JP2015222208A

JP2015222208A - 生体分析用のデバイス、分析装置および分析方法

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Publication number: JP2015222208A
Application number: JP2014106648A
Authority: JP
Inventors: 禎昭杉村; Teisho Sugimura; 斎藤　俊郎; Toshiro Saito; 俊郎斎藤
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2015-12-10
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: JP6482774B2

Abstract

【課題】強力な磁場下で１ミクロン以下の常磁性磁気微粒子を使用する場合、磁気微粒子が磁束に沿って数珠状の凝集体を形成し、平坦な粒子の層と粒子の塊が混ざって凸凹状になることが確認された。生体分析に使用する場合、この現象が定量性の低下に影響する。
【解決手段】微小な磁気微粒子を含む水溶液を濡れ性の異なる二枚の平面基板で構成されたフローセル構造を持ったデバイスに流し込み、次いで疎水性溶液を同デバイスに流し込むことで、磁気微粒子を一方の平面基板面に膜のように均一に固定でき、生体分子の定量性を向上できる。
【選択図】図２

Description

本発明は生体分子分析用のデバイスおよび、それを用いた分析装置、あるいはそれを用いた分析方法に関する。

近年、癌診断の分野では、早期に癌発症の徴候を知るため様々な癌マーカーが研究され、実用化も進んでいる。癌マーカーとは癌細胞由来の分泌型の生体因子であり、癌の進行とともに増加し血中や尿中に現れる。例えば、ホルモン、サイトカイン等のタンパク質、マイクロＲＮＡ等の核酸が知られている。早期の癌ではこれらの癌マーカーの量は少なく検出が難しい。発現量の少ない癌マーカーを検出する場合も同様である。

現在、主流である高感度の癌マーカー検出方法は、抗体を用いた免疫測定法であり、ＥＬＩＳＡやナノ微粒子アッセイといった手法が知られている。最近では、さらなる高感度な免疫測定法として、単分子で検出可能なデジタルカウンティング法が開発されている。

一方、患者から採取できる血液量は限られており、その中から極微量の癌マーカーを出来るだけ多く捕捉して検出することが求められる。例えば、５０ｕｌの血漿中から癌マーカーを検出する場合、早期の癌では癌マーカーは１０^-16〜１０^-12Ｍの濃度範囲であるため、５０ｕｌ中に３０００分子程度存在する標的分子を定量する検出感度が必要になる。このように低濃度の癌マーカーを検出可能な超高感度の検出装置が要求されている。

特許文献１並びに非特許文献１には、デジタルＥＬＩＳＡ法を用いた高感度検出装置を開示している。これらの文献では、抗体を用いて磁性粒子（磁気ビーズ）に検出対象分子を固定した後、酵素を結合させた抗体で検出対象分子を標識する。つまり抗体を介して磁気ビーズ、検出対象分子、酵素の複合体を形成する。この複合体を含む磁気ビーズ分散液を、内壁面に微細なウェルを有したフローセルに流し、次いで酵素の基質溶液を流し、更にオイルを流すことで、ウェルに磁性粒子を含んだ水溶液からなる微小反応容器を形成する。その後、このオイルにより独立した反応容器中で酵素反応を行い、蛍光物質を形成する。反応容器中の磁気ビーズが、検出対象分子及び酵素を含む複合体を形成していれば、その反応容器は酵素反応により蛍光を示す。この現象を画像により蛍光観察することで、無数の独立した反応容器のうち、または磁気ビーズのうち、いくつが酵素を含む複合体を形成していたかを定量できる。

特表２０１４−５０３８３１号公報

ＲｉｓｓｉｎＤＭｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎ２８（６）；ｐ５９５−５９９（２０１０）

特許文献１および非特許文献１に記載されている方式では、独立した微小反応容器のうち、いくつの微小反応容器が蛍光を示したかのカウントに基づいて測定対象成分の定量を行うため、カウント可能な数は観察視野中の反応容器の数で制限され、ダイナミックレンジが制限されてしまう問題がある。また独立した水滴で構成された反応容器を作成するには、反応容器側の基板に規則的な凹部（ウェル）を作成する必要があり、またより好ましくは、ウェル内部が親水性、ウェルとウェルの間の基板表面が疎水性にする必要があるなど、加工が複雑であり、デバイスの単価が高くなってしまう課題もあった。

本発明は上記課題に鑑み、簡易な構成の基板上を用いてデジタルカウンティング法による微量試料の分析を行う場合に、粒子を正確にカウントすることが可能となる分析装置を提供することを目的とする。

本発明は上記課題に鑑み以下の特徴を有する。すなわち、平面状の固定面を有する支持基板と、前記支持基板と離間して配置されるカバー基板と、前記指示基板とカバー基板との間に導入流路、捕捉領域、および排出流路を形成するデバイスと、前記デバイスの導入流路に第一の液体、次いで前記第一の液体よりも比重の軽い第二の液体を供給する供給手段と、前記デバイス内に固定された測定対象成分を発光させる手段と、前記デバイス内からの発光輝点の画像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段により得られた画像内の輝点数に基づいて測定対象成分を分析する手段と、を有することを特徴としている。

水溶液中に含まれる微小な微粒子を平面基板上に収集し、疎水性の溶液を流し込むことで余剰な水溶液を除去し、かつ、微粒子を単一の層で平面基板上に固定する。

本発明によれば上記構成により、測定対象物を含んだ微粒子が平面基板上に単層で固定されるため、測定のダイナミックレンジが基板の構造に限定されることがない。また、基板上にウェルを形成させる加工の必要がないため、デバイスの構成を簡易にすることが可能である。

本実施例のデバイス構造を説明するための図本実施例に用いるサンプルの調製方法を説明するための図。本実施例のデバイス構造と固定原理を説明するための図。本実施例の原理検証の結果を説明するための図。本実施例のデバイス構造を説明するための図本実施例４のデバイス構造を説明するための図本実施例５の生体分子分析装置の構成の一例を説明するための図。

実施例では、微粒子を二次元平面に提示するための平滑な支持基板を持つデバイスの構造と、当該デバイスを用いた生体分子分析装置、および当該微粒子を支持基板上に導入、固定、観察する手順について開示する。

本発明におけるデバイスの構造を図１に示す。本デバイス１００は、少なくとも一部が平面形状である支持基板１０１、カバー基板１０２、支持基板とカバー基板の間に設けられ支持基板とカバー基板との距離を規定する接着シート１０３からなる。

支持基板１０１は観察対象となる微粒子を固定する固定領域１０４が平坦な面で構成されている基板であり、既知の表面修飾手法の適用が容易かつ、可視光の反射率が低いものであれば何でもよい。特に好ましくは石英基板、ガラス基板、樹脂基板などである。

支持基板上に溶液を封止するカバー基板２０２としては、少なくとも固定領域１０４の直上に位置する観察領域１０５が可視光透過性の無機ガラスや光学樹脂で形成されていれば良い。

接着シート１０３は、支持基板１０１とカバー基板１０２の間に溶液を通すための一定のスペース（捕捉領域１０６）を有し、さらに捕捉領域１０６に溶液を導入するための導入流路１０７および注入口１０８、スペースから溶液および測定対象物を排出する排出流路１０９および排出口１１０を有する。なお、フローセルのギャップの形成方法は特に限定せず、別の方式を用いても良い。

次に図２を用いて測定対象物について説明する。

直径３００ｎｍの磁気微粒子２０２に対して、ＥＤＣ（ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２２９８０）およびＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（Ｗａｋｏ，０８９−０４０３２）を用いて抗ＰＳＡ抗体２０１を固定する。抗体が固定された後の磁気微粒子は、ＢＳＡで未反応部位をブロッキングし、緩衝液中で保管することが望ましい。この磁性微粒子を、抗原２０３である１ｆＭ〜１０００ｆＭのＰＳＡ溶液と混和し、３７℃で所定時間（約１ｈｒ）反応させる。その後、磁気微粒子を回収し、磁気微粒子上の抗体２０１とは異なる認識部位を持ち、抗体２０６とビオチン２０７からなるビオチン結合抗ＰＳＡ抗体（ビオチン化抗体２０４）および、ストレプトアビジン２０８と蛍光体２０９を結合させた蛍光標識ストレプトアビジン２０５と反応させる。

以上の反応を行うことにより、ＰＳＡ抗体２０１、磁気微粒子２０２、蛍光体２０９を含んだ複合体２１０を形成させることができる。複合体２１０を含んだ試料水溶液を洗浄した後、上述したデバイス１００に注入し、支持基板１０１上に固定させた後に蛍光観察を行う。ここでは、検出対象となる生体分子としてＰＳＡを示したが、本発明はそれに限定される物ではなく、検出対象は適切な抗体が得られるものであれば何であっても良い。

本発明の実施例１に係る生体分子分析方法を説明する。

一般的に、溶液中に浮遊する極微量の生体分子を、微粒子を用いて捕捉するためには、生体分子と微粒子の衝突頻度を高める必要がある。粒子体積当たりの表面積を大きくすると共に、分子運動量を向上させ、目的の生体分子との反応効率を高めるためには、１ミクロン以下の微小な磁気微粒子を用いることが考えられる。

一方、微小な磁気微粒子は磁化率が低く集磁しにくいため、支持基板上に固定する際には強力な磁場を長時間に亘って印加する必要がある。しかし、強力な磁場の元では、磁気微粒子が磁束に沿って数珠状の凝集体を形成し、粒子が平坦な層に捕捉された領域と、粒子が凝集して塊を形成した領域が混ざり、支持基板上に凸凹を形成して収集される場合がある。この現象は特に磁気微粒子濃度が高い場合に多く見られる。対物レンズの焦点深度を超えた凹凸が形成されると、部分的に焦点から外れる蛍光輝点が存在することになり、デジタルカウントする際の定量性が損なわれる。ピントのずれた輝点をすべて撮像するためにオートフォーカス機能を付けることもできるが、解析が複雑になる上に撮影に時間を要することになり高速検出にとっては不利となってしまう。

他の方式として重力などの外力を微粒子に働かせることにより支持基板上に複合体を収集させることも考えられる。この場合、微粒子の収集に磁場を用いないため、磁気微粒子以外の微粒子を使うことも可能である。しかし、１ミクロン以下の微粒子は水溶液中の分散性が良い場合も多く、十分に微粒子が沈降するまでにデバイスを長時間静置する必要があり、測定のスループットが低下する。以上より、高濃度の微粒子を平面基板上に高密度かつ均一に固定する必要があると言える。

上記を踏まえて本実施例１の実施形態を図３を用いて説明する。

本実施例１では、目的の生体分子と磁気微粒子が結合した複合体２１０を含む試料水溶液３０２を、注入口１０８からデバイス１００に注入する。試料水溶液中に含まれる複合体２１０が重力や磁力等によって支持基板１０１の近傍に沈降した後、注入口１０８から磁気微粒子や試料水溶液よりも比重の軽い疎水性溶液（ミネラルオイル３０１）を注入し、余剰な試料水溶液を押し出して排出口１１０から除去する。注入口１０８から注入するミネラルオイル３０１の注入方法、注入量および注入スピードを適切に制御することにより、ミネラルオイル３０１がカバー基板１０２側に充填され、複合体２１０を支持基板１０１側に押しつけ、単層かつ密に固定することができる。

図４は、支持基板１０１上に固定された複合体２１０に含まれる蛍光標識の発光画像を示す図である。

ミネラルオイル３０１を使用して磁気微粒子を固定した場合（図３（ｂ））、磁気微粒子が支持基板１０１上にほぼ単層かつ密に固定される。この状態で、磁気微粒子が固定されたデバイスあるいはカメラをＸＹ方向にスキャニングしつつ、固着領域の全面に亘って蛍光顕微鏡により画像観察することで、デバイス中の蛍光輝点数を正確にカウントすることが可能となる。蛍光輝点数は測定対象となる生体分子数を反映することから、サンプル中の生体分子濃度を定量することが出来る。

一方、ミネラルオイル３０１を使用せずに磁気微粒子を固定した場合（図３（ａ））、磁気微粒子は凝集等により支持基板上に複数の層を形成して固定され、あるいはブラウン運動により位置が変動するため、輝点に対するピントが合わず、正確に輝点数をカウントすることは難しい。また、磁力線の向きによって固定される磁気微粒子に粗密なムラが生じるため、捕捉領域１０６に密に固定することができず、測定のダイナミックレンジが確保できない。

なお、本実施例では磁気微粒子が支持基板１０１に単層で固定されるため、焦点深度が狭いレンズでも観察が出来、結果としてＮＡの高いレンズを用いることが可能である。高開口数のレンズを用いることで、蛍光検出の感度が向上し、蛍光像のＳＮ比が向上、ひいては輝点とバックグランドとの差異が明瞭となり、蛍光輝点の誤検出及び検出漏れを防ぐことが出来る。また、開口数の高いレンズを用いることにより、短い露光時間でＳＮ比の高い蛍光像を取得することが出来る為、一回の撮影に要する露光時間を短縮でき、サンプル全体のスキャニングに要する時間を短縮でき、測定ＴＡＴの低減につながる。

また、図５（ａ）に示すようにデバイス１００の補足領域１０６平面に対して平行な磁場５０１を発生させる磁石５０２を用いても良い。この場合、ミネラルオイル３０１を注入する前（図５（ｂ））の状態では磁場５０１の磁力線に沿って数珠状に磁気微粒子が連結・凝集する場合があるが、デバイス１００に磁気微粒子２０５を含んだ水溶液３０２を注入してから、所定時間（約５分間）磁石５０２の上で静置した後、ミネラルオイル３０１を注入することで、ミネラルオイル３０１と試料水溶液３０２の界面によって、連結・凝集した磁性微粒子が押し広げられ、支持基板１０１上に単層に固定される。磁力で積極的に支持基板側に磁気微粒子を引き付けることができるため、自重による沈降を待つ必要が無く、ミネラルオイル注入前の静置時間を短縮できることから、分析全体に要する時間を短縮できる。この場合、磁石５０２は、好ましくはネオジム磁石などの希土類磁石を指すが、その他の永久磁石、または電磁石であってもかまわない。また、磁場の向きは捕捉領域１０６平面に対して垂直方向であっても良い。

また、本実施例では磁気微粒子の一例として直径３００ｎｍの磁気微粒子を用いたが、その他の種類の磁気微粒子を用いても良い。例えば、直径５００ｎｍのＭａｓｔｅｒｂｅａｄｓｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ（Ａｄｅｍｔｅｃｈ，０２１５０）を用いた場合でも、同様に磁気微粒子を単層に固定することができる。大きい磁気微粒子を用いることにより、散乱像が鮮明になり、観察視野中の磁気微粒子のカウントが容易となる。観察視野間での磁気微粒子数のバラつきや、サンプル調整時の磁気微粒子のロスなどが生じた際にこれを検出できることから、測定結果の信頼性に優れる。また、３００ｎｍ磁気微粒子に比べ集磁が容易であることから、反応、特に洗浄工程に要する時間を短縮でき、検査にかかる時間を短縮できる。

また、本実施例では支持基板１０１およびカバー基板１０２の素材としてガラスを採用しているが、少なくとも一方が可視光域において透過性を有しておれば、材質は問わない。例えば樹脂製の基板であっても、プラズマ処理、ＶＵＶ処理、化学修飾などによる表面処理が可能であれば、本デバイスの材料として使用できる。

また、本実施例では接着シート１０３の厚みを５０ｕｍとしてフローセルを形成したが、３０ｕｍ〜５００ｕｍ程度であれば任意の厚みの接着シートを用いて良い。接着シートの厚みが厚いほど、基板及びシート部材の歪みが許容できるため、例えば樹脂等の安価な材料で形成可能であり、製造原価の低減につながる。本デバイスは極微量の成分検出を行う目的で用いられるており、そのような極微量成分の検出系はサンプル間のクロスコンタミネーションやキャリーオーバーに影響を受けやすい。そのため、本デバイスは使い捨てでの使用が好ましく、製造原価が低減することで、使い捨てでの使用が容易になる。

また、接着部材１０３の厚みが十分に薄い場合や、比較的大径の粒子を使用する場合は、磁場を使用せずとも微粒子が支持基板１０１上に沈降しやすいため、必ずしも磁気微粒子を使用する必要はなく、一般的な微粒子（磁気を有さない）を用いても良い。

本実施例の方式によれば、フローセル内部がミネラルオイルで置換され、親水性の磁気微粒子が支持基板から浮遊することができないように押し付けられるため、平坦な支持基板を用いた場合であっても、磁気微粒子のブラウン運動や、磁気微粒子の凝集による蛍光観察画像のぼけを防いで、ピントの合った画像を撮像でき、精度よくデジタルカウントすることが可能となる。

さらに、１ミクロン以下の磁気微粒子を用いることにより、蛍光を用いて生体分子の検出を行う場合であっても、磁気微粒子のサイズが励起波長および発光波長と同等以下であるため、蛍光発光を妨げることなく観察することができる。したがって、目的の生体分子と結合した磁気微粒子だけでなく、結合していない磁気微粒子が支持基板上に固定された場合でも、定量性を損なわず蛍光輝点を観察することができる。

また、従来技術のように支持基板上にウェルを形成する加工を行う必要がなく、また、形成されたウェルの個数によって測定のダイナミックレンジが制限されずに広いダイナミックレンジが実現できる。つまり、磁気微粒子の粒径が小さければ小さいほど、捕捉効率の向上および高密度な固着が可能となり、高感度検出・高速検出・広ダイナミックレンジが実現できる。

実施例２として、支持基板およびカバー基板の表面の濡れ性を変える表面処理を行う場合の実施形態について説明する。なお、実施例１と重複する記載については説明を省略する。本実施例では、デバイス１００の使用方法の具体例として、前立腺がんマーカー分子であるＰＳＡを検出する場合の適用例を示す。

本実施例２におけるデバイス１００は、濡れ性の異なる二枚の基板として、支持基板１０１とカバー基板１０２を張り合わせて作成されている。一例として、支持基板１０１は、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅｓ（ＭｕｔｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓｃｏ．，ＬＴＤ，５１１６）を用い、カバー基板１０２は、ＭｉｃｒｏＣｏｖｅｒＧｌａｓｓ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｎｏ１）を用い、両者を流路形状に切り抜いた５０ｕｍ厚の接着シート１０３（ＮｉｔｔｏＤｅｎｋｏ，ＤＰＳ１２２０）で張り合わせ、一定のギャップを持ったフローセル構造を形成する。

デバイス１００に観察対象となる磁気微粒子を含んだ試料水溶液３０２を捕捉領域１０６に導入し、支持基板１０１を下側にした状態で一定時間静置、あるいは磁場を印加することで磁気微粒子を支持基板１０１の方に沈降させる。その後、疎水性溶液であるミネラルオイル３０１（ＭｉｎｅｒａｌｏｉｌＬｉｇｈｔＷｈｉｔｅ，ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，１９４８３６）を同様に捕捉領域１０６に導入する。本実施例では、カバー基板１０２は疎水性を有するため、ミネラルオイル３０１は濡れ性の差からもカバー基板２０１側に優先して接触し易い。一方、磁気微粒子は水溶液中での分散性を高める為、表面に親水処理がなされていることが多く、ミネラルオイル３０１層には分配されない。結果として、磁気微粒子はミネラルオイル３０１と試料水溶液３０２の界面に押し付けられ、親水性を有する支持基板１０１の上面に単層かつ密に固定される。

なお、支持基板１０１とカバー基板１０２は、濡れ性の異なる部材であれば他の部材を用いても良い。本実施例においては、支持基板１０１の濡れ性は蒸留水の接触角１０〜３０°程度で十分であるが、より効果を得るためには接触角は１０°未満を示し、カバー基板１０２は接触角４０〜６０度を示す。より好ましくは、支持基板１０１は洗浄したガラスなどで形成され、カバー基板１０２に比較して濡れ性が高い。ただし、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）などの疎水性ポリマーでもＯ₂プラズマやカルボキシル基の導入によって表面を親水化処理することで利用することができる。

なお、注入されるミネラルオイルの比重は、磁気微粒子や水溶液に比べて小さければさらに良い。本実施例で用いたミネラルオイルの比重は約０．８５であり、比重の軽いミネラルオイルはデバイス１００の上面に配置されたカバー基板１０２側に広がり易い。そのため、比重の重い磁気微粒子は、デバイス１００の下面に配置される支持基板１０１側に押しつけられ易くなる。

また、本実施例で示した支持基板１０１やカバー基板１０２に対して、安定して両基板の濡れ性の差を再現する為の表面処理を行っても良い。例えば、支持基板側のガラスをＫＯＨ洗浄して更に濡れ性を向上させることや、カバー基板表面にＳｉｌａｎｅ−ＰＥＧ処理を行って撥水性を向上させても良い。カバー基板側の親水性が高い場合、磁気微粒子の一部がカバー基板側にも固定されてしまう現象が確認されており、カバー基板側は撥水的であるほうが、本デバイスの構成としては好ましい。

本実施例によれば、支持基板１０１とカバー基板１０２の濡れ性を利用することでミネラルオイル３０１はカバー基板１０２側に接触しやすくなる。そのため、磁気微粒子が十分に沈降するまで静置時間を設けなくとも、磁気微粒子を支持基板１０１上に押しつけ固定することが可能となり、分析に要する時間を短縮することができる。

実施例３として、支持基板１０１に接着層をコーティングした場合の実施例を示す。なお、実施例１と重複する記載については説明を省略する。

本実施例では実施例１の構成のうち、支持基板１０１として、ＡＰＳコートガラスＵｌｔｒａＧＡＰＳ^TM ＣｏａｔｅｄＳｌｉｄｅｓ（ＣｏｒｎｉｇＩｎｃ．，４００１６）を用いた。ＡＰＳコートされたガラス表面はアミノ基による正電化を帯びており、負電荷を有するカルボキシル基ビーズと結合しやすい。本実施例における磁気微粒子は、実施例１と同様に、カルボキシル基ビーズに抗体及びＢＳＡを結合させた物を用いる。なお、一部のカルボキシル基はタンパクと結合しておらず、負電化を有している。

デバイス１００内に試料水溶液３０２を注入した後に室温で静置することで、ＡＰＳコートされた支持基板上に負電荷を有する磁気微粒子が引き付けられる。その後、ミネラルオイル３０１を注入すると、支持基板１０１上に単層で磁気微粒子を固定させることが可能となり、画像観察時に輝点数を精度よくカウントすることが可能となる。

さらに、支持基板１０１に比べてカバー基板１０２の濡れ性を低くすれば、より短時間で磁気微粒子を支持基板上に固定することが可能となる。その場合は、ＰＥＧやフッ素を有する表面修飾を行うことが好ましい。そのような表面修飾は、カバー基板にガラスを用いた場合、ＳｉｌａｎｅＰＥＧやＣＦ₃−（ＣＦ₂）₅−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₁₁−Ｓｉ（ＯＭｅ）₃、Ｓｉ（ＯＭｅ）₃−（ＣＨ₂）₁₁−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ₆Ｆ₅との反応で得られる。

また、本実施例では支持基板１０１の材質にＵｌｔｒａＧＡＰＳ？ＣｏａｔｅｄＳｌｉｄｅｓ（ＣｏｒｎｉｇＩｎｃ．，４００１６）を用いたが、例えばＭＡＳコート付マイクロスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｓ９１１５）を用いた場合でも、同様に磁気微粒子を固定化できる。なお、ここでは具体的に製品を挙げたが、基本的には使用する磁気微粒子と親和性を有する組み合わせであれば良く、例えばポリリジン被覆ガラスなどでも良い。

なお、本実施例における固定化方法では、フローセルの高さ（磁気微粒子の補足面に対して垂直方向の長さ）を調整することで、磁気微粒子注入からミネラルオイル注入までの時間、つまり磁気微粒子固定に要する時間を調整できる。５０ｕｍ、３０ｕｍ、１０ｕｍ、５ｕｍのぞれぞれの厚みの接着シート（５０ｕｍ（ＮｉｔｔｏＤｅｎｋｏ，ＤＰＳ１２２０），３０ｕｍ（ＮｉｔｔｏＤｅｎｋｏ，５６０３），１０ｕｍ（ＮｉｔｔｏＤｅｎｋｏ，５６０１），５ｕｍ（ＤＩＣ株式会社，８６０２ＴＮＷ−０５））を用い、フローセルの高さ１０９（支持基板とカバー基板間の距離）を変更した場合に磁気微粒子の固定に要する時間を検討した所、高さ方向の厚みが薄いほど短時間での固定が可能となり、特に厚みが１０ｕｍ以下の場合には１５分以下での固定が可能であった。これは高さが減少したことにより磁気微粒子が支持基板表面の接着層に衝突するまでの移動距離が短くなったためと考えられる。

なお、捕捉領域１０６あるいは注入流路１０７や注入口１０８に図示しない温調素子を設け、フローセル内の温度を制御して磁気微粒子の固定時間を短縮させても良い。磁気微粒子の固定速度は磁気微粒子の移動速度により決定される。アインシュタインストークスの式によれば、温度が高いほど粒子の拡散速度は速くなる。なお、温度は測定対象の生体分子や生体分子を含んだ複合体を変性・乖離させる場合があるため、測定対象物質の種類に応じて温調素子の温度を制御する手段を備えることが望ましい。

また、さらに磁石５０２を用い、積極的に接着層が設けられた支持基板側に磁気微粒子を集積させても良い。この場合、ギャップ２０４が５０ｕｍ以上であっても迅速に支持基板表面に磁気微粒子を集めることが可能となる。この支持基板１０１、カバー基板１０２間のギャップ寸法が大きい場合、高精度の寸法で作成する必要が無い為、デバイスを安価に製造することが出来る。例えば、ギャップ寸法２００ｕｍであれば樹脂のような張り合わせ時に歪みの生じやすい部材であっても作成できることから、製造原価低減が期待できる。

実施例４として、基板表面に微細な凹凸を有した支持基板を用いた場合の実施例を説明する。なお、実施例１と重複する記載については説明を省略する。

本実施例では、光学樹脂Ｚｅｏｎｏｒの表面に熱ナノインプリント法でナノピラー構造を形成した支持基板１０１を用いる。ナノピラー構造６０２により、磁気微粒子を支持基板１０１上に安定して固定することができ、ミネラルオイル３０１を注入した際においても、磁気微粒子がミネラルオイル３０１と試料水溶液３０２の界面３０３に押されて剥がれ、流されることを防ぐことができる。そのため、ミネラルオイル３０１を高速度で注入した場合でも磁気微粒子が支持基板上に保持されるので、分析装置としてのスループットを向上させることが可能となる。この効果はナノピラー構造５０２凹凸構造を設けたことにより、支持基板の最表面におけるオイル流速が低下する、若しくは単純に磁気微粒子が凹凸構造に捕捉されたことによる結果と考えられる。

本実施例におけるナノピラー構造６０２は、高さ６０３が２５０〜５００ｎｍ、形状が直径６０４およそ２２０〜５００ｎｍの円柱、間隔６０５が５００〜１０００ｎｍの正方格子状に並んだ構造である。観察対象となる蛍光物質の励起波長よりも小さな構造物を用いることにより、その構造物由来の散乱が蛍光像に漏れこんでしまうことを防ぐことができる。

前述の散乱の観点から、本デバイスでの微細な凹凸の形状は制御された物が好ましく、例えばガラスに対してはフッ化水素アンモニウムによるエッチングやサンドブラスト法などで作成されたランダムな凹凸は、蛍光観察時に励起光を散乱してしまい蛍光輝点と誤認識されてしまうため適さない。本デバイスの微細な凹凸として適する他の形状としては、モス・アイ構造が挙げられる。モス・アイ構造は、入射方向に対する反射率が低いことが知られており、本デバイスの用途に適する。

また、支持基板上の微細な凹凸構造の作成は、石英基板やガラス基板に対するドライエッチングや、ガラス及び樹脂に対する熱ナノインプリンティングにより作成しても良い。

実施例５として、本発明におけるデバイス２００を用いた生体分子分析装置について説明する。

図７は本実施例における生体分子分析装置７００の構成を示す図である。生体分子分析装置７００は、支持基板１０１とカバー基板１０２を含むデバイス１００、デバイス１００に磁気微粒子を含んだ試料水溶液３０２と、ミネラルオイル３０１を注入する為の送液管７０４、照射光を発する光源７０７、光源からの照射光をデバイスに照射する対物レンズ７１１、デバイス１００からの発光を測定するカメラ等の撮像手段７１３、デバイス１００を水平方向にスキャンさせる可動ステージ７０１、デバイス内の液体を排出する排出管７０５を有する。なお、本実施例ではデバイス１００を駆動させているが、光源および撮像手段を含む光学系の方を駆動させる方式であっても良い。

送液管７０４及び排出管７０５の材料は、溶液を送液できるものであれば特に限定しないが、例えばシリコンチューブを使用するのが一般的である。また、送液管側の送液経路には２流路以上の切り替えが可能なバルブ７１６が設けられており、磁気微粒子を含んだ試料水溶液３０２とミネラルオイル３０１を切り替えてデバイスに送り込める構造となっている。

試料水溶液３０２を送液ポンプ７１５によって、デバイス１００内に注入した後、磁石等の磁場発生装置７０６により磁場を発生させ、支持基板２０１表面に磁気微粒子２０５を引き付ける。なお、磁場発生装置７０６による磁場印加状態を切り替えるため、磁場発生装置７０６は捕捉領域１０６に対して移動可能に設けられ、磁場発生装置７０６と捕捉領域１０６との距離を変更する手段（モータ等）が設けられていても良い。

その後、バルブ６１６を切り替え、ミネラルオイル３０１をデバイス１００内に流し込み、磁気微粒子を支持基板１０１の上に単層かつ密に固定する。なお、磁場発生装置７０６は必ずしも設けている必要はなく、磁場以外の方法によって収集する場合や、デバイスの厚みが十分に薄い場合、磁気微粒子が沈降するのに十分な静置時間を確保できる場合には磁場発生装置７０６は不要である。

光源７０７は、用いる蛍光体の種類によって適切なものを選択する。例えば、蛍光標識用の蛍光色素として、量子ドットを用いる場合には、光源７０７に水銀ランプを用いるのが望ましい。また、ＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ）も使用できる。光源７０７から発する励起光は、励起フィルタ７０８とレンズ７０９を通し、ダイクロイックミラー７１０によって対物レンズ７１１に導き、デバイスの支持基板１０１上に照射される。

励起光が照射されることによりデバイス中に固定された蛍光標識付分子から発せられる蛍光は、励起光と同軸光路を逆に進み、対物レンズ７１１で集められた後、ダイクロイックミラー７１０を通過し、結像レンズ７１２により撮像手段である２次元ＣＣＤカメラ７１３の感光面上に結像される。なお、励起光の散乱光は吸収フィルタ７１４によって除去される。

望ましくは、定量性を高めるためには２次元ＣＣＤカメラ７１３で観察可能な輝点数を増やすため、デバイス１００を載せた可動ステージ７０１を動作させ、支持基板１０１上をスキャンしても良い。上記のように、対物レンズ７１１、送液ポンプ７１５、光源７０７及び蛍光検出ユニット（２次元ＣＣＤカメラ７１３）、磁場発生装置７０６、可動ステージ７０１を備えた生体分子分析装置を用いることで、約３分で１００視野（１６ｍｍ²）の固着面積をスキャンすることができる。これは一層に敷き詰めた磁気微粒子を１．８×１０⁷個観察できる速さに相当する。

１０１支持基板
１０２カバー基板
１０３接着シート
１０４固定領域
１０５観察領域
１０６捕捉領域
１０７導入流路
１０８注入口
１０９排出流路
１１０排出口

２０１抗体
２０２磁気微粒子
２０３抗原
２０４ビオチン化抗体
２０５蛍光標識ストレプトアビジン
２０６抗体
２０７ビオチン
２０８ストレプトアビジン
２０９蛍光体
２１０複合体

３０１ミネラルオイル
３０２試料水溶液

５０１磁場
５０２磁石

６０２ナノピラー構造
６０３高さ
６０４直径
６０５間隔

７００生体分子分析装置
７０１可動ステージ
７０４送液管
７０５排出管
７０６磁場発生装置
７０７光源
７０８励起フィルタ
７０９レンズ
７１０ダイクロイックミラー
７１１対物レンズ
７１２結像レンズ
７１３２次元ＣＣＤカメラ
７１４吸収フィルタ
７１５送液ポンプ
７１６バルブ

Claims

平面状の固定面を有する支持基板と、前記支持基板と離間して配置されるカバー基板と、前記指示基板とカバー基板との間に導入流路、捕捉領域、および排出流路を形成するデバイスと、
前記デバイスの導入流路に第一の液体、次いで前記第一の液体よりも比重の軽い第二の液体を供給する供給手段と、
前記デバイス内に固定された測定対象成分を発光させる手段と、
前記デバイス内からの発光輝点の画像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により得られた画像内の輝点数に基づいて測定対象成分を分析する手段と、を有することを特徴とする分析装置。
請求項１記載の分析装置において、
前記第一の液体は親水性溶液、前記第二の液体は疎水性溶液であり、
前記固定面は前記カバー基板よりも高い濡れ性を有することを特徴とする分析装置。
請求項１記載の分析装置において、
前記デバイスまたは前記撮像手段をスキャンする駆動手段を有することを特徴とする分析装置。
請求項１記載の分析装置において、
前記第一の液体は測定対象成分と磁気微粒子が結合した複合体を含む液体であって、
前記デバイスの下方に液体中の複合体を収集する磁場発生手段を備えたことを特徴とする分析装置。
請求項１記載の分析装置において、
前記発光させる手段は励起光源であり、
前記撮像手段は励起光源からの励起光の照射により生じる蛍光を検出する二次元光検出装置であることを特徴とする分析装置。
請求項１記載の分析装置において、
前記固定面はさらに接着面コーティングされていることを特徴とする分析装置。
請求項１記載の分析装置において、
前記固定面はさらにナノピラー構造またはモス・アイ構造を有することを特徴とする分析装置。
平面状の固定面を有する支持基板と、
前記支持基板と離間して配置されるカバー基板と、を有し、
前記支持基板と前記カバー基板との間に導入流路、捕捉領域、および排出流路を形成され、
第一の溶液を導入し、その後、前記第一の液体よりも比重の軽い第二の溶液を導入し、前記第一の溶液中に含まれる測定対象成分の量をカウントするためのデバイスであって、
前記支持基板は前記カバー基板よりも下側に配置されることを特徴とするデバイス。
請求項８記載のデバイスにおいて、
前記第一の溶液は親水性溶液、前記第二の溶液は疎水性溶液であり、
前記固定面は前記カバー基板よりも高い濡れ性を有することを特徴とするデバイス。
請求項９記載のデバイスにおいて、
前記第一の溶液は電荷を帯びた粒子を含み、
前記固定面は前記電荷を帯びた粒子を引き付けるための接着層がコーティングされていることを特徴とするデバイス。
請求項８記載のデバイスにおいて、
前記固定面はナノピラー構造またはモス・アイ構造を有することを特徴とするデバイス。
少なくとも測定対象物と微粒子が結合された複合体を含む第一の液体を平面状の固定面に導入する工程と、
導入された複合体を前記固定面に固定する工程と、
前記固定面に試料溶液よりも比重の軽い第二の液体を導入し、余剰な第一の液体を前記捕捉領域から排出する工程と、
前記捕捉領域上に固定された複合体の数をカウントする工程と、を有する生体分子分析方法。
請求項１２記載の生体分子分析方法において、
前記固定面は親水性を有し、
前記第一の液体は水溶液であり、前記第二の液体は疎水性溶液であることを特徴とする生体分子分析方法。
請求項１２記載の生体分子分析方法において、
前記微粒子は直径１ミクロン以下の磁気微粒子であることを特徴とする生体分子分析方法。
請求項１２記載の生体分子分析方法において、
前記捕捉領域は接着層コーティングされていることを特徴とする生体分子分析方法。
請求項１２記載の生体分子分析方法において、
前記捕捉領域はナノピラー構造またはモス・アイ構造を有することを特徴とする生体分子分析方法。