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルを判定する段階と；ｂ）ａ）において決定したＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子活性／前記少なくとも１つのマーカーの発現レベルを、対照被験者／患者（応答者／非応答者）から得た細胞又は組織サンプルにおいて場合によっては判定した、ＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルと比較する段階とを含み、この場合、ａ）において決定した前記活性又は発現レベルと前記基準若しくは対照活性又は基準若しくは対照発現レベルとの差の程度が、癌の治療の予測効力を示唆する。またこの場合、特に、活性化ＫＲＡＳ遺伝子突然変異がこの実施形態では興味深いことを指摘することができる。
前記ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌の治療は、本明細書において上で定義したとおりのＨＳＰ９０阻害剤の投与を含み得る。
本発明に関連して、本明細書に開示するＫＲＡＳ遺伝子は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性についてのマーカー／予測因子として作用することを立証した。詳細には、ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答者又は感度の高い患者を、本発明に従って同定することができる。従って、本発明は、例えば前記マーカー遺伝子（１つ又はそれ以上）の活性を判定することにより、ＫＲＡＳ活性の（異常）変化を、それらが発生したら直ちに、認識する可能性をもたらす。代案では、ＨＳＰ９０活性の（異常）変化を認識し得る。
（突然変異）ＫＡＲＳ並びに、場合により、（突然変異）ＥＧＦＲ、（突然変異）ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０の活性を、発現レベルを測定することによって判定できるばかりでなく、例えば、ＨＳＰ９０若しくはＥＧＦＲの場合は基質交代を測定することによっても、又はＫＲＡＳのＧＴＰアーゼ活性を測定することによっても、又は下流のシグナリング経路メンバーの活性化を測定することによっても、例えば、ＫＲＡＳの場合にはホスホ−Ａｋｔ若しくはホスホ−Ｅｒｋのレベル、又はＢＲＡＦの場合にはＢＲＡＦ若しくはＥｒｋのリン酸化レベルを判定することによっても、判定することができる。前記タンパク質の活性を判定するための手段及び方法は、当分野において周知であり、例えば、Lottspeich(Spektrum Akademischer Verlag, 1998)から演繹することができる。本明細書において上で述べたように、活性の判定は、発現レベルの判定を含むことがある。従って、代案では、（突然変異）ＫＡＲＳ、（突然変異）ＥＧＦＲ、（突然変異）ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０の発現状態（すなわち、遺伝子産物、例えばｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現）を、標準的な技法によって判定することができる。ＫＲＡＳ遺伝子（１つ又はそれ以上）並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、突然変異は、これらの遺伝子の発現レベルの変化と必ずしも相関しない。従って、本発明に関連して、（突然変異）ＫＡＲＳ並びに、場合によっては、（突然変異）ＥＧＦＲ、（突然変異）ＢＲＡＦ、の活性を、これらの遺伝子の発現状態を測定することによって判定するのではなく、例えば対応するタンパク質の酵素的活性を反映する、別法によって判定するほうが好ましい。例えば、突然変異ＫＲＡＳ遺伝子、並びに場合によっては突然変異ＥＧＦＲ遺伝子及び／又は突然変異ＢＲＡＦ遺伝子、によってコードされたタンパク質の酵素的活性は、発現レベルの変化のない野生型遺伝子によってコードされたそれぞれのタンパク質のもの（すなわち、基準活性）とは異なるだろうということに留意する。好ましくは、突然変異ＫＲＡＳ遺伝子並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ遺伝子、突然変異ＢＲＡＦ遺伝子は、野生型ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、野生型ＥＧＦＲ及び／又は野生型ＢＲＡＦ（対照）と比較して増加した活性を示す。詳細には、本明細書において上に記載した酵素的活性及び／又は発現レベルが増加される。「正常」活性（すなわち、野生型ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、野生型ＥＧＦＲ及び／又は野生型ＢＲＡＦの活性）と比較した前記活性の変化の例示的範囲を、本明細書において下に記載する。本明細書において用いる用語「野生型」は、「原」核酸配列及びアミノ酸配列／それらによってコードされたタンパク質、詳細には、「ＫＲＡＳ突然変異」、「ＥＧＦＲ突然変異」及び「ＢＲＡＦ突然変異」に関連して本明細書に記載する突然変異を伴わない核酸配列を指す。本発明による「増加された活性」は、ＫＲＡＳの特定の活性化突然変異における、同定された野生型（ＫＲＡＳ）遺伝子が示すものより高い活性に関する。
「マーカー遺伝子」ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦによってコードされた本明細書において上に記載したタンパク質の活性に加えて又は前記活性の代わりに、ｃ−ＲＡＦ及び／又はＡｋｔｉｎの活性／発現レベルを測定／判定することがある。Ｃ−ＲＡＦ遺伝子及びＡｋｔｉｎ遺伝子並びに対応するタンパク質は、当分野において周知であり、これらのタンパク質の発現状態も付属の実施例において判定した。従って、本発明に関連して、Ｃ−ＲＡＦ及び／又はＡｋｔｉｎを「マーカー遺伝子」として使用することもある。治療の効力を監視する方法又は治療の効力を予測する方法に関連して本明細書において下でＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦについて与えるすべての説明は、必要な変更を加えて、Ｃ−ＲＡＦ及び／又はＡｋｔｉｎにもあてはまる。
これらの発見に基づき、本発明は、本発明に従って、前記マーカー遺伝子の少なくとも１つであるＫＲＡＳの発現レベル又は活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルを判定することにより、突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０活性／発現レベルの（異常）変化を早期に認識することができる、すなわち、ＫＲＡＳの並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌の治療の効力を早期に監視することができる、並びに前記癌の治療の効力を早期に予測することができる、という特別な利点をもたらす。従って、本発明の手段及び方法を用いることにより、その治療に対して起こりうる耐性も早期に認識することができる。
特定の実施形態において、本発明は、対応する手段、方法及び使用に関し、これらは、突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０活性／前記それぞれの遺伝子の発現レベルの（異常）変化の早期認識に基づく。突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０活性／発現レベルの（異常）変化を早期に認識する可能性は、幾つかの利点、例えば、（例えば、起こりうる治療失敗の予告、及び治療レジメンの対応する変更のため）被験者／患者のより長い寿命／より高い生存の尤度並びに（例えば、治療失敗を早期に回避する／認識する可能性のため、並びに、従って、療法の早期に治療レジメンを相応じて変更するため、すなわち、より適する阻害剤に時宜を得て切り替えるため、診断後早期に、高価で効力のない治療を中止するため、及び別療法を選ぶため）より効率的な療法の可能性をもたらす。
本発明の上記実施形態に関連して、「早期に」は、（完全な若しくは部分的な）細胞遺伝学的若しくは血液学的応答又は任意のタイプのイメージング法によって測定される応答の（開始の）前に、並びに／又はＫＲＡＳの並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子、及び／若しくはＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌（又はそれらに対する感受性）の発生前に、という意味である。
例えば、前記癌の療法／治療の効力の「早期」の監視は、前記療法／治療に対する（部分的な）細胞遺伝学的若しくは血液学的応答又は任意のタイプのイメージング技術によって測定される応答の（開始の）少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも１０、又は少なくとも１４日前、並びに／或いは（患者又は対照患者（応答者）の）前記療法／治療に対する完全な細胞遺伝学的若しくは血液学的応答又は任意のタイプのイメージング技術によって測定される応答の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、又は少なくとも１８ヶ月前であることがあり、この場合、より長い期間のほうが好ましい。
或いは、前記癌の療法／治療の効力の「早期」の監視は、前記癌の療法／治療（の開始）の長くとも１、長くとも２、長くとも３、長くとも４、長くとも５、長くとも６、長くとも７、長くとも１０、又は長くとも１４日後であることもあり、この場合、より短い期間のほうが好ましい。最も好ましくは、前記癌の療法／治療の効能を、その療法／治療を開始する日には、すなわち、突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０活性／発現レベルが前記療法／治療によって一度でも変化したときには、既に監視していることが考えられる。
以下に、本発明による本明細書において定義する癌の療法／治療の効力を（早期に）監視するための計画の非限定的な例を提供する：
・前記癌の療法／治療（例えば、本明細書に記載するようなＨＳＰ９０阻害剤（例えば、１７−ＡＡＧ）に基づく療法／治療）を監視するとき、ＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性又はＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦの前記マーカー遺伝子（１つ又はそれ以上）（すなわち、突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０）の発現レベル（１つ又はそれ以上）を、その療法／治療の開始後、最初の１週間、１日１回、その療法／治療の最初の１か月間、週１回及び、その後、月１回、判定し得る。
・基準活性又は基準発現レベルを、その療法／治療を開始する日に、治療する被験者／患者から、及び／又は対応する対照被験者／患者（応答者／非応答者）から得る；下記参照。
・マーカーレベルの上昇が２つの連続したサンプルにおいて観察された場合、又はマーカーレベルの減少が、十分には速くない（例えば、応答者のものほど速くない、又は非応答者のものより十分に速くない）場合、治療レジメンの変更を考えることができる。
この例は、決して限定的なやり方でないことに留意する。当業者には、本明細書に提供する技術及び普通一般の知識に基づいて、それぞれの個々の場合に適切な特定の要件にこの計画を適応させることが容易にできる。
例えば、本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の「早期」の予測は、前記療法／治療に対する（部分的な）細胞遺伝学的又は血液学的応答の（開始の）少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも１０、又は少なくとも１４日前、並びに／或いは前記療法／治療に対する完全な細胞遺伝学的若しくは血液学的応答又は任意のタイプのイメージング技術によって測定される応答の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、又は少なくとも１８ヶ月前であることがあり、この場合、より長い期間のほうが好ましい。
或いは、本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の「早期」の予測は、本明細書において定義する癌の療法／治療（の開始）の長くとも１、長くとも２、長くとも３、長くとも４、長くとも５、長くとも６、長くとも７、長くとも１０、又は長くとも１４日後であることもあり、この場合、より短い期間のほうが好ましい。最も好ましくは、前記癌の療法／治療の効力を、その療法／治療を開始する日には、すなわち、突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０活性／発現レベルが前記療法／治療によって一度でも変化したときには、既に監視していることが考えられる。
さらに、本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の「早期」の予測は、その癌の診断の長くとも１、長くとも２、長くとも３、長くとも４、長くとも５、長くとも６、長くとも７、長くとも１０、又は長くとも１４日後であることもあり、この場合、より短い期間のほうが好ましい。最も好ましくは、前記癌の療法／治療の効力をその診断日にはすでに予測していることが考えられる。
述べたように、本発明は、本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の監視に特に有用である。対応する手段、使用及び方法を本明細書に提供する。一般に、一定の種類の療法／治療の効力の監視は、臨床日常教務では定期的に適用される。従って、当業者は、一定の種類の療法／治療の効力を監視する手段を承知している。本発明に関連して、用語「監視」の意味は、「追跡」、「発見」などのような用語の意味を包含する。詳細には、本明細書において用いる場合の用語「ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌の療法／治療の効力の監視」は、前記疾患に罹患している（又は前記疾患に罹患しやすい）被験者／患者が、前記疾患の療法／治療にいったい応答するのかどうか、及び／又は前記応答の経過がどのようなのか（例えば、その応答がどのように速い／遅いのか、及び／又はその応答がどの程度であるのか）を監視することを指す。
さらに、本発明は、本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の予測に有用である。対応する手段、使用及び方法も本明細書に提供する。一般に、一定の種類の療法／治療の効力の予測は、臨床日常業務において非常に望ましい。それによって、その疾患を予防すること、及び／又は療法／治療の効力を増加させることができ、従って、費用及び時間の節約、並びにより長い寿命／より高い生存の尤度／罹患患者の「Ｇｅｎｅｓｕｎｇ」をもたらすからである。本明細書に提供する用語「ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌の療法／治療の効力」に関して与えた定義が、必要な変更を加えて、ここにもあてはまる。本発明に関連して、用語「ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌の療法／治療の被験者／患者に対する効力を予測すること」は、被験者／患者が、そのような療法／治療に対する感受性を示すかどうか、及び／又はどの程度示すのか、すなわち、前記被験者／患者が、前記疾患の療法／治療にいったい応答するだろうか若しくはしたのだろうか、及び／又は前記応答の経過がどのようであろうか若しくはどのようであったのだろうか（例えば、その応答がどのように速い／遅いのか、及び／又はその応答がどの程度であるのか）を判定することと同様に、基本的に同じ意味で、用いる。詳細には、被験者／患者は、その突然変異ＫＲＡＳ並びに、場合によっては、突然変異ＥＧＦＲ、突然変異ＢＲＡＦ及び／又はＨＳＰ９０活性／発現レベルが異常であるとき、本発明による前記癌に対する感受性を示す。
１つの実施形態では、本発明による「本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の予測」を、その療法／治療の開始後、すなわち、既に進行している療法／治療中に、行うことができる。詳細には、前記「予測」を、前記癌の療法／治療の効力の本明細書において説明する監視中に、好ましくは、該監視の開始後早期に、行うことができる。そのために、前記予測は、その進行中の療法／治療の一定の時点で得た前記監視からの結果に基づくだろう。好ましくは、前記時点は、例えば、前記監視の最初の結果を得た時点などの、早い時点である。「本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の予測」を、既に進行している療法／治療中に行う場合、それは、前記療法／治療の追従／後発効力を指す。
もう１つの実施形態では、本発明による「本明細書において定義する癌の療法／治療の効力の予測」を、診断（直）後であるが、しかし、その療法／治療の開始前に行うことができる。そのような場合、「前記癌の療法／治療の効力の予測」は、まだ開始されていない（又はその「予測」を行うのと実質的に同じ時点で開始された）療法／治療の効力を指す。
本発明のこの実施形態に関連して、健常対照被験者／患者の１つの非限定的な例は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子（１つ又はそれ以上）、詳細には、ＫＲＡＳの異常活性／異常発現をもたらす突然変異に対しての野生型ＫＲＡＳ遺伝子（１つ又はそれ以上）を有する者である。言い換えると、前記健常対照被験者／患者は、ＫＲＡＳの異常活性／異常発現をもたらす突然変異（例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ及びＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆ突然変異の存在）を有するＫＲＡＳ遺伝子の形態を有さない者である。これらの突然変異を添付の配列番号：３から７８にも示す。
上で述べたことに従って、本明細書において定義するとおりの癌の治療の効力の監視の手段、方法、及び使用に関するＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては（すなわち、ＫＲＡＳの活性／発現レベルの判定に加えて）ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルは、対応する健常対照被験者（のサンプル）において判定したもの、すなわち、「正常」活性／発現レベルである。
本明細書に記載するマーカー遺伝子の異常活性又は発現レベルが、本明細書に記載するようなＫＲＡＳの活性又は発現、並びに、場合によっては（すなわち、ＫＲＡＳの活性／発現レベルの判定に加えて）ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性／発現レベルがＫＲＡＳの上記基準活性又は基準発現、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ活性／発現レベル及び／又はＢＲＡＦ活性／発現レベルと異なることを意味することは、理解されるはずである。従って、この文脈でのこれらのマーカー遺伝子の基準活性又は基準発現レベルは、「正常」活性／発現レベルである。詳細には、本明細書において定義するとおりの癌の治療の効力の監視／予測の本明細書に開示する手段、方法及び使用に関して、対照被験者／患者は、１つの実施形態では、前記癌に罹患している又は前記癌に罹患しやすい被験者／患者、すなわち、例えばＫＲＡＳの異常活性／発現レベル有する、並びに、従って、本発明に従って説明するようなＫＲＡＳの「正常な」活性及び正常なＫＲＡＳ発現レベルを有さない、被験者／患者であると考えられる。
それに関して、本明細書において定義する及び説明する癌が、上方制御されたＫＲＡＳ活性、並びに場合によっては（すなわち、ＫＲＡＳの活性／発現レベルの判定に加えて）、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベル伴って現れるか、又は下方制御されたＫＲＡＳ活性、並びに場合によっては（すなわち、ＫＲＡＳの活性／発現レベルの判定に加えて）、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベル伴って現れるか、によって、「異なる」活性又は発現レベルが、より高い又はより低い活性又は発現レベルを意味することは、明らかである。
この文脈での「異なる」、「より高い」又は「より低い」は、ＫＲＡＳの正常な（範囲の）活性又は発現、並びに、場合によっては、（すなわち、ＫＲＡＳの活性／発現レベルの判定に加えて）ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルに比べて、異なる、より高い又はより低いを意味する。例えば、異なる、より高い又はより低いは、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍異なる、より高い又はより低いを意味し、この場合、より高い値のほうが好ましい。
活性又は発現レベルが変化するかどうか（すなわち、「より高い」又は「より低い」などの一定の方向で）及びＫＲＡＳ変化の活性又は発現レベルがどの程度であるかを、当業者は、本明細書に提供する教示及び普通一般の知識に基づいて容易に演繹することができる。本明細書において指摘するように、ＫＲＡＳ修飾に加えて、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの発現レベル及び／又は活性も測定、評定することができる。ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性及び／又は発現レベルのこの任意の測定又は評定も、当業者は、本明細書に提供する教示及び普通一般の知識に基づいて容易に演繹することができる。
これに関連して、対照被験者／患者を、前記被験者／患者自体と同じ、本明細書において説明及び定義する癌の治療に付すこと、並びに／又は対照被験者／患者がこの治療に対する応答者であるのか、若しくは非応答者であるのかが分かっていることが、特に好ましい。
被験者／患者が、一定の種類の癌治療／療法についての「応答者」であるのか、又は「非応答者」であるのかを、当業者は、普通一般の知識及び／又は本明細書に提供する教示に基づいて評価することができる。従って、患者は、癌治療／療法に対して、ＫＲＡＳ、並びに場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＳ、の発現／活性が前記治療／療法によって低減される場合、応答する。好ましくは、ＫＲＡＳ、並びに場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ、の発現／活性は、（例えば、前記癌に罹患していない患者から得たサンプルにおいて判定した）対照発現／活性に低減される。言い換えると、ＫＲＡＳ、並びに場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ、の発現レベル又は活性の低減は、好結果の治療／療法を示唆する。当業者は、ＫＲＡＳの、並びに場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの、発現レベル又は活性の評価によって、患者が癌治療／療法に対して応答するかどうかを容易に判定することができる。前記発現レベル又は活性の評価に加えて、当業者は、患者が癌の治療／療法に対して応答するかどうかを評定するために、特定の癌についての細胞学的／血液学的パラメータを決定することもある。
対照的に、治療／療法に対して応答しない患者は、前記治療／療法により、ＫＲＡＳの低減された発現レベル又は活性、並びに場合によっては、ＥＧＦＲの及び／又はＢＲＡＦの低減された発現レベル又は低減された活性を示さない。これは、そのような低減された発現レベル及び／又はそのような低減された活性を示す「応答者／応答患者」とは対照的である。
詳細には、「応答者」は、細胞学的／血液学的パラメータ及び／又は（異常）ＫＲＡＳ活性若しくは発現レベル（及び従って、対応するマーカー遺伝子の発現レベル（１つ又はそれ以上））、ＫＲＡＳ、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの活性が、癌の治療／療法により、それらの「正常な」活性／（タンパク質又はｍＲＮＡ発現）レベル（１つ又はそれ以上）の方に（十分に）変化する、被験者／患者であり得る。１つの特定の実施形態において、「レスポンダー」は、本明細書において定義する耐性の１つに罹患していない被験者／患者であり得る。詳細には、「非応答者」は、細胞学的／血液学的パラメータ及び／又はＫＲＡＳの（異常な）活性若しくは発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベル（１つ又はそれ以上）（及び従って、対応するマーカー遺伝子発現レベル）が、癌の治療／療法により、それらの「正常な」（発現）レベル（１つ又はそれ以上）の方に（十分に）変化しない、被験者／患者であり得る。１つの特定の実施形態において、「非応答者」は、本明細書において定義する耐性の１つに罹患している被験者／患者であり得る。
本発明のこの実施形態に関連して、本明細書において定義する癌に罹患している又はそれに対する感受性を経験しやすい（疾病）対照被験者／患者（応答者及び／又は非応答者）の１つの非限定的な例は、異常なＫＲＡＳ活性／ＫＲＡＳの発現をもたらす、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異形態を有する者である。
当業者は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする公知の癌（例えば、非小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌）の公知の療法／治療に対する典型的な／望ましい応答が、どのように進行することになるのか、又はどのように進行すると思われているかを承知している。さらに、当業者は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする（未知の）癌の（未知の）療法／治療に対する典型的な／望ましい応答が、どのように進行するのか、又はどのように進行すると思われるのかを考えることができる。この知識に基づき、そのような癌の療法／治療の効力に言及する本発明の手段、方法及び使用は、例えば、特定の対照被験者／患者（のサンプル）を用いることなく、すなわち、「ＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性、又は少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベル」と対照被験者／患者（からのサンプル）において判定された「ＫＲＡＳの基準活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ基準活性、又は基準発現レベル」とを比較することなく、行うこともできる。癌の療法／治療中に判定される「ＫＲＡＳの活性」、並びに、場合によっては、「ＥＧＦＲの活性」及び／若しくは「ＢＲＡＦの活性」又は「ＫＲＡＳの発現レベル」並びに、場合によっては、「ＥＧＦＲの発現レベル」及び／若しくは「ＢＲＡＦの発現レベル」の経過を、上で述べた公知の「典型的な／望ましい応答」と単純に比較することにより、当業者は、監視される／予測される療法／治療の効力について考えることができる。被験者／患者の応答が、「典型的な／望ましい応答」と同じように速い場合（又は、より速い場合でさえ）、その被験者／患者は、「応答者」である。被験者／患者の応答が、「典型的な／望ましい応答」より遅い場合、その被験者／患者は、「非応答者」（実質的な応答を観察できないとき）又は「弱応答者」である。
一般に、「マーカー遺伝子」である、ＫＲＡＳの異常な（すなわち、強化された又は減少された）活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルが、前記癌治療又はそれに対する感受性のために、又はその結果として、（健常）対照被験者／患者の「正常レベル」のほうにシフトして戻るとき、本明細書に記載する癌の治療の（望ましい）効力又はそれに対する感受性が示される／予測される。
本発明に関連して、本明細書において定義する癌の治療の効力は、治療された（される）被験者／患者が、「応答者」と同じように速く（またはさらにより速く）及び同じように完全に応答する、すなわち、「典型的な／望ましい応答」を示すとき、高い。これは、前記被験者／患者が、「応答者」と同じように速く、すなわち、「典型的な／望ましい応答」の場合と同様に、関連細胞学的／血液学的パラメータの「正常」レベル及び／又は健常被験者／患者のＫＲＡＳ活性の（及び従って、対応するマーカー遺伝子発現レベル（１つ又はそれ以上）の）「正常レベル」に達することを意味する。
本発明に関連して、本明細書において定義する癌の治療の効力は、治療された（される）被験者／患者が、「応答者」ほど速く及び／又はほど完全は応答しない、すなわち、「典型的な／望ましい応答」を示さないとき、中等度である／低い。これは、前記被験者／患者が、関連細胞学的／血液学的パラメータの「正常」レベル及び／又はＫＲＡＳの「正常」活性若しくは発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの「正常な」活性レベル又は発現レベル（及び従って、対応するマーカー遺伝子レベル（１つ又はそれ以上）の）に達しないことを意味する。従って、中等度の／低い効力は、「応答者」ほど完全に及び／又はほど早く、すなわち、「典型的な／望ましい応答」の場合と同様には、健常被験者／患者のＫＲＳＡの、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの、活性／発現レベルに達しないことを意味する。
本発明に関連して、治療された（される）被験者／患者が全く応答しないとき、癌の治療の効力は、まったくない。
特に、本発明に関連して監視／予測されるような癌の治療の効力が、中等度である若しくは低いとき、又はそのような効力がない場合、（計画した）療法／治療の変更が考えられるだろう。
監視／予測の本明細書に開示する手段、方法及び使用についての代替実施形態において、ＫＲＡＳ、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ、の基準活性若しくは基準発現レベル／対照被験者／患者のレベルを、治療される被験者／患者自体から治療／療法の前（又は治療／療法の開始時）に得た、基準ＫＲＡＳ活性、並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルによって置き換えることができる。この特殊な場合には、「対照被験者／患者」が、治療される被験者／患者自体であろう。そのとき、癌治療の効力は、本発明に従って、ＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性、又は前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルが、治療／療法中に、前記特定のＫＲＡＳ基準活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルと比較してどのように変化するかに基づいて評定されるだろう。前記変化が有意であるほど、及び／又は速いほど、その治療／療法は有効である。
上で述べたように、本明細書に記載するような少なくとも１つのマーカー遺伝子であるＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルが、ＫＲＡＳの一定の基準活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベル、と異なることに基づいて、本発明の特定の実施形態に従って、癌の治療の効力を評定する。それに関して、癌が、上方制御されたＫＲＡＳ活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性または発現レベルに伴って現れるのか、又は下方制御されたＫＲＡＳ活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性または発現レベルに伴って現れるのかによって、異なるが、より高い又はより低いを意味することは明らかである。
この文脈で、異なる、より高い又はより低いは、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子であるＫＲＡＳの正常な（範囲の）活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベル、と異なる、より高い又はより低いを意味する。例えば、異なる、より高い又はより低いは、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍又は少なくとも２００倍異なる、より高い又はより低いを意味し、この場合、より高い値のほうが好ましい。
いずれにせよ、並びに本明細書に記載するような少なくとも１つのマーカー遺伝子であるＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルが、その対応する基準発現レベルと、どちらの方向（すなわち、より高い、又はより高い）で、どの程度異なるのかを、当業者は、本明細書に提供する教示及び普通一般の知識に基づいて、容易に演繹することができる。従って、ＫＲＡＳの基準活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルと、診断評定される被験者／患者のＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルとの所与の差が、少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異の存在を特徴とする癌又はその治療に対する効力の診断に役立つかどうかを、本明細書に特に記載するそれぞれのマーカー遺伝子について評定することができる。
述べたように、本明細書に開示するような監視／診断の手段、方法及び使用に関連して、本発明に従って評定又は監視するサンプル又は患者におけるＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルと、ＫＲＡＳの対応する「基準活性／基準発現レベル」、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ「基準活性／基準発現レベル」との「差」の程度が、行われた（行われる）癌の療法／治療の（予測された）効力を示唆する。
例えば、対照被験者／患者が、「応答者」（例えば、「陽性対照」）である場合、「基準」と評定または監視するサンプル／患者とのＫＲＡＳの活性／発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルの最小の又は小さい差は、「高い効力」を示唆する。それらを、「典型的な／望ましい応答」を基準にして評価することができる。また、この場合、「対照」に対する（一定の時点での）小さい差は、高い効力を示す。類似して、「対照被験者／患者」が非応答者（例えば、「陰性対照」）である、又は治療前に得た患者サンプルである場合、少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異の存在を特徴とする癌の療法／治療の前／開始時に得たＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルのより大きな差も、高い効力の指標となる。これに関連して、「非応答者サンプル」又は所与の患者の「治療前若しくは治療開始時の固有サンプル」と治療中又は後に評定したサンプルとの大きい及びその結果「陽性の」差は、高い効力を示す。
上で述べたことから演繹することができるように、本明細書において言及するＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルを、治療する被験者／患者自体から、又は対応する対照被験者／患者（健常者／応答者／非応答者）から、診断日に、その療法／治療が開始されたら、治療／療法の間及び／又は中に得ることができる。前記ＫＲＡＳの基準活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルを、ＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性又は少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルと同じまたは異なる時点で、例えば療法／治療の経過に関して、判定することができる。
詳細には、ＫＲＡＳの基準活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルを、治療する被験者／患者とは異なる対照被験者／患者から得る場合、そのＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルを、療法／治療中に同時に判定することが好ましい。詳細には、ＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルを、治療する被験者／患者自体から得る場合、そのＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ基準活性又は基準発現レベルを、比較を可能にするような療法／治療中の異なる時点で、例えば、その療法／治療の開始時（又は前）に判定すべきである。
一般に、本明細書に記載するＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベル（１つ又はそれ以上）を、１回、又は好ましくは、数回、判定することができる。例えば、ＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルを、療法／治療中、１日１回、週１回、月１回又は年１回ベースで判定することができる。通常、ＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルを判定する頻度が、療法／治療の過程で減少すれば、対応する研究の要件が満たされたこととなる。本発明に従ってＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルを判定する計画の非限定的な例を、本明細書に提供する。
当業者は、提供する手段、方法及び使用のそれぞれの個々の段取りのために、適する対照患者（１人又はそれ以上）／被験者（１人又はそれ以上）、並びにＫＲＡＳの（基準）活性又は（基準）発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ（基準）活性又は（基準）発現レベルを判定する時点（１つ又はそれ以上）を、容易に選ぶことができることに注目される。
１つの実施形態において、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異を特徴とする癌の治療用の医薬品のスクリーニング及び／又はバリデーションのための、ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異を有する（トランスジェニック）細胞または（トランスジェニック）非ヒト動物の使用に関する。これに関連して用いる場合の用語「細胞」は、多数の細胞並びに組織に含まれている細胞も包含し得る。使用される細胞は、例えば、原発性腫瘍細胞であり得る。前記スクリーニング又はバリデーション方法に用いる腫瘍細胞又は細胞を、非小細胞肺癌、肺癌腫、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍又は肉腫に罹患している（トランスジェニック）非ヒト動物からのサンプルより得ることができる。前記腫瘍細胞又は細胞を、患者サンプル（例えば、生検材料）、特に、非小細胞肺癌、肺癌腫、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、脳腫瘍、小児腫瘍又は肉腫に罹患している患者／被験者からの生検材料、から得ることもできる。従って、前記腫瘍細胞又は細胞は、ヒト腫瘍細胞または細胞であり得る。さらにまた、本スクリーニング又はバリデーション方法において使用されるそのような細胞は、組織または組織サンプルに、例えばサンプル生検材料に、含まれていることがある。
使用される非ヒト動物又は細胞は、トランスジェニックである場合もあり、又は非トランスジェニックである場合もある。この文脈での「トランスジェニック」は、詳細には、本明細書に記載する又は本発明において定義するとおりのマーカー遺伝子の少なくとも１つが過剰又は過少発現されることを意味する。例えば、ＨＳＰ９０阻害剤をスクリーニング及び／又はバリデートすべき場合、そのようなマーカー遺伝子が過剰発現される（それらのＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルは、ＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルが増されると、増される）こと、及び／又はそのようなマーカー遺伝子が過少発現される（それらのＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルは、ＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性または発現レベルが増されると、減少される）ことが好ましい。
この文脈での「トランスジェニック」は、ＫＲＡＳが過剰若しくは過少発現されること、及び／又はトランスジェニック非ヒト動物若しくはトランスジェニック細胞におけるＫＲＡＳ−活性が、強化される若しくは減少されることも意味する。本発明に関連して、好ましい（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞は、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の存在を特徴とする癌に罹患しており、詳細には、そのような癌に罹患しており、その治療のために医薬品をスクリーニング及び／又はバリデートすることとなる。例えば、非小細胞肺癌のための医薬品をスクリーニング及び／又はバリデートすることとなる場合、その（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞は、特に、非小細胞肺癌に罹患している、すなわち、例えば、ＫＲＡＳ活性増加及び／又は発現レベル増加を有すると思われる。
本明細書において用いる場合の用語「トランスジェニック非ヒト動物」又は「トランスジェニック細胞」は、対応する野生型動物／細胞の遺伝物質とは異なる遺伝物質を含む、ヒトではない、非ヒト動物又は細胞を指す。この文脈での「遺伝物質」は、任意の種類の核酸分子、又はその類似体、例えば、本明細書において定義するとおりの核酸分子又はその類似体であり得る。この文脈での「異なる」は、野生型動物／細胞のゲノムを基準にして追加の若しくはより少ない遺伝物質、及び／又は再配列遺伝物質、すなわち、野生型動物／細胞のゲノムを基準にしてゲノムの異なる遺伝子座に存在する遺伝物質を意味する。トランスジェニック細胞／動物を産生するために用いられる異なる発現系の例の概要は、例えば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516 に、Bitter et al.(Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)に、及びSawers et al.(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9）、Billman-Jacobe（Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al.,(Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれている。
好ましい実施形態において、（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞は、哺乳動物である又は哺乳動物から採取される。（トランスジェニック）非ヒト動物又は採取される（トランスジェニック）細胞の非限定的な例は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びショウジョウバエからなる群より選択される。
好ましくは、本発明による（トランスジェニック）細胞は、動物細胞、例えば、非ヒト動物細胞であり得る。しかし、ヒト細胞も本発明に関連して細胞として利用することが考えられる。非限定的な例では、そのような細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、特に、例えばマウス又はラットＥＳ細胞のような、非ヒト動物ＥＳである場合がある。本明細書に記載するような（トランスジェニック）細胞、特にＥＳ細胞を、本明細書に記載するような（トランスジェニック）非ヒト動物を産生するために使用することもできる。トランスジェニック動物を産生するためのＥＳ細胞技術は、当分野において周知であり、例えば、Pirity(Methods Cell Biol, 1998,57:279)に記載されている。
一般に、前記（トランスジェニック）細胞は、原核細胞である場合もあり、または真核細胞であり得る。例えば、前記（トランスジェニック）細胞は、細菌、酵母、真菌、植物又は動物細胞であり得る。一般に、核酸構築物又はベクターでの細胞の形質転換又は遺伝子操作は、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press. Cold Spring Harbor, NY, USA；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990 に記載されているような、標準的な方法によって行うことができる。
本発明に関連して記載する又は定義するような（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞は、本明細書において定義する及び本明細書に記載するような癌の治療用の医薬品のスクリーニング及び／又はバリデーションのための方法に、特に有用である。
これらのスクリーニング法は、詳細には、例えば、本明細書に記載するような（トランスジェニック）動物（例えば、ラット、マウス及びこれらに類するもの）、及び／又はＫＲＡＳ遺伝子の並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異を特徴とする細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を含む動物を使用して、インビボで行うことができる。前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、例えば、ＫＲＡＳ遺伝子の並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異を特徴とする腫瘍細胞（１つ又はそれ以上）／腫瘍（１つ又はそれ以上）から得る、又は採取することができる。詳細には、前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）は、ＫＲＡＳ遺伝子の並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの突然変異を特徴とする癌に罹患している被験者／患者から得ることができる。本明細書に記載する例示的癌は、とりわけ、非小細胞肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌及び白血病である。これらのインビボスクリーニング法は、詳細には、例えば本明細書において上で説明した（トランスジェニック）動物における、腫瘍容積の差の測定及び判定を含む。
従って、本発明は、癌の治療用の医薬品のそのようなスクリーニング及び／又はバリデーション方法にも関する。前記方法は、
ａ）本明細書において定義するとおりの（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞に、スクリーニング／バリデートする前記医薬品を投与する段階；
ｂ）本発明に従って、前記動物又は細胞（からのサンプル）において、ＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルを判定する段階；
ｃ）スクリーニングする前記医薬品を投与していない、本明細書において定義するとおりの対照（トランスジェニック）非ヒト動物又は（トランスジェニック）細胞（からのサンプル）において判定した、ＫＲＡＳの基準活性又は基準発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルと、ｂ）において判定した活性又は発現レベルを比較する段階；および
ｄ）前記活性又は発現レベル、すなわち、ｂ）において判定したＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルが、ｃ）において判定した前記基準発現レベル又は基準活性と異なるときの前記医薬品を選択する段階、を含む。
例えば「マーカー遺伝子」、「療法／治療」、「効力」、「ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在を特徴とする癌」又はそれに対する「感受性」、「（対照）被験者／患者」、「（トランスジェニック）非ヒト動物」又は「（トランスジェニック）細胞」、「発現レベル」、「基準発現レベル」などに関して、上で提供した対応する定義及び説明が、必要な変更を加えて、ここにあてはまる。特に、「対照被験者／患者」に関して上で提供した関連定義及説明は、必要な変更を加えて、「対照（トランスジェニック）非ヒト動物」又は「（トランスジェニック）細胞」にもあてはまる。
本発明に関連して、「医薬品のスクリーニング及び／又はバリデーション」は、一方で、化合物の所与のセットが、医薬品として機能することができる１つ若しくはそれ以上の化合物（１つ又はそれ以上）を含むかどうか、及び／又は、もう一方で、所与の化合物（１つ又はそれ以上）が、医薬品（１つ又はそれ以上）として機能することができるかどうかを意味する。本発明に関連してスクリーニング及び／又はバリデートする医薬品は、本明細書において定義するとおりの癌の治療、予防及び／又は改善のための医薬品であることを、特に意図している。
当業者は、本発明のこの実施形態を容易に実施することができる。例えば、そうすることによって、スクリーニング及び／又はバリデートする化合物（１つ又はそれ以上）／医薬品（１つ又はそれ以上）を、本明細書に記載する非ヒト（トランスジェニック）動物又は細胞に投与することができ、その後（例えば、本明細書に記載するような癌に対して化合物が作用するために十分な一定の期間の後）、前記動物／細胞の癌又はその症状が改善されるかどうかを分析する。
本発明は、本発明の方法又は使用を実行するためのキットにも関する。好ましい実施形態において、本明細書に記載する方法及び使用の実行に有用な前記キットは、ＫＲＡＳ遺伝子、並びに、場合によってはＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子、の少なくとも１つの突然変異の存在を判定することができるオレゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。
例えば、前記キットは、本明細書において定義するとおりのＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルを特異的に判定するために必要とされる化合物（１つ又はそれ以上）を含むことがある。さらに、本発明は、本発明の方法又は使用を実行するためのキットの作製のための、本明細書において定義するとおりのＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベルを特異的に判定するために必要とされる化合物（１つ又はそれ以上）の使用にも関する。本発明の教示に基づいて、当業者は、本明細書において定義するとおりのＫＲＡＳの活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ活性又は発現レベルを特異的に判定するためにどの化合物（１つ又はそれ以上）が必要とされるかがわかる。例えば、そのような化合物は、例えば、本明細書において上で定義したとおりの「結合分子（１つ又はそれ以上）」のような、「結合分子（１つ又はそれ以上）」である場合がある。詳細には、そのような化合物（１つ又はそれ以上）は、本明細書に記載するような少なくとも１つのマーカー遺伝子又はその産物に対して特異的な（ヌクレオチド）プローブ（１つ又はそれ以上）、プライマー（ペア）（１つ又はそれ以上）、抗体（１つ又はそれ以上）及び／又はアプタマー（１つ又はそれ以上）である場合がある。好ましい実施形態において、本発明の（本発明に関連して作製される）キットは、診断キットである。
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明又は本発明の方法及び使用の（本発明又は本発明の方法及び使用に関連して作製される）キットは、取扱説明書（１冊又はそれ以上）をさらに含む又備えていることがある。例えば、前記取扱説明書（１冊又はそれ以上）は、当業者が、本発明に従って、ＫＲＡＳの、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦの、（基準）活性又は（基準）発現レベルを判定するように誘導する（判定の仕方を当業者に教える）、すなわち、本明細書に記載する癌若しくはそれに対する感受性を診断するように誘導する（診断の仕方を当業者に教える）、前記癌の治療の効力若しくはそれに対する感受性を監視するように誘導する（監視の仕方を当業者に教える）又は前記癌の治療の効力若しくはそれに対する感受性を診断するように誘導する（診断の仕方を教える）ことができる。詳細には、前記取扱説明（１冊又はそれ以上）書は、本明細書に提供する方法又は仕様を用いる又は適用するためのガイダンスを含み得る。
本発明の（本発明に関連して作製される）キットは、本発明の方法及び使用を実行するために適する／必要とされる物質／化学薬品及び／又は器具をさらに含み得る。例えば、そのような物質／化学薬品及び／又は器具は、ＫＲＡＳの活性又は発現レベル、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ活性又は発現レベル、の特異的判定に必要とされる化合物（１つ又はそれ以上）を安定させる及び／又は保存するための溶媒、希釈剤及び／又は緩衝剤である。
１つの実施形態において、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療、治療の改善及び／又は予防のための医薬組成物を調製するための、本明細書において上で定義したとおりのＨＳＰ９０阻害剤の使用に関する。或いは、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療、改善及び／又は予防の際に使用するための、本明細書において定義するとおりのＨＳＰ９０阻害剤に関することもある。従って、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌を予防、治療又は改善するための方法に関し、この方法は、そのような予防、治療又は改善が必要な被験者に、本明細書において上で定義したとおりのＨＳＰ９０阻害剤の有効量を投与することを含む。好ましくは、そのような予防、治療又は改善が必要な被験者は、ヒトである。
前記医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、その医薬組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を考慮に入れて、良好な医療行為に見合ったやり方で調合および投薬されるであろう。従って、本明細書における趣旨のための医薬組成物の「有効量」は、そのような考慮事項によって決められる。
個体に投与される医薬組成物の有効量が、とりわけ、その化合物の性質に依存することは、当業者には公知である。例えば、前記化合物が、本明細書において上で説明したようなＨＳＰ９０阻害剤である場合、非経口投与する前記医薬組成物の１回分あたりの全医薬有効量は、患者の体重に対して、１μｇ ＨＳＰ９０阻害剤／ｋｇ／日から１０ｍｇ ＨＳＰ９０阻害剤／ｋｇ／日であるだろうが、上で述べたように、これは、治療上の自由裁量にゆだねられる。さらに好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ ＨＳＰ９０阻害剤／ｋｇ／日、及び最も好ましくは、ヒトについては、約０．０１ｍｇ ＨＳＰ９０阻害剤／ｋｇ／日と１０ｍｇ ＨＳＰ９０阻害剤／ｋｇ／日の間である。継続的に与える場合、概して、１日１〜４回の注射により、又は例えばミニポンプを使用する、持続皮下注入により、約１μｇ／ｋｇ／時から約５０μｇ／ｋｇ／時の投薬速度で前記医薬組成物を投与する。静注バッグ溶液を利用することもできる。変化を観察するために必要な治療の長さ及び応答が発生する治療後の間隔は、所望される効果によって変わるようである。当業者に周知である従来の試験によって個々の量を決定することができる。
本発明の医薬組成物は、経口投与、直腸内投与、非経口投与、槽内投与、膣内投与、腹腔内投与、局所（例えば、粉末、軟膏、滴剤又は経皮パッチによって）投与、口腔内投与、又は経口若しくは鼻スプレー剤として投与することができる。
本発明の医薬組成物は、好ましくは、医薬的に許容される担体を含む。「医薬的に許容される担体」とは、任意のタイプの非毒性の固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材又は調合助剤を意味する。本明細書において用いる場合の用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む投与方式を指す。
前記医薬組成物は、徐放システムによっても適切に投与される。徐放組成物の適する例としては、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセル、の形態の半透性ポリマー材料が挙げられる。徐放マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー(Sidman, U. et al., Bipolymers 22:547-556 (1983))、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）(R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)、及び R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982))、エチレンビニルアセタート(R. Langer et al., Id.)又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）が挙げられる。徐放医薬組成物としては、リポソームに捕捉された化合物も挙げられる。前記医薬組成物を含有するリポソームは、それ自体公知である方法によって調製することができる：ＤＥ ３，２１８，１２１；Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980)；欧州特許第５２，３２２号明細書；欧州特許第３６，６７６号明細書；欧州特許第８８，０４６号明細書；欧州特許第１４３，９４９号明細書；欧州特許第１４２，６４１号明細書；特願昭５８−１１８００８(Japanese Pat. Appl. 83-118008)；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；並びに欧州特許第１０２，３２４号明細書。通常、リポソームは、脂質内容物が約３０ｍｏｌパーセントより多いコレステロールであり、最適に治療できるようにこの選択比率を調節する、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層タイプのものである。
非経口投与のために、一般に、前記医薬組成物は、医薬的に許容される担体、すなわち、利用する用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、その調合物の他の成分と相溶性であるもの、を用いて、所望の純度で単位用量注射用形態（溶液、懸濁液又はエマルジョン）に調合される。
一般に、前記調合物は、前記医薬組成物の成分を液体担体若しくは微粉固体担体又は両方と均一且つ均質に接触させることによって調製される。その後、必要な場合には、その生成物を所望の調合物に成形する。好ましくは、前記担体は、非経口担体、さらに好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体ビヒクルの例としては、水、食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液が挙げられる。リポソームばかりでなく、固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルもここでは有用である。担体は、少量の添加剤、例えば、等張性及び化学的安定性を増す物質を適切に含有する。そのような材料は、利用する用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、及びそのような材料としては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸及び他の有機酸若しくはそれらの塩；抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）（ポリ）ペプチド、例えば、ポリアルギニン若しくはトリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（セルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトール若しくはソルビトール；対イオン、例えば、ナトリウム；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー又はＥＰＧが挙げられる。
治療的投与に用いられる医薬組成物の成分は、滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２マイクロメートル膜）による濾過によって容易に果たされる。一般に、前記医薬組成物の治療成分を、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する静注溶液バッグ又はバイアルに入れる。
通常、前記医薬組成物の成分を単回又は多回用量容器、例えば密封アンプル又はバイアルに、水溶液として又は再構成用の凍結乾燥調合物として保管することとなる。凍結乾燥調合物の一例として、１０ｍＬバイアルに５ｍＬの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）水溶液を充填し、得られた混合物を凍結乾燥させる。静菌性注射用蒸留水を使用してその（それらの）凍結乾燥化合物（１つ又はそれ以上）を再構成することによって、輸液を調製する。
本発明は、Ａ４２７、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、Ｈ１２９９、Ｈ１３５５、Ｈ１３９５、Ｈ１４３７、Ｈ１５６３、Ｈ１５６８、Ｈ１６４８、Ｈ１６５０、Ｈ１６６６、Ｈ１７３４、Ｈ１７５５、Ｈ１７７０、Ｈ１７８１、Ｈ１７９２、Ｈ１８１９、Ｈ１８３８、Ｈ１９１５、Ｈ１９４４、Ｈ１９７５、Ｈ１９９３、Ｈ２００９、Ｈ２０３０、Ｈ２０５２、Ｈ２０８７、Ｈ２１１０、Ｈ２１２２、Ｈ２１２６、Ｈ２１７２、Ｈ２２２８、Ｈ２３、Ｈ２３４７、Ｈ２４４４、Ｈ２８、Ｈ３５８、Ｈ４４１、Ｈ４６０、Ｈ５２０、Ｈ５２２、Ｈ５９６、Ｈ６４７、Ｈ６６１、Ｈ８２０、ＨＣＣ２９３５、ＨＣＣ４００６、ＨＣＣ８２７、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＫＶＸ、Ｈ３２２Ｍ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、Ｃｏｌｏ６９９、ＤＶ−９０、ＨＣＣ１５、ＨＣＣ３６６、ＨＣＣ４４、ＨＣＣ７８、ＬＣＬＣ１０３Ｈ、ＬＣＬＣ９７ＴＭ１及びＬｏｕＮＨ９１からなる群より選択されるより選択される細胞株の組み合わせにも関する。
細胞株のこれらの組み合わせは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０の、本明細書において上で提供したような細胞株を含むはずである。詳細には、細胞株の前記組み合わせは、少なくとも６０の、本明細書において上で提供したような細胞株を含むはずである。これらの細胞株、及び特にそれらの組み合わせは、任意の起こりうる薬物感受性の評定のためのモデル系として特に有用である。薬物感受性の評定のためのこれらの特に選択した細胞株（組み合わせで）のこの有用性を、付属の実施例において立証する。当業者又は一般の人々は、図１９に例示するような細胞受託機関、特に、ＡＴＣＣ又はＤＭＳＺから、上述の細胞株のすべてを入手することができる（これらの細胞についての対応するアクセッション番号も図１９に提供する）。
薬物、特にＨＳＰ９０阻害剤、に対する感受性を予測するための、本明細書において上で定義したとおりの細胞株の組み合わせの使用も、本明細書に開示する。細胞株の前記組み合わせは、薬物、特にＨＳＰ９０阻害剤、に対する感受性の予測、又は薬物、特にＨＳＰ９０阻害剤、での治療に対する（哺乳動物）腫瘍細胞の応答の予測に有用である。患者が、薬物、特にＨＳＰ９０阻害剤、に対して応答する可能性が高いかどうか、又は感度が高いかどうかを予測する際にも有用である。感受性／応答性及びこれらに類するものを予測するための対応する手段及び方法は、当分野において周知であり、本明細書においても上で説明した。従って、当業者は、これに関連してそのような細胞株の組み合わせをどのように使用するかがわかるだろう。
以下の非限定的な図及び実施例への参照により、本発明をさらに説明する。
要約すると、本発明は、本明細書において詳細に説明する及びまた添付の特許請求の範囲に反映される、以下の項目に関する：
１．ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を有する細胞、組織又は細胞培養物を選択する方法であって、
（ａ）前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定する段階；及び
（ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する段階
を含む方法。
２．（ｉ）前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）とＨＳＰ９０阻害剤を接触させる段階；及び
（ｉｉ）ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）の生存度を評価する段階
をさらに含む、項目１に記載の方法。
３．ＨＳＰ９０阻害剤を用いた治療に対する哺乳動物腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を判定するための方法であって、前記腫瘍細胞中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定することを含み、前記活性化突然変異が、その細胞がその治療に対して応答する可能性が高いかどうか、又は応答するかどうかを示すことを特徴とする方法。
４．加えて、及び／又は場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の活性化突然変異も判定する、項目１から３のいずれかに記載の方法。
５．ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答者又は感度の高い患者を同定するためのインビトロ法であって、該方法は、次の段階：
（ａ）ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌に罹患している疑いのある又は罹患しやすい患者からサンプルを得る段階；及び
（ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を評価する段階
を含み；
単独での、又はＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ遺伝子の活性化突然変異に加えての、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異が、ＨＳＰ９０阻害剤に対し応答する患者を示唆する又はＨＳＰ９０阻害剤に対する前記患者の感度を示唆することを特徴とする方法。
６．前記ＨＳＰ９０阻害剤が、ゲルダナマイシン又はその誘導体である、項目１から５のいずれかに記載の方法。
７．前記ゲルダナマイシン誘導体が、１７−ＡＡＧ又はＩＰＩ−５０４である、項目６に記載の方法。
８．前記ＨＳＰ９０阻害剤が、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２である、項目１から５のいずれかに記載の方法。
９．ＫＲＡＳ遺伝子の前記突然変異が、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ及びＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆからなる群より選択される、項目１から８のいずれかに記載の方法。
１０．ＥＧＦＲ遺伝子の前記突然変異が、ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１＞ＡＧＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＮ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｇ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｈ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｋ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｖ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｔ７５１Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｉ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｓ７５２Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｓ７５２Ｄ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７Ｉ９Ｓ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＞ＮＰＹ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ，Ａ７５０Ｐ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｐ７５３Ｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｑ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｔ７５０ｄｅｌ，Ｐ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｔ７５１ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ＿Ｍ７６６＿Ａ７６７ｉｎｓＡＩ；ＥＧＦＲ＿Ｐ７７２＿Ｈ７７３ｉｎｓＶ；ＥＧＦＲ＿Ｓ７５２＿Ｉ７５９ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｓ７６８Ｉ；ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ＿Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ；ＥＧＦＲ＿Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ；及びＥＧＦＲ＿Ｖ７７４＿Ｃ７７５ｉｎｓＨＶからなる群より選択される、項目４から９のいずれかに記載の方法。
１１．ＢＲＡＦ遺伝子の前記突然変異が、ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｇ、ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｆ４６８Ｃ、ＢＲＡＦ＿Ｆ５９５Ｌ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ａ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ａ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｓ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ５９６Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｎ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｑ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｓ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｔ５９９Ｉ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｌ、及びＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｒからなる群より選択される、項目４から１０のいずれかに記載の方法。
１２．ＫＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ及び／又はＢＦＡＲ遺伝子の前記突然変異が、ＳＳＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、シークエンシング、ＨＰＬＣ又は質量分析遺伝子型判定法によって検出される、項目４から１１のいずれかに記載の方法。
１３．前記サンプルが、癌に罹患している疑いのある又は癌に罹患しやすい患者から得られる、項目５から１２のいずれかに記載の方法。
１４．項目６から８のいずれかに記載のＨＳＰ９０阻害剤に対する感度を診断するための、ＫＲＡＳ遺伝子の並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異のうちの活性化突然変異（１つ又はそれ以上）を検出することができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用。
１５．前記オレゴヌクレオチドが、約１５から１００ヌクレオチドの長さである、項目１４に記載の使用。
１６．ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の効力を、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者において監視する方法であって、
ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織において、ＫＲＡＳの発現又は活性、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲの活性化若しくは発現レベル及び／又はＢＲＡＦの発現若しくは活性化を判定する段階；及び
ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性を、ＫＲＡＳの基準若しくは対照発現レベル又は基準若しくは対照活性と、並びに、場合によってはＥＧＦＲの基準若しくは対照発現レベルと、及び／又はＢＲＡＦの基準若しくは対照発現レベルと、比較する段階
を含み、ａ）において判定した前記活性又は発現レベルと前記基準発現レベル又は基準活性との差の程度が、前記癌の治療の前記効力を示唆することを特徴とする方法。
１７．ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者に対する、効力を予測する方法であって、
ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦからなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性化又は発現レベルを判定する段階；及び
ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性を、対照被験者／患者（応答者及び／又は非応答者）から得た細胞又は組織サンプルにおいて場合によっては判定した、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の基準活性又は基準発現レベルと比較する段階
を含み、
ａ）において判定した前記活性又は発現レベルと、前記基準若しくは対照活性又は前記基準若しくは対照発現レベルとの差の程度が、癌の治療の予測効力を示唆することを特徴とする方法。
１８．ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の前記治療が、項目６から８のいずれかに記載のＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む、項目１６又は１７に記載の方法。
１９．ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌を治療するための医薬品をスクリーニング及び／又はバリデーションするための、ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異を有する（トランスジェニック）細胞又は（トランスジェニック）非ヒト動物の使用。
２０．前記癌が、小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃腸癌（胃及び食道癌を含む）、腎細胞癌、尿路癌腫、白血病、前立腺癌、リンパ腫、黒色腫、脳腫瘍、小児腫瘍及び肉腫からなる群より選択される、項目５から１９のいずれかに記載の方法。
２１．ＫＲＡＳ遺伝子、並びに、場合によっては、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子、の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定することができるオレゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、項目１から１２、１６、１７及び２０のいずれかに記載の方法を行うために有用なキット。
２２．ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療、治療の改善及び／又は予防のための医薬組成物を調製するための、項目６から８のいずれかに記載のＨＳＰ９０阻害剤の使用。
２３．ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療、改善及び／又は予防に使用するための、項目６から８のいずれかに記載のＨＳＰ９０阻害剤。
２４．Ａ４２７、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、Ｈ１２９９、Ｈ１３５５、Ｈ１３９５、Ｈ１４３７、Ｈ１５６３、Ｈ１５６８、Ｈ１６４８、Ｈ１６５０、Ｈ１６６６、Ｈ１７３４、Ｈ１７５５、Ｈ１７７０、Ｈ１７８１、Ｈ１７９２、Ｈ１８１９、Ｈ１８３８、Ｈ１９１５、Ｈ１９４４、Ｈ１９７５、Ｈ１９９３、Ｈ２００９、Ｈ２０３０、Ｈ２０５２、Ｈ２０８７、Ｈ２１１０、Ｈ２１２２、Ｈ２１２６、Ｈ２１７２、Ｈ２２２８、Ｈ２３、Ｈ２３４７、Ｈ２４４４、Ｈ２８、Ｈ３５８、Ｈ４４１、Ｈ４６０、Ｈ５２０、Ｈ５２２、Ｈ５９６、Ｈ６４７、Ｈ６６１、Ｈ８２０、ＨＣＣ２９３５、ＨＣＣ４００６、ＨＣＣ８２７、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＫＶＸ、Ｈ３２２Ｍ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、Ｃｏｌｏ６９９、ＤＶ−９０、ＨＣＣ１５、ＨＣＣ３６６、ＨＣＣ４４、ＨＣＣ７８、ＬＣＬＣ１０３Ｈ、ＬＣＬＣ９７ＴＭ１及びＬｏｕＮＨ９１からなる群より選択される細胞株の組み合わせ。
２５．薬物に対する感受性を予測するための、項目２４に記載の細胞株の組み合わせの使用。
２６．前記薬物が、ＨＳＰ９０阻害剤である、項目２５に記載の使用。
図面の説明
［図１］ＮＳＣＬＣ細胞株コレクションを示す図である。
供給者及び形態の詳細を含む、この研究において使用したＮＳＣＬＣ細胞株コレクションの概要。
［図２］肺癌における有意な損傷を示す図である。
細胞株パネル及び原発性肺癌パネルにおけるＧＩＳＴＩＣによって定義するような有意なコピー数改変を有する領域の概要。

［図３］８４のＮＳＣＬＣ細胞株のゲノムバリデーションを示す図である。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株の染色体コピー数変化を３７１の原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍のものに対してプロットする。それぞれの改変についての偽陽性発見率(false discovery rate)のｑ値（ｘ軸）をそれぞれのゲノム位置（ｙ軸）にプロットする。図３Ａ１、染色体消失（細胞株、灰色；原発性腫瘍、黒色）；図３Ａ２右パネル、染色体獲得（細胞株、灰色曲線；原発性腫瘍、黒色曲線）。偶数染色体に対応するゲノム位置に影をつける；点線は、動原体を示す；淡灰色線、有意性についてのｑ値カットオフ（０．２５）。太字で記す遺伝子は、肺腺癌の突然変異の公知ターゲットを表す。ピーク付近の推定ターゲットを括弧の中に与える。ピーク境界検出についてのストリンジェントなフィルタリング基準を用いてＧＩＳＴＩＣによって同定した遺伝子にアスタリスクを付ける。（Ｂ）原発性肺腫瘍（空白バー）(Aviel-Ronen et al., 2006；Bamford et al., 2004；Sharma et al., 2007；Thomas et al., 2007）と比較してＮＳＣＬＣ細胞株（黒色バー）に存在する癌遺伝子突然変異をそれらの相対頻度に従ってプロットする。（Ｃ）クラスタの距離測定及び群平均法のような、ＧＩＳＴＩＣ及び相互共起率を用いる癌遺伝子突然変異によって定義された有意な損傷の階層的クラスタリング。クラスタの距離は、枝の長さに反映される。ＥＧＦＲ及びＫＲＡＳの突然変異が互いに排反する様式で発生する一方で、ＥＧＦＲ突然変異及び増幅が同じクラスタ内で見出されることに留意すること。（Ｄ）腎初代組織（灰色）及び細胞株（黒色）；肺癌初代組織（濃灰色）及び細胞株（淡黒色）；リンパ腫初代組織（淡黒色）及びリンパ腫細胞株（淡灰色）からの転写プロフィールを、階層的クラスタリングによって分析した。ノイズを減少させるために、クラスタリング前にプローブセットをフィルタリングした（１．０〜１０．０の変動係数、陽性シグナル率(present call rate)２０％；＞２０％のサンプルにおける絶対発現＞１００）。
［図４］神経膠腫、黒色腫及び肺癌における異常のプロフィールを示す図である。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株の染色体コピー数変化を原発性神経膠腫のものに対してプロットする。欠失（左パネル、黒色でＮＳＣＬＣ細胞株、灰色で神経膠腫）及び増幅（右パネル、淡黒色でＮＳＣＬＣ細胞株、濃灰色で神経膠腫）について２つの別々の図を与える。（Ｂ）ＮＳＣＬＣ細胞株の染色体コピー数変化を原発性黒色腫のものに対してプロットする（上のようにそれぞれ赤色、青色でＮＳＣＬＣ細胞株、紫色で黒色腫短期培養物）。（Ｃ）ＮＳＣＬＣ細胞株と、表示した癌エンティティ原発性肺癌、卵巣癌、神経膠腫、黒色腫細胞サンプル、正常組織及びランダムに分割したＮＳＣＬＣ細胞株サブセットとの間のそれぞれのＳＮＰについてのＧＩＳＴＩＣのｑ値の相関をコンピュータ計算することによってゲノム類似性を分析した。
［図５］突然変異ＥＧＦＲ肺癌細胞のインビトロでの表現型特性の頑強性を示す図である。（Ａ）主成分分析によって測定したところ、ＥＧＦＲ突然変異は遺伝子発現の相当な変化を誘導する。最初の２つの主成分は、突然変異（ｍｔ）ＥＧＦＲを有する細胞株（白色四角）とＥＧＦＲ（ｗｔ）を有する細胞株（黒色の点）を明確に区別する（ＰＣ；合計５４；最初の２つの主成分の累積分散＝２４．１：％；ｌｏｇ１０｜固有ベクトル｜を与える）。（Ｂ）ＥＧＦＲ突然変異細胞株のシグネチャー（倍率変化＞２；絶対差＞ＦＣ２；１００、ｐ＜０．０１）を、ＥＧＦＲ突然変異の存在（ＥＧＦＲ ｍｔ）又は不在（ＥＧＦＲ ｗｔ）について注釈が施されている１２３の原発性腺癌(Bhattacharjee et al., 2001)の階層的クラスタリングに用いた。すべてのＥＧＦＲ−突然変異体サンプルが１つのクラスタに分類された。（Ｃ）細胞株パネルの中でＥＧＦＲ突然変異（ｍｔ）細胞株とＥＧＦＲ野生型（ｗｔ）細胞株の間で差次的に発現されることが確認されたＲＮＡ転写産物を用いて、ＥＧＦＲ突然変異状態がわかっている１２３すべての原発性腺癌を分類した。ＥＧＦＲ突然変異体腫瘍を生存分析から除外した。（Ｄ）遺伝子損傷の存在（増幅、緑色；突然変異、赤色；欠失、黄色）とエルロチニブ感度の間の関連性をｔ検定及びフィッシャの正確確率検定によって分析した。一般的なｐ値調節方法を適用した場合、ＥＧＦＲ突然変異及び増幅だけが統計的に有意と考えることができる。
［図６］原発性腫瘍の表現型特性が、エルロチニブに対する感度の高い肺癌細胞において保存されることを示す図である。（Ａ）エルロチニブに耐性のＮＳＣＬＣ細胞株に対してエルロチニブに対する感度の高い細胞株において有意に発現されると確認された遺伝子を用いて、原発性肺腺癌の階層的クラスタリングを行った。白色バーは、ＥＧＦＲ−突然変異体腫瘍を表す。（Ｂ）Choi et al PLoS ONE 2: e1226 (2007) によって発表されたＥＧＦＲ突然変異シグネチャーを用いて、原発性肺腺癌の階層的クラスタリングを行った。赤色バーは、ＥＧＦＲ−突然変異体腫瘍を表す。
［図７］スクリーニングされた化合物についての生感度データを示す図である。各細胞株及び各化合物についての死滅曲線下のそれぞれのプレイメージのスクリーニング及び分析に基づくハイスループット細胞株から導出した半最大阻害濃度（ＩＣ５０値；［μＭ］）に関する概要。
［図８］多重損傷感度予測因子を示す図である。ＫＮＮ法、フィッシャの正確確率検定及びｔ−検定で試験した多重損傷感度予測因子を表示する。２つの異なるＧＬＡＤ閾値について有意な予測因子のみを表示する。
［図９］スクリーニングにおいて用いた化合物の特性表示を示す図である。スクリーニング実験に用いたすべての化合物についての化学構造、開発段階及び主な公知ターゲットを表示する。
［図１０］ハイスループット細胞株スクリーニングによって判定した化合物の感度プロフィールを示す図である。１１の化合物についての半最大阻害濃度（ｙ軸；ＩＣ５０値）を、ＮＳＣＬＣ細胞株の全コレクション（個々の細胞株、ｘ軸）について示す。ラパマイシンは、細胞増殖を完全に阻止できない(O'Reilly et al., 2006)ことから、この化合物については２５％阻害濃度を示す。バーは、感度に従ってランク付けした細胞株コレクション（ｘ軸）全体にわたってそれぞれＩＣ５０、ＩＣ２５値（ｙ軸）を表す。最大濃度を耐性細胞株についてそれぞれＩＣ５０、ＩＣ２４値に割り当てる（１７−ＡＡＧ、エルロチニブ、バンデタニブ、スニチニブ及びＰＤ１６８３９３については１０μＭ、ＳＵ−１１２７４及びダサチニブについては３０μＭ、ＶＸ−６８０については６０μＭ、プルバラノール及びＵＯ１２６については９０μＭ）。
［図１１］化合物活性の階層的クラスタリングが突然変異ＥＧＦＲをダサチニブ活性についてのターゲットとして暴露することを示す図である。（Ａ）すべての化合物（ｘ軸）及びすべての細胞株（ｙ軸）について対数変換及びそれぞれのプロフィールの平均値での正規化後のＩＣ５０値（赤−高化合物活性；白色−低化合物活性）を表示する。関連損傷の存在（黒色の点）又は不在（灰色の点）を右のパネルに注釈する。ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ突然変異サンプルが最高感度を示す、特異なサブクラスタを構成する。（Ｂ）染色体獲得（ａｍｐ）及び消失（ｄｅｌ）に対する対数変換後のＩＣ５０値の相関係数（ｒ２；赤色−高い相関；白色−低い相関）ならびに癌遺伝子突然変異（ｍｕｔ）；ＧＩＳＴＩＣによって定義された領域内のコピー数変化を二分し、２進突然変異データとマージした。ＧＩＳＴＩＣによって定義された領域の内部（＃）の及び該領域に接している（＊）推定ターゲット遺伝子を注釈する。この場合もやはり、ＥＧＦＲ阻害剤は別のクラスタに分類される。（Ｃ）上のパネル：野生型ＥＧＦＲへのエルロチニブ（灰色の棒）の結晶学により判定した結合方式。白色から濃灰色の球棒として表されるダサチニブを組み込んでＥＧＦＲのＡＴＰ結合部位のモデルを作った。下のパネル： 患者における二次的ＥＧＦＲ阻害剤耐性に関連した、ＡＴＰポケットのゲートキーパー位置でのＴ７９０Ｍ突然変異が、キナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットからエルロチニブとダサチニブの両方をはずす。（Ｄ）上のパネル：突然変異体（ｄｅｌ Ｅｘ１９又はＥｘ１９／Ｔ７９０Ｍ）ＥＧＦＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、表示濃度のダサチニブ又はエルロチニブのいずれかで１２時間治療し、全細胞溶解産物をホスホ−ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲについて免疫ブロットした。下のパネル：ダサチニブ又はエルロチニブのいずれかでの９６時間の治療後の用量依存性成長阻害を細胞ＡＴＰ含量の測定により評定した。
［図１２］バンデタニブ活性についてのターゲットとしての突然変異ＥＧＦＲを示す図である。（Ａ）左パネル：球棒として表されるバンデタニブを組み込んで、ＥＧＦＲのＡＴＰ結合部位のモデルをＲＥＴキナーゼとのその結晶学的に判定した結合方式に基づいて作った。右パネル：患者における二次的なＥＧＦＲ阻害剤耐性に関連した、ＡＴＰポケットのゲートキーパー位置でのＴ７９０Ｍ突然変異が、ＡＴＰ結合ポケットからその薬物をはずす。球棒として、エルロチニブの結晶学により判定した結合方式を、参考のために両方のパネルにオーバーレイとして示す。（Ｂ）突然変異体（ｄｅｌ Ｅｘ１９又はＥｘ１９／Ｔ７９０Ｍ）ＥＧＦＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、示されている濃度のバンデタニブ又はエルロチニブのいずれかで１２時間治療し、全細胞溶解産物をホスホ−ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲについて免疫ブロットした。（Ｃ）ダサチニブ又はエルロチニブのいずれかでの９６時間の治療後の用量依存性成長阻害を細胞ＡＴＰ含量の測定により評定した。
［図１３］１７−ＡＡＧ、ＵＯ１２６及びダサチニブの活性についての損傷に基づく予測を示す図である。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株コレクション及びＮＣＩ−６０細胞株パネルにおける１７−ＡＡＧ−感度プロフィール（ＩＣ５０値）全体にわたってのＫＲＡＳ突然変異（黒色の柱）の分布。ＫＲＡＳ突然変異の発生率及び１７−ＡＡＧの対する感度を、両方のデータセットについてのフィッシャの正確確率検定によって表す。（Ｂ）異なる濃度の１７ＡＡＧで治療したＫＲＡＳ野生型（ｗｔ）及びＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｃ）細胞株の溶解産物を、ｃ−ＲＡＦ、ＫＲＡＳ、サイクリンＤ１及びＡｋｔについて免疫ブロットした。（Ｃ）ＮＳＣＬＣ細胞株コレクションにおけるＵＯ１２６−感度プロフィール（ＩＣ５０値）及びＮＣＩ−６０細胞株パネルにおけるハイポセマイシン(hypothemycin)−感度プロフィール全体にわたっての１ｑ２１．３でのコピー数増加（黒色の柱）の分布。１ｑ２１．３突然変異の増幅の発生率及び１７−ＡＡＧに対する感度を、両方のデータセットについてのフィッシャの正確確率検定によって表す。（Ｄ）細胞株を、ダサチニブ（ＩＣ５０＜１μＭ；淡灰色）に対するそれらの感度に従ってソートした。ダサチニブに対して著しく、最も感度の高いＮＳＣＬＣ細胞株が、ＳＲＣ及びエフリン(Ephrin)受容体キナーゼファミリーのメンバーについての最大コピー数を有するものの中に見いだされる。
［図１４］ダサチニブ感度のゲノム予測因子を生じさせたターゲット強化感度予測方法のバリデーションを示す図である。すべての細胞株を、エルロチニブ（ＩＣ５０＜１μＭ、灰色バー）に対するそれらの感度に従ってソートした。エルロチニブに対する感度が強化された細胞株が、ＥＧＦＲについての最大コピー数を有するものの中に見いだされる。フィッシャの正確確率検定を用いて決定されたｐ値を示すＥＧＦＲ（濃灰色バー）増幅及びエルロチニブ感度についての分割表を右のパネルに表示する。
［図１５］Huang et al., (2007) によって発表された６遺伝子シグネチャーを使用するダサチニブに対するＮＳＣＬＣ細胞株のクラスタ画像を示す図である。Huang (2007), Cancer Res 67, 2226-2238 によって提案された６遺伝子シグネチャーの予測値を評価するために、０と１による注釈を用いてダサチニブ感度を示す階層的クラスタリングにより、それぞれの遺伝子の発現レベルを分析した。これらの遺伝子全体をとおして類似した発現プロフィールを有するサンプルが同じサブクラスタの中で見いだされる。明るい箇所は、抑制される遺伝子を表し、暗い箇所は、平均ｍＲＮＡ発現レベルと比較して過剰発現される遺伝子を表す。
［図１６］ダサチニブ感度に関連した前立腺／乳癌−遺伝子シグネチャーを示す図である。Huang (2007), Cancer Res 67, 2226-2238 によって提案された遺伝子シグネチャーの予測値を評価するために、０と１による注釈を用いてダサチニブ感度を示す階層的クラスタリングにより、それぞれの遺伝子の発現レベルを分析した。これらの遺伝子全体をとおして類似した発現プロフィールを有するサンプルが同じサブクラスタの中で見いだされる。明るい箇所は、抑制される遺伝子を表し、暗い箇所は、平均ｍＲＮＡ発現レベルと比較して過剰発現される遺伝子を表す。
［図１７］前立腺癌におけるダサチニブ感度に関連したすべての遺伝子を示す図である。Huang (2007), Cancer Res 67, 2226-2238 によって提案された全遺伝子セットのシグネチャーの予測値を評価するために、０と１による注釈を用いてダサチニブ感度を示す階層的クラスタリングによって、それぞれの遺伝子の発現レベルを分析した。これらの遺伝子全体をとおして類似した発現プロフィールを有するサンプルが同じサブクラスタの中で見いだされる。明るい箇所は、抑制される遺伝子を表し、暗い箇所は、平均ｍＲＮＡ発現レベルと比較して過剰発現される遺伝子を表す。
［図１８］ＮＳＣＬＣ細胞株パネルを示す図である。図１８は、最初に試験したＮＳＣＬＣ細胞パネルのリスト、それらのそれぞれのＫＲＡＳ突然変異、及び対応する半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
［図１９］細胞株を示す図である。図１９は、抗癌治療／増殖抑制治療において使用することができる薬物の同定のために本明細書に提供するスクリーニング方法に従って用いることができる１セットの細胞株を示す。
［図２０］ＫＲＡＳ−突然変異体肺癌のトランスジェニックのマウスモデルを示す図である。肺においてＫＲＡＳのＧ１２Ｄ突然変異を特異的に発現するトランスジェニックマウスを、文献(Jackson, E.L. et al., Genes Dev 15:3243-3248 (2001)；Johnson L. et al., Nature, 410(6832):1111-6(2001)及びJi H. et al., Nature. 448(7155):807-10 (2007))に記載されているようにＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＫＲＡＳＧ１２Ｄマウスに対するアデノウイルスＣｒｅリコンビナーゼの鼻腔内適用によって産生させた（上のパネルの左から右）。これらのマウスは、高い浸透度で、致死性肺腺癌を発現する（下のパネルの左から右）。これらの画像を単に例証のためにｃａｌｉｃｒ出版物から取ったことに留意すること。
［図２１］ＨＳＰ９０阻害剤でのＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＫＲＡＳＧ１２Ｄマウスの治療を示す図である。ＫＲＡＳ−突然変異肺腫瘍を有するトランスジェニックマウス（図２０に記載したとおり）を数日間、ＨＳＰ９０阻害剤１７−ＤＭＡＧで治療した。腫瘍容積を磁気共鳴イメージングによって判定し、経胸腔画像（左パネル）として示し、定量した。治療前画像に対する腫瘍容積の変化をパーセントで与える。
本実施例は、本発明を例証するものである。
方法及び結果
細胞
ＡＴＣＣ(www.atcc.org)、ＤＳＭＺ(www.dsmz.de)所有のものから、又は他の細胞コレクションから細胞を得た。すべての細胞株の詳細を図１に列挙する。これは、供給者及び培養条件に関する情報も含む。細胞を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ(www.cambrex.com)によりマイコプラズマでの感染に関して常例的に管理し、感染した場合には、以前に発表されたプロトコル(Uphoff and Drexler, 2005)に従って抗生物質で治療した。
ＳＮＰアレイ
ＰｕｒｅＧｅｎｅキット(www.gentra.com)を使用して細胞株からゲノムＤＮＡを抽出し、５．２ｋｂのマーカー間距離中央値（平均１２．２ｋｂ；www.affymetrix.com）を有する、Ｙを除くすべての染色体に関して２３８，０００のＳＮＰ遺伝子座を問い合わせる高密度オリゴヌクレオチドアレイ（カリフォルニア州、サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズした。製造業者の説示に従って、アレイ実験を行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ソフトウェアによってＳＮＰの遺伝子型を判定した。Ｔｕｍｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ（http://www.genome.gov/cancersequencing/）から初代サンプルのＳＮＰアレイデータを得た。本発明者らは、癌における有意なターゲットのゲノム同定(Genomic Identification of Significant Targets in Cancer：ＧＩＳＴＩＣ)(Beroukhim et al., 2007)のための新規で一般的な方法を利用して、データセットを分析した。コピー数変化の出現率及び幅（ＬＯＨの場合は出現率のみ）の統合的な測度に従ってそれぞれのゲノムマーカーにスコアをつけ、バックグラウンド異常率のみから予測した結果との比較によってそれぞれのスコアの統計学的有意性を評定する。２つの異なるコピー数閾値を用いてＧＩＳＴＩＣアルゴリズムを実行して、コピー数４（ＧＬＡＤ閾値１．０）及びコピー数２．１４（ＧＬＡＤ閾値０．１）でＤＮＡの獲得及び消失分析(Gain and Loss Analysis of DNA：ＧＬＡＤ)セグメンテーションアルゴリズム(Hupe et al., 2004)を用いてＳＮＰ全体にわたってゲノムセグメントを指定した。
ホモ接合欠失の検出
ホモ接合欠失の同定のために、ＳＮＰデータを＜０．５のコピー数減少を示す５つのコーヒレントＳＮＰについてフィルターした。完全染色体アームを除外して、局所的消失に分析の焦点を合せた。ホモ接合欠失領域に位置する遺伝子についての情報は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校(University of California, Santa Cruz)(http://genome.ucsc.edu)からのヒトゲノム配列のｈｇ１７ビルド(build)に基づくものであった。
共起損傷の分析
個々の損傷の予想共起頻度に対する実測共起頻度の比率をコンピュータ計算することによって分析を行った。群平均法での距離測定のような相互共起率を用いる、定量的コピー数変化の二分化バージョンに組み合わせた突然変異データの階層的クラスタリングを行った。コピー数損傷の発生についての適切な閾値は、その特定の損傷についてのコピー数変化の総合レベルに依存するので、３つの異なる閾値についてこれらの比率の合計を用いた。
突然変異検出
遺伝子ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ２、ＣＤＫ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲＡ及びＲＥＴの公知の癌遺伝子突然変異の突然変異状態を、質量分析遺伝子型判定法(Thomas et al., 2007)によって判定した。すべての細胞株についてのこれらの遺伝子の突然変異状態が以前に発表されている(Thomas et al., 2007)。加えて、すべてのコーディングエキソンのＰＣＲ増幅後に、遺伝子ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＳＴＫ１１、ＰＴＥＮ及びＣＤＫＮ２Ａの両方向シークエンシングを行った。
それぞれの突然変異に依存して適切な療法を選択するための突然変異方向づけを、高非腫瘍細胞混合物での腫瘍サンプルのシークエンシングに関連した方法論的問題点を補償すべく、さらに発展させた。そのために、本発明者らの研究所において、本発明者らは以下のアルゴリズムを開発した：従来の組織形態学によって推定して、腫瘍検体材料の腫瘍含量が、７０％より高い又は７０％である場合、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ連鎖停止シークエンシングが費用効率及び感度の点で最適であることを、本発明者らは発見した。しかし、腫瘍含量が７０％と２０％の間であるとき、例えばＢｉｏｔａｇｅ機器に実装されているような従来のパイロシークエンシングが、より高い感度及び特異性を、許容される費用でもたらすことを、本発明者らは発見した。腫瘍含量が２０％より低い場合、例えばＲｏｃｈｅ−４５４シークエンシングシステム(Thomas et al., Nature Medicine Jul; 12(7):852-5 2006）に実装されているような、大量平行次世代シークエンシングがこの状況で最も感度が高く正確な方法であることを、本発明者らは発見した。全体として、このアルゴリズムは、最大費用効率と併せてすべての状況で高い感度をもたらす。
発現アレイ
５４の細胞株からＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａアレイを用いて発現データを得た。標準的な手順(Bhattacharjee et al., 2001)を用いて、アレイのＲＮＡ抽出、ハイブリダイゼーション及びスキャンを行った。ｄＣｈｉｐソフトウェアを用いて、Ｕ１１３ＡアレイからのＣＥＬファイルの予備的処理を行った。本発明者らは、階層的クラスタリングによって、前記細胞株を、原発性肺癌、腎細胞癌腫及びリンパ腫検体材料並びにそれぞれの細胞株と比較した。さらなるエンティティからの発現プロフィールとの比較のために、本発明者らは、ＧＥＯアレイ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に関して公表されているような肺癌(Lu et al., 2006)、腎細胞癌腫(Lenburg et al., 2003)(Shankavaram et al., 2007)及びリンパ腫(Hummel et al., 2006；Rinaldi et al., 2006)検体材料データセットを使用した。標準的な手順によってデータを処理し、ｄＣｈｉｐで正規化を行った(http://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/)。ＮＳＣＬＣ細胞株（Ｕ１３３Ａ）と原発性腫瘍との比較のために、本発明者らは、Ｕ９５Ａｖ２アレイで生成したＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ及び同僚からの腺癌に関するデータを用いた。突然変異ＥＧＦＲを有する細胞株と野生型ＥＧＦＲを有する細胞株との間で（群間倍率変化＞２［９０％ ＣＩ］、絶対差＞１００及びｐ＜０．００５）、エルロチニブに対して感度の高い及び耐性の細胞株間で（エルロチニブ感度（ＩＣ５０＜０．５μＭ）対エルロチニブ耐性（ＩＣ５０＞２μＭ）、倍率変化＞１．５［９０％ ＣＩ］、絶対差＞１００、ｐ＜０．００５）それぞれ差次的に発現される遺伝子を選択した。主成分分析については、統計コンピュータ計算にＲ言語を用いた。以下のフィルタリング基準を用いて可変転写産物を同定した：［１．９；１０］の変動係数、４０％陽性シグナル率。第一の主成分は、１４．５％の全体分散を示し第二の主成分は、９．６％の全体分散を示し、及び第三の主成分は、８．２％の全体分散を示した。１４００のカットオフを用いて、第一の主成分に従ってサンプルを分類した。
細胞ベースのスクリーニング
エルロチニブ、バンデタニブ及びスニチニブを市場の供給者から購入し、製造業者の説示に従ってＤＭＳＯに溶解して保管した。Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ器具(www.thermo.com)を使用して滅菌マイクロタイタープレートに細胞をプレーティングし、一晩、培養した。その後、化合物を滅菌希釈物に添加した。９６時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ(www.promega.com)を使用して細胞ＡＴＰ含量を測定することにより細胞生存率を判定した。Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０プレートリーダー(www.bertholdtech.com)でプレートを測定した。死滅曲線下のそれぞれのプレイメージから半最大阻害濃度を決定した（前記死滅曲線を、ロジスティック関数と適切に選択したパラメータによって平滑化した）。
化合物感度の損傷に基づく予測
損傷に基づく感度予測のために、３つの異なるアプローチを適用した。第一に、最も感度の高い及び最も耐性の大きいサンプルを、それらの感度プロフィールに従って選択した。対応する化合物の感度プロフィールによって、耐性の細胞株と感度の高い細胞との明確な区別ができなかった場合、第２５及び第７５百万分位数によって群を定義した。本発明者らは、前記化合物の活性とＧＩＳＴＩＣによって定義したときの有意な損傷の存在との関連性を評価するために、フィッシャの正確確率検定を用いた。このために、それぞれの損傷の存在に従って、細胞株パネルを分割した。次に、２サンプルｔ検定によって、それぞれの群に関係する対数変換したＩＣ５０値を比較した。人為的低分散を避けるために、前記ｔ検定は、ゼロとは明確に異なる（＞０．１）分散の平均として決定した固定分散に基づくものであった。
次の段階で、フィッシャの正確確率検定について上で述べたものと同じサンプル選択を用いる、リーブ・ワン・アウト(leave-one-out)戦略(Golub et al., 1999)でＫＮＮアルゴリズムを用いて、多重損傷感度予測因子を計算した：１つを除いてすべてについて、感度の高い細胞株と耐性細胞株とを強烈に区別する遺伝子損傷を選択し、前記ＫＮＮアルゴリズムはこれらに基づくものであった。残りの除外サンプルによってこの予測をバリデートした。このバリデーションが最高動作を有する場合の特徴のコレクションを、それぞれの化合物に対する最高の組み合わせの予測因子と考えた。
最良のエルロチニブ単一遺伝子予測因子を同定するために、本発明者らは、本発明者らの損傷データを二分した（閾値＝０．７）。ＩＣ５０＜０．０７μＭを有する細胞株を感度の高いものとして定義した。前記予測因子について、同じカットオフ値を用いた。１５の特徴、ｋ＝３近傍、及びコサインに基づく距離を用いて、リーブ・ワン・クロス(leave-one-cross)バリデーションにおいて最高動作を得た。多重仮説検定の問題のため、上述のｔ検定並びにフィッシャの正確確率検定の有意性を、確証的な意味でではなく探索的な意味で解釈すべきである。
単一損傷を特定の阻害剤に対する感度と関係づけることができるという発見をバリデートするために、本発明者らは、ＢＮＣＩ−６０癌細胞株パネル(http://dtp.nci.nih.gov/matargets/mt_index.html)を使用した。ＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６及びＨｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧは、薬理学データのコレクションに含まれていなかったので、本発明者らは、代わりに、ハイポセマイシン（ＭＥＫ阻害剤）に対する及びゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧは、ゲルダナマイシン誘導体である）に対するそれぞれの損傷の関連性を分析した。損傷と感度の間の関連性を比較するために、肺癌細胞株パネルにおいて感度の高いもの又は耐性のものとして分類された細胞株の番号を、それぞれの化合物についてＮＣＩ−６０細胞株コレクションに適応させた。関連性の有意性をフィッシャの正確確率検定によって分析した。一致しないＩＣ５０値のため、Ｈｓｐ−９０−阻害剤に関する分析から細胞株ＨＯＰ６２及びＡ５４９を除外した。それぞれのデータセットのコピー数変化の総合的分布に従って、１ｑ２１．３増幅についての閾値を設定した（ＮＳＣＬＣ細胞株の３３％に対応する２．７；ＮＣＩ−６０コレクションの３３％に対応する２．４）。
Huang et al. (2007) によって提案された６遺伝子シグネチャーを評価するために、０及び１による注釈を用いて示されるダサチニブ感度での階層的クラスタリング（図１７）によってそれぞれの遺伝子の発現レベルを分析した。これらの遺伝子全体にわたって類似した発現プロフィールを有するサンプルが同じサブクラスタの中で見つけられる。しかし、ダサチニブに対して感度の高いサンプルは、特定のサブクラスタを構成するのではなく、カラム内にランダムに分布していた。これは、考慮中のシグネチャーがダサチニブ脆弱性の予測に適さないことを示唆している。
ＥＧＦＲ−突然変異体Ｂａ／Ｆ３細胞の産生
ＥＧＦＲ ｃＤＮＡをｐＢａｂｅ−ｈｙｇｒｏベクターにサブクローニングした。部位特異的突然変異（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＸＬ ｋｉｔ；米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、最も一般的なＮＳＣＬＣ由来突然変異体(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)をレトロウイルス構築物に導入し、以前に記載された(Greulich et al., 2005)ようにウイルスをパックして生産した。マウスＢａ／Ｆ３細胞にレトロウイルスを安定的に形質導入し、ＩＬ−３除去後、独立して成長している細胞をさらなる実験のために選択した。
化合物結合の構造的モデリング
ＰｙＭｏｌ(http://www.pymol.org)を用いて、ＲＥＴキナーゼに結合しているダサチニブ及びバンデタニブの結晶構造（ｐｄｂコード２ＩＶＵ(Knowles et al., 2006)）を、エルロチニブに結合しているＥＧＦＲのキナーゼドメイン（ｐｄｂコード１Ｍ１７(Stamos et al., 2002)）にアラインした。ＡｂｌとＥＧＦＲの構造的アラインメントに基づき、ＥＧＦＲにおけるダサチニブに対する結合モードは、ダサチニブ−Ａｂｌ複合体と同一である。前記阻害剤のピペラジン部分は、ＡＴＰ部位を出て溶媒の中のほうに向くが、２−アミノ−チアゾールが、キナーゼのヒンジ領域と（チアゾール環のＮ３と、Ｍｅｔ７９３、ＡｂｌにおけるＭｅｔ３１８、のアミド窒素）と、及びダサチニブの２−アミノ水素がＭｅｔ７９３（Ａｂｌ中のＭｅｔ３１８）のＯと、２つの水素結合を形成する。追加の水素結合が、ゲートキーパーＴｈｒ７９０（ＡｂｌにおけるＴｈｒ３１５）の側鎖ヒドロキシルと阻害剤のアミド窒素の間で形成する場合がある。ダサチニブのクロロ−メチル−フェニル環は、ゲートキーパーＴｈｒ７９０及びヘリックスＣ付近の疎水性ポケットに結合し、薬物耐性ＥＧＦＲ−Ｔ７９０ＭのＭｅｔ側鎖と明らかにぶつかるだろう。１つのバンデタニブ、キナゾリン足場のＮ１、は、そのヒンジ領域（ＥＧＦＲにおけるＭｅｔ７９３、ＲＥＴキナーゼにおけるＡｌａ８０７）の主鎖への１つの重要な水素結合を構成する。バンデタニブのブロモ−フルオロ−フェニルアラニン部分は、ＥＧＦＲにおけるＴｈｒ７９０及びＲＥＴキナーゼにおけるＶａｌ８０４の側鎖に近接しているエルロチニブのエチニル−フェニルアラニンに類似した配座をとる。これらの構造の図を、ＰｙＭｏｌを用いて作製した。
ウエスタンブロット分析
プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤Ｉ及びＩＩカクテル(www.merckbiosciences.co.uk/g.asp?f=CBC/home.html)を補足したＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ４０）中で全細胞溶解産物を調製し、遠心分離によって清澄化した。Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ(www.piercenet.com)を使用してタンパク質濃度を判定し、指示されている場合を除き、等量（４０〜６０μｇ）を１２％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。以前に記載された(Shimamura et al., 2006)ように、ウエスタンブロッティングを行った。抗ＥＧＦＲ、抗−ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）及び抗−ｐＡｋｔ抗体をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州、ベヴァリー）から購入した。抗ｃ−ｒａｔ及び抗−サイクリンＤ１抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。抗ＫＲＡＳ抗体をＭｅｒｃｋから購入した。
結果
ＮＳＣＬＣ細胞株のゲノムバリデート済みコレクション
８４のＮＳＣＬＣ細胞株を様々な供給源から採集し（図１）、すべてのサブシークエント実験のための基礎を作った。腺癌、扁平上皮癌腫及び大細胞癌腫を含む、ＮＳＣＬＣ腫瘍のすべての主要サブタイプを代表する腫瘍から細胞株を採取した。
これらの細胞株のゲノムのランドスケープを、高分解能一塩基多型（ＳＮＰ−）アレイ（２５０Ｋ Ｓｔｙ１；www.affymetrix.com）を用いるゲノムコピー数改変の分析によって、特徴づけした。本発明者らは、癌における有意なターゲットのゲノム同定(Genomic Identification of Significant Targets in Cancer：ＧＩＳＴＩＣ)と呼ばれる新規分析アルゴリズムを用いて、生物学的に適切な生体関連損傷とバックグラウンドノイズとを統計学的に区別した(Beroukhim et al., 2007)。この方法は、データセット内の所与の遺伝子座での変化の平均幅及び頻度両方を反映するそれぞれの染色体マーカーに統計学的スコアを割り当てる。ＧＩＳＴＩＣの適用により、１６の回帰的な高レベルコピー数増加（推定コピー数＞２．１４）領域及び２０の回帰的なコピー数減少（推定コピー数＜１．８６）領域が明らかになった（図２）。総合的に、本発明者らは、増幅について１．４５Ｍｂ（中央値 １３．５遺伝子／領域）及び欠失について０．４５Ｍｂ（中央値 １遺伝子／領域）の中央値幅を有する局所的ピークを同定した。これらの領域は、ＮＳＣＬＣにおいて発生することが公知である損傷（例えば、ＬＲＰ１Ｂ（２ｑ）、ＦＨＩＴ（３ｐ）、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ）の欠失；ＭＹＣ（８ｑ）、ＥＧＦＲ（７ｐ）及びＥＲＢＢ２（１７ｑ）の増幅；（図３Ａ及び図２））を含有する。さらに、コピー数増加の広い領域内で、本発明者らは、原発性肺腺癌の大規模ゲノムプロファイリング(Kendall et al., 2007；Lockwood et al., 2008；Weir et al., 2007)によって最近同定された、ＴＩＴＦ１（１４ｑ）及びＴＥＲＴ（５ｐ）の増幅（図３Ａ及び図２）も同定した。
ホモ接合欠失（ＨＤ）並びにヘテロ接合性欠損（ＬＯＨ）の分析は、概して、原発性腫瘍中の非腫瘍細胞の混合物によって妨げられる。細胞株ＤＮＡの純度により、片親性ダイソミーの結果として生ずるＬＯＨ事象（例えば、コピー・ニュートラル事象）を含めて、以前には知られていなかったＨＤ、及びＬＯＨ領域の同定が可能になった。ＬＯＨのターゲットになる領域は、他の腫瘍タイプのＬＯＨ、並びに以前に認識されていないＬＯＨターゲット、例えばＴＳＰＡＮ５（４ｑ）、ＬＲＤＤ（１１ｐ）、ＳＩＲＴ３（１１ｐ）、ＮＬＲＰ６（１１ｐ）、ＢＣＬ２Ｌ１４（１２ｐ）、ＣＤＫ８（１３ｑ）、ＢＣＬ２Ｌ１２（１８ｑ）、ＤＡＰＫ３（１９ｐ）又はＵＨＲＦ１（１９ｐ）、による影響を受けることが証明されている遺伝子を包含した。この分析では、ＭＴＡＰ（９ｑ）及びＬＡＴＳ２（１３ｑ）などの公知の遺伝子をＨＤによって改変し（Chen et al., 2005；Schmid et al., 1998）、本発明者らは、ＴＵＢＡ２又はＦＲＫなどの遺伝子の新規ＨＤを見いだした。注目すべきこととして、これらの領域の大部分は、原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍においても欠失されているものとして同定されている（Weir et al., 2007）が、推定コピー数はＬＯＨ又はＨＤを不規則にしか示さなかった。これは、正常な二倍体ＤＮＡの混合物を示す。従って、最近の大規模癌プロファイリング研究（Weir et al., 2007）は、肺腺癌のゲノムのランドスケープの洞察を可能にした一方で、腫瘍細胞の純性集団の使用は、以前に認識されていないＨＤ及びＬＯＨ領域の発見をさらに可能した。
次に、本発明者らは、この細胞株コレクションの中の有意な増幅及び欠失のプロフィールを３７１の原発性肺腺癌セットのもの(Weir et al., 2007)と比較した。この比較により、ＮＳＣＬＣ細胞株と神経膠腫又は黒色腫との間（図４Ａ及び４Ｂ）ではなく、前記２つのデータセット間（図３Ａ）の著しい類似性が明らかになった。ｑ値の相関をコンピュータ計算することによる類似性の定量的分析により、原発性肺癌と肺癌細胞株の類似性（ｒ２＝０．７７）、及び肺癌細胞株と原発性神経膠腫(Beroukhim et al., 2007)（ｒ２＝０．４４）又は黒色腫細胞株（Lin et al., 2008）（ｒ２＝０．４４；図４Ｃ）との類似性欠如を確認した。前記肺細胞株データの反復無作為分割及び内部類似性の算定は、０．８２と０．８６の間の相関を示したが、本発明者らは、正常組織とは相関がないことを発見した（ｒ２＝０．０１９５；図４Ｃ）。これらの結果は、ＮＳＣＬＣ細胞株の前記ゲノムコピー数ランドスケープが、原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍のものを反映するが、他の系統の腫瘍又は細胞株は、はるかに低い類似度(Greshock et al., 2007；Jong et al., 2007)を示すことを明示している。さらに、前記細胞株における癌遺伝子突然変異の分布は、ＫＲＡＳ遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子の突然変異の高い出現率(Aviel-Ronen et al., 2006；Bamford et al., 2004；Sharma et al., 2007；Thomas et al., 2007)並びにＰＩＫ３ＣＡ突然変異及びＢＲＡＦ突然変異の稀な出現を有する原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍のものに類似していた（図３Ｂ）。これらの結果は、本発明者らの細胞株コレクションを遺伝子レベルでさらにバリデートする。
ＮＳＣＬＣ細胞株からの二次元の遺伝子情報（染色体コピー数変化及び突然変異）を利用できることにより、本発明者らは、両方の損傷タイプの相互作用を分析することができた（図３Ｃ）。損傷の階層的クラスタリングにより、ＥＧＦＲの突然変異と増幅の両方が１つのサブクラスタにしっかりと分類された（予想共起に対する実測共起の比率Ｑ：Ｑ＝４．３８、ｐ＝０．００１）一方で、ＫＲＡＳ突然変異は、一貫して異なるクラスタに分類された。これらの発見は、ＥＲＡＳ及びＥＧＦＲの突然変異が相互に相容れない一方で、ＥＧＦＲ突然変異とＥＧＦＲ増幅が、多くの場合、共起する、インビトロでの以前の観察(Kaya, 2005；Pao et al., 2005b；Sharma et al., 2007)を確証する。さらに、これらの結果は、これらの突然変異のそれぞれが、特異的に、ゲノム変化のより大きなセットの条件となることを示唆している。
最後に、遺伝子発現データのクラスタ分析において、原発性肺癌検体材料(Lu et al., 2006)及び肺癌細胞株は、１つのクラスタを共有した（図３Ｄ）が、腎細胞癌腫(Lenburg et al., 2003)及びリンパ腫(Hummel et al., 2006)は、別個の群にクラスタ化した。要約すると、ＮＳＣＬＣ細胞株及び原発性腫瘍の大きなパネルの直交ゲノムデータセットの徹底的な比較分析は、これらの細胞株が原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍の遺伝的及び転写的ランドスケープを反映することを立証する。
ＥＧＦＲ突然変異はインビトロ及びインビボでの肺腫瘍の表現型特性を規定する
活性化された癌遺伝子は、そのような癌遺伝子を有する腫瘍を同定するために使用することができる転写シグネチャーを概して生じさせる(Bild et al., 2006；Lamb et al., 2003)。しかし、本発明者らは、１２３の原発性肺癌腫の注釈が施されている遺伝子発現データセット(Bhattacharjee et al., 2001)を使用してＥＧＦＲ−突然変異体腫瘍に特異的な遺伝子発現シグネチャーを同定することに一貫して失敗した（データを示さない）。従って、本発明者らは、本発明者らの細胞株の細胞純度が、そのようなシグネチャーの抽出及び原発性腫瘍へのその翻訳を可能にし得ると推論した。本発明者らは、可変遺伝子に関する主成分分析を利用し、全分散に１４．５％寄与する主成分（ｐ＝０．０００５）において既に有意な解離を有するすべてのＥＧＦＲ突然変異細胞株の顕著な群化を見出した（図５Ａ）。類似した結果を階層的クラスタリングによって得た（データを示さない）。代わりの特徴としてＥＧＦＲ−突然変異細胞株において差次的に発現される遺伝子を用いて、階層的クラスタリングを行って、ＥＧＦＲ−突然変異体原発性腫瘍のすべてを異なるクラスタに分類した（図５Ｂ）。この結果は、エルロチニブに対して感度の高い細胞株において差次的に発現される遺伝子を選択した際にも繰り返された（図６Ａ）。さらに、ＥＧＦＲ突然変異細胞株のシグネチャーを発現する腫瘍を有する患者は、腫瘍がそれらを発現しない患者より、インビボで観察されたようなＥＧＦＲ−突然変異体腫瘍(Eberhard et al., 2005b)を除外したときでさえ、良好な全生存率を有した（図５Ｃ）。これらのデータは、抽出されたシグネチャーのインビトロでの発現を、生物学的に多岐にわたる腫瘍のインビボでの同定、最近開発され、バリデートされた概念(Nevis and Potti, 2007)、に用いることができることを示している。
他の者が、最近、細胞株の小セットを用いてＥＧＦＲ突然変異体ＮＳＣＬＣの転写シグネチャーを特徴づけしている(Choi et al., 2007)。しかし、Ｃｈｏｉらによって記載されたシグネチャーを有する原発性肺癌腫を分析したとき、ＥＧＦＲ−突然変異体サンプルは、そのデータセット全体にわたってランダムに分布した（図６Ｂ）。この発見は、原発性腫瘍のゲノム多様性全体を表すために大きな細胞株コレクションを使用することの重要性をさらに強調する。
患者にける腫瘍退縮、又はエルロチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤に対する「応答」は、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異と相関する(Lynch et al., 2004；Paez et al., 2004；Pao et al., 2004)。エルロチニブに対する感度に関連した遺伝子損傷を系統的に分類するために、本発明者らは、すべての細胞株においてエルロチニブ感度を判定した。そのとき、本発明者らは、感度の低い細胞株と比較して感度の高い細胞株における遺伝子損傷の分布を分析し（図７）、さらに、それぞれの遺伝子損傷を有する細胞株の平均感度と有さない細胞株の平均感度を比較した。両方の分析において、ＥＧＦＲ突然変異は、エルロチニブ感度の最良の単一損傷予測因子であった（図５Ｄ、ｐ＜０．０００１）。さらに、本発明者らは、ＥＧＦＲの増幅とのあまりストリンジェントでない関連性を見出した；しかし、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法又はＦＤＲに基づく方法のいずれかを用いて多重仮説検定を調整したとき、ＥＧＦＲ突然変異のみが、エルロチニブ感度の有意な予測因子であった（データを示さない）。
次に、本発明者らは、ＫＮＮアルゴリズム(Golub et al., 1999；Reich et al., 2006)と組み合わせたシグナル対ノイズに基づく特徴選択を用いて、エルロチニブ感度の多損傷予測因子を構築した。最もよく動作する多損傷予測因子は、ＥＧＦＲ突然変異、ＥＧＦＲの増幅、及びＫＲＡＳ突然変異の欠如を含み（図８）、これらは、すべて、ＥＧＦＲ阻害剤に対するＮＳＣＬＣ患者の応答性の判定に結びつけられている(Cappuzzo et al., 2005；Hirsh et al., 2005；Lynch et al., 2004；Paez et al., 2004；Pao et al., 2004；Pao et al., 2005b；Tsao et al., 2005)。これらの結果は、包括的遺伝子損傷プロフィールにかかわる系統的コンピュータ解析においてエルロチニブに感度を付与する際のＥＧＦＲ突然変異の役割を強調する。さらに、これらの発見は、原腫瘍の本質的な転写及び細胞生物学表現型が細胞株において保存されること、全臨床薬物ターゲットバリデーションに向けての取り組みにおいて代用品としてそのようなコレクションの利用するための必須要件、を含意する。
ＮＳＣＬＣ細胞株における臨床開発中の化合物の特異的活性
細胞株コレクションを、原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍とそれらのゲノム及び表現型類似性を立証することによりバリデートして、本発明者らは、複雑な表現型データを加えることで、癌遺伝子型の細胞生物学表現型に対する影響の及ぼし方へのさらなる洞察を導き出すことができるだろうと推論した。そのために、本発明者らは、全細胞株パネルにわたって短時間で系統的化学的摂動を可能にするハイスループット細胞株スクリーニングプラットホームを確立した。本発明者らの最初の予備スクリーニング実験において、本発明者らは、臨床評価中である又は前臨床モデルにおいて高い活性を示した、１０の阻害剤に対してすべての細胞株をプロファイリングした；これらの化合物は、癌における広域スペクトルの関連タンパク質をターゲットにする（図９）。本発明者らは、これらの化合物ですべての細胞株を試験し、ＩＣ５０値を決定した（図７）。得られた感度パターン（図１０）により、細胞株の小さなサブセットにおいて顕著な細胞毒活性を示した化合物もあり（例えば、エルロチニブ、バンデタニブ、ＶＸ−６８０）、細胞株の大部分において活性であったものもあり、ほんの少数は耐性であった（例えば、１７−ＡＡＧ）ことが明らかになった。２つの細胞株（＜２％）だけは、化合物のすべてに対して耐性であった（図７）。これは、大部分のＮＳＣＬＣ腫瘍がターゲット治療の対象となり得ることを示唆している。総合的に、これらの観察は、患者の限られたサブセットは部分的な又は完全な応答を経験するが、患者の大多数は安定した疾病を示し変化及び進行を示さない、臨床試験における患者応答に非常によく似ている。従って、ハイスループット細胞株スクリーニングは、開発中の新規化合物に対して感度の高い腫瘍の分率の推定を助長することができる。
類似性プロファイリングによる関連化合物ターゲットの同定
阻害剤の共有ターゲットを同定するための最初のアプローチとして、本発明者らは、感度プロフィールの類似性に基づく（図１１Ａ）及び感度プロフィールとゲノム損傷プロフィールとの相関の基づく（図１１Ｂ）階層的クラスタリングを行った。エルロチニブ及びバンデタニブは、最高の類似度を示した。これは、ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞におけるバンデタニブの臨床ターゲットとして突然変異体ＥＧＦＲを示す（図１１及び１１Ｂ）。両方の化合物についての細胞株ＩＣ５０値の高い相関度（ｒ２＝０．９１；ｐ＜０．００１；）、並びにエルロチニブのものと同一である結合方式を示す、ＥＧＦＲキナーゼドメイン内のバンデタニブ結合の構造的モデリングが、この考えをさらに強めた（図１２Ａ）。注目すべきは、このモデルは、両方の化合物の結合がＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ耐性突然変異によって妨げられると予測し；それに応じて、Ｔ７９０Ｍと共にＥＧＦＲのエルロチニブ増感突然変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞は、エルロチニブ及びバンデタニブに対して完全に耐性であった（図１２Ａ及び１１Ｄ）。
バンデタニブに加えて、ＰＤ１６８３９３、公知の不可逆ＥＧＦＲ阻害剤(Sos et al., 2008)、及びＳＲＣ／ＡＢＬ阻害剤ダサチニブ(Shah et al., 2004)は、エルロチニブとクラスタを共有した（図１１Ａ及びＢ）。ＥＧＦＲへのダサチニブ結合の分子モデリングは、エルロチニブのものに類似した結合方式（図１１Ｃ）と、エルロチニブ及びダサチニブとエルロチニブ耐性突然変異Ｔ７９０Ｍ(Kobayashi et al., 2005；Pao et al., 2005a；Yun et al., 2007)との立体化学的衝突（図１１Ｃ）を予測した。本発明者らは、Ｔ７９０Ｍ耐性対立遺伝子を共発現するものではなく突然変異体ＥＧＦＲを異所発現するＢａ／Ｆ３においてこの化合物により惹起されるＥＧＦＲ脱リン酸化(Song et al., 2006)ばかりでなく細胞毒性を証明することにより、ダサチニブの関連腫瘍細胞ターゲットとしてＥＧＦＲを正式にバリデートした（図１１Ｄ）。このように、本発明者らのアプローチは、系統的不偏アプローチを用いてＦＤＡ認可薬の関連腫瘍細胞ターゲットを同定した。エルロチニブ耐性を獲得した患者におけるダサチニブの試験が現在進行中であることに留意すること（試験Ｉｄ：ＮＣＴ００５７０４０１、http://clinicaltrials.gov/ct2/home）；本発明者らは、獲得耐性がＴ７９０Ｍ突然変異に起因する患者における、ダサチニブの限られた活性を予測する。
阻害剤応答性についての予測因子を同定するための教師あり学習
系統的様式で包括的損傷データから阻害剤−応答性を予測するための別法として、本発明者らは、本発明者らがエルロチニブのために利用した（上記参照）ような、教師あり学習方法(Golub et al., 1999)を利用した。この方法を利用して、本発明者らは、エルロチニブ（上記参照）、バンデタニブ、ＰＤ１６８３９３、ダサチニブ、ＶＸ−６８０、１７−ＡＡＧ及びＵＯ１２６の活性についての確固たる、遺伝子損傷に基づく予測因子を同定した（図８）。本発明者らのクラスタ分析、その後の構造モデリングからの結果を裏付けるように、ＥＧＦＲの突然変異は、エルロチニブ、ＰＤ１６８３９３、バンデタニブ及びダサチニブの活性についての最良の予測因子であった（図８）。
本発明者らの最初のクラスタ分析において、本発明者らは、ＫＲＡＳ突然変異がＨｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧ、ゲルダナマイシン誘導体、に対する感度と相関することを見いだした（図１３Ａ）。本発明者らのＫＮＮに基づく予測アプローチを用いると、ＫＲＡＳ突然変異は、１７−ＡＡＧ感度も示した（ｐ＝０．０３０７、図１３Ａ）。独立したデータセットにおいてこの観察をバリデートすることにより、本発明者らは、ＮＣＩ−６０細胞株パネルにおけるゲルダナマイシン感度及びＫＲＡＳ突然変異の分布が、本発明者らのパネルにおいて観察されたものと著しく類似していることを見いだした（ｐ＝０．０４９；図１３Ａ）。感度の高い細胞株において、１７−ＡＡＧ治療は、ｃ−ＲＡＦ及びＡｌｔのタンパク質レベルを低下させたが、ＫＲＡＳのタンパク質レベルは低下させなかった（図１３Ｂ）。ｃ−ＲＡＦとＡｋｔは両方とも公知のＨｓｐ９０クライアントである(Basso et al., 2002；Grbovic et al., 2006)ので、ＫＲＡＳ突然変異は、Ａｋｔ及びＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナリング経路の活性化に対する依存性をもたらすことができ、従って、それらの細胞のＨｓｐ９０阻害剤への感度を高め得る。
Ｕ０１２６は、肺癌細胞株コレクションのサブセットにおいて強化された活性も証明されているＭＥＫ阻害剤である。ここでは、ＫＫＮ−予測アプローチにより遺伝子ＡＲＮＴ及びＲＡＢ１３に影響を及ぼす１ｑ２１．３の染色体獲得を同定し、それらをＵＯ１２６感度としっかりと関係づけた（フィッシャの正確確率検定、ｐ＝０．０４４２；図１３Ｃ及び１４Ａ）。独立したデータセットにおいてこの発見をバリデートするために、さらにまた、本発明者らは、ハイポセマイシンがＭＥＫ阻害剤として使用された(Solit et al., 2006)ＮＣＩ−６０癌細胞株パネル(Shoemaker, 2006)を使用した。この交差プラットホームバリデーションにより、１ｑ２１．３獲得が、両方のデータセットにおけるＭＥＫ阻害に対する感度を予測することが明らかになった（フィッシャの正確確率検定、ｐ＝０．０４２ ＮＳＣＬＣ細胞株；ｐ＝０．０３５ ＮＣＩ−６０コレクション）。このように、薬物感度の系統的な、損傷に基づく予測に連結させた細胞株プロファイリングが、独立したデータセットにおいてバリデートすることができる予測因子をもたらした。
感度を予測するための化合物ターゲット遺伝子の富化
ターゲット遺伝子の増幅により、ＥＲＢＢ２増幅乳癌及びＥＧＦＲ増幅肺癌におけるターゲット特異的化合物に対する脆弱性の予測を立証した。そのために、本発明者らは、生化学的に定義されている薬物ターゲットの染色体コピー数改変を他のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感度の予測に用いることができると推測した。このために、本発明者らは、定量的キナーゼアッセイ(Karaman et al., 2008)において決定されるような定量的解離定数によって定義された適切なチロシンキナーゼ阻害剤ターゲットを使用した。第一の証拠として、本発明者らは、ＥＧＦＲにおけるコピー数増加をエルロチニブに対する感度と関連づけられるかどうかを試験した。本発明者らの系統的アプローチにおいて、エルロチニブに対して感度の高い細胞株をＥＧＦＲの増幅（ｃｎ＞３）のために高度に富化させた（ｐ＝０．００００８２）（図１４）。次に、本発明者らは、ラパチニブ、ＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２の特異的阻害剤、の限定スクリーニング（３０細胞株）を行った。さらにまた、本発明者らは、ラパチニブに対して感度の高い細胞株が増幅されたＥＧＦＲ又はＥＲＢＢ２遺伝子を有する細胞株において、有意に富化されることを観察した（ｐ＝０．０２６５；データを示さない）。
これらの発見に励まされて、本発明者らは、広範な阻害キナーゼを有する化合物、例えばダサチニブ(Karaman et al., 2008)、に対する本発明者らのアプローチの試験に着手した。本発明者らは、生物学的に最も感度の高いダサチニブターゲット（Ｋｄ＜１ｎＭ）のうちのいずれか１つにおける染色体コピー数増加に従って細胞株をランクづけした。これらの細胞系は、この化合物に対する感度が有意に強化された（ｐ＝０．００３、図１３Ｄ）。詳細には、この予測因子は、エフリン受容体及びＳｒｃキナーゼの遺伝子ファミリーメンバーの増加を含んだ。これは、そのような損傷を有するＮＳＣＬＣ細胞が、コードされたタンパク質の治療的阻害に対して非常に感度が高いことを示唆している。対照的に、生物学的にあまり感度が高くないダサチニブターゲットをコードする遺伝子座を含むコピー数増加は、感度の高い細胞株の富化を示すことができなかった（データを示さない）。従って、本発明者らは、ＮＳＣＬＣにおいて、エフリン受容体又はＳＲＣファミリーメンバー遺伝子のコピー数増加が、それらの細胞をこれらのキナーゼに対して依存性にし、その結果、ダサチニブでの治療的阻害に対する脆弱性を顕示させると結論づける。
動物データは、ＫＲＡＳ由来肺腺癌を有するマウスがＨＳＰ９０阻害剤での治療に対して感受性であることを示す
このインビボ実験は、ＫＲＡＳ由来肺癌腫を発現するように遺伝子操作したマウスがＨＳＰ９０阻害剤での治療に対して感受性であることを確認するものである。
これらのマウスは、Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ遺伝子を有する。鼻腔吸入によるアデノウイルスＣｒｅの投与後に、これらのマウスは、高い浸透度で肺癌を発現して、この疾病から急死に至る。従って、このマウスモデルは、ＫＡＲＳ−突然変異体ヒト肺癌の最もストリンジェントで最適なモデルの代表であり、それ故、インビボ実験のために選択された；図２０参照。マウスは、２０ｍｇ／ｋｇ／日の１７−ＤＭＡＧ、１７−ＡＡＧとほぼ同じ構造を有するゲルダナマイシンＨＳＰ９０阻害剤、を摂取した。インビトロデータは、この細胞株において１７−ＡＡＧで見られる生物学的作用が１７−ＤＭＡＧで見られるものと同一であることを裏付けた（データを示さない）。
たった１週間の治療後、ＭＲＩイメージングによって測定すると３匹のうち２匹のマウスが腫瘍の劇的な退縮を示した；図２１参照。第三のマウスは、安定な疾病に匹敵する、腫瘍負荷量のわずかな、有意でない減少を示した。対照的に、未治療のマウスは、急速な腫瘍進行及び疾病による急死を決まって示した。
本発明は、以下のヌクレオチド配列を参照する：
本明細書に提供する配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手することができ、及びwww.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene:から引き出すことができる。これらの配列はまた、注釈された及び修飾された配列にも関する。本発明は、相同配列、並びにまた、本明細書に提供する簡略化した配列の対立遺伝子変異体及びこれらに類するものを用いる技術及び方法も提供する。好ましくは、そのような「変異体」は、遺伝子変異体である。
配列番号１：
ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ（アイソフォームｂ）、ｍＲＮＡ、をコードするヌクレオチド配列（＞ｇｉ｜３４４８５７２３｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００４９８５．３｜）。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号２：
ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）のアミノ酸配列
配列番号３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、のアミノ酸配列
配列番号７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、のアミノ酸配列
配列番号９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号１０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、のアミノ酸配列
配列番号１１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号１２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、のアミノ酸配列
配列番号１３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号１４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号１５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号１６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆ、のアミノ酸配列
配列番号１７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号１８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、のアミノ酸配列
配列番号１９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号２０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、のアミノ酸配列
配列番号２１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号２２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、のアミノ酸配列
配列番号２３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号２４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号２５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号２６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ、のアミノ酸配列
配列番号２７： 突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号２８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号２９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号３０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、のアミノ酸配列
配列番号３１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号３２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、のアミノ酸配列
配列番号３３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号３４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、のアミノ酸配列
配列番号３５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号３６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、のアミノ酸配列
配列番号３７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号３８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号３９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号４０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、のアミノ酸配列
配列番号４１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号４２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号４３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号４４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、のアミノ酸配列
配列番号４５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号４６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、のアミノ酸配列
配列番号４７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号４８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、のアミノ酸配列
配列番号４９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号５０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、のアミノ酸配列
配列番号５１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号５２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号５３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号５４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆ、のアミノ酸配列
配列番号５５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号５６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、のアミノ酸配列
配列番号５７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号５８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、のアミノ酸配列
配列番号５９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号６０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、のアミノ酸配列
配列番号６１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号６２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号６３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号６４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ、のアミノ酸配列
配列番号６５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号６６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号６７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号６８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、のアミノ酸配列
配列番号６９：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号７０：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、のアミノ酸配列
配列番号７１：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号７２：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、のアミノ酸配列
配列番号７３：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号７４：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、のアミノ酸配列
配列番号７５：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号７６：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号７７：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ｂ、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７４８にわたる。
配列番号７８：
突然変異ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、のアミノ酸配列
配列番号７９：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号８０：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号８１：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号８２：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号８３：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ａ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号８４：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ａ、のアミノ酸配列
配列番号８５：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号８６：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号８７：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｆ４６８Ｃ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号８８：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｆ４６８Ｃ、のアミノ酸配列
配列番号８９：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号９０：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号９１：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号９２：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号９３：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｓ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号９４：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｓ、のアミノ酸配列
配列番号９５：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号９６：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号９７：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号９８：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号９９：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１００：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号１０１：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ａ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１０２：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ａ、のアミノ酸配列
配列番号１０３：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１０４：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号１０５：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１０６：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号１０７：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｆ５９５Ｌ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１０８：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｆ５９５Ｌ、のアミノ酸配列
配列番号１０９：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ５９６Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１１０：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｇ５６９Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号１１１：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１１２：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号１１３：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｓ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１１４：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｓ、のアミノ酸配列
配列番号１１５：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１１６：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号１１７：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｋ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１１８：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｋ、のアミノ酸配列
配列番号１１９：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１２０：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号１２１：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｎ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１２２：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｎ、のアミノ酸配列
配列番号１２３：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｅ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１２４：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｅ、のアミノ酸配列
配列番号１２５：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｇ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１２６：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｇ、のアミノ酸配列
配列番号１２７：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｖ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１２８：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｖ、のアミノ酸配列
配列番号１２９：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｒ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１３０：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｒ、のアミノ酸配列
配列番号１３１：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｑ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１３２：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｑ、のアミノ酸配列
配列番号１３３：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｔ５９９Ｉ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１３４：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｔ５９９Ｉ、のアミノ酸配列
配列番号１３５：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｌ、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１３６：
突然変異ホモサピエンスＢＲＡＦ、突然変異ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｌ、のアミノ酸配列
配列番号１３７：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル性）をコードするヌクレオチド、クラスＡメンバー１（ＨＳＰ９０ＡＡ１／ＨＳＰ９０）、転写産物変異体１、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜１５３７９２５８９｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１０１７９６３．２）、をコードするヌクレオチド配列
配列番号１３８：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル性）をコードするヌクレオチド、クラスＡメンバー１アイソフォーム１（ＨＳＰ９０ＡＡ１）（＞ｇｉ｜１５３７９２５９０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０１７９６３．２）、のアミノ酸配列
配列番号１３９：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル性）、クラスＡメンバー１（ＨＳＰ９０ＡＡ１）、転写産物変異体２、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜１５４１４６１９０｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００５３４８．３）、をコードするヌクレオチド配列
配列番号１４０：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル性）をコードするヌクレオチド、クラスＡメンバー１アイソフォーム２（＞ｇｉ｜１５４１４６１９１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００５３３９．３）、のアミノ酸配列
配列番号１４１：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル性）、クラスＢメンバー１（ＨＳＰ９０ＡＢ１）、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜２０１４９５９３｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００７３５５．２｜）ｍＲＮＡ、をコードするヌクレオチド配列
配列番号１４２：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａタンパク質１、ベータ（＞ｇｉ｜２０１４９５９４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３１３８１．２｜）、のアミノ酸配列
配列番号１４３：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ（Ｇｒｐ９４）、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜４５０７６７６｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００３２９９．１｜）、をコードするヌクレオチド配列
配列番号１４４：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（＞ｇｉ｜４５０７６７７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００３２９０．１｜）、のアミノ酸配列
配列番号１４５：
ホモサピエンス熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル性）、クラスＡメンバー２（ＨＳＰ９０ＡＡ２）、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜９２８５９６２９｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１０４０１４１．１｜）
配列番号１４６：
ホモサピエンス熱ショック９０ｋＤａタンパク質１、アルファ様３（＞ｇｉ｜９２８５９６３０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０３５２３１．１｜）、のアミノ酸配列
配列番号１４７：
ホモサピエンスｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜１８７６０８６３２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００４３３３．４｜）、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド６２からヌクレオチド２３６２にわたる。
配列番号１４８：
ホモサピエンスｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜１８７６０８６３２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００４３３３．４｜）、のアミノ酸配列
配列番号１４９：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、転写産物変異体１（アイソフォームａ）、ｍＲＮＡ（＞ｇｉ｜４１３２７７３７｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００５２２８．３｜）、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド２４７からヌクレオチド３８７９にわたる。
配列番号１５０：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、（アイソフォームａ）、のアミノ酸配列。
配列番号１５１：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、転写産物変異体２（アイソフォームｂ）、ｍＲＮＡ（＞｜ＮＭ＿２０１２８２．１｜）、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド２４７からヌクレオチド２１３３にわたる。
配列番号１５２：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、（アイソフォームｂ）、のアミノ酸配列
配列番号１５３：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、転写産物変異体３（アイソフォームｃ）、ｍＲＮＡ（＞｜ＮＭ＿２０１２８３．３｜）、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド２４７からヌクレオチド１４６４にわたる。
配列番号１５４：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、（アイソフォームｃ）、のアミノ酸配列
配列番号１５５：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、転写産物変異体１（アイソフォームｄ）、ｍＲＮＡ（＞｜ＮＭ＿２０１２８４．３｜）、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド２４７からヌクレオチド２３６４にわたる。
配列番号１５６：
ホモサピエンス上皮増殖因子受容体（赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ）（ＥＧＦＲ）、（アイソフォームｄ）、のアミノ酸配列
配列番号１５７：
ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、転写産物変異体ａ（アイソフォームａ）、ｍＲＮＡ（｜ＮＭ＿０３３３６０．２｜）、をコードするヌクレオチド配列。このコーディング領域は、ヌクレオチド１８２からヌクレオチド７５１にわたる。
配列番号１５８：
ホモサピエンスｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）（アイソフォームａ）のアミノ酸配列
本明細書において引用した参考文献：
Arao T et al., Small in-frame deletion in the epidermal growth factor receptor as a target for ZD6474. Cancer Res 64: 9101-4 (2004).
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Claims (26)

  1. ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する方法であって、
    （ａ）前記細胞、組織又は細胞培養物中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定する段階；
    （ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異を有する細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）を選択する段階
    （ｃ）前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）とＨＳＰ９０阻害剤を接触させる段階；及び
    （ｄ）ＨＳＰ９０阻害剤と接触させた前記細胞（１つ又はそれ以上）、組織（１つ又はそれ以上）又は細胞培養物（１つ又はそれ以上）の生存度を評価する段階
    を含む方法。
  2. ＨＳＰ９０阻害剤を用いた治療に対する哺乳動物腫瘍細胞又は癌細胞の応答性を判定するための方法であって、前記腫瘍細胞中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定することを含み、前記活性化突然変異が、その細胞がその治療に対して応答する可能性が高いかどうか、又は応答するかどうかを示すことを特徴とする方法。
  3. 加えて、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の活性化突然変異を判定する、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答者又は感度の高い患者を同定するためのインビトロ法であって、該方法は、次の段階：
    ＫＲＡＳ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌に罹患している疑いのある又は罹患しやすい患者から得たサンプルに対し、
    ＫＲＡＳ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を評価する段階
    を含み；
    単独でのＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異が、ＨＳＰ９０阻害剤に対し応答する患者を示唆する又はＨＳＰ９０阻害剤に対する前記患者の感度を示唆することを特徴とする方法。
  5. ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答者又は感度の高い患者を同定するためのインビトロ法であって、該方法は、次の段階：
    ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌に罹患している疑いのある又は罹患しやすい患者から得たサンプルに対し、
    ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を評価する段階
    を含み；
    ＥＧＦＲ及び／若しくはＢＲＡＦ遺伝子の活性化突然変異に加えての、ＫＲＡＳ遺伝子の活性化突然変異が、ＨＳＰ９０阻害剤に対し応答する患者を示唆する又はＨＳＰ９０阻害剤に対する前記患者の感度を示唆することを特徴とする方法。
  6. 前記ＨＳＰ９０阻害剤が、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２、ゲルダナマイシン、およびその誘導体からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ゲルダナマイシン誘導体が、１７−ＡＡＧ又はＩＰＩ−５０４である、請求項６に記載の方法。
  8. ＫＲＡＳ遺伝子の前記突然変異が、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｓ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｐ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ａ５９Ｔ及びＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｆからなる群より選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ＥＧＦＲ遺伝子の前記突然変異が、ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１＞ＡＧＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ；ＥＧＦＲ＿Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＮ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｇ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｈ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｋ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７０９Ｖ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｔ７５１Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｉ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｓ７５２Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｓ７５２Ｄ；ＥＧＦＲ＿Ｅ７４６＿Ｔ７５１ｄｅｌ，Ｖ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ＿Ｇ７Ｉ９Ｓ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ；ＥＧＦＲ＿Ｈ７７３＞ＮＰＹ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｅ７４９ｄｅｌ，Ａ７５０Ｐ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｐ７５３Ｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ｄｅｌ，Ｑ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｔ７５０ｄｅｌ，Ｐ ｉｎｓ；ＥＧＦＲ＿Ｌ７４７＿Ｔ７５１ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ＿Ｍ７６６＿Ａ７６７ｉｎｓＡＩ；ＥＧＦＲ＿Ｐ７７２＿Ｈ７７３ｉｎｓＶ；ＥＧＦＲ＿Ｓ７５２＿Ｉ７５９ｄｅｌ；ＥＧＦＲ＿Ｓ７６８Ｉ；ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ＿Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ；ＥＧＦＲ＿Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ；及びＥＧＦＲ＿Ｖ７７４＿Ｃ７７５ｉｎｓＨＶからなる群より選択される、請求項３、５から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＢＲＡＦ遺伝子の前記突然変異が、ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｇ、ＢＲＡＦ＿Ｄ５９４Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｆ４６８Ｃ、ＢＲＡＦ＿Ｆ５９５Ｌ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６４Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ａ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ａ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｓ、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６９Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｇ５９６Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｋ６０１Ｎ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｑ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｒ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｓ、ＢＲＡＦ＿Ｌ５９７Ｖ、ＢＲＡＦ＿Ｔ５９９Ｉ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｌ、及びＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｒからなる群より選択される、請求項３、５から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ＫＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ及び／又はＢＦＡＲ遺伝子の前記突然変異が、ＳＳＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、シークエンシング、ＨＰＬＣ又は質量分析遺伝子型判定法によって検出される、請求項３から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記サンプルが、癌に罹患している疑いのある又は癌に罹患しやすい患者から得られる、請求項４から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤に対する感度を診断するための、ＫＲＡＳ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異のうちの活性化突然変異（１つ又はそれ以上）を検出することができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであって、前記オレゴヌクレオチドが、１５から１００ヌクレオチドの長さである、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用。
  14. 請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤に対する感度を診断するための、ＫＲＡＳ遺伝子の並びにＥＣＲＦ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異のうちの活性化突然変異（１つ又はそれ以上）を検出することができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであって、前記オレゴヌクレオチドが、１５から１００ヌクレオチドの長さである、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用。
  15. ＫＲＡＳ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の効力を、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者において監視する方法であって、
    ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織において、ＫＲＡＳの発現若しくは活性化を判定する段階；及び
    ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性を、ＫＲＡＳの基準若しくは対照発現レベル又は基準若しくは対照活性と比較する段階
    を含み、ａ）において判定した前記活性又は発現レベルと前記基準発現レベル又は基準活性との差の程度が、前記癌の治療の前記効力を示唆することを特徴とし、
    ＫＲＡＳ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の前記治療が、請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む、
    方法。
  16. ＫＲＡＳ遺伝子の、並びにＥＧＦＲ及び／またはＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の効力を、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者において監視する方法であって、
    ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織において、ＫＲＡＳの発現又は活性、並びに、ＥＧＦＲの活性化若しくは発現レベル及び／又はＢＲＡＦの発現若しくは活性化を判定する段階；及び
    ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性を、ＫＲＡＳの基準若しくは対照発現レベル又は基準若しくは対照活性と、並びに、ＥＧＦＲの基準若しくは対照発現レベルと、及び／又はＢＲＡＦの基準若しくは対照発現レベルと、比較する段階
    を含み、ａ）において判定した前記活性又は発現レベルと前記基準発現レベル又は基準活性との差の程度が、前記癌の治療の前記効力を示唆することを特徴とし、
    ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の前記治療が、請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む、方法。
  17. ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者に対する、効力を予測する方法であって、
    ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦからなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性化又は発現レベルを判定する段階；及び
    ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性を、対照被験者／患者（応答者及び／又は非応答者）から得た細胞又は組織サンプルにおいて判定した、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の基準活性又は基準発現レベルと比較する段階
    を含み、
    ａ）において判定した前記活性又は発現レベルと、前記基準若しくは対照活性又は前記基準若しくは対照発現レベルとの差の程度が、癌の治療の予測効力を示唆することを特徴とし、ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の前記治療が、請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む、方法。
  18. ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療の、該疾患に罹患している又は該疾患に罹患しやすい被験者／患者に対する、効力を予測する方法であって、
    ａ）前記被験者／患者から得た細胞又は組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦからなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性化又は発現レベルを判定する段階；及び
    ｂ）ａ）において判定した前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の活性を、対照被験者／患者（応答者及び／又は非応答者）から得た細胞又は組織サンプルにおいて判定した、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の基準活性又は基準発現レベルと比較する段階
    を含み、
    ａ）において判定した前記活性又は発現レベルと、前記基準若しくは対照活性又は前記基準若しくは対照発現レベルとの差の程度が、癌の治療の予測効力を示唆することを特徴とし、ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の前記治療が、請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む、方法。
  19. ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌を治療するためのＨＳＰ９０阻害剤をスクリーニング及び／又はバリデーションするための、ＫＲＡＳ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異を有する（トランスジェニック）細胞又は（トランスジェニック）非ヒト動物の使用。
  20. ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌を治療するためのＨＳＰ９０阻害剤をスクリーニング及び／又はバリデーションするための、ＫＲＡＳ遺伝子の、並びに、ＥＧＦＲ及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の、少なくとも１つの活性化突然変異を有する（トランスジェニック）細胞又は（トランスジェニック）非ヒト動物の使用。
  21. 前記癌が、小細胞肺癌、肺腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃腸癌（胃及び食道癌を含む）、腎細胞癌、尿路癌腫、白血病、前立腺癌、リンパ腫、黒色腫、脳腫瘍、小児腫瘍及び肉腫からなる群より選択される、請求項４から２０のいずれかに記載の方法。
  22. ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定することができるオレゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、請求項１から１１、１５〜１８及び２１のいずれか一項に記載の方法を行うために有用なキットの使用。
  23. ＫＲＡＳ遺伝子、並びに、ＥＧＦＲ遺伝子及び／又はＢＲＡＦ遺伝子、の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を判定することができるオレゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、請求項１から１１、１４、１６、１８及び２０のいずれか一項に記載の方法を行うために有用なキット。
  24. ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療、治療の改善及び／又は予防のための医薬組成物を調製するための、請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤の使用。
  25. ＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの活性化突然変異の存在を特徴とする癌の治療、改善及び／又は予防に使用するための、請求項６または７に記載のＨＳＰ９０阻害剤。
  26. ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を予測するための、少なくとも５つの株を含む細胞株の組み合わせの使用であって、前記少なくとも５つの株は
    Ａ４２７、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、Ｈ１２９９、Ｈ１３５５、Ｈ１３９５、Ｈ１４３７、Ｈ１５６３、Ｈ１５６８、Ｈ１６４８、Ｈ１６５０、Ｈ１６６６、Ｈ１７３４、Ｈ１７５５、Ｈ１７７０、Ｈ１７８１、Ｈ１７９２、Ｈ１８１９、Ｈ１８３８、Ｈ１９１５、Ｈ１９４４、Ｈ１９７５、Ｈ１９９３、Ｈ２００９、Ｈ２０３０、Ｈ２０５２、Ｈ２０８７、Ｈ２１１０、Ｈ２１２２、Ｈ２１２６、Ｈ２１７２、Ｈ２２２８、Ｈ２３、Ｈ２３４７、Ｈ２４４４、Ｈ２８、Ｈ３５８、Ｈ４４１、Ｈ４６０、Ｈ５２０、Ｈ５２２、Ｈ５９６、Ｈ６４７、Ｈ６６１、Ｈ８２０、ＨＣＣ２９３５、ＨＣＣ４００６、ＨＣＣ８２７、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＫＶＸ、Ｈ３２２Ｍ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、Ｃｏｌｏ６９９、ＤＶ−９０、ＨＣＣ１５、ＨＣＣ３６６、ＨＣＣ４４、ＨＣＣ７８、ＬＣＬＣ１０３Ｈ、ＬＣＬＣ９７ＴＭ１及びＬｏｕＮＨ９１からなる群より選択される使用。
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