JP2015190989A - パターン入りカバーガラス付きスライドガラス - Google Patents

Abstract

【課題】複数チャンネルで観察が可能な蛍光顕微鏡のシェーディング補正とレジストレーションを容易に行なえるようにする。
【解決手段】蛍光試料収容空間が形成されたスライドガラスと、パターンが施されたカバーガラスとを備え、カバーガラスは、蛍光試料を蛍光試料収容空間に注入するための隙間が設けられた状態で、蛍光試料収容空間を覆うように接着されているカバーガラス付きスライドガラス。
【選択図】図２

Description

本発明は、複数チャンネルで観察が可能な蛍光顕微鏡のシェーディング補正とレジストレーションに適したスライドガラスに関する。

試料に励起光を照射し、試料が発する蛍光を観察する蛍光顕微鏡が、生物学・医学を中心とした研究、臨床検査、浸透探傷検査等に用いられている。また、蛍光顕微鏡を応用した共焦点レーザー顕微鏡が、上記の分野に加え、工業分野における回路や半導体部品の品質管理等にも用いられている。

ここで、共焦点レーザー顕微鏡は、レーザー光を試料の特定の狭い範囲に焦点を合わせて像を検出する方式の顕微鏡であり、光軸方向の情報と二次元走査型の情報をコンピュータ処理によって組み合わせることにより、立体イメージを構築することができる。

蛍光顕微鏡には、蛍光観察に加え、明視野観察、暗視野観察等を同一の試料に対して行なえるものがある。ここでは、蛍光観察と明視野観察とを行なうことができる顕微鏡システムを例に説明する。

蛍光観察と明視野観察とを行なうことができる顕微鏡システムでは、像をカメラで撮影することにより、蛍光チャンネルの画像と、明視野チャンネルの画像とが得られるが、画像による試料の解析の事前処理として、シェーディング補正と、チャンネル間のレジストレーションを行なう必要がある。

シェーディング補正は、撮像素子の感度ムラや、対物レンズの周辺減光等に起因して、画像に生じる輝度ムラであるシェーディングを補正するための処理であり、一般に、走査範囲内の照度校正係数マップを算出することで補正を行なう。

レジストレーションは、蛍光チャンネルの画像と、明視野チャンネルの画像との位置合わせ処理であり、画像内の特徴量のマッチングを行なうことで位置の調整を行なう。

特開２００７−１１４３３９号公報

シェーディング補正とレジストレーションは、顕微鏡システムに接続されたコンピュータにより自動的に行なうことができるが、これらの処理に用いるサンプルの選定は容易ではない。

一般には、蛍光チャンネルで明瞭な画像が獲られる蛍光ビーズがサンプルとして用いられているが、蛍光ビーズは明視野チャンネルでは明瞭に映らないため、コンピュータによるレジストレーションのための画像解析には必ずしも適したものではない。

また、蛍光ビーズの作成は専門的な技術が必要であるため、市販品が多く用いられるが、高価な上、退色が生じる消耗品であるため、コスト的な負担が大きくなる等の問題もある。

このような状況から、複数チャンネルで観察が可能な蛍光顕微鏡のシェーディング補正とレジストレーションを容易にする技術の開発が望まれている。そこで、本発明は、複数チャンネルで観察が可能な蛍光顕微鏡のシェーディング補正とレジストレーションを容易にすることを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明によれば、蛍光試料収容空間が形成されたスライドガラスと、パターンが施されたカバーガラスとを備え、前記カバーガラスは、蛍光試料を前記蛍光試料収容空間に注入するための隙間が設けられた状態で、前記蛍光試料収容空間を覆うように接着されていることを特徴とするパターン入りカバーガラス付きスライドガラスが提供される。
ここで、前記蛍光試料収容空間は、前記スライドガラスの面上に凸状の壁により形成されていることができる。
あるいは、前記蛍光試料収容空間は、前記スライドガラスを掘削して形成されているものであってもよい。
いずれの場合も、前記パターンはグリッドパターンとすることができる。
また、前記蛍光試料収容空間が複数個形成されていてもよい。
また、前記蛍光試料収容空間に、自家蛍光を有する蛍光試料が収容されていることものであってもよい。

本発明によれば、複数チャンネルで観察が可能な蛍光顕微鏡のシェーディング補正とレジストレーションとを容易に行なうことができるようになる。

本実施形態に係る共焦点レーザー顕微鏡システムの構成を示すブロック図である。 本実施形態のパターン入りカバーガラス付きスライドガラスの構造を示す図である。 カバーガラスに施すパターンの例を示す図である。 カバーガラスに施すパターンの例を示す図である。 カバーガラスに施すパターンの例を示す図である。 カバーガラスに施すパターンの例を示す図である。 蛍光試料を注入したパターン入りカバーガラス付きスライドガラスを示す図である。 パターン入りカバーガラス付きスライドガラスの別例を示す図である。 パターン入りカバーガラス付きスライドガラスの別例を示す図である。 パターン入りカバーガラス付きスライドガラスの別例を示す図である。 パターン入りカバーガラス付きスライドガラスの別例を示す図である。

本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。本実施形態では、本発明のパターン入りカバーガラス付きスライドガラスを蛍光観察と明視野観察とを行なう共焦点レーザー顕微鏡システムに使用する場合を例に説明するが、本発明のパターン入りカバーガラス付きスライドガラスは、蛍光観察と明視野観察とを行なう共焦点レーザー顕微鏡システムに限られず、蛍光観察に加え、明視野観察、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察等を行なうことができる蛍光顕微鏡システムに広く適用することができる。

図１は、本実施形態に係る共焦点レーザー顕微鏡システム１０の構成を示すブロック図である。本図に示すように、共焦点レーザー顕微鏡システム１０は、光学系２００と画像処理系３００とを備えており、本発明を適用したパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００を利用してシェーディング補正とレジストレーション補正とを行なう。

光学系２００は、従来と同様の構成とすることができ、対物レンズ２１１を含んだ顕微鏡２１０、ダイクロイックミラー２２０、変倍レンズ２２１、明視野観察用カメラ２２２、共焦点スキャナ２３０、分光光学ユニット２４０、蛍光観察用第１カメラ２６０ａ、蛍光観察用第２カメラ２６０ｂを備えている。

共焦点スキャナ２３０は、ダイクロイックミラー２３１、ピンホールアレイディスク（ニポウディスク）２３２、マイクロレンズアレイディスク２３３、リレーレンズ２３４を備えている。分光光学ユニット２４０は、レンズ２４１、ダイクロイックミラー２４２、第１バンドパスフィルタ２４３ａ、第１レンズ２４４ａ、第２バンドパスフィルタ２４３ｂ、第２レンズ２４４ｂを備えている。

蛍光観察では、特定の波長を持つ励起光束をパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００にセットされた蛍光試料１８０に向けて出射する。この際に、共焦点スキャナ２３０を通すようにする。励起された蛍光試料１８０から励起光束よりも長い波長の蛍光信号が発せられ、顕微鏡２１０を通って共焦点スキャナ２３０に入射する。

共焦点スキャナ２３０のピンホールアレイディスク２３２を通過した蛍光信号が共焦点画像となる。その蛍光信号は、共焦点スキャナ２３０のダイクロイックミラー２３１によって反射され、リレーレンズ２３４によって蛍光観察用第１カメラ２６０ａおよび蛍光観察用第２カメラ２６０ｂで結像する。

複数波長の励起光源を同時に用いることに対応するため、分光光学ユニット２４０内に蛍光信号を分光する特性を有するダイクロイックミラー２４２を設置している。さらに、画像のＳ／Ｎ比向上と蛍光信号の必要な波長帯域のみを通すために第１バンドパスフィルタ２４３ａ、第２バンドパスフィルタ２４３ｂが設置されている。蛍光試料１８０が発する蛍光波長は様々であり、例えば、フィルタホイル等を用いて必要な波長に対応したバンドバスフィルタ２４３を複数用意することが望ましい。

明視野観察では、明視野照明を蛍光試料１８０に向けて照射する。明視野信号光は、顕微鏡２１０を通ってダイクロイックミラー２２０によって反射され、変倍レンズ２２１によって明視野観察用カメラ２２２で結像する。

画像処理系３００は、光学系２００に対応した画像処理用プログラムをインストールしたコンピュータで構成することができ、画像取得部３１０、シェーディング補正部３２０、レジストレーション処理部３３０を備えている。これらの機能ブロックは、従来と同様の処理を行なうことができる。

画像取得部３１０は、光学系２００の明視野観察用カメラ２２２、蛍光観察用第１カメラ２６０ａ、蛍光観察用第２カメラ２６０ｂが撮影した画像を取得する。

シェーディング補正部３２０は、画像取得部３１０が取得した画像を用いてシェーディング補正を行なう。シェーディング補正は、取得した画像から輝度ムラのレベルを画素毎に求め、そのレベルで除算することにより行なうことができる。シェーディング補正は、チャンネル毎に行なうようにする。

レジストレーション処理部３３０は、シェーディング補正済みの各チャンネルの画像を用いてチャンネル間のレジストレーション処理を行なう。レジストレーション処理では、あるチャンネルの画像を基準としたときの他のチャンネルの画像のズレ分を把握すればよいため、各チャンネルのシェーディング補正済みの画像からエッジを検出して特徴量として抽出する。エッジの検出は、Ｈａｒｒｉｓのコーナー検出等の手法を用いることができる。そして、チャンネル間で特徴量のマッチングを推定して位置ズレ量を算出する。位置ズレ量が得られると、アフィン変換等の幾何学的な変換を施してチャンネル間の画像の位置ズレを補正する。

図２は、本実施形態のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００の構造を示す図であり、図２（ａ）は上面図、図２（ｂ）は断面図である。本図に示すように、パターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００は、周りを囲む凸状の壁部１０１により蛍光試料収容空間１０２が形成されており、蛍光試料収容空間１０２は、パターン１１１が施されたカバーガラス１１０で覆われている。

カバーガラス１１０は、蛍光試料収容空間１０２に蛍光試料を注入するための隙間ができる位置に配置され、壁部１０１の上面と接着されている。この隙間を蛍光試料注入口と称する。このため、カバーガラス１１０は、壁部１０１に対して少しずれた位置で固定される。ただし、カバーガラス１１０に切り欠き部や穴部を設けることで蛍光試料注入口を形成するようにしてもよい。蛍光試料注入口は複数箇所形成されていてもよい。

接着は、例えば、接着剤や粘着剤を用いることができる。壁部１０１の高さは、少なくともカバーガラス１１０が覆う部分については一律の高さとする。

壁部１０１は、スライドガラス１００本体と一体化して形成してもよいし、壁となる枠を形成してスライドガラス１００本体に接着するようにしてもよい。前者の場合は、厚めのスライドガラスを切削加工することにより壁部１０１を形成することができ、後者の場合は、接着剤や粘着剤を用いて壁部１０１を接着することができる。

カバーガラス１１０は、パターン１１１が施された面が蛍光試料収容空間１０２側となるように配置する。パターン１１１は、カバーガラス１１０面に刻印してもよいし、印刷等してもよい。

パターン１１１は、図３に示すようにグリッドパターンとすることができる。本図のグリッドパターンでは、グリッド線の交点に円を配置し、識別記号を付している。

ただし、グリッドパターンに限定されず、他のパターンであってもよい。例えば、図４に示すように○△□等の異なる図形を上下左右に並べたパターンとしたり、図５に示すように多数の同心円のパターンとしたり、図６に示すように、同一の点を上下左右に並べたパターン等とすることができる。

本実施形態では、パターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００の蛍光試料収容空間１０２に蛍光試料１８０を注入して、共焦点レーザー顕微鏡システム１０のシェーディング補正、レジストレーションを行なう。蛍光試料１８０は、蛍光試料注入口から注入し、蛍光試料収容空間１０２を蛍光試料１８０で満たすようにする。ただし、蛍光試料収容空間１０２内に隙間が生じてもよい。

蛍光試料１８０は、例えば、自家蛍光を有する試料を用いて、蛍光試料注入口から蛍光試料収容空間１０２に注入する。自家蛍光を有する試料としては、例えば、ツクシの胞子を微粒化したものや、マツの茎や花粉、ユリの花粉等を微粒化したものを用いることができる。また、蛍光試薬を用いることもできる。これらは、蛍光チャンネルの特性に合わせて適したものを１または複数個選択することが好ましい。

図７は、蛍光試料１８０を蛍光試料収容空間１０２に収容したパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００を示している。倒立顕微鏡で使用するときは、蛍光試料１８０が漏れないように、エポキシ樹脂系接着剤等のガラス対応の接着剤等を用いて蛍光試料注入口をシールするようにする。

蛍光試料１８０を収容したパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００を用いることにより、蛍光試料１８０とパターン１１１が光軸方向について同一の位置で明瞭に撮像できるため、蛍光顕微鏡であってもその画像をシェーディング補正とチャンネル間のレジストレーションの両方に用いることができる。特に、明視野チャンネルではパターンが明瞭に写るため、レジストレーションのための特徴量解析が容易となる。

蛍光試料１８０を収容したパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００は、パターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００と蛍光試料１８０により簡易に、安価に作成することができるため、異なる波長のサンプルを多数作成する際の負担が、工数的にもコスト的にも軽減される。

また、蛍光試料１８０がパターンを除いた面で光って撮影されるため、シェーディング補正の際の蛍光強度の平均化の過程で、ゴミの蛍光強度への影響が無視できるほど小さくなる。そもそも、蛍光試料１８０として自家蛍光の試料を用いた場合にはゴミは混入せず、低倍率のレンズに対しても適切なシェーディング補正が可能となる。

蛍光試料１８０を収容したパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００は、対物レンズ倍率やチャンネルの種類によらず共通に使用することができる。また、光軸方向の蛍光分布から光学系の色収差が分かるため、チャンネル間で色収差を補正するための基準サンプルとしても用いることができる。さらに、パターンが施されているため、複数視野が適切に連結するように、回転補正、台形補正等の画像補正するための基準サンプルとしても用いることができる。

一般に、顕微鏡システムのオートフォーカスは、観察面の屈折率差を利用するが、蛍光試料１８０を収容したパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００は、スライドガラス１００本体とカバーガラス１１０との間の隙間で大きな屈折率となるため、カバーガラス１１０の試料面で適切に合焦することができる。

なお、上述の例では、壁部１０１を矩形状に形成していたが、図８（ａ）に示すように角に丸みを持たせたり、図８（ｂ）に示すように円形状に形成してもよい。

また、蛍光試料収容空間１０２を壁部１０１によって形成するのではなく、図９や図１０に示すように、スライドガラス１００本体を凹状に掘削して蛍光試料収容空間１０２を形成するようにしてもよい。この場合、壁部１０１は不要となり、スライドガラス１００本体の凹状部分を覆うようにカバーガラス１１０をスライドガラス１００本体に接着する。このときも蛍光試料注入口を形成するようにする。

さらには、図１１に示すように、１枚のスライドガラス１００本体に、複数個の蛍光試料収容空間１０２（１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ）を形成するようにしてもよい。それぞれの蛍光試料収容空間１０２には、異なる波長特性の蛍光試料１８０（１８０ａ、１８０ｂ、１８０ｃ）を注入することができる。これにより、１枚のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス１００で、複数の蛍光チャンネルのシェーディング補正を行なうことができるため、測定時間を短縮することができる。

また、同じ蛍光試料でそれぞれの蛍光試料収容空間１０２の濃度を変化させてもよい。これにより、対物レンズ出射パワーを一定にしたときの蛍光のリニアリティを測定し、補正することができる。蛍光試料収容空間１０２の数を増やすことで、より高次のフィッティングカーブによる補正が可能となる。

１０…共焦点レーザー顕微鏡システム、１００…パターン入りカバーガラス付きスライドガラス、１０１…壁部、１０２…蛍光試料収容空間、１１０…カバーガラス、１１１…パターン、１８０…蛍光試料、２００…光学系、２１０…顕微鏡、２２２…明視野観察用カメラ、２３０…共焦点スキャナ、２４０…分光光学ユニット、２６０…蛍光観察用カメラ、３００…画像処理系、３１０…画像取得部、３２０…シェーディング補正部、３３０…レジストレーション処理部

Claims (6)

1. 蛍光試料収容空間が形成されたスライドガラスと、
   パターンが施されたカバーガラスとを備え、
   前記カバーガラスは、蛍光試料を前記蛍光試料収容空間に注入するための隙間が設けられた状態で、前記蛍光試料収容空間を覆うように接着されていることを特徴とするパターン入りカバーガラス付きスライドガラス。
2. 前記蛍光試料収容空間は、前記スライドガラスの面上に凸状の壁により形成されていることを特徴とする請求項１に記載のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス。
3. 前記蛍光試料収容空間は、前記スライドガラスを掘削して形成されていることを特徴とする請求項１に記載のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス。
4. 前記パターンはグリッドパターンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス。
5. 前記蛍光試料収容空間が複数個形成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス。
6. 前記蛍光試料収容空間に、自家蛍光を有する蛍光試料が収容されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のパターン入りカバーガラス付きスライドガラス。