JP2015204844A - アポトーシスのインビボ検出 - Google Patents
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Abstract
【課題】生物体における細胞のアポトーシス状態のインビボ定量のための方法および製品を提供する。【解決手段】本発明は、生物体における細胞のアポトーシス状態を決めるのに有用な方法で、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された、動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが細胞のアポトーシス状態と相関する、方法、およびキットなどの製品を提供する。本発明の別の実施態様において、アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法が提供される。この疾患としては、緑内障、黄班変性、増殖性網膜症、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病および心疾患が挙げられるが、これらに限定されない。【選択図】図5
Description
(関連出願)
この特許書面は、2005年10月21日に出願された米国出願第60/729,227号(この出願は、参考として本明細書に援用される)の優先権の利益を主張する。
この特許書面は、2005年10月21日に出願された米国出願第60/729,227号(この出願は、参考として本明細書に援用される)の優先権の利益を主張する。
(背景)
アネキシンVおよびアネキシンV誘導体を用い、インビボにおけるアポトーシス検出および画像化の試みが為されている(例えば、非特許文献1;Belhocineら、2004;Reddy,2005;Boermanら、2005;Watanabeら、2006;Vanderheydenら、2006;および、Corstenら、2006を参照)。細胞原形質膜の正常組織の撹乱および変化に依存する新規化合物による他の試みも行われている(例えば、特許文献1および特許文献2を参照)。
アネキシンVおよびアネキシンV誘導体を用い、インビボにおけるアポトーシス検出および画像化の試みが為されている(例えば、非特許文献1;Belhocineら、2004;Reddy,2005;Boermanら、2005;Watanabeら、2006;Vanderheydenら、2006;および、Corstenら、2006を参照)。細胞原形質膜の正常組織の撹乱および変化に依存する新規化合物による他の試みも行われている(例えば、特許文献1および特許文献2を参照)。
従来記載される方法はどれも、アポトーシスの検出および画像化のために細胞浸透性プローブを用いていない。このこと、および他の不備のため、前述の方法は全て、いくつかの問題点を抱えることになり、その結果、背景ノイズが高くなり、ある種のアポトーシス腫瘍細胞に対する結合が欠如する。アネキシンVは、細胞浸透性ではなく、いずれの組織に対しても浸透が遅く、高い背景ノイズを有し、かつ、初期のアポトーシス細胞を検出しない(非特許文献1;Belhocineら、2004;Boersmaら、2005;Watanabeら、2006;Vanderheydenら、2006;および、Corstenら、2006)。背景ノイズが高くなってしまうのは、アネキシンVが、正常で健康な骨髄由来細胞に積極的に結合するからである(Dillon,2001)。アネキシンVは、必ずしも全ての腫瘍細胞に結合しないことが報告されている(Dicker,2005)。
Ziv公刊物では(特許文献1および特許文献2)、発明人の化合物が、細胞壁の代謝回転を受けない細胞よりも、アポトーシス細胞の方に高速で蓄積することが報告されている。これによって、背景レベルが高くなり、アネキシンV同様、特異性が欠如する。危機的な細胞状態を要求することも、アポトーシスの初期段階にある細胞の検出を妨げる。
このようにして、インビボにおけるアポトーシス検出および画像化に関して従来記載される方法は、特異性および感度に欠け、高い背景ノイズに暴露される。アポトーシスに関与する特異的活性酵素およびプロテアーゼに対して結合する、高感度で、特異的な細胞恒久性抑制剤プローブの使用は従来記載されていない。
Kietselaerら、Q J Nucl Med,(2003)47(4)349−361
したがって、生物体における細胞のアポトーシス状態のインビボ定量のための方法および製品が求められている。
(本発明のいくつかの実施態様の概要)
したがって、本発明のいくつかの実施態様は、インビボにおける、例えば、生物体、例えば、動物における細胞のアポトーシス状態を判定するのに有用な方法、およびキットなどの製品を提供する。
したがって、本発明のいくつかの実施態様は、インビボにおける、例えば、生物体、例えば、動物における細胞のアポトーシス状態を判定するのに有用な方法、およびキットなどの製品を提供する。
本発明は、インビボにおけるアポトーシス事象の検出および画像化を可能とする、上方調整カスパーゼおよびアポトーシス関連酵素に対して特異的に結合する、細胞恒久性プローブを提供する。
本発明のある実施態様は、動物における一つ以上の細胞のアポトーシス状態のインビボ判定法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤(caspaseaffinitylabeling
agent)が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤
の存在または豊富さを検出することを含み、前記カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、細胞のアポトーシス状態と相関する、方法を提供する。
agent)が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤
の存在または豊富さを検出することを含み、前記カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、細胞のアポトーシス状態と相関する、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、治療薬が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、以前に該治療薬によって治療されたことがあり、かつ、以前に少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、治療薬のアポトーシス調節能力と相関する、方法を提供する。本発明のある実施態様では、方法は、該治療薬が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する。
本発明のある実施態様は、放射線治療が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボにおいて判定するための方法であって、以前に少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該動物は以前に放射線治療を受けたことがあり、かつ、該カスパーゼ親和性標識剤の存在は、該放射線のアポトーシス調節能力と相関する、方法を提供する。本発明のある実施態様では、方法は、該放射線治療が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する。
本発明のある実施態様は、アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された、動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無が、該疾患の有無と相関する、方法を提供する。
本発明のある実施態様では、該疾患として、眼疾患、例えば、緑内障、網膜疾患、例えば、黄班変性および増殖性網膜症;神経変性疾患、例えば、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病など;および心疾患が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のある実施態様は、少なくとも一つの治療薬または治療に対する疾患の感受性を評価するためのインビボ法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無を検出することを含み、該動物が以前に該治療薬または治療を受けたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、少なくとも一つの治療薬または治療に対する該疾患の感受性と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、動物における癌治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、動物における白血病治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、動物における血液および骨髄疾患治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、化学ライブラリー中の一つ以上の化合物が、動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、該ライブラリーの一つ以上の化合物と接触させられた動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを定量すること、および、該一つ以上の化合物が該カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定することを含む方法を提供する。
本発明のある実施態様は、化学ライブラリー中の一つ以上の化合物が、動物においてアポトーシスを調節するかどうかを判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、該ライブラリーの一つ以上の化合物と接触させられた動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを定量すること、および、該一つ以上の化合物がアポトーシスを調節するかどうかを判定することを含む方法を提供する。
本発明のある実施態様では、該判定工程が、該動物における親和性標識剤のレベルを、該化合物に暴露されないコントロール動物と比較することを含む。
ある実施態様では、該判定工程が、該化合物に暴露される前と、該化合物に暴露された後の、該動物における親和性標識剤のレベルの比較から構成される、長期的な研究である。この場合、動物は、化合物に暴露される前に親和性標識剤に接触させられ、化合物に暴露されて後もう一度接触させられる。
本発明のある実施態様では、検出は、NMR、MRI、CT、CAT、またはPETスキャン;フローサイトメーター;レーザースキャニング・サイトメーター;蛍光マイクロプレートリーダー;発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー;蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;発光顕微鏡またはシンチグラフィー;明視野顕微鏡;全身動物蛍光画像システム(光学画像システム);または、全身動物発光画像システム、またはこれらの組み合わせを用いて実行される。
本発明のある実施態様では、検出は、動物の体内に挿入されたウィンドウチェンバー(windowchamber)を用いて行われる。
本発明のある実施態様では、検出は、蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる。
本発明のある実施態様では、検出は、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法によって動物からサンプルを取り出すことによって実行、または確認され、検出は、動物から取り出されたサンプルに対して行われる。
本発明のある実施態様では、検出は、フローサイトメーター;レーザースキャニング・サイトメーター;蛍光マイクロプレートリーダー;発色マイクロプレートリーダー;蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;明視野顕微鏡;発光マイクロプレートリーダー;または発光顕微鏡を通じて行われる。
本発明のある実施態様では、親和性標識剤の存在または豊富さは、動物の骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、または、循環血において検出される。
本発明のある実施態様では、親和性標識剤の存在または豊富さは、末梢血単球(PBMC)において検出される。
本発明のある実施態様では、細胞は、動物の組織、器官、または腫瘍に含まれる。
本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって動物に導入される。
本明細書で用いる動物という用語は、任意のタイプの生きている生物体、例えば、多細胞生物体を指す。本発明のある実施態様では、動物は哺乳動物である。本発明のある実施態様では、哺乳動物は、ヒトの男性または女性である。
本発明のある実施態様は、包装材料、および一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤、および、インビボでアポトーシスレベルを定量するためにカスパーゼ親和性標識剤を使用するための説明書を含むアッセイキットを提供する。
本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、式I:
L1−A1−X1−NH−CH(R1’)C(=O)CH2F (I)
の化合物から成る細胞恒久性プローブである。
L1−A1−X1−NH−CH(R1’)C(=O)CH2F (I)
の化合物から成る細胞恒久性プローブである。
式中、L1は、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ユーロピウム(Eu)、または、他の、任意のランタニド系列元素(例えば、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、またはLu)、または鉄(Fe)、マンガン(Mn)、レニウム(Re)、またはテクネチウム(Tc)を含んでもよい検出可能な基である。この検出可能な基は、核磁気共鳴(NMR)、または磁気共鳴画像(MRI)検出、または発光またはシンチグラフィーにとって好適であってもよい。検出可能基は、例えば、コンピュータ断層撮影法(CTスキャン)、またはコンピュータ体軸断層撮影法(CATスキャン)検出用として、ヨウ素(I)、またはバリウム(Ba)であってもよい。検出可能基は、例えば、ポジトロン発射断層撮影法(PETスキャン)用として、ポジトロンエミッター(例えば、11C、13N、15O、または64Cu)であってもよい。検出可能基は、蛍光標識(例えば、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Cy染料誘導体、BODIPY誘導体、クマリン誘導体、QuantumDot、または、例えば、直接、ま
たはリンカーを介してアミノ基に付着させることが可能な任意の蛍光染料)であってもよい。検出可能基は、放射性同位体(例えば、3H、14C、または35S)であってもよい。
たはリンカーを介してアミノ基に付着させることが可能な任意の蛍光染料)であってもよい。検出可能基は、放射性同位体(例えば、3H、14C、または35S)であってもよい。
A1は、直接結合、または、単純に共有結合であってもよいリンカーである。この検出可能基は、ペプチドまたはアミノ酸の、N−末端アミノ基に直接付着されてもよい(例えば、アミド結合L−(C=O)−NH−R)。A1はまた、任意の数の、当該技術分野で周知のリンカークラスであってもよい。リンカーは、通常、炭素、窒素、酸素、または硫黄原子を含む、約4〜18原子長を有する。
X1は、不在か、アミノ酸か、または、約1から10個のアミノ酸を持つペプチド、例えば、約2から4個のアミノ酸持つペプチド(例えば、V、VA、YVA、DEV、LEE、LEH、VDVA、IET、WHE、またはAEV)であってもよいペプチドである。式(I)の化合物において、X1は、天然のアミノ酸(例えば、A、V、またはE)であってもよい。式(I)の化合物において、R1’は、メチレンカルボキシ(エタン酸)側鎖(CH2−COOH)であってもよい。なぜなら、カスパーゼは、通常、ペプチド基質のP1位置にアスパラギン酸塩を有するからである。
R1’は、例えば、アスパラギン酸側鎖(CH2−COOH)か、またはアスパラギン酸のエステル(例えば、−CH2CO2R、式中、Rは、C1〜C6アルキルまたはベンジル、CH3、C2H5、またはCH2C6H5)である。あるカスパーゼ親和性標識プローブは、同じ標識、および1から5個のアミノ酸配列を含んでもよいが、アスパラギン酸のアザ−ペプチドエポキシド修飾(例えば、米国特許第7,056,947B2号を参照)、またはアザ−ペプチド・マイケルアクセプター(Ekiciら、2004)、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾(HC=O)、クロロメチルケトン基(CH2Cl)、またはアシルオキシ反応基((C=O)O−Ar、式中、Arは、[2,6−(CF3)2]ベンゾエート、または、その、各種誘導体である)(Krantzら、1991、およびThornberryら、1994)を利用してもよい。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
動物における一つ以上の細胞のアポトーシス状態のインビボ判定法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該細胞のアポトーシス状態と相関する、方法。
(項目2)
治療薬が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、以前に該治療薬によって治療されたことがあり、かつ、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤を導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、該治療薬のアポトーシス調節能力と相関する、方法。
(項目3)
上記方法は、上記治療薬が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する、項目2に記載の方法。
(項目4)
放射線治療が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該動物は以前に放射線で治療されたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、該放射線のアポトーシス調節能力と相関する、方法。
(項目5)
上記方法は、上記放射線治療が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する、項目4に記載の方法。
(項目6)
アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無が、該疾患の有無と相関する、方法。
(項目7)
上記疾患が、眼疾患、神経変性疾患、または心疾患である、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記疾患が、緑内障、黄班変性、増殖性網膜症、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、またはハンチントン病である、項目7に記載の方法。
(項目9)
少なくとも一つの治療薬または治療に対する疾患の感受性を評価するためのインビボ法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無を検出することを含み、該動物が以前に該治療薬または治療を受けたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、少なくとも一つの治療薬または治療に対する該疾患の感受性と相関する、方法。
(項目10)
動物における癌治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある該動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
(項目11)
動物における白血病治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある該動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
(項目12)
動物における血液および骨髄疾患治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
(項目13)
一つ以上の化合物が、動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、
少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを決定する工程であって、該動物はまた一つ以上の化合物と接触されている、工程、および、
該一つ以上の化合物が、該カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定する工程を含む方法。
(項目14)
一つ以上の化合物が、動物においてアポトーシスを調節するかどうかを判定するための方法であって、
少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを決定する工程であって、該動物は一つ以上の化合物と接触されている、工程、および、
該一つ以上の化合物がアポトーシスを調節するかどうかを判定する工程を含む方法。
(項目15)
上記判定工程が、上記動物における親和性標識剤のレベルを、上記化合物に暴露されないコントロール動物と比較することを含む、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
上記判定工程が、上記化合物に暴露される前の上記動物における親和性標識剤のレベルと、該動物が該化合物に暴露された後の親和性標識剤のレベルとを比較することを含む長期的な研究である、項目13または14に記載の方法。
(項目17)
検出が、NMR、MRI、CT、CAT、PETスキャン、シクチグラフィー(sctintigraphy)、フローサイトメーター、レーザースキャニング・サイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、発光顕微鏡、明視野顕微鏡、全身動物蛍光画像システム、全身動物発光画像システム、またはこれらの組み合わせを用いて実行される、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
検出が、上記動物の体内に挿入されたウィンドウチェンバーを用いて行われる、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
検出が、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる、項目18に記載の方法。
(項目20)
検出が、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法などによって、上記動物からサンプルを取り出すことによって実行、または確認され、検出は、該動物から取り出されたサンプルに対して行われる、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
上記検出が、フローサイトメーター;レーザースキャニング・サイトメーター;蛍光マイクロプレートリーダー;発色マイクロプレートリーダー;蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;明視野顕微鏡;発光マイクロプレートリーダー;または発光顕微鏡による、項目20に記載の方法。
(項目22)
上記親和性標識剤の存在または豊富さが、上記動物の骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、または循環血において検出される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
上記親和性標識剤の存在または豊富さが、末梢血単球において検出される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
上記細胞が、上記動物の組織、器官、または腫瘍に含まれる、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって上記動物に導入される、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
上記動物が哺乳動物である、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
上記哺乳動物がヒトである、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、式I:
L1−A1−X1−NH−CH(R1’)C(=O)CH2F (I)
の化合物であり、式中、
L1は検出可能な基であり;
A1は、直接結合、またはリンカーであり;
X1は、不在か、アミノ酸か、またはペプチドであり;および、
R1’は、アスパラギン酸側鎖、アスパラギン酸のエステル、該アスパラギン酸のアザペプチドエポキシド修飾、アザ−ペプチド・マイケルアクセプター、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾、クロロメチルケトン基、またはアシルオキシ反応基を含む、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
上記検出可能基がランタニド系列元素を含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記検出可能基がポジトロンエミッターを含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
上記検出可能基が蛍光標識を含む、項目28に記載の方法。
(項目32)
上記検出可能基が放射性同位体を含む、項目28に記載の方法。
(項目33)
上記検出可能基が、Gd、Tb、Eu、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Fe、Mn、Re、およびTc、I Ba、11C、13N、15O,64Cu、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Cy染料誘導体、BODIPY誘導体、クマリン誘導体、QuantumDot、3H、14C、または35Sを含
む、項目28に記載の方法。
(項目34)
X1が、V、VA、YVA、DEV、LEE、LEH、VDVA、IET、WHE、AEV、A、V、またはEである、項目28に記載の方法。
(項目35)
R1’が、CH2−COOH、または−CH2CO2Rであり、式中、Rは、C1−C6アルキルまたはベンジル、CH3、C2H5、またはCH2C6H5である、項目28に記載の方法。
(項目36)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル(O−メチル)−フルオロメチルケトンである、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
上記カスパーゼ親和性標識剤が細胞浸透性である、項目1〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、活性触媒部位に共有結合することによって活性カスパーゼを阻害し、かつ、上記細胞内に保持される、項目1〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
包装材料、一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤、注入用バッファー、および、インビボでアポトーシスレベルを定量するために該カスパーゼ親和性標識剤を使用するための説明書を含むアッセイキット。
(項目40)
上記一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤が、項目28〜38のいずれか1項に記載の化合物を含む、項目39に記載のキット。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
動物における一つ以上の細胞のアポトーシス状態のインビボ判定法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該細胞のアポトーシス状態と相関する、方法。
(項目2)
治療薬が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、以前に該治療薬によって治療されたことがあり、かつ、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤を導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、該治療薬のアポトーシス調節能力と相関する、方法。
(項目3)
上記方法は、上記治療薬が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する、項目2に記載の方法。
(項目4)
放射線治療が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該動物は以前に放射線で治療されたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、該放射線のアポトーシス調節能力と相関する、方法。
(項目5)
上記方法は、上記放射線治療が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する、項目4に記載の方法。
(項目6)
アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無が、該疾患の有無と相関する、方法。
(項目7)
上記疾患が、眼疾患、神経変性疾患、または心疾患である、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記疾患が、緑内障、黄班変性、増殖性網膜症、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、またはハンチントン病である、項目7に記載の方法。
(項目9)
少なくとも一つの治療薬または治療に対する疾患の感受性を評価するためのインビボ法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無を検出することを含み、該動物が以前に該治療薬または治療を受けたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、少なくとも一つの治療薬または治療に対する該疾患の感受性と相関する、方法。
(項目10)
動物における癌治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある該動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
(項目11)
動物における白血病治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある該動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
(項目12)
動物における血液および骨髄疾患治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
(項目13)
一つ以上の化合物が、動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、
少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを決定する工程であって、該動物はまた一つ以上の化合物と接触されている、工程、および、
該一つ以上の化合物が、該カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定する工程を含む方法。
(項目14)
一つ以上の化合物が、動物においてアポトーシスを調節するかどうかを判定するための方法であって、
少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを決定する工程であって、該動物は一つ以上の化合物と接触されている、工程、および、
該一つ以上の化合物がアポトーシスを調節するかどうかを判定する工程を含む方法。
(項目15)
上記判定工程が、上記動物における親和性標識剤のレベルを、上記化合物に暴露されないコントロール動物と比較することを含む、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
上記判定工程が、上記化合物に暴露される前の上記動物における親和性標識剤のレベルと、該動物が該化合物に暴露された後の親和性標識剤のレベルとを比較することを含む長期的な研究である、項目13または14に記載の方法。
(項目17)
検出が、NMR、MRI、CT、CAT、PETスキャン、シクチグラフィー(sctintigraphy)、フローサイトメーター、レーザースキャニング・サイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、発光顕微鏡、明視野顕微鏡、全身動物蛍光画像システム、全身動物発光画像システム、またはこれらの組み合わせを用いて実行される、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
検出が、上記動物の体内に挿入されたウィンドウチェンバーを用いて行われる、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
検出が、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる、項目18に記載の方法。
(項目20)
検出が、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法などによって、上記動物からサンプルを取り出すことによって実行、または確認され、検出は、該動物から取り出されたサンプルに対して行われる、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
上記検出が、フローサイトメーター;レーザースキャニング・サイトメーター;蛍光マイクロプレートリーダー;発色マイクロプレートリーダー;蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;明視野顕微鏡;発光マイクロプレートリーダー;または発光顕微鏡による、項目20に記載の方法。
(項目22)
上記親和性標識剤の存在または豊富さが、上記動物の骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、または循環血において検出される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
上記親和性標識剤の存在または豊富さが、末梢血単球において検出される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
上記細胞が、上記動物の組織、器官、または腫瘍に含まれる、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって上記動物に導入される、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
上記動物が哺乳動物である、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
上記哺乳動物がヒトである、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、式I:
L1−A1−X1−NH−CH(R1’)C(=O)CH2F (I)
の化合物であり、式中、
L1は検出可能な基であり;
A1は、直接結合、またはリンカーであり;
X1は、不在か、アミノ酸か、またはペプチドであり;および、
R1’は、アスパラギン酸側鎖、アスパラギン酸のエステル、該アスパラギン酸のアザペプチドエポキシド修飾、アザ−ペプチド・マイケルアクセプター、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾、クロロメチルケトン基、またはアシルオキシ反応基を含む、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
上記検出可能基がランタニド系列元素を含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記検出可能基がポジトロンエミッターを含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
上記検出可能基が蛍光標識を含む、項目28に記載の方法。
(項目32)
上記検出可能基が放射性同位体を含む、項目28に記載の方法。
(項目33)
上記検出可能基が、Gd、Tb、Eu、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Fe、Mn、Re、およびTc、I Ba、11C、13N、15O,64Cu、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Cy染料誘導体、BODIPY誘導体、クマリン誘導体、QuantumDot、3H、14C、または35Sを含
む、項目28に記載の方法。
(項目34)
X1が、V、VA、YVA、DEV、LEE、LEH、VDVA、IET、WHE、AEV、A、V、またはEである、項目28に記載の方法。
(項目35)
R1’が、CH2−COOH、または−CH2CO2Rであり、式中、Rは、C1−C6アルキルまたはベンジル、CH3、C2H5、またはCH2C6H5である、項目28に記載の方法。
(項目36)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル(O−メチル)−フルオロメチルケトンである、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
上記カスパーゼ親和性標識剤が細胞浸透性である、項目1〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
上記カスパーゼ親和性標識剤が、活性触媒部位に共有結合することによって活性カスパーゼを阻害し、かつ、上記細胞内に保持される、項目1〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
包装材料、一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤、注入用バッファー、および、インビボでアポトーシスレベルを定量するために該カスパーゼ親和性標識剤を使用するための説明書を含むアッセイキット。
(項目40)
上記一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤が、項目28〜38のいずれか1項に記載の化合物を含む、項目39に記載のキット。
(詳細な説明)
本発明のある実施態様は、ヒトなどの生物体における細胞のアポトーシス状態を判定するのに有用な方法、およびキットなどの製品を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトなどの生物体における細胞のアポトーシス状態を判定するのに有用な方法、およびキットなどの製品を提供する。
ある実施態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳動物において、例えば、組織、器官、または腫瘍に含まれてもよい、一つ以上の細胞(例えば、全体生細胞)のアポトーシス状態のインビボ判定のための方法であって、1)被検体中に、例えば、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって導入される、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤と、インビボで細胞を接触させること;および、2)少なくとも一つの親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、細胞のアポトーシス状態と相関する、方法を提供する。
本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、細胞浸透性プローブである。カスパーゼ親和性標識剤は、活性触媒部位に共有的に結合することによって活性カスパーゼを阻害してもよく、かつ、細胞内に保持されると考えられる。これらの、標識された膜恒久性プローブは、生細胞の細胞膜に浸透し、アポトーシス細胞内の活性カスパーゼ酵素に共有的に結合し、それによって、アポトーシスの特異的および高感度検出を可能とすると考えられる(Bednerら、2000,Smolewskiら、2001、およびSmolewskiら、2002)。本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、式I:
L1−A1−X1−NH−CH(R1’)C(=O)CH2F (I)
の化合物である。
L1−A1−X1−NH−CH(R1’)C(=O)CH2F (I)
の化合物である。
式中、L1は、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ユーロピウム(Eu)、または、他の、任意のランタニド系列元素(例えば、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、またはLu)、または鉄(Fe)、マンガン(Mn)、レニウム(Re)、またはテクネチウム(Tc)を含む検出可能な基である。この検出可能な基は、核磁気共鳴(NMR)、または磁気共鳴画像(MRI)検出、または発光またはシンチグラフィーにとって好適であってもよい。検出可能基は、例えば、コンピュータ断層撮影法(CTスキャン)、またはコンピュータ体軸断層撮影法(CATスキャン)検出用として、ヨウ素(I)、またはバリウム(Ba)であってもよい。検出可能基は、例えば、ポジトロン照射断層撮影法(PETスキャン)用の、ポジトロンエミッター(例えば、11C、13N、15O,または64Cu)であってもよい。検出可能基は、蛍光標識(例えば、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Cy染料誘導体、BODIPY誘導体、クマリン誘導体、QuantumDot、または、例えば、直接、またはリンカー
によってアミノ基に付着させることが可能な任意の蛍光染料)であってもよい。検出可能基は、放射性同位体(例えば、3H、14C、または35S)であってもよい。
によってアミノ基に付着させることが可能な任意の蛍光染料)であってもよい。検出可能基は、放射性同位体(例えば、3H、14C、または35S)であってもよい。
A1は、直接結合、または、単純に共有結合であってもよいリンカーである。この検出可能基は、ペプチドまたはアミノ酸の、N−末端アミノ基に直接付着されてもよい(例えば、アミド結合L−(C=O)−NH−R)。A1はまた、任意の数の、従来技術で周知のリンカークラスであってもよい。リンカーは、通常、炭素、窒素、酸素、または硫黄原子を含む、約4−18原子長である。
X1は、不在か、アミノ酸か、または、約1から10個のアミノ酸を持つペプチド、例えば、約2から4個のアミノ酸持つペプチド(例えば、V、VA、YVA、DEV、LEE、LEH、VDVA、IET、WHE、またはAEV)であってもよいペプチドである。式(I)の化合物において、X1は、天然のアミノ酸(例えば、A、V、またはE)であってもよい。式(I)の化合物において、R1’は、メチレンカルボキシ(エタン酸)側鎖(CH2−COOH)であってもよい。なぜなら、カスパーゼは、通常、ペプチド基質のP1位置にアスパラギン酸塩を有するからである。
R1’は、アスパラギン酸側鎖(CH2−COOH)か、またはアスパラギン酸のエステル(例えば、−CH2CO2R、式中、Rは、C1〜C6アルキルまたはベンジル、CH3、C2H5、またはCH2C6H5)である。ある種のカスパーゼ親和性標識プローブは、同じ標識および1から5個のアミノ酸配列を含んでもよいが、アスパラギン酸のアザ−ペプチドエポキシド修飾(例えば、米国特許第7,056,947B2号を参照)、またはアザ−ペプチド・マイケルアクセプター(Ekiciら、2004)、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾(HC=O)、クロロメチルケトン基(CH2Cl)、またはアシルオキシ反応基((C=O)O−Ar、式中、Arは、[2,6−(CF3)2]ベンゾエート、または、その、各種誘導体である)(Krantzら、1991、およびThornberryら、1994)を利用してもよい。
下記の構造体は、式Iの化合物の例であるが、本発明は、これらの構造体に限定されない。「レポーター標識」という用語は、「検出可能基」と相互交換的に使用される。
一例は、活性カスパーゼの触媒部位のシステイン残基に結合すると考えられる、Asp(OMe)−FMK修飾反応性末端である。
一旦フルオロメチルケトンペプチドが細胞内に侵入し、活性カスパーゼと接触すると、その配列が、触媒部位によって認識され、3工程プロセスを介して共有結合を形成すると考えられる。第一工程では、チオヘミケタル中間体の形成が起こると考えられる。
一旦アザ−ペプチドエポキシド修飾ペプチドが細胞内に侵入し、活性カスパーゼと接触すると、その配列が、触媒部位によって認識され、共有結合を形成するが、その際、活性部位のシステインが、3員環を求核的に攻撃して、アポトーシス細胞に残留することになる最終産物を形成すると考えられる。
合成後、薬剤は、好適な有機溶媒、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジメチルフォルムアミド(DMF)、ジメチルスルフォキシド(DMSO)、1,4−ジオキサン、またはテトラヒドロフランに溶解することによってさらに処理して、バイアルに納めてもよい。一旦溶解させたならば、薬剤は、次に、適切な、非水性または水性液体で希釈し、個々のバイアルに投下してもよい。個々のバイアルは、0℃未満に冷却し、10から500ミリトールの真空下−80℃から+100℃で、液体窒素またはドライアイストラップを用いて、または用いずに凍結乾燥してもよい。次に、個別バイアルにキャップを被せ、−80℃から20℃の間で保存することが可能である。
インビボアポトーシス検出および画像化キットは、一本以上の、試薬(例えば、処理および凍結乾燥試薬)バイアル、および適切な注入用バッファー(例えば、10×注入用バッファーの瓶)を含んでもよい。10×注入用バッファーは、エンドトキシン非含有DI
H2Oにおける下記のレシピに従って調製されてもよい。
87.66g/LのNaCl(1.5M)、60.53g/LのNa2HPO4・12H2O+4.84g/LのNaH2PO4・2H2O(0.2Mリン酸塩)、pH6.9。
H2Oにおける下記のレシピに従って調製されてもよい。
87.66g/LのNaCl(1.5M)、60.53g/LのNa2HPO4・12H2O+4.84g/LのNaH2PO4・2H2O(0.2Mリン酸塩)、pH6.9。
使用前、試薬は、DMSOに溶解してもよく、直ちに、または、分液して、例えば、−20℃未満で保存してもよい。この10×注入用バッファーは、エンドトキシン非含有DI H2Oにおいて1:10に希釈し、フィルター滅菌し、7.4の最終pHとしてもよい。試薬は、滅菌された1×注入用バッファーにおいて注入濃度に希釈されてもよい。試薬は、kg当たり0.1マイクロモルからkg当たり1.0ミリモルにおいて動物に注入されてもよい。次に、試薬を、例えば、約5分から数時間動物の全身に循環させ、それからアポトーシスの検出および画像化を行ってもよい。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、治療薬がアポトーシスを誘発するかどうかをインビボ判定するための方法であって、1)被検体を該治療薬で治療すること;2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)細胞、組織、器官、または腫瘍において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、該治療薬のアポトーシス誘発能力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様はさらに、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、治療薬がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかをインビボ判定するための方法であって、1)被検体を該治療薬で治療すること;2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)細胞、組織、器官、または腫瘍において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、該薬剤がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかと、負の相関をすることを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、放射線治療がアポトーシスを誘発するかどうかをインビボ判定するための方法であって、1)被検体を放射線で治療すること;2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)細胞、組織、器官、または腫瘍において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、該治療薬のアポトーシス誘発能力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、放射線がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかをインビボ判定するための方法であって、1)被検体を放射線で治療すること;2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)細胞、組織、器官、または腫瘍において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、該治療薬がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかと、否定的な意味で相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物中の一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、1)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および2)細胞、組織、器官、または腫瘍において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物の網膜内の一つ以上の全体生細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって黄班変性および増殖性網膜症を診断するためのインビボ診断法であって、1)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および2)網膜において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物中の一つ以上の網膜グリア細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって緑内障を診断するためのインビボ診断法であって、1)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および2)網膜グリア細胞において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物の心臓組織内の一つ以上の全体生細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって心疾患における損傷量を評価するためのインビボ診断法であって、1)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および2)心臓組織において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、該疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物の神経組織および脳内の一つ以上の全体生細胞および神経細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって神経変性疾患における損傷量を評価するためのインビボ診断法であって、1)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および2)神経組織において基Lの存在を検出することを含み、Lの存在が、該疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、哺乳動物における疾患の、治療薬または治療に対する感受性を評価するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該疾患の感受性と相関する、方法であって、1)哺乳動物に、治療薬または治療を施すこと、2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)細胞、組織、器官、または腫瘍において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、該存在または豊富さが、感受性と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、癌治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、1)被検体に、治療薬または治療を施すこと、2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)細胞、組織、器官、または腫瘍において各親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、白血病の治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、1)被検体に、治療薬または治療を施すこと、2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;および3)骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、および循環血において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、血液および骨髄疾患治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、1)被検体に、治療薬または治療を施すこと、2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;3)血液を抽出し、末梢血単球(PBMC)を調製すること、および、4)細胞において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、治療効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、白血病治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、1)被検体に、治療薬または治療を施すこと、2)被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること;3)血液を抽出し、末梢血単球(PBMC)を調製すること、および、4)該細胞において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、治療効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、哺乳動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること、および、
化合物がカスパーゼ活性を調節したかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること、および、
化合物がカスパーゼ活性を調節したかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを誘発するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、アポトーシス親和性標識剤に接触させること、および、
化合物が、アポトーシスを誘発するかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
被検体を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、アポトーシス親和性標識剤に接触させること、および、
化合物が、アポトーシスを誘発するかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを緩和するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、アポトーシス親和性標識剤に接触させること、および、
化合物が、アポトーシスを緩和するかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
被検体を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、アポトーシス親和性標識剤に接触させること、および、
化合物が、アポトーシスを緩和するかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、哺乳動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかについて長軸的に判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
化合物が、カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを(化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと)比較することを含む、方法を提供する。
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
化合物が、カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを(化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと)比較することを含む、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを誘発するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および、
化合物が、カスパーゼ活性を誘発するかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを(化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと)比較することを含む、方法を提供する。
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および、
化合物が、カスパーゼ活性を誘発するかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを(化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと)比較することを含む、方法を提供する。
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを緩和するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および、
化合物が、カスパーゼ活性を下げるかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを(化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと)比較することを含む、方法を提供する。
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること;および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および、
化合物が、カスパーゼ活性を下げるかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを(化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと)比較することを含む、方法を提供する。
本発明のある実施態様では、検出は、NMR、MRI、CT、CAT、PETスキャン、またはシンチグラフィー;フローサイトメーター;レーザースキャニング・サイトメーター;蛍光マイクロプレートリーダー;発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー;蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;発光顕微鏡;明視野顕微鏡;全身動物蛍光画像システム(光学画像システム);または、全身動物発光画像システムを用いて実行される。
本発明のある実施態様では、検出は、直接観察のために、試験被検体の体内に挿入されたウィンドウチェンバーを用いて行われる。
本発明のある実施態様では、検出は、蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる。
本発明のある実施態様では、検出は、試験被検体からサンプルを取り出すことによって、例えば、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法によって実行、および/または確認され、検出は、フローサイトメーター;レーザースキャニング・サイトメーター;蛍光マイクロプレートリーダー;発色マイクロプレートリーダー;蛍光顕微鏡;共焦点顕微鏡;明視野顕微鏡;発光マイクロプレートリーダー;または発光顕微鏡によって行われる。
本発明のある実施態様は、1)一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤;2)10×注入用バッファー;および3)インビボにおけるアポトーシスレベル定量用化合物を用いるための説明書を含む包装材料を含む、アッセイキットなどのキットを提供する。
以上本発明は、様々の、特定の、好ましい実施態様および技術を参照しながら説明された。しかしながら、本発明の精神および範囲の内に留まりながら、多くの変更および修飾の実行が可能であることを理解しなければならない。
(実施例1)
マウスのウィンドウチェンバー・モデルを用い、SCK乳腺腫瘍について、三酸化砒素(ATO)および熱による照射治療後の腫瘍におけるアポトーシス誘発レベルを評価した。腫瘍の目視のために用いたウィンドウチェンバーは、A/Jマウスの皮膚襞の上に設置した。2×105個のSCK乳腺癌細胞を、この皮膚襞の中に注入した。腫瘍を7から9日間増殖させた。試験マウスでは、20Gy、8mg/kgのATOを照射し、2時間後、腫瘍を41.5℃で60分加熱した。コントロールマウスは、照射または加熱処理をせず、ATOの代わりにプラシーボを注入した。
マウスのウィンドウチェンバー・モデルを用い、SCK乳腺腫瘍について、三酸化砒素(ATO)および熱による照射治療後の腫瘍におけるアポトーシス誘発レベルを評価した。腫瘍の目視のために用いたウィンドウチェンバーは、A/Jマウスの皮膚襞の上に設置した。2×105個のSCK乳腺癌細胞を、この皮膚襞の中に注入した。腫瘍を7から9日間増殖させた。試験マウスでは、20Gy、8mg/kgのATOを照射し、2時間後、腫瘍を41.5℃で60分加熱した。コントロールマウスは、照射または加熱処理をせず、ATOの代わりにプラシーボを注入した。
腫瘍を7日間増殖させた後、先ず、試験マウスを20Gyで照射した。その直後に、ATOの腹腔内(I.P.)注入を行った。ATOは、水に溶解し、5%w/vデキストロース含有のPBSにおいて、8mg/kg濃度の溶液として注入した。2時間後、腫瘍を41.5℃で60分加熱した。コントロールマウスには、5%デキストロース含有PBSのI.P.注入を行った。
治療前、腫瘍を、コントロールマウスと、表示された試験マウスにおいて調べた。ウィンドウチェンバー越しに撮影された、SCK乳腺腫瘍の、低倍率明視野画像複合写真から、全ての腫瘍に低レベルの出血が明らかにされた(図1)。
治療3時間後、低倍率明視野画像複合写真から、コントロールマウスでは、持続的な低レベルの出血が、試験マウスでは高レベルの出血が示された(図2)。これは治療の効力を実証する。24時間後、コントロールマウスでは、同じレベルの出血が見られ、治療を受けた試験マウスでは、出血レベルが増加し続けた(図3)。
コントロールおよび試験マウスの尾部静脈に、インビボアポトーシス検出試薬、FAM−VAD−FMKを注入することによってアポトーシスを検出した。52μgのFAM−VAD−FMKを含む、処理済試薬バイアルを、50μLのDMSOに溶解した。この溶液を、200μLの滅菌1×注入用バッファーを加えて希釈した。この希釈試薬について、40μL(8.3μg)を、尾部静脈からI.V.注入し、マウスの体内を30分間循環させた。各腫瘍におけるアポトーシスレベルは、488nmの励起波長およびFITCフィルターを用い、ウィンドウチェンバー越しに高倍率で直接目視で定めた。
コントロールマウスには、プラシーボ注入後FAM−VAD−FMKを与えた。これらのマウスでは、急速に増殖する腫瘍から予想されるように、低レベルのアポトーシスが示された(図4)。ATO治療を受けた試験マウスには、ATO治療の3時間後、および24時間後にFAM−VAD−FMKを与え、アポトーシスを、前述のように評価した。3時間後、図5に見られるように、アポトーシスのレベルに確実な増加が見られた。24時間後、アポトーシスレベルはさらに高くなった(図6)。
別の一組のマウスにおいて、腫瘍を7日間増殖させた。コントロールマウスには、前述のようにプラシーボ注入を行い、試験マウスには、前述のようにATO注入を行った。24時間後、全てのマウスに、前述のようにFAM−VAD−FMKのI.V.注入を行った。インビボにおけるアポトーシス検出・画像試薬を、各マウスの体内に30分循環させた。腫瘍関連アポトーシスのインビボ画像化後、チェンバーから腫瘍をトリプシン液に掻き落とすことによって、腫瘍組織をウィンドウチェンバーから収集し、これを、10μg/mlのDNアーゼおよび5μg/mlのコラゲナーゼと共に30分攪拌し、70μM細胞用篩を用いてこの縣濁液をろ過した。次に、ウィンドウチェンバーから得られた細胞集団におけるアポトーシスの分析のために、フローサイトメトリー分析を、FACS口径フローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytometry System、サンホセ、カリフォルニア州)を用いて行った。データは全て、事象獲得を10,000事象に設定して得られた。データは、CellQuest Proサイトメーターソフトウェアを用いて分析した。結果は、アポトーシスの2倍の増加を示した。すなわち、コントロールマウスは18%のアポトーシス細胞を有し、試験マウスは39%のアポトーシス細胞を有していた(図7)。
(実施例2)
ATO治療前後において、FSaIIマウス線維肉腫に対する、三酸化砒素(ATO)の効力を、ウィンドウチェンバーを通じて評価するために、nu/nuマウスを用いて長軸実験を行った。
ATO治療前後において、FSaIIマウス線維肉腫に対する、三酸化砒素(ATO)の効力を、ウィンドウチェンバーを通じて評価するために、nu/nuマウスを用いて長軸実験を行った。
背部皮膚片チェンバー(DSFC)を、下記のように、nu/nuマウスの背部に外科的に埋め込んだ。埋め込み処置は全て、滅菌視野を保持するために層流フード内で行った。皮膚は、ベタジンで二度洗浄し、乾燥させた。丸窓(9mm)を含む、一方の滅菌チェンバー片を、背部皮膚襞の一側に設置した。3本の接続ネジ用の孔を、皮膚襞に貫通させ、同様の窓を持つ、もう一つのチェンバー片と接続した。次に、このアッセンブリを、チェンバー片スペーサを介在させた状態で、ネジで堅く締め合わせた。DSFCウィンドウ内の皮膚襞から、円形の皮膚組織および筋膜を注意深く切り取り、対向する皮膚襞の横紋筋に隣接する皮下組織の血管を露出した。DSFCウィンドウ内部の外傷辺縁に、抗生物質軟膏(亜鉛バシトラシン/ポリミキシンB硫酸塩/ネオマイシン硫酸塩)を用いた。露出組織を覆うために、ガラスウィンドウをチェンバーに設置し、スナップ型C−リングによって固定した。次に、反対側のDSFCウィンドウで外科的外傷処置を繰り返し、両方のウィンドウ越しに、筋膜および血管から成る、きわめて薄い透明層(組織を通過する、顕微鏡光の透過を促進するために創出された)が見えるようにした。最後に、チェンバーを皮膚に縫合した。
術後、動物たちは、32℃に維持された加湿恒温器内の障壁ケージに、食物および水を自由に得られる状態で収容された。感染のリスクを最小にするために、マウスには全て、DSFC埋設後および実験を通じて、その飲用水にアモキシシリン(5mLの水当たり250mg)を加えた。
C−リングおよびガラスカバースリップを一時的に外すことによって、チェンバーの一側に腫瘍細胞を植えつけた。10μLのMatrigel(BD Biosciences、Bedford、マサチューセッツ州)に縣濁した1×105FSaIIマウス線維肉腫細胞を筋膜の上に添加し、ウィンドウを、前述のように組織の上に戻して封鎖した。術後24時間細胞をチェンバー内部に置いた。マウスは、毎日、一般的健康状態ばかりでなく、血管の存在、腫瘍の進行、および、チェンバー皮膚相互作用についてもチェックした。C−リングおよびガラスカバースリップを外し、かつ、麻酔したマウスのチェンバーを、改造顕微鏡ステージに取り付けることによって腫瘍の画像を撮影した。
血管新生阻害剤および投与:三酸化砒素(ATO)は、1.0mg/mLの濃度でTrisenoxという商品名の下にCell Therapeutics,Inc.(シアトル、ワシントン州)から元々販売されているものを購入した。注入対象のマウスを体重測定し、ATOを、マウスの体重キログラム当たり8.0mgATOの用量でIP注入した。
インビボアポトーシス検出試薬カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル(O−メチル)−フルオロメチル・ケトン(FAM−VAD−FMK)、調製および投与:52μgのFAM−VAD−FMKを含む、処理済試薬バイアルを50μLのDMSOに溶解した。この溶液を、200μLの滅菌1×注入用バッファーを加えて希釈した。この希釈試薬について、70μL(12.0μg)を、尾部静脈からI.V.注入し、マウスの体内を45分間循環させた。各腫瘍におけるアポトーシスレベルは、488nmの励起波長およびFITCフィルターを用い、ウィンドウチェンバー越しに10×倍率で直接目視で定めた。
結果:腫瘍は、9日間増殖させた。FAM−VAD−FMKを注入し、45分間循環させた。DFSC C−リングおよびガラスカバーを外し、マウスを顕微鏡にセットした。FITCフィルターの下に488nm励起を用いて10×写真を撮影した(図8)。この写真は、腫瘍におけるアポトーシスの欠如を示す。次に、同じマウスに、前述のようにATOを注入した。ATOに3時間作動させ、次いで、マウスにもう一度FAM−VAD−FMKを注入した。45分後、再び、マウスを顕微鏡にセットし、腫瘍を撮影した(図9)。この写真は、マウスの腫瘍における著明なアポトーシスレベルを示す。
最終結論:インビボアポトーシス検出試薬(FAM−VAD−FMK)のIV注入は、動物の生体組織におけるアポトーシスのインビボ検出に有効である。さらに、この試薬には副作用がないので、同じ動物で長期的な研究を行うために使用することも可能である。この方法は、正常であるか、または悪性の生体組織において抗癌剤活性を高い信頼度で明らかにするための新規で、貴重な方法を体現する。
(実施例3)
本プロジェクトの目的は、モルフィン介在性アポトーシスの検出を可能とするインビボ動物モデルを開発することであった。モルフィンを含む薬剤の乱用は、培養細胞においてアポトーシスを誘発することが示されている。アポトーシスは、様々な複雑な経路を通じて起動され、カスパーゼという名前のシステインプロテアーゼの活性化をもたらす。アポトーシスは、薬剤の有害作用、例えば、モルフィンなどの薬剤の乱用の理解のために重要である。アポトーシスの検出のために複数の技術があるが、それらの技術は、一般に、細胞を、その天然の環境から取り出すことに限定される。この機械的な処理は、アポトーシスを誘発するので、陽性結果を誇張する可能性のあることが知られる。本実験の目的は、モルフィンによって誘発されるアポトーシス検出用のインビボモデルを開発することである。
本プロジェクトの目的は、モルフィン介在性アポトーシスの検出を可能とするインビボ動物モデルを開発することであった。モルフィンを含む薬剤の乱用は、培養細胞においてアポトーシスを誘発することが示されている。アポトーシスは、様々な複雑な経路を通じて起動され、カスパーゼという名前のシステインプロテアーゼの活性化をもたらす。アポトーシスは、薬剤の有害作用、例えば、モルフィンなどの薬剤の乱用の理解のために重要である。アポトーシスの検出のために複数の技術があるが、それらの技術は、一般に、細胞を、その天然の環境から取り出すことに限定される。この機械的な処理は、アポトーシスを誘発するので、陽性結果を誇張する可能性のあることが知られる。本実験の目的は、モルフィンによって誘発されるアポトーシス検出用のインビボモデルを開発することである。
モルフィンの作用を調べるために、治療に応じてマウスを4群に分割した。1群にはプラシーボを与え、第2群には、細胞を刺激するためにLPSを与え、第3群にはモルフィンを与え、第4群には、モルフィンおよびLPSを与えた。マウスにそれぞれの治療を施した後、FAM−VAD−FMKをIV注入した。52μgのFAM−VAD−FMKを含む、処理済バイアルを50μLのDMSOに溶解した。この溶液を、200μLの滅菌1×注入用バッファーを加えて希釈した。この希釈試薬について、40μL(8.3μg)を、尾部静脈からIV注入し、マウスの体内を45分間循環させた。
異なる治療群から、脾臓、肝臓、胸腺、およびCNS組織を分離し、冷凍してガラススライドにマウントした。この様々の細胞タイプを、1×106細胞/mLとなるように調整し、蛍光顕微鏡による分析のためにガラススライド上でサイトスピンする。切片を写真撮影し、アポトーシス陽性細胞カウントのためにMetaMorph分析プログラムによって分析した。カウント数は、統計ソフトウェアによって分析した。モルフィンは、脾臓および胸腺においてLPS誘発性アポトーシスを統計学的に強化した(それぞれ、p=0.012および0.0018)。肝臓および中枢神経系においてアポトーシスの増加が検出されたが、それらは、統計学的に有意ではなかった。モルフィン単独ではアポトーシスを誘発しなかった。定量結果を表1に要約する。
結論:免疫細胞におけるモルフィン介在性のインビトロアポトーシスに関して従来公表されている報告とは対照的に、本実験は、モルフィン単独はアポトーシスを有意に誘発しないことを示す。一方、モルフィンは、脾臓、骨髄、および肝臓組織で検出されたLPS活性化細胞のアポトーシスを強化した。
表1は、脾臓、胸腺、肝臓、およびCNSにおいて、LPS、モルフィン、およびモルフィン+LPSによって誘発されるアポトーシスの定量結果の要約である。インビボアポトーシスの検出は、8.3μgのFAM−VAD−FMKの静脈内注入、および45分間のインキュベーション時間によって行った。異なる治療群から、脾臓、肝臓、胸腺、およびCNS組織を分離し、ガラススライドにマウントした。切片を写真撮影し、アポトーシス陽性細胞カウントのためにMetaMorph分析プログラムによって分析した。カウント数は、統計ソフトウェアによって分析した。
表1
以上本発明は、様々の特異的な、および好ましい実施態様を参照しながら説明されてきた。しかしながら、本発明の精神および範囲の中に留まりながら、多くの変更および修正を実行することが可能であることを理解しなければならない。
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