JP2015200570A - バイオセンサおよびバイオセンサの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】均一な試薬層を有する高精度なバイオセンサを提供すること。【解決手段】絶縁性基板１と、前記絶縁性基板の一方の面に設けられた作用極２１および対極２２を含む電極層と、前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面に形成された、前記基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層３と、前記試料液を前記試薬層３に誘導する供給路を形成するための切欠部４２ａを有し、該切欠部の内部に前記試薬層３が位置するように前記電極層上に配置されたスペーサ４２と、少なくとも前記切欠部４２ａを覆うように、前記スペーサ４２の前記絶縁性基板と反対側の面に設けられたカバー５とを備え、前記電極層の前記絶縁性基板１と反対側の表面において、前記試薬層３が形成される試薬層形成領域２ａの周囲の少なくとも一部に前記試薬層形成領域２ａよりも親水性が低い低親水性領域を有することを特徴とする、バイオセンサである。【選択図】図３

Description

本発明は、電気化学法を用いたバイオセンサ、および、バイオセンサの製造方法に関する。

血糖値センサなどのグルコースセンサのように、電気化学法を利用した各種のバイオセンサが知られている。

例えば、バイオセンサ（チップ）のスペーサに形成された溝に、検体（血液など）を導入すると、検体に含まれる成分（基質）が、酵素を介してメディエータを還元する。ここで、電極に所定の電圧を印加すると、電気化学反応により、還元されたメディエータが逆に酸化される。このとき発生する酸化電流を測定することで、着目する成分の量を検出できる。

例えば、特許文献１（特開２００７−２９８３２５号公報）に開示されるように、ベース基板上に形成された測定電極の上に試薬を滴下し、乾燥させて、試料である血液が導入されるキャビティ部をスペーサによって形成し、空気孔を設けたカバーで蓋をした３層構造を有するバイオセンサが知られている。ここでは、電極基板上に開口部を有する部材を積層し、試薬溶液を該開口部に滴下して、開口部の内壁で試薬溶液を堰き止めることで試薬層の形成位置を規定している。

しかし、特許文献１に開示されるセンサでは、滴下した試薬液が表面張力によりキャビティの内壁を登ってしまい、そのまま乾燥されることで、試薬がキャビティの端部に偏析する現象が起こる。それにより、（ｉ）グルコース測定電極付近に位置する正味の試薬（酵素、メディエータや親水性高分子など）の量が滴下量より少なくなることで測定電流の感度が小さくなる、あるいは、（ｉｉ）試薬の均一性がセンサチップ間でばらつくことで、測定電流の精度が低下するという問題があった。

また、特許文献２（特許第４１９７０８５号公報）には、試薬液が滴下される位置の周りを囲うスリットを設けることで、試薬液が均一に広がり、所定の面積の試薬層が所定の位置に形成されるので、位置および面積のばらつきの無い均一な試薬層が形成される旨記載されている。しかしながら、この場合でも、（ｉ）滴下量がばらついてスリットを超える大きさの試薬液が滴下されたり、（ii）実際の試薬液の滴下位置とスリットで囲った箇所の中心部との位置関係にズレが生じるような滴下位置の偏りが生じたりすると、試薬液がスリットから漏れ出て、試薬の形成面積や位置にチップ間でのばらつきが生じやすくなる。そのため、本先行技術では、滴下時の工程ばらつきによって試薬品位が受ける影響が大きくなる。また、試薬液が滴下される位置の電極と測定器に装着され端子電極との導通を確保するために、所定の試薬形成位置の周りを完全に囲うスリットを設けることができず、試薬を滴下すると試薬液がスリットの上記開口箇所から漏れ出てしまうことで、試薬の形成面積にチップ間でばらつきが生じる。そのため、特許文献２で用いられる手法を採用しても、なおセンサ性能が悪化するという問題があった。

特開２００７−２９８３２５号公報 特許第４１９７０８５号公報

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、均一な試薬層を有する高精度なバイオセンサを提供することを目的とする。

本発明者らは、電極層の絶縁性基板と反対側の表面において、試薬層形成領域の周囲の少なくとも一部に試薬層形成領域よりも親水性が低い領域を形成することで、試薬の偏析のない均一な試薬層を形成することが出来ることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のとおりである。

（１）試料液中に含まれる基質を定量するためのバイオセンサであって、
絶縁性基板と、
前記絶縁性基板の一方の面に設けられた作用極および対極を含む電極層と、
前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面に形成された、前記基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層と、
前記試料液を前記試薬層に誘導する供給路を形成するための切欠部を有し、該切欠部の内部に前記試薬層が位置するように前記電極層上に配置されたスペーサと、
少なくとも前記切欠部を覆うように、前記スペーサの前記絶縁性基板と反対側の面に設けられたカバーとを備え、
前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面において、前記試薬層が形成される試薬層形成領域の周囲の少なくとも一部に前記試薬層形成領域よりも親水性が低い低親水性領域を有することを特徴とする、バイオセンサ。

（２） ある液体に対する前記試薬層形成領域の接触角と、前記液体に対する前記低親水性領域の接触角との差が２０°以上である、上記（１）に記載のバイオセンサ。

（３） 前記低親水性領域が前記試薬層形成領域の全周を囲っている、上記（１）または（２）に記載のバイオセンサ。

（４） 前記試薬層は、前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面に、前記酵素および前記メディエータを含む試薬液を付着させ、前記試薬液を乾燥することによって形成された層である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のバイオセンサ。

（５） 試料液中に含まれる基質を定量するためのバイオセンサの製造方法であって、
前記絶縁性基板の一方の面に、作用極および対極を含む電極層を設ける工程と、
前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面において、前記基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層を形成するための試薬層形成領域と、該試薬層形成領域の周囲の少なくとも一部に前記試薬層形成領域よりも親水性が低い低親水性領域とが形成されるように、表面処理を行う工程と、
前記試薬層形成領域に、前記酵素および前記メディエータを含む試薬液を付着させ、前記試薬液を乾燥することによって前記試薬層を形成する工程と、
前記試料液を前記試薬層に誘導する供給路を形成するための切欠部を有するスペーサを、前記切欠部の内部に前記試薬層が位置するように前記電極層上に配置する工程と、
少なくとも前記切欠部を覆うように、前記スペーサの前記絶縁性基板と反対側の面にカバーを設ける工程とを備える、バイオセンサの製造方法。

（６） 前記表面処理を行う工程の後、前記試薬層を形成する工程の前において、
ある液体に対する前記試薬層形成領域の接触角と、前記液体に対する前記低親水性領域の接触角との差が２０°以上である、上記（５）に記載のバイオセンサの製造方法。

（７） 前記低親水性領域が前記試薬層形成領域の全周を囲っている、上記（５）または（６）に記載のバイオセンサの製造方法。

前記表面処理を行う工程において、前記試薬層形成領域に親水化処理を施す、上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載のバイオセンサの製造方法。

前記表面処理を行う工程において、前記低親水性領域に撥水化処理を施す、上記（５）〜（８）のいずれか１項に記載のバイオセンサの製造方法。

本発明においては、試薬層が均一な形状、面積および組成を有しているため、センサ性能を悪化させることなく高精度なバイオセンサを提供することができる。

従来のバイオセンサの一例の構成を示す模式図である。 従来のバイオセンサの一例の試薬層を説明するための断面模式図である。 実施形態１の製造工程の一例を説明するための斜視図である。 実施形態１のバイオセンサの試薬層を説明するための断面模式図である。 実施形態２のバイオセンサの構成を示す分解斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施形態２のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。 実施例１および比較例１において、グルコース濃度とグルコース測定電流との関係を示すグラフである。 実施例１および比較例１において、グルコース測定電流のＣＶ値を示すグラフである。

本発明のバイオセンサは、試料液中に含まれる基質を定量するためのバイオセンサであって、
絶縁性基板と、
絶縁性基板の一方の面に設けられた作用極および対極を含む電極層と、
電極層の絶縁性基板と反対側の表面に形成された、基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層と、
試料液を試薬層に誘導する供給路を形成するための切欠部を有し、該切欠部の内部に試薬層が位置するように電極層上に配置されたスペーサと、
少なくとも切欠部を覆うように、スペーサの絶縁性基板と反対側の面に設けられたカバーとを備えている。

そして、本発明のバイオセンサは、電極層の絶縁性基板と反対側の表面において、試薬層が形成される領域（試薬層形成領域）の周囲の少なくとも一部に試薬層形成領域よりも親水性が低い領域（低親水性領域）を有することを特徴としている。

基質（分析対象物）としては、例えば、グルコース（血糖）、乳酸、コレステロール、アルコール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

絶縁性基板の材料としては、特に限定されないが、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどのプラスチック材料、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、または、生分解性材料などが挙げられる。これらの材料は、スペーサ、カバーの材料としても用いられる。

絶縁性基板上に設ける電極層は、少なくとも作用極と対極を含む。電極層は、作用極および対極以外に、電極電位の測定時に電位の基準となる参照電極や、キャビティに試料が供給されたことを検知するための検知用電極を含んでいてもよい。

これらの電極（作用電極、対極、参照極、検知用電極など）の材料としては、白金、金、パラジウムなどの貴金属やカーボン、銅、アルミニウム、ニッケル、チタン、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide：酸化インジウム錫）、ＺｎＯ（酸化亜鉛）などが挙げられる。電極層は、例えば、スクリーン印刷や、スパッタリング蒸着法を用いて絶縁性基板の一方の面に上記材料からなる導電層を形成し、さらに、レーザー加工、フォトリソグラフィーなどを用いてパターン形成することにより、作製することができる。

酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらの酵素を検出したい測定対象物質（グルコース、アルコール、乳酸、コレステロール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸など）に応じて選択することで種々のバイオセンサを作製することができる。

例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のグルコースを検出するグルコースセンサを作製でき、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のエタノールを検出するアルコールセンサを作製でき、乳酸オキシダーゼを用いれば血液試料中の乳酸を検出する乳酸センサを作製でき、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物を用いれば総コレステロールセンサを作製できる。

メディエータとは、作用極と対極との間の電子伝達を仲介する化合物（電子伝達体）であり、それ自体が酸化還元反応を行う物質であることが好ましい。メディエータとしては、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを用いることができる。

試薬層は、親水性高分子を含むことが好ましい。この場合、試薬層を電極層の表面へ容易に固定化することができる。また、親水性高分子は、試料液中の夾雑物（血液中の血球など）をろ過するろ過剤としても機能する。

親水性高分子としては、特に限定されないが、例えば、カルボニル基、アシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホ基、スルホニル基、スルホキシド基、トシル基、ニトロ基、ニトロソ基、エステル基、ケト基、ケテン基を有する親水性高分子があげられる。カルボキシル基を有する親水性高分子としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロースが挙げられ、好ましくはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。

カバーの材料は、絶縁性材料であることが好ましく、例えば、ＰＥＴフィルムなどプラスチック、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、生分解性材料を用いることができる。なお、カバーは、スペーサによって形成されるキャビティと連通する空気孔を有していることが好ましい。毛細管現象により試料が空気孔に向かって吸引されて、キャビティ内への試料の導入が容易になるからである。

以下、本発明のバイオセンサ（チップ）の具体的構成の一例について、図面を参照して説明する。

（実施形態１）
本実施形態のバイオセンサおよびバイオセンサの製造方法の一例について、図３を参照して説明する。図３（ａ）〜図３（ｇ）は、本実施形態のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための図であって、それぞれ異なる工程を示している。

まず、電極層（作用極２１および対極２２）を、絶縁性基板１上に形成する（図６）。具体的には、絶縁性基板の一方の面に、導電層をスクリーン印刷や、スパッタリング蒸着法により形成し、形成された導電層にレーザー加工やフォトリソグラフィーによるパターン形成を施すことで、電極層を形成する。

次に、図３（ｂ）を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側、および、絶縁性基板１の電極層が形成されていない領域の電極層側に、試薬層形成領域２ａ（図３（ｄ））に相当する部分に開口部４１ａを有するマスク４１を積層する（図３（ｃ））。

図３（ｃ）を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側の一部、および、絶縁性基板１の電極層が形成されていない領域の電極層側の表面の一部からなる、試薬層形成領域２ａ（図３（ｄ））に対して、親水化処理を施す。なお、親水化処理の後、マスク４１は取り除かれる。これにより、試薬層形成領域２ａと、それ以外の試薬層形成領域２ａよりも相対的に親水性の低い領域となった低親水性領域とが形成される（図３（ｄ））。

親水化処理の方法としては、例えば、プラズマ処理、コロナ放電またはＵＶ処理が挙げられる。他の親水化処理の方法としては、例えば、酸性溶液、アルカリ性溶液または有機溶媒を用いた化学処理が挙げられる。プラズマ処理としては、例えば、酸素プラズマ処理、アルゴンプラズマ処理または窒素プラズマ処理が挙げられる。また、プラズマ処理におけるプラズマは、減圧プラズマであっても大気圧プラズマであってもよい。なお、プラズマ処理により、電極層の表面の清浄度が上がったり、電極表面が薄く酸化されたりすることで親水性が向上する。

また、これらの親水化処理のためのマスク（マスキング用シート）としては、低粘着フィルム、熱剥離シートやフォトレジストなどを用いることができる。

なお、本実施形態では、試薬層形成領域２ａに親水化処理を施すことにより、試薬層形成領域２ａの周囲の少なくとも一部に試薬層形成領域よりも親水性が低い低親水性領域を形成したが、試薬層形成領域２ａの周囲に撥水化処理を施すことにより、低親水性領域を形成してもよい。撥水化処理としては、例えば、フッ素系のプラズマ処理やシランカップリング剤などの有機ケイ素化合物による化学処理が挙げられる。また、試薬層形成領域２ａの親水化処理と、低親水性領域の撥水化処理の両者を実施してもよい。

次に、図３（ｅ）を参照して、このようにして形成された試薬層形成領域２ａに試薬液を滴下し、試薬液を乾燥させることによって試薬層３を形成する。なお、例えば、ＣＭＣ液、酵素液、メディエータ液を順に滴下および乾燥して試薬層を形成してもよく、酵素、メディエータおよびＣＭＣ等を含む液を滴下した後に乾燥して、試薬層を形成してもよい。

次に、図３（ｆ）を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側の一部、および、絶縁性基板１の電極層が形成されていない領域の電極層側の表面の一部に、切欠部４２ａを有するスペーサ４２を貼り合わせる。

次に、図３（ｇ）を参照して、空気孔５ａを有するカバー５が、スペーサ４２上に、少なくとも切欠部４２ａを覆うように積層されることで、試薬層３に試料液を誘導するためのキャビティが形成される。なお、空気孔５ａはキャビティの開口の反対側においてキャビティの内部と連通するように設けられている。

以上の工程によって、本実施形態のバイオセンサを得ることができる。上記のようなプロセスを採用することで、マスク４１の開口部４１ａに位置する電極層上の試薬層形成領域のみが親水化処理され、該試薬層形成領域のみ親水性が向上するが、試薬層形成領域以外の電極層の表面は相対的に低親水性の領域となる。これにより、試薬液を試薬層形成領域に滴下したときに、試薬液の外周位置が試薬層形成領域と低親水性領域との境界で規定されることになり、試薬層を所望の領域に精度よく形成することが可能となる。

図１に、従来のバイオセンサの一例の構成を示す。図１を参照して、従来は、電極層（作用極２１および対極２２）上に、キャビティを形成する切欠部４２ａを有するスペーサ４２を貼り合わせたのち、試薬液を滴下して試薬層３を形成し、空気孔５ａを有するカバー５を順次貼り合わせていた。従来のバイオセンサでは、図２に示すように、滴下した試薬液３０が表面張力によりスペーサ４２のキャビティの内壁を登ってしまい、そのまま乾燥されることで、試薬がキャビティの端部３０ａに偏析する場合があった。

これに対して、本実施形態のバイオセンサでは、絶縁性基板１の表面に形成された電極層（図示せず）上の試薬層形成領域の親水性が、周囲の少なくとも一部よりも高い（試薬層形成領域の周囲の少なくとも一部に前記試薬層形成領域よりも親水性が低い低親水性領域を有する）ことにより、キャビティの端部を用いずに試薬液が試薬層形成領域から流出することを防止できるため、試薬の偏析が抑制されて試薬の均一性が向上する。これにより、高感度および高精度のバイオセンサを提供することができ、搭載する試薬量を必要最小限に抑えられ、かつ、製造工程での不良率を低減することができる。なお、図４では、スペーサ４２の切欠部の端部（内壁）が試薬層３の外側に対して離れているが、試薬層３の乾燥後にスペーサ４２を積層する工法を採用するのであれば、試薬が切欠部の端部に偏析する恐れもないことから、スペーサ４２が試薬層３の一部を覆うようなセンサ構造を採用しても良い。

（実施形態２）
本実施形態のバイオセンサの製造方法の一例について、図５〜図１３を参照して説明する。図５は、本実施形態のバイオセンサの構成を示す分解斜視図である。図６〜図１３は、本実施形態のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための図であって、それぞれ異なる工程を示している。本実施形態では、複数のバイオセンサを同時に作製することができる。なお、実施形態１と重複する説明につては、ここでは省略する。

まず、図６を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）を、複数の絶縁性基板１の各々の上に形成する。次に、図７を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側、および、絶縁性基板１の電極層が形成されていない領域の電極層側に、試薬層形成領域２ａ（図９）に相当する部分に開口部４１ａを有するマスク４１を積層する。

図８を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側の一部、および、絶縁性基板１の電極層が形成されていない領域の電極層側の表面の一部からなる、試薬層形成領域２ａ（図９）に対して、プラズマ処理を施す。なお、プラズマ処理の後、マスク４１は取り除かれる。これにより、試薬層形成領域２ａと、それ以外の試薬層形成領域２ａよりも相対的に親水性の低い領域となった低親水性領域とが形成される（図９）。

次に、図９を参照して、このようにして形成された試薬層形成領域２ａに試薬液を滴下し、試薬液を乾燥させることによって試薬層３を形成する（図１０）。

次に、図１１を参照して、電極層（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側の一部、および、絶縁性基板１の電極層が形成されていない領域の電極層側の表面の一部に、切欠部４２ａを有するスペーサ４２を貼り合わせる。

次に、図１２を参照して、空気孔５ａを有するカバー５が、スペーサ４２上に、少なくとも切欠部４２ａを覆うように積層されることで、試薬層３に試料液を誘導するためのキャビティが形成される。なお、空気孔５ａはキャビティの開口の反対側においてキャビティの内部と連通するように設けられている。

次に、以上の工程によって形成されたバイオセンサの集合基板を分割することで、バイオセンサが得られる（図１３）。

＜バイオセンサの使用方法＞
本発明のバイオセンサは、測定器に装着されて使用されるものである。すなわち、測定器に装着されたバイオセンサのキャビティに試料（血液など）を供給し、試料中の測定対象物質（グルコースなど）と酵素およびメディエータとが反応することで還元物質が生成する。そして、バイオセンサの作用極および対極と電気的に接続された測定器により、作用極と対極との間に電圧を印加し、この還元物質を酸化することにより得られる酸化電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が行われる。

以下、本発明のバイオセンサの使用方法の一例について説明する。まず、キャビティの先端部分に血液を接触させ、血液を、毛細管現象を利用してキャビティ内部に導入する。そして、作用極と対極間に電圧を印加し、一定のタイミングで電流値を測定する。印加電圧は、例えば０．３Ｖとする。キャビティ内に血液が導入されると、血中の分析対象物が酵素を介してメディエータを還元する。作用極と対極の間に電圧を印加した際に流れる電流は、メディエータの還元体濃度、すなわち分析対象物濃度と相関がある。

次に、電圧印加から一定時間経過後の電流値を測定する。例えば、３〜５秒後の電流値を測定する。この電流値を用いて、あらかじめ求めておいた検量線から分析対象物濃度を決定することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
基本的には、上記実施形態２の方法でバイオセンサを作製した。親水化処理として、酸素によるプラズマ処理を実施した。プラズマ処理の条件は、チャンバー内の圧力：１．２５ｍｂａｒ、処理時間：５分とした。

なお、試薬層は、ＣＭＣ液、酵素液、メディエータ液を順に滴下および乾燥して形成した。酵素液としてはグルコースデヒドロゲナーゼとメチルセルロースの混合液、メディエータ液としてはフェリシアン化カリウムとヒドロキシプロピルメチルセルロースの混合液を用いた。

絶縁性基板およびスペーサの材質はポリエチレンテレフタレートである。スペーサの厚みは１８５μｍである。

（比較例１）
電極層上にスペーサを積層し、スペーサの切欠部において露出した電極層表面の所定範囲に、ＣＭＣ液、酵素液、メディエータ液を順に滴下および乾燥させることで試薬層を形成した。この点以外は実施例１と同様にしてバイオセンサを作製した。

［グルコース濃度の測定］
所定濃度のグルコース水溶液を実施例１および比較例１のバイオセンサを用いて測定した（ｎ＝１０）。なお、作用極と対極の間に０．３Ｖの電圧を印加し、グルコース応答電流の値を測定した。グルコース濃度とグルコース測定電流との関係を図１４に示す。また、グルコース測定電流のＣＶ値を図１５示す。

図１４に示されるように、比較例１よりも実施例１の方がグルコースに対する応答電流が増加している。これは、比較例１では、試薬液の偏析により、電極付近に位置する正味の試薬量が滴下量より少なくなることで測定電流の感度が小さくなったと考えられる。

また、図１５に示されるように、実施例１のバイオセンサでは、比較例１よりもＣＶ値が低下しており、実施例１が性能のばらつきの少ない信頼性の高いバイオセンサであることが分かる。

以上の結果から、本発明のバイオセンサでは、従来構造より測定電流の感度が高く、測定ばらつきも小さくなることがわかる。すなわち、本発明によって、信頼性が高く、高精度なバイオセンサの提供が可能である。

（実施例２）
プラズマ処理時の処理時間を６通りに変化させ、試薬層形成領域の親水化の程度を変化させた以外は、実施例１と同様にして、バイオセンサを作製した。

実施例２で得た６種類のバイオセンサの各々について、試薬層を形成する前の電極層表面の試薬層形成領域とその周囲の低親水性領域の水に対する接触角を測定した。接触角の測定は、液滴法により実施した。

また、実施例２で得た６種類のバイオセンサの各々について、試薬滴下品位の評価試験を実施した。具体的には、マスクの開口部（直径１．２３ｍｍ）の中心に当たる電極部から約１００μｍずれた位置に試薬を滴下して、形成された試薬品位を評価した。形成された試薬の形状が、マスクの開口部形状と同等であったものをＡ、開口部形状に対して欠け・不足、少なくとも一部のはみ出しなどがあったものをＢと評価した。表１に、試薬層形成領域と低親水性領域の接触角の差と、試薬滴下品位との関係を示す。

表１に示す結果から、接触角の差が２０°以上である場合に、試薬が望ましい形状で形成される（滴下品位が向上する）ことが分かる。したがって、接触角の差が２０°以上である場合に、性能のばらつきが少なく信頼性の高いバイオセンサが得られると考えられる。なお、本実施例の結果は、水に対する接触角に関するものであるが、高粘度のＣＭＣ水溶液でも同等の結果が得られたことから、他の液体に対する接触角についても同様に、接触角の差が２０°以上である場合に滴下品位が向上すると考えられる。

（実施例３）
実施例１と同様にして、試薬層の形成までの工程を実施した。

（比較例２）
比較例２として、試薬層形成領域にマスクを用いて親水化処理を施す代わりに、特許文献２の図１に示されるように、試薬層形成領域の周囲に部分的にスリットを形成した点以外は、実施例３と同様の工程を実施した。

実施例３のバイオセンサと比較例２のバイオセンサとについて、試薬滴下品位の相違の有無を検証した。具体的には、実施例１および比較例２の両者について、各々５５個の実際の試薬層の大きさ（直径）を測定し、設計値との関係を確認した。表２に、その結果を示す。なお、表２では、設計値を１として規格化し、それに対する実際の試薬の大きさ（直径）の比率を示した。

また、設計値からのズレが、４％を超えるものを不良とする良否判定基準を設けると、良品率は表３に示すとおりであった。

表２および３の結果から、実施例３の方が比較例２よりも安定して試薬を滴下できることが分かる。これは、比較例２では、単にスリットで試薬液の流動の抑制を図っているのに対して、実施例３では、試薬形成領域である親水性箇所と低親水性領域の箇所の境界で試薬形成位置の規定を図っているため、実施例３では、たとえ滴下時の工程ばらつきの影響で、試薬液がプラズマ処理箇所から多少はみ出した状態で滴下されても、試薬液が非処理の低親水性領域からプラズマ処理した高親水性領域に流動する、試薬液形成のセルフアライメント機能を有し、滴下時の工程ばらつきの影響が緩和される構造であるためであると考えられる。また、比較例２では、導通を確保するために、試薬液をとめるスリットに開口箇所を形成する必要があるのに対して、実施例３では試薬液の外周を親水性の高い試薬層形成領域と親水性の低い低親水性領域との境界で完全にわけることで、試薬の流動を抑制する効果が高くなったためであると考えられる。

以上の結果から、本発明によって、高感度および高精度のバイオセンサを提供することができ、搭載する試薬量を必要最小限に抑えられ、かつ、製造工程での不良率を低減できることが分かる。

１ 絶縁性基板、２ａ 試薬層形成領域、２１ 作用極、２２ 対極、３ 試薬層、３０ 試薬液、３０ａ 端部、４１ マスク、４１ａ 開口部、４２ スペーサ、４２ａ 切欠部、５ カバー、５ａ 空気穴。

Claims (9)

1. 試料液中に含まれる基質を定量するためのバイオセンサであって、
   絶縁性基板と、
   前記絶縁性基板の一方の面に設けられた作用極および対極を含む電極層と、
   前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面に形成された、前記基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層と、
   前記試料液を前記試薬層に誘導する供給路を形成するための切欠部を有し、該切欠部の内部に前記試薬層が位置するように前記電極層上に配置されたスペーサと、
   少なくとも前記切欠部を覆うように、前記スペーサの前記絶縁性基板と反対側の面に設けられたカバーとを備え、
   前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面において、前記試薬層が形成される試薬層形成領域の周囲の少なくとも一部に前記試薬層形成領域よりも親水性が低い低親水性領域を有することを特徴とする、バイオセンサ。
2. ある液体に対する前記試薬層形成領域の接触角と、前記液体に対する前記低親水性領域の接触角との差が２０°以上である、請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 前記低親水性領域が前記試薬層形成領域の全周を囲っている、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
4. 前記試薬層は、前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面に、前記酵素および前記メディエータを含む試薬液を付着させ、前記試薬液を乾燥することによって形成された層である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
5. 試料液中に含まれる基質を定量するためのバイオセンサの製造方法であって、
   前記絶縁性基板の一方の面に、作用極および対極を含む電極層を設ける工程と、
   前記電極層の前記絶縁性基板と反対側の表面において、前記基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層を形成するための試薬層形成領域と、該試薬層形成領域の周囲の少なくとも一部に前記試薬層形成領域よりも親水性が低い低親水性領域とが形成されるように、表面処理を行う工程と、
   前記試薬層形成領域に、前記酵素および前記メディエータを含む試薬液を付着させ、前記試薬液を乾燥することによって前記試薬層を形成する工程と、
   前記試料液を前記試薬層に誘導する供給路を形成するための切欠部を有するスペーサを、前記切欠部の内部に前記試薬層が位置するように前記電極層上に配置する工程と、
   少なくとも前記切欠部を覆うように、前記スペーサの前記絶縁性基板と反対側の面にカバーを設ける工程とを備える、バイオセンサの製造方法。
6. 前記表面処理を行う工程の後、前記試薬層を形成する工程の前において、
   ある液体に対する前記試薬層形成領域の接触角と、前記液体に対する前記低親水性領域の接触角との差が２０°以上である、請求項５に記載のバイオセンサの製造方法。
7. 前記低親水性領域が前記試薬層形成領域の全周を囲っている、請求項５または６に記載のバイオセンサの製造方法。
8. 前記表面処理を行う工程において、前記試薬層形成領域に親水化処理を施す、請求項５〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサの製造方法。
9. 前記表面処理を行う工程において、前記低親水性領域に撥水化処理を施す、請求項５〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサの製造方法。

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