CN111240001A - 一种带有盖玻片的显微标本的对焦方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低对比度标本的对焦方法，属于显微技术领域，用于提高低对比度标本自动对焦的成功率。本发明在盖玻片上增加特定的图案，在对焦时先找到这几个图案的焦面位置，然后以这些焦面位置拟合出一个平面作为参考面，并结合图案和标本的厚度设定上下限，在此范围内对标本进行对焦，这样可以确保不会对焦到非标本上，同时有效提高对焦的速度和成功率。

Description

一种带有盖玻片的显微标本的对焦方法

技术领域

本发明属于显微技术领域，具体来说，是一种提高低对比度标本自动对焦的成功率。

背景技术

光学显微镜是利用光学透镜放大原理， 把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器，光学显微镜的发明是人类历史上取得的一项重大成就，它使得人们能够看到放大上千倍的肉眼所不能看见的精细结构。在医疗、教学、工业、科研等多领域得到广泛的应用。观察的标本也各种各样，其中那种带有盖玻片的低对比度标本，如纤维标本、脂肪组织标本、荧光标本等，由于有标本的区域和非标本的区域差异不明显，在自动显微镜进行自动对焦时容易出现以下两种问题：一是可能找到盖玻片之外的地方即非有效观察区域，找不到标本，还可能导致Z轴过度调整使物镜压到载玻片上，从而损坏标本，二是有可能对焦到盖玻片上的脏点，导致标本都是模糊的。这时，一般是改用人工手动对焦，导致自动化程度不高，特别是在利用自动显微镜对这类标本进行数字化时，需要人工重新扫描，影响效率。

现有技术专利US2018/0373014A1公开了：用于显微镜观察的载玻片包括：配置标签的标签区域，配置观察标本的盖玻片区域，在标签区域与盖玻片之间的空白区域配置的位置基准标记区域，并且被指定为指定切片的参考位置以及彼此正交的X轴方向和Y轴方向，以及沿着参考区域的周围的两个相对侧重复地布置有预定图案的聚焦参考标记。但该专利要求标本及盖玻片必须放置在此标记限定的范围内，操作起来有一定难度；盖玻片尺寸规格有多种，通用性不强；这些标记上没有盖玻片，实际焦面会有差别，因此需要亟待改进此类技术。

发明内容

本发明旨在提供一种带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：在盖玻片的下表面打印上特定图案，将盖玻片下表面朝着载玻片上的标本盖上，盖玻片上表面朝物镜，具体步骤如下：

第一步、用低倍光学图像采集装置快速获取整个载玻片的低分辨率图片作为宏观图片，根据特定图案及其位置，和盖玻片的尺寸参数，获得盖玻片的位置；

第二步、对盖玻片上特定图案进行对焦，获得盖玻片上的几个特定图案的焦面位置以确定一个参考面；

第三步、在参考面附近对标本进行对焦：以参考面为基准，加上和减去某个偏移量分别作为上限和下限，在此范围内对标本进行自动对焦。

进一步，所述的盖玻片上的特定图案，至少在1个位置上设置，优选的至少在3个位置上设置。

所述的特定图案的可以多种，如圆形、四边形、三角形等构成的阵列，最小特定图案的尺寸要小于所用物镜的物方视场，确保在物方视场内有明暗图案。

所述的特定图案可以分布在任何位置，优选的特定图案分布在盖玻片的边缘，这样可以减少对标本的遮挡。

所述的盖玻片上的特定图案朝着载玻片上的标本贴着。

进一步，所述的盖玻片的位置，可以通过识别盖玻片上的图案及位置，再结合盖玻片的尺寸参数，以确定盖玻片的位置；由于盖玻片上的图案位置是已知的，只要通过识别出这些特定图案及其位置，再结合盖玻片的尺寸参数，可以确定盖玻片的位置。

所述的盖玻片的位置，可以根据该特定图案的分布位置及盖玻片的边长来确定，至少有如下几种方法：

第一、只有1个特定图案时，优选的放置在盖玻片的中心，可以根据此图案及盖玻片的边长来确定盖玻片位置；

第二、有2个特定图案时，优选的放置在盖玻片的其中两个对角上，可以根据这2个对角的图案确定盖玻片位置；

第三、有3个特定图案时，优选的放置在盖玻片的3个对角上，可以根据这3个对角的图案确定盖玻片位置。

第四、有4个及以上特定图案时，优选的有4个放置在盖玻片的4个对角上，其他的放置在盖玻片边上，可以根据这4个对角的图案确定盖玻片位置。进一步，所述的对焦前先用低倍光学图像采集装置快速获取整个载玻片的低分辨率图片作为宏观图片，结合盖玻片上的这些特定图案及其尺寸参数确定盖玻片的位置。

所述的低倍光学图像采集装置采用低倍物镜或低倍摄像头。

所述的宏观图片，可以用低倍物镜如2x物镜对整张玻片拍摄多张连续的图片后进行拼接，或者用低倍摄像头，可以一次性拍照获得，这是一般数字切片扫描仪中常用的方法。

进一步，所述的盖玻片的位置区域可估算获取标本的焦面位置，再根据焦面位置拟合参考面后，再进行小范围对焦，确保聚焦到标本上而不会聚焦到盖玻片上表面。

所述的对焦是分别对盖玻片上这些特定图案进行对焦，根据这几个图案的焦面位置拟合出一个曲面做为参考面。

进一步，所述的参考面，由盖玻片上特定图案数量的不同有三种确定参考面的方法。

第一、当只有1个图案时，用该图案的焦面位置作为参考面。

第二、当只有2个图案时，可以用这两个图案线性拟合出一个平面作为参考面，或者简单用这两个图案的焦面位置的平均值作为参考面。

第三、当有3个及以上图案时，可以用这几个图案的焦面位置以拟合算法得出一个曲面作为参考面，

所述的拟合算法可以用最小二乘法、三角面片法等。

进一步，所述的对焦以参考面为基准加上和减去某个偏移量分别作为上限和下限，在此范围内对标本进行自动对焦。。

所述的偏移量，可以根据经验进行设定，优选的是根据图案的厚度及标本的厚度来确定。。

所述的上限可以取盖玻片下表面的焦面位置，即盖玻片上有图案的这面，即参考面加上以图案厚度作为偏移量后的数值。

所述的下限可以取参考面位置数值减去以标本厚度值作为偏移量后的数值。

本发明与现有技术US2018/0373014A11专利在设计上存在较大区别，而其中重要区别是US2018/0373014A11专利有“将其图案是打印载玻片中”的设计，不是同于本发明是将图案打印盖玻片上。而US2018/0373014A11专利技术要求标本及盖玻片必须放置在此标记限定的范围内，操作起来有一定难度；而且由于盖玻片尺寸规格多，造成不容易适配，因此该现有技术的通用性不强；并且由于这些载玻片上的图案标记分布在盖玻片之外，实际上使用该技术会造成焦面有差别，由此导致参考面位置存在误差，因此会引起系列测量误差等严重问题。而采用本发明后，对标本的放置没有位置上的限定；可以适应多种规格的盖玻片；图案和标本都在盖玻片下，其焦面位置基本一致。

除此之外，本发明相比现有技术中带有盖玻片的稀疏或者颜色很淡或接近透明的标本对焦技术，还具有以下优点：

1）不会聚焦到盖玻片之外的无效标本上，也不会聚焦到盖玻片上表面的脏点，保证对焦清楚。

2）只需在一个较小的范围内进行对焦，不会出现没有因过度调整Z轴带来损坏标本的风险。

3）同时提高对焦速度和成功率。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明显微标本的对焦实施例带有图案的盖玻片示意图；

图2 为本发明显微标本的对焦实施例盖玻片各种图案示意图；

图3为本发明显微标本的对焦实施例带有图案的盖玻片和载玻片结构示意图；

图4为本发明显微标本的对焦实施例带有盖玻片标本置于显微镜下的示意图。

标号说明

盖玻片1；盖玻片上表面（朝着物镜）11；盖玻片下表面（朝着载玻片）12；特定图案21、22、23、24；标本3；载玻片4；物镜5。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。

如图1,3、4所示，本发明提供一种带有盖玻片1的低对比度标本3的速对焦方法，盖玻片1上带有特定图案21、22、23、24，步骤如下：

1）在盖玻片下表面12上打印些特定图案21、22、23、24，将盖玻片下表面12朝着载玻片4上的标本3盖上，盖玻片上表面11朝物镜5。

2）根据盖玻片1上的特定图案21、22、23、24的焦面位置确定一个参考面。

3）在参考面附近对标本3进行对焦。

进而，在盖玻片下表面12上打印些特定图案21、22、23、24，将盖玻片下表面12朝着载玻片4上的标本3盖上，对焦前先用低倍物镜或低倍摄像头快速获取整个玻片的低分辨率图片作为宏观图片，根据盖玻片1上的这些特定图案21、22、23、24及其尺寸参数确定盖玻片1的位置，然后在此位置区域估算标本3的焦面位置即参考面后再进行小范围对焦，确保聚焦到标本3上而不会聚焦到盖玻片上表面11，具体是分别对这些图案21、22、23、24进行对焦，根据这几个图案21、22、23、24的焦面位置拟合出一个曲面并做为参考面，再结合图案21、22、23、24的厚度和标本3的厚度设定上下限，在此范围内对标本3进行自动对焦。

进一步具体方法，如图2、3所示，在盖玻片下表面12上打印些特定图案21、22、23、24，将盖玻片下表面12朝着载玻片4上的标本3盖上（即盖玻片上表面11朝上），其中所述图案21、22、23、24的可以多种，如四边形21、22、圆形23、三角形24等构成的阵列；如图2 所示，图案21、22、23、24的尺寸要小于所用物镜5的物方视场，假设所用的物镜5为20x，其物方视场一般为1mm，则图案21、22、23、24的尺寸要小于1mm，优选的为其十分之一即100um。图案21、22、23、24的数量至少有1个，优选的至少有3个。图案21、22、23、24可以分布在盖玻片1的任何位置，优选的分布在盖玻片1的边缘，这样可以减少对标本3的遮挡。

对焦方法的步骤如下：

如图4所示，获得整张载玻片4的图片作为宏观图片，可以用低倍物镜5如2x物镜5对整张玻片拍摄多张连续的图片后进行拼接获得，也可以用一个视场比较大的低倍摄像头，一次性拍照获得。

如图2、4所示，通过宏观图片确定盖玻片1在载玻片4上的位置，在此范围内进行对焦，确保不会对到盖玻片1之外的无效区域。由于盖玻片1上的图案21、22、23、24位置是已知的，只要通过识别出这些图案21、22、23、24及其位置，就可以结合盖玻片1的尺寸参数，确定盖玻片1的位置。

如图1所示，当只有1个图案21、22、23、24时，优选的放置在盖玻片1的中心，这样可以根据该图案21、22、23、24的位置及盖玻片1的边长来确定盖玻片1的位置；有2个图案21、22、23、24时，优选的放置在盖玻片1的其中两个对角上；有3个图案21、22、23、24时，优选的放置在盖玻片1的3个对角上，有4个及以上图案时，优选的有4个放置在盖玻片1的4个对角上，其他的放置在边缘上。

根据这几个图案21、22、23、24的焦面位置拟合出一个曲面作为参考面。具体要根据盖玻片1上图案21、22、23、24数量，当只有1个图案21、22、23、24时，用该图案21、22、23、24的焦面位置作为参考面。当有2个图案21、22、23、24时，可以用这两个图案21、22、23、24的焦面位置线性拟合出一个平面作为参考面，或者简单用这两个图案21、22、23、24的焦面位置的平均值作为参考面。当有3个及以上图案21、22、23、24时，可以用这几个图案21、22、23、24的焦面位置拟合出一个曲面作为参考面，拟合算法可以最小二乘法、三角面片法等。

以此参考面为基准，根据经验设定上下限，在此范围内对标本3进行对焦，优选的此上下限可以结合图案21、22、23、24的厚度和标本3的厚度，优选的上限可以取盖玻片下表面12的焦面位置，即参考面加上图案21、22、23、24厚度值作为偏移量后的平面，下限可以取参考面减去以标本3厚度值作为偏移量后的平面。

以上对本发明提供的一种带有盖玻片的显微标本的对焦方法进行了详细介绍。具体实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (19)

1.一种带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于在盖玻片的下表面打印上特定图案，将盖玻片下表面朝着载玻片上的标本盖上，盖玻片上表面朝物镜，步骤如下：

第一步、根据特定图案的分布位置和盖玻片的尺寸参数，获得盖玻片的位置；

第二步、对盖玻片上特定图案进行对焦，获得盖玻片上的几个特定图案的焦面位置以确定一个参考面；

第三步、在参考面附近对标本进行对焦。

2.根据权利要求1所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的盖玻片上的特定图案，至少在1个位置上设置，优选的至少在3个位置上设置。

3.根据权利要求2所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的特定图案可以分布在任何位置，优选的特定图案分布在盖玻片的边缘。

4.根据权利要求2所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：当只有1个特定图案时，优选的放置在盖玻片的中心；当有2个特定图案时，优选的放置在盖玻片的其中两个对角上；当有3个特定图案时，优选的放置在盖玻片的3个对角上；当有4个及其以上的特定图案时，优选的至少有4个放置在盖玻片的4个对角上,其他的放置在盖玻片边上。

5.根据权利要求2所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的特定图案的可以多种，如圆形、四边形、三角形等构成的阵列；最小特定图案的尺寸要小于所用物镜的物方视场。

6.根据权利要求1或2所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的盖玻片上的特定图案朝着载玻片上的标本贴着。

7.根据权利要求1所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的对焦前先用低倍光学图像采集装置快速获取整个载玻片的低分辨率图片作为宏观图片，结合盖玻片上的这些特定图案及其尺寸参数确定盖玻片的位置。

8.根据权利要求1所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的低倍光学图像采集装置采用低倍物镜或低倍摄像头。

9.根据权利要求7所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的宏观图片，可以用低倍物镜如2x物镜对整张玻片拍摄多张连续的图片后进行拼接，或者用低倍摄像头，可以一次性拍照获得。

10.根据权利要求1所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的盖玻片的位置，可以通过识别盖玻片上的图案及位置，再结合盖玻片的尺寸参数，以确定盖玻片的位置。

11.根据权利要求1所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的盖玻片的位置，由盖玻片上特定图案数量及其分布位置有多种识别方法，优选的方法如下：

第一、只有1个特定图案时，优选的放置在盖玻片的中心，可以根据图案的位置及盖玻片的边长确定盖玻片位置；

第二、有2个特定图案时，优选的放置在盖玻片的其中两个对角上，可以根据这两个对角上的图案位置确定盖玻片位置；

第三、有3个及以上特定图案时，优选的放置在盖玻片的3个对角上，可以根据这3个对角上的图案位置确定盖玻片位置。

12.根据权利要求1或11所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的盖玻片的位置区域可估算获取标本的焦面位置，再根据焦面位置拟合参考面后，再进行小范围对焦。

13.根据权利要求12所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的对焦是分别对盖玻片上这些特定图案进行对焦，根据这几个图案的焦面位置拟合出一个曲面做为参考面。

14.根据权利要求1或12所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的参考面，由盖玻片上特定图案数量的不同有三种确定参考面的方法：

第一、当只有1个图案时，用该图案的焦面位置作为参考面；

第二、当只有2个图案时，可以用这两个图案线性拟合出一个平面作为参考面，或者简单用这两个图案的焦面位置的平均值作为参考面；

第三、当有3个及以上图案时，可以用这几个图案的焦面位置以拟合算法得出一个曲面作为参考面。

15.根据权利要求14所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的拟合算法可以用最小二乘法、三角面片法等。

16.根据权利要求1所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的对焦以参考面为基准加上和减去某个偏移量分别作为上限和下限，在此范围内对标本进行自动对焦。

17.根据权利要求16所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的偏移量，可以经验值，优选的根据图案的厚度及标本的厚度来确定偏移量。

18.根据权利要求17所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的上限可以取盖玻片下表面的焦面位置，即盖玻片上有图案的这面，即参考面加上以图案厚度作为偏移量后的数值。

19.根据权利要求17所述的带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：所述的下限可以取参考面位置数值减去以标本厚度值作为偏移量后的数值。

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