JP2015173628A - キシロオリゴ糖利用能を付与したコリネ型細菌形質転換体 - Google Patents
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Abstract
【課題】セルロース系バイオマス資源の有効利用を図る上で必要なキシロオリゴ糖の利用機能が向上した組換え微生物、及びこの微生物を用いる有機化合物の製造方法を提供する。
【解決手段】宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体。キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質としてはキシロシドＡＢＣトランスポーター（ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質）及びキシロシド／Ｎａ＋（Ｈ＋）シンポーター（シンポーター型輸送体蛋白質）があり、前記蛋白質の遺伝子をコリネ型細菌に導入する。
【選択図】図７
【解決手段】宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体。キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質としてはキシロシドＡＢＣトランスポーター（ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質）及びキシロシド／Ｎａ＋（Ｈ＋）シンポーター（シンポーター型輸送体蛋白質）があり、前記蛋白質の遺伝子をコリネ型細菌に導入する。
【選択図】図７
Description
本発明は、キシロオリゴ糖を効率良く利用できるコリネ型細菌形質転換体、さらに詳しくは、キシロオリゴ糖利用機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌形質転換体に関する。また、本発明は、この形質転換体を用いた高効率的な発酵又は反応方法に関する。
セルロース系バイオマスは、発酵に代表される微生物変換による有機化合物やエタノール等のバイオ燃料の製造原料として有用である。セルロース系バイオマスは、コーンデンプン、砂糖などの糖質系バイオマスと異なり、安価に農産廃棄物、林地残材等の木質廃棄物、およびススキ等のエネルギー作物として多様な種類のものが入手可能である。また、セルロース系バイオマスは、将来的に、穀物などの食料資源確保の障害とはならない原料である。セルロース系バイオマスは、３５質量％〜４５質量％のセルロース、３０質量％〜４０質量％のヘミセルロース、１０質量％のリグニン、および１０質量％の他の成分から構成されている。セルロースはグルコース（C6糖：ヘキソース）のポリマーである。一方、ヘミセルロースでは、C5糖：ペントースであるキシロースやアラビノース等が主要な構成糖成分である。
草本系セルロース系バイオマスであるコーンストーバー（Corn stover）、小麦わら（Wheat straw）、稲わら（Rice straw）、バガス（Baggasse）等は、ヘミセルロース含量が高いため、前処理工程および酵素糖化工程後の糖化液（混合糖）には、セルロース由来のグルコースに加えて、ヘミセルロースの主要構成成分であるキシランに由来するキシロースやキシロオリゴ糖が含まれる （非特許論文１）。従って、セルロース系バイオマスの有効利用を図る上で、微生物による高効率的なキシロース利用技術の確立が不可欠であるが、前処理工程および酵素糖化工程では完全にヘミセルロースを分解できないため、キシロオリゴ糖が残存することが問題である。
しかし、これまで使用されている工業用発酵微生物はキシロオリゴ糖を利用できない。また、酵素糖化工程においてキシロオリゴ糖がセルラーゼを著しく阻害することも報告されている （非特許論文２）。
このように草本系セルロースバイオマスの有効利用、糖化工程の効率アップ、およびヘミセルロース分解効率の改善には、キシロオリゴ糖の完全分解が望まれる。しかし、酵素によりキシロオリゴ糖を完全分解するには高活性のセルラーゼの使用、またはキシラナーゼ等のキシラン分解酵素の追加が必要となり（非特許論文３）、このことはコスト上昇につながる。したがって酵素使用量の低減を可能にし、コスト面で非常に有益である、キシロオリゴ糖を直接利用できる発酵微生物の創出が望まれていた。
このように草本系セルロースバイオマスの有効利用、糖化工程の効率アップ、およびヘミセルロース分解効率の改善には、キシロオリゴ糖の完全分解が望まれる。しかし、酵素によりキシロオリゴ糖を完全分解するには高活性のセルラーゼの使用、またはキシラナーゼ等のキシラン分解酵素の追加が必要となり（非特許論文３）、このことはコスト上昇につながる。したがって酵素使用量の低減を可能にし、コスト面で非常に有益である、キシロオリゴ糖を直接利用できる発酵微生物の創出が望まれていた。
キシランを利用できる細菌はいくつか知られている。細胞外のエンド型のキシラナーゼで分解されたキシロビオースやキシロトリオース等のキシロオリゴ糖は、細菌細胞膜に存在する特異的な輸送体（トランスポーター）により細胞内に輸送され、細胞内のβ-キシロシダーゼによりＤ-キシロースに分解されてペントースリン酸経路、解糖系で代謝される。細菌の細胞膜に存在するキシロオリゴ糖の輸送体は、２種類が知られている。一方はキシロシド/Na+ (H+)シンポーター（xyloside/Na+ (H+) symporter）であり、他方はキシロシドＡＢＣトランスポーター（xyloside ABC transporter）である。
キシロシド/Na+ (H+)シンポーターは、細胞膜を複数回ペプチドが貫通する構造を有する蛋白質であり、キシロオリゴ糖をナトリウムイオンまたはプロトンと共輸送（シンンポート）する。クレブシエラ オキシトカ（Klebciella oxytoca） のキシロシド/Na+ (H+)シンポーター（XynT）遺伝子は大腸菌で発現され、キシロオリゴ糖のキシロシル６単位まで輸送可能である（非特許論文４）。また、クレブシエラ ニューモニア（Klebciella pneumoniae ）のキシロシド/Na+ (H+)シンポーター（XynT）遺伝子も同じく大腸菌で発現され、キシロオリゴ糖のキシロシル３単位を細胞内に輸送できることが確認されている（非特許論文５）。
キシロシドＡＢＣトランスポーターは基質結合性蛋白質、輸送蛋白質、およびＡＴＰ結合蛋白質の複合体である。キシロシドＡＢＣトランスポーターは、エネルギー依存的にキシロオリゴ糖を細胞内に輸送するため、ＡＴＰを必要とする。ストレプトマイセス サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus ）で見いだされたＡＢＣトランスポーター（BxlEFG）の基質結合性蛋白質、およびサーモビオラセウス テアロサーモフィラス（Geobacillus staerothermophilus ）で見いだされたＡＢＣトランスポーター（XynEFG）の基質結合性蛋白質は、それぞれ、キシロオリゴ糖に対して高い親和性を示した（非特許文献６および非特許文献７）。
このようにキシロオリゴ糖を利用可能な細菌の細胞膜におけるキシロオリゴ糖輸送体には２つのタイプが存在している。また、これらを異種細胞で発現させて物質生産に応用した報告がなされている。しかし、単離したキシロシド/Na+ (H+)シンポーターとキシロシダーゼ遺伝子を異種細胞である大腸菌で発現した例では、導入した大腸菌でのキシロオリゴ糖からの物質生産能は十分ではなかった（非特許文献４）。また、キシロシドＡＢＣトランスポーターについては、細胞内での遺伝子の発現や転写制御が研究されている段階であり（非特許文献８）、発酵微生物のような異種細胞で発現され、物質生産に適用された報告はない。
輸送体により細胞内に輸送されたキシロオリゴ糖は、β-キシロシダーゼにより単糖のＤ-キシロースに分解される。β-キシロシダーゼは極めて高価であるため、β-キシロシダーゼを微生物で産生させる方法が報告されている。例えば、特許文献１および特許文献２は、アスペルギルス オリゼ（Aspergillus oryzae）等のカビからβ-キシロシダーゼ遺伝子を抽出し、アスペルギルス属菌株を形質転換してβ-キシロシダーゼを生産する方法を開示している。しかし、これらは生産した酵素によるリグノセルロース系バイオマスからのＤ-キシロースの回収が目的である。
非特許文献９および非特許文献１０は、細菌由来のβ-キシロシダーゼの性質を報告しているが、一部の好熱菌由来β-キシロシダーゼの高温度条件下での反応を除いて、低比活性であったり、分解生成物であるD-キシロースによる生成物阻害を受けやすいなど、実際にリグノセルロースを糖化する酵素として利用する場合には問題があった。
アスペルギルス オリゼ等のカビのβ-キシロシダーゼを酵母表層で発現させて、キシロオリゴ糖をＤ-キシロースに分解し、Ｄ-キシロースを酵母内に取り込んで利用する方法が提案されているが、キシロオリゴ糖からのエタノール生産性が低く、グルコースとの同時利用ができない等の問題があった（特許文献３）。
アスペルギルス オリゼ等のカビのβ-キシロシダーゼを酵母表層で発現させて、キシロオリゴ糖をＤ-キシロースに分解し、Ｄ-キシロースを酵母内に取り込んで利用する方法が提案されているが、キシロオリゴ糖からのエタノール生産性が低く、グルコースとの同時利用ができない等の問題があった（特許文献３）。
ここで、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）及びその組換え株は、嫌気性な還元条件下における糖類からの有機酸等の有機化合物へのバイオ変換反応において、増殖することなく物質生産が行えるので、食料と競合しないセルロース系バイオマス由来の糖類を原料とした化学品やバイオ燃料の生産（バイオリファイナリー）に有用な微生物である（特許文献４）。
物質生産の場合は、まず菌体（C. glutamicum）を好気的に培養後、反応容器に高密度に充填し、嫌気的条件下で基質を加えて反応を行う。高密度で反応できることから、コンパクトな反応装置設計が可能である。本発明者等は、ザイモモナス モビリス由来のピルベート デカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカムに導入・発現した形質転換体により、高効率にエタノールが生産される技術を開示している（非特許文献１１）。
物質生産の場合は、まず菌体（C. glutamicum）を好気的に培養後、反応容器に高密度に充填し、嫌気的条件下で基質を加えて反応を行う。高密度で反応できることから、コンパクトな反応装置設計が可能である。本発明者等は、ザイモモナス モビリス由来のピルベート デカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカムに導入・発現した形質転換体により、高効率にエタノールが生産される技術を開示している（非特許文献１１）。
さらに、増殖を伴いながら物質生産を行う、例えばサッカロミセス セレビシアエ、ザイモモナス モビリス、エシェリヒア コリなどを用いた発酵法では、糖化工程前のセルロース系バイオマスの高温・高圧処理等の前処理工程において生成するフェノール類、フラン類、有機酸などの“発酵阻害物質”（増殖阻害物質）による生産阻害を受けることが大きな問題となっている。しかし、コリネバクテリウム グルタミカムを用いる我々の技術は、増殖を伴わずに有機酸等の有機化合物へのバイオ変換反応が可能であることから、所謂“発酵阻害物質”（増殖阻害物質）による生産阻害を受けない利点を有する（非特許文献１２）。
コリネバクテリウム グルタミカムの野生株は、様々な利点を有するバイオ変換反応を可能とする能力を有するものの、本来の特性として、Ｄ‐キシロース等のC5糖（ペントース）を利用することができなかったが、発明者らは、この点に関して、コリネバクテリウム グルタミカムに、エシェリヒア コリ由来のキシロース イソメラーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子を導入し、発現させることで、Ｄ−キシロースの利用能を付与する技術を開示している（非特許文献１３）。
しかし、すぐれたキシロオリゴ糖利用能を有する微生物の創製が求められている。
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本発明は、セルロース系バイオマス資源の有効利用を図る上で必要なキシロオリゴ糖の利用機能がすぐれた組換え微生物、及びこの微生物を用いる高効率な有機化合物の製造方法を提供することを課題とする。
前記の課題を解決するために本発明者は研究を重ね、コリネ型細菌に、キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及びβ-キシロシダーゼをコードする外来遺伝子を導入することにより創製される形質転換体がキシロオリゴ糖から有機化合物を効率よく生産することを見出した。
また、上記２つの外来遺伝子の導入により、宿主のコリネ型細菌のキシロオリゴ糖利用速度が大幅に向上すると共に、Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖の両糖の存在下での、Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖を並行的かつ同時に利用できることを見出した。
また、上記２つの外来遺伝子の導入により、宿主のコリネ型細菌のキシロオリゴ糖利用速度が大幅に向上すると共に、Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖の両糖の存在下での、Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖を並行的かつ同時に利用できることを見出した。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記の形質転換体および有機化合物の製造方法を提供する。
項１． 宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体。
項２． キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型の輸送体蛋白質である項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項３． ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(b)配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項２に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項４． キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送体がシンポーター型の輸送体蛋白質である項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項５． シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(d)配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項４に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項６． キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型の輸送体蛋白質およびシンポーター型の輸送体蛋白質である項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項７． ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(b)配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡであり、
シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(d)配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項６に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項８． β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(e)配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(f)配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項１〜７の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項９． さらに、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されている項１〜８の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１０． ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(g)配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(h)配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号４と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＴＰ結合部位を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項９に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１１． 宿主のコリネ型細菌が、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌である項１〜１０の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１２． Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、キシロース イソメラーゼをコードする外来遺伝子、及びキシルロキナーゼをコードする外来遺伝子を導入された形質転換体である項１１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１３． 宿主のコリネ型細菌が、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来遺伝子を導入された形質転換体である項１〜１２の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１４． 宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルタミカムInd-araE/pCRA811 (受託番号 NITE BP−576)、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号 NITE BP−577)、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号 NITE BP−581)である項１３記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１５． ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体をコードする外来遺伝子およびＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されており、これらの外来遺伝子が、それぞれ独立して、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）、またはゲオバシルス スタエロサーモフィルス（Geobacillus staerothermophilus）由来の遺伝子である項１〜３、および６〜１４の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１６． シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体をコードする外来遺伝子が導入されており、この外来遺伝子が、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylycum）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、バシルス サブチリス（Bacillus subtilis）、またはクレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来の遺伝子である項１、３〜１５の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１７． β-キシロシダーゼをコードする外来遺伝子が、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス スカビエイ（Streptomyces scabiei）、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、ラクトバシルス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、パエニバシルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、またはゲオバシルス サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）由来の遺伝子である項１〜１６の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１８． コリネ型細菌の形質転換体がCorynebacterium glutamicum XYD9 （受託番号NITE P-01812）である項１〜１７の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１９． 項１〜１８の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、キシロオリゴ糖を含むか、又はキシロオリゴ糖とグルコースを含む反応液中で反応させる工程と、培養物から有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
項２０． 有機化合物が、アミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質、および有機性ガスからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１９に記載の方法。
項２１． 還元条件下の反応液中で反応させる項１９または２０に記載の方法。
項２２． 還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００ｍＶ〜−５００ｍＶである項２１に記載の方法。
項１． 宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体。
項２． キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型の輸送体蛋白質である項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項３． ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(b)配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項２に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項４． キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送体がシンポーター型の輸送体蛋白質である項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項５． シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(d)配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項４に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項６． キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型の輸送体蛋白質およびシンポーター型の輸送体蛋白質である項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項７． ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(b)配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡであり、
シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(d)配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項６に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項８． β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(e)配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(f)配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項１〜７の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項９． さらに、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されている項１〜８の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１０． ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(g)配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(h)配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号４と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＴＰ結合部位を有する蛋白質をコードするＤＮＡである項９に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１１． 宿主のコリネ型細菌が、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌である項１〜１０の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１２． Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、キシロース イソメラーゼをコードする外来遺伝子、及びキシルロキナーゼをコードする外来遺伝子を導入された形質転換体である項１１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１３． 宿主のコリネ型細菌が、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来遺伝子を導入された形質転換体である項１〜１２の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１４． 宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルタミカムInd-araE/pCRA811 (受託番号 NITE BP−576)、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号 NITE BP−577)、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号 NITE BP−581)である項１３記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１５． ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体をコードする外来遺伝子およびＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されており、これらの外来遺伝子が、それぞれ独立して、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）、またはゲオバシルス スタエロサーモフィルス（Geobacillus staerothermophilus）由来の遺伝子である項１〜３、および６〜１４の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１６． シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体をコードする外来遺伝子が導入されており、この外来遺伝子が、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylycum）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、バシルス サブチリス（Bacillus subtilis）、またはクレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来の遺伝子である項１、３〜１５の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１７． β-キシロシダーゼをコードする外来遺伝子が、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス スカビエイ（Streptomyces scabiei）、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、ラクトバシルス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、パエニバシルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、またはゲオバシルス サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）由来の遺伝子である項１〜１６の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１８． コリネ型細菌の形質転換体がCorynebacterium glutamicum XYD9 （受託番号NITE P-01812）である項１〜１７の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１９． 項１〜１８の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、キシロオリゴ糖を含むか、又はキシロオリゴ糖とグルコースを含む反応液中で反応させる工程と、培養物から有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
項２０． 有機化合物が、アミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質、および有機性ガスからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１９に記載の方法。
項２１． 還元条件下の反応液中で反応させる項１９または２０に記載の方法。
項２２． 還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００ｍＶ〜−５００ｍＶである項２１に記載の方法。
コリネ型細菌は、増殖を停止した状態で物質生産が行えるため、増殖に要する栄養源を消費せずに有用物質を生産させることができ、生産産物による増殖阻害を受けることがなく、さらにコンパクトな反応装置設計が可能等のメリットがある有用な微生物である。ところが、コリネ型細菌は、本来、キシロオリゴ糖を利用できないため、キシロオリゴ糖を多く含むセルロース系バイオマスの糖化液からの物質生産に使用できなかった。この点、本発明の形質転換体は、コリネ型細菌でありながら、キシロオリゴ糖を利用して有機化合物を効率よく生産することができるため、セルロース系バイオマスの糖化液から効率よく物質生産できる極めて有用な微生物である。
また、本発明のコリネ型細菌形質転換体は、キシロオリゴ糖利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ−グルコースとキシロオリゴ糖とを並行的かつ同時に利用できる。
本明細書中、コリネ型細菌形質転換体が「Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖を並行的かつ同時利用することができる」、又は「同時利用性（能）を有する」とは、Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖の混合糖を炭素源とする培地中で本発明の形質転換体を用いて有機化合物を生成させた場合に、何れか一方の糖を先に消費してから他方の糖を消費し始めるものではないことを意味する。
また、本発明のコリネ型細菌形質転換体は、キシロオリゴ糖利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ−グルコースとキシロオリゴ糖とを並行的かつ同時に利用できる。
本明細書中、コリネ型細菌形質転換体が「Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖を並行的かつ同時利用することができる」、又は「同時利用性（能）を有する」とは、Ｄ−グルコース及びキシロオリゴ糖の混合糖を炭素源とする培地中で本発明の形質転換体を用いて有機化合物を生成させた場合に、何れか一方の糖を先に消費してから他方の糖を消費し始めるものではないことを意味する。
一般に、コリネ型細菌を含む微生物は、複数の糖類が存在する場合、Ｄ−グルコースを優先的に消費し、遅れてまたはその後に他の糖を消費し始める。しかし、セルロース系バイオマスはヘミセルロース含量が高いため、前処理および酵素糖化後の糖化液にはセルロース由来のグルコースに加えて、ヘミセルロースの主構成成分であるキシランに由来するキシランやキシロオリゴ糖が含まれる。従って、グルコースを優先的に消費する微生物によりセルロース系バイオマスの糖化液を原料として有機化合物を製造しようとすると、一般には、グルコースの消費に遅れてキシロオリゴ糖が消費され、製造効率ないしは原料利用効率が悪い。この点、本発明の形質転換体は、キシロオリゴ糖及びグルコースを並行的かつ同時に効率よく利用できるため、セルロース系バイオマスの糖化液を原料として効率よく有機化合物を製造することができる。
従って、本発明の形質転換体は、農業残渣や木質バイオマス等の非可食バイオマスからバイオ化学品やバイオ燃料を効率的に製造するのに極めて有益である。
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体である。
（Ｉ）形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体である。
宿主
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、安全でかつキシロオリゴ糖の利用能が高い点で、コリネバクテリウム グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
コリネ型細菌の野生株は、Ｄ−キシロース等のペントースを利用することができない。β-キシロシダーゼの作用によりキシロオリゴ糖から生成するキシロースから各種の有機化合物を効率よく生成できるように、宿主のコリネ型細菌は、Ｄ−キシロース利用能を有するものであることが好ましい。
コリネ型細菌にＤ−キシロース利用能を付与する方法としては特に限定されず、例えば、該コリネ型細菌に他の生物種由来のＤ−キシロース代謝関連遺伝子を導入する方法が挙げられる。
コリネ型細菌にＤ−キシロース利用能を付与する方法としては特に限定されず、例えば、該コリネ型細菌に他の生物種由来のＤ−キシロース代謝関連遺伝子を導入する方法が挙げられる。
原核生物及び一部のカビにおけるＤ−キシロースからＤ−キシルロース−５−ホスフェートへの代謝は、具体的には、Ｄ−キシロースからＤ−キシルロースへの反応を触媒するキシロース イソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、及びＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−ホスフェートへの反応を触媒するキシルロキナーゼ（ｘｙｌＢ）の２つの酵素に触媒された２ステップの反応により行われる。これらの酵素をコードする各遺伝子をコリネ型細菌に導入することによりコリネ型細菌にＤ−キシロース利用能が付与される。
例えば、本発明者らは既に、コリネ型細菌に、Ｄ−キシロース代謝関連遺伝子として、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来のｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子を導入し、発現させることで、Ｄ−キシロースの利用能を付与する技術を開示している（Appl. Environ. Microbiol. Vol.72，3418-3428 (2006)）。本発明においては、このような技術により作製されるＤ−キシロース利用能が付与されたコリネ型細菌を用いることができる。また、例えばＤ−キシロース利用能を付与する方法としては、上記のエシェリヒア コリ （Escherichia coli）以外の生物種由来遺伝子を導入した形質転換体であってもよい。
ｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子は、通常、Ｄ−キシロースの代謝能を有する微生物に保有されている。ｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子としては、それぞれ独立して、エシェリヒア コリ、コリネバクテリウム グルタミカム(ｘｙｌＢ遺伝子のみ保有)、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バチラス ハロデュランス（Bacillus halodurans）、シノリゾビューム メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）、及びアグロバクテリュウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からなる群より選ばれる微生物由来のものを用いることが好ましい。中でも、エシェリヒア コリに由来するｘｙｌＡ遺伝子（例えば、配列番号２４のアミノ酸配列からなる遺伝子）、及びｘｙｌＢ遺伝子（例えば、配列番号２５のアミノ酸配列からなる遺伝子）がより好ましい。
また、これらの微生物由来のｘｙｌＡ、またはｘｙｌＢのアミノ酸配列において、１乃至数個（通常１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、付加、または置換されたアミノ酸配列を有し、かつキシロース イソメラーゼ活性、またはキシルロキナーゼ活性を有する類縁体をコードする遺伝子を用いることもできる。
また、宿主のコリネ型細菌は、種々の有機化合物を生産するために、正常に機能する解糖経路とペントースリン酸経路とを有していることが好ましい。さらには、ピルビン酸から目的とする発酵産物、例えばコハク酸、酢酸又は乳酸に変換するための酵素を含有することが好ましい。さらに、エタノール；乳酸、酢酸、ギ酸等のような有機酸；フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールのような糖分解産物に対して高い耐性を持っていることが好ましい。このような点から、本発明で用いられるコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム グルタミカムR（FERM BP-18976）又は、コリネバクテリウム グルタミカムATCC31831等も好ましい。
また、これらコリネ型細菌は自然界に存在する野生株の変異株、又は人為的な遺伝子組換え株等であってもよい。野生株の変異株としては、セロビオース利用性変異株であるFERM P-18977、FERM P-18978（特開２００４−０８９０２９号公報）等が挙げられる。人為的な遺伝子組換え株としては、エタノール生産組換え株であるFERM P-17887（FERM P-17887はFERM BP-7621と同じ株である）、FERM P-17888（FERM P-17888はFERM BP-7622と同じ株である）、及びJ.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol8,243-254(2004)記載株、すなわち日本国特許第４２９４３７３５号に記載のFERM P-19361及びFERM P-19362等；セロビオース利用組換え株であるFERM P-18979（特開２００４−０８９０２９号公報）等；コハク酸生産組換え株であるFERM P-19446（FERM P-19446はFERM BP-10060と同じ株である）及びFERM P-19477（FERM P-19477はFERM BP-10061と同じ株である）等が挙げられる。FERM P-19361及びFERM P-19362は、ザイモモナス モビリス由来のピルベート デカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカムに導入した形質転換体である。
さらに、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM BP-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株(FERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978)、コハク酸生産組換え株（FERM P-19446及びFERM P-19477）、並びにエタノール生産組換え株(FERM P-17887（FERM BP-7621）、FERM P-17888（FERM BP-7622）及びJ.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol 8,243-254（2004）記載の株（すなわちFERM P-19361及びFERM P-19362）)からなる群より選択される菌株であって、かつＤ−キシロース利用能が付与されているものであることが好ましい。本発明において特に好ましいコリネ型細菌は、Ｄ−キシロース利用能が付与されたコリネバクテリウム グルタミカムR（FERM BP-18976）である。
また、セルロース系バイオマスの前処理および酵素糖化後の糖化液には、キシロオリゴ糖の他にキシロースが多く含まれるので、宿主のコリネ型細菌は、Ｄ−キシロースの取り込み能が野生株より向上した細菌であることが好ましい。Ｄ−キシロースの取り込み能が向上した細菌としては、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来遺伝子を導入された細菌が好ましい。Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子は既知であり、ａｒａＥと称されている。細菌では、以下に示す菌株等でａｒａＥ遺伝子配列や酵素特性が報告されている。コリネバクテリウム グルタミカム（再表２００９−１５４１２２号）、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）〔J. Bacteriol.、Vol. 179、7705-7711(1997)〕、クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）8017〔J. Bacteriol.、Vol. 177、5379-5380（1995）〕、エシェリヒア コリ〔J. Biol. Chem.、Vol. 263、8003-8010（1988）〕。
Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子としては、コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリ、バチラス サブチリス、クレブシエラ オキシトカ、及びサルモネラ ティフィムリウムからなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子が好ましく、コリネバクテリウム グルタミカム由来のａｒａＥ遺伝子が好ましい。
中でも、コリネバクテリウム グルタミカムATCC31831由来の配列番号２６の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２６と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを用いることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のａｒａＥ遺伝子、及びエシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子を導入した株として、コリネバクテリウム グルタミカムInd-araE/pCRA811（ＮＩＴＥ ＢＰ−５７６）、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE/Plac-araBAD（ＮＩＴＥ ＢＰ−５７７）（いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託済み。受託日：２００８年５月２８日）、及びコリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE-Δldh/pEthAra （ＮＩＴＥ ＢＰ−５８１）（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに寄託済み。受託日：２００８年６月４日）などが挙げられる。これらのコリネ型細菌形質転換体は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用するものである。
キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質の遺伝子
本発明の形質転換体は、キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするために、キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されている。前述したとおり、キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質としては、キシロシドＡＢＣトランスポーター（以下、「ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質」ということもある）、及びキシロシド/Na+ (H+)シンポーター（以下、「シンポーター型輸送体蛋白質」ということもある）がある。
本発明の形質転換体は、キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするために、キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されている。前述したとおり、キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質としては、キシロシドＡＢＣトランスポーター（以下、「ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質」ということもある）、及びキシロシド/Na+ (H+)シンポーター（以下、「シンポーター型輸送体蛋白質」ということもある）がある。
ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質の遺伝子としては、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）、またはゲオバシルス スタエロサーモフィルス（Geobacillus staerothermophilus）由来の遺伝子が好ましく、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来の遺伝子がより好ましい。
ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子は、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(b)配列番号１と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能は、エシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、並びにコリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムに、対象遺伝子を発現させ、得られた形質転換体をキシロオリゴ糖を含む培地で培養して、HPLCにてキシロビオースの消費をモニターし、キシロビオースの消費が検出される場合にこの機能を有すると判定する。
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(b)配列番号１と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能は、エシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、並びにコリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムに、対象遺伝子を発現させ、得られた形質転換体をキシロオリゴ糖を含む培地で培養して、HPLCにてキシロビオースの消費をモニターし、キシロビオースの消費が検出される場合にこの機能を有すると判定する。
シンポーター型輸送体蛋白質の遺伝子としてはクロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylycum）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、バシルス サブチリス（Bacillus subtilis）、またはクレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来の遺伝子が好ましく、クロストリジウム アセトブチリカム由来の遺伝子がより好ましい。
シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子は、
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(d)配列番号２と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、シンポーター型の輸送体機能は、エシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、並びにコリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムに対象遺伝子を発現させ、得られた形質転換体をキシロオリゴ糖を含む培地で培養してHPLCにてキシロビオースの消費をモニターし、キシロビオースの消費が検出される場合にこの機能を有すると判定する。
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(d)配列番号２と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、シンポーター型の輸送体機能は、エシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、並びにコリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムに対象遺伝子を発現させ、得られた形質転換体をキシロオリゴ糖を含む培地で培養してHPLCにてキシロビオースの消費をモニターし、キシロビオースの消費が検出される場合にこの機能を有すると判定する。
本発明の形質転換体は、さらに、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されていることが好ましく、これにより、一層効率よくキシロオリゴ糖を利用して有機化合物を生産できるようになる。
特に、ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質はＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質を必要とする。キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質である場合、宿主のＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質を利用することもできるが、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入することが好ましい。
特に、ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質はＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質を必要とする。キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質である場合、宿主のＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質を利用することもできるが、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入することが好ましい。
ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質の遺伝子としては、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Clostridium acetobutylicum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス サーモビオラセウス(Streptomyces thermoviolacens)、またはゲオバシルス スタエロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）由来の遺伝子が好ましく、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来の遺伝子がより好ましい。
ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子は、
(g)配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(h)配列番号４と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号４と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、ＡＴＰ-結合部位を有するか否かは、エシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子、並びにコリネバクテリウム アルカノリティカム由来のＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムに対象遺伝子を発現させ、得られた形質転換体をキシロオリゴ糖を含む培地で培養してHPLCにてキシロビオースの消費をモニターし、キシロビオース消費速度の上昇が検出される場合にＡＴＰ-結合部位を有すると判定する。
(g)配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(h)配列番号４と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号４と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、ＡＴＰ-結合部位を有するか否かは、エシェリヒア コリ由来のｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子、並びにコリネバクテリウム アルカノリティカム由来のＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムに対象遺伝子を発現させ、得られた形質転換体をキシロオリゴ糖を含む培地で培養してHPLCにてキシロビオースの消費をモニターし、キシロビオース消費速度の上昇が検出される場合にＡＴＰ-結合部位を有すると判定する。
宿主に導入するキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする遺伝子は、ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質の遺伝子であってもよく、シンポーター型輸送体蛋白質の遺伝子であってもよい。
キシロオリゴ糖には、キシロース単位２つからなるキシロビオース、キシロース単位３つからなるキシロトリオース、キシロース単位４つからなるキシロテトラオースなどの他、キシロース単位を３つ〜６つ有するアラビノキシロオリゴ糖等、多種のものが含まれる。ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質は、キシロオリゴ糖の取り込み速度は遅いが、取り込めるキシロオリゴ糖の種類が多い。一方、シンポーター型輸送体蛋白質は、キシロオリゴ糖の取り込み速度は速いが、取り込めるキシロオリゴ糖の種類が少ない。従って、ＡＢＣトランスポーター型輸送体蛋白質の遺伝子とシンポーター型輸送体蛋白質の遺伝子との両方を導入することも好ましい。
β-キシロシダーゼ
β-キシロシダーゼは、キシロースによるフィードバック阻害を受け難いものが好ましい。このようなβ-キシロシダーゼとして、コリネバクテリウム アルカノリティカム、マイクロバクテリウム テスタセウム、アースロバクター フェナンスレニボランス、セルロモナス フラビゲナ、ビフィドバクテリウム ロングム、ストレプトマイセス スカビエイ（Streptomyces scabiei）、クロストリジウム アセトブチリカム、クロストリジウム セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、ラクトバシルス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、パエニバシルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、またはゲオバシルス サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）由来の遺伝子が挙げられる。中でも、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子が好ましい。
β-キシロシダーゼは、キシロースによるフィードバック阻害を受け難いものが好ましい。このようなβ-キシロシダーゼとして、コリネバクテリウム アルカノリティカム、マイクロバクテリウム テスタセウム、アースロバクター フェナンスレニボランス、セルロモナス フラビゲナ、ビフィドバクテリウム ロングム、ストレプトマイセス スカビエイ（Streptomyces scabiei）、クロストリジウム アセトブチリカム、クロストリジウム セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、ラクトバシルス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、パエニバシルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、またはゲオバシルス サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）由来の遺伝子が挙げられる。中でも、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来のβ-キシロシダーゼ遺伝子が好ましい。
β-キシロシダーゼをコードする外来遺伝子は、
(e)配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(f)配列番号３と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、β-キシロシダーゼ活性は、対象遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムから100 mM Tris-HCl (pH 7.5)バッファーを用いて抽出した粗酵素 100 μgを、1 mlの100 mM Tris-HCl (pH 7.5)反応液中で終濃度1 mM のp-nitrophenyl β-xylopyranosideと３３℃で１０分間反応させて反応液の410 nmにおける吸光度を測定し、その吸光度が0.2以上である場合にβ-キシロシダーゼ活性を有すると判定する。
(e)配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(f)配列番号３と９０％以上、中でも９５％以上、中でも９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましい。
本発明において、β-キシロシダーゼ活性は、対象遺伝子を発現させたコリネバクテリウム グルタミカムから100 mM Tris-HCl (pH 7.5)バッファーを用いて抽出した粗酵素 100 μgを、1 mlの100 mM Tris-HCl (pH 7.5)反応液中で終濃度1 mM のp-nitrophenyl β-xylopyranosideと３３℃で１０分間反応させて反応液の410 nmにおける吸光度を測定し、その吸光度が0.2以上である場合にβ-キシロシダーゼ活性を有すると判定する。
本発明において「ストリンジェントな条件」は、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
本発明において、塩基配列間の同一性は、計算ソフト ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標） Ｖｅｒ．８（ジェネティックス社製）を用いて計算した値である。
本発明で創製したコリネ型細菌形質転換体は、有機化合物の生産性を向上させるために、ペントースリン酸経路の流量の増加、エタノール、浸透圧、又は有機酸に対する耐性の増加、及び副生物（目的とする生成産物以外の炭素含有分子を意味すると理解される）生産の減少などの特徴の１又は２以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。そのような遺伝子修飾は、具体的には、外来性遺伝子の過剰発現及び／又は内在性遺伝子の不活化；古典的突然変異誘起；スクリーニング及び／又は目的変異体の選別などにより導入することができる。
本発明のコリネ型細菌形質転換体は、キシロオリゴ糖を原料として、アミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質、および有機性ガスなどの多様な有機化合物を、発酵生産物として生産できる。
（ＩＩ）有機化合物の製造方法
上記説明した本発明のコリネ型細菌形質転換体を、キシロオリゴ糖を含むか、又はキシロオリゴ糖とグルコース若しくはグルコース単位からなるオリゴマー若しくはポリマーとを含む反応液中で反応させる工程と、培養物から有機化合物または発酵生産物を回収する工程とを含む方法により有機化合物または発酵生産物を製造することができる。
上記説明した本発明のコリネ型細菌形質転換体を、キシロオリゴ糖を含むか、又はキシロオリゴ糖とグルコース若しくはグルコース単位からなるオリゴマー若しくはポリマーとを含む反応液中で反応させる工程と、培養物から有機化合物または発酵生産物を回収する工程とを含む方法により有機化合物または発酵生産物を製造することができる。
微生物の増殖
キシロオリゴ糖を含む反応液中での反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約２５〜３８℃で、約１２〜４８時間培養して増殖させることが好ましい。
キシロオリゴ糖を含む反応液中での反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約２５〜３８℃で、約１２〜４８時間培養して増殖させることが好ましい。
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応液
反応液としては、キシロオリゴ糖を含む炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
炭素源としてはキシロオリゴ糖が含まれるが、キシロオリゴ糖に加えてＤ−グルコースも含むことができる。また、キシロオリゴ糖に加えて、マルトース、セルロース、デンプンなどのＤ−グルコース単位からなるオリゴマー又はポリマーを含むこともできる。そのような炭水化物からＤ−グルコース単位を遊離させるために、適当な炭水化物分解酵素（αグルコシダーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）を、反応培地に加えてもよく、コリネ型細菌形質転換体にこの酵素を生産させてもよい。
反応液としては、キシロオリゴ糖を含む炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
炭素源としてはキシロオリゴ糖が含まれるが、キシロオリゴ糖に加えてＤ−グルコースも含むことができる。また、キシロオリゴ糖に加えて、マルトース、セルロース、デンプンなどのＤ−グルコース単位からなるオリゴマー又はポリマーを含むこともできる。そのような炭水化物からＤ−グルコース単位を遊離させるために、適当な炭水化物分解酵素（αグルコシダーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）を、反応培地に加えてもよく、コリネ型細菌形質転換体にこの酵素を生産させてもよい。
反応培地は、キシロオリゴ糖、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコースを生成するオリゴマーまたはポリマー以外の炭素源を含んでもよい。このような炭素源としては、本発明のコリネ型細菌形質転換体が利用できる糖類であればよいが、フルクトース、マンノース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロースのような二糖；糖蜜等が挙げられる。また、稲わら、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化した、グルコース、キシロース、キシロオリゴ糖などの複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
反応液中の糖類の濃度は、約1〜20（ｗ／ｖ％）が好ましく、約2〜10（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2〜5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。
また、糖類を含む全炭素源の反応液中の濃度は、通常、約2〜5（ｗ／ｖ％）とすればよい。
炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
反応液中の糖類の濃度は、約1〜20（ｗ／ｖ％）が好ましく、約2〜10（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2〜5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。
また、糖類を含む全炭素源の反応液中の濃度は、通常、約2〜5（ｗ／ｖ％）とすればよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
反応液のｐＨは約６〜８が好ましい。
反応液のｐＨは約６〜８が好ましい。
具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地や、稲わら、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物、又はスイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素で糖化した糖化液等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応条件
反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く有機化合物を製造できる。
また、反応時間は、約１〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。
反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く有機化合物を製造できる。
また、反応時間は、約１〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。
＜還元条件＞
還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的に有機化合物を生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶが好ましく、約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY JAMES社製、ORP Electrodes）を用いて測定できる。
還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的に有機化合物を生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶが好ましく、約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY JAMES社製、ORP Electrodes）を用いて測定できる。
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate−reducing bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書 第三巻、京都大学農学部 農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは約５〜４０分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは約５〜４０分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
有機化合物の回収
上記のようにして培養することにより、反応液中に各種の有機化合物が生産される。反応液を回収することにより有機化合物を回収できるが、さらに、公知の方法で有機化合物を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、活性炭吸着溶離法等が挙げられる。有機化合物としては、アミノ酸（アラニン、バリン、スレオニン、リジン、トリプトファン、メチオニンなど）、有機酸（乳酸、コハク酸、酢酸など）、アルコール（エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノールなど）、核酸、生理活性物質、および有機性ガスなどなどが挙げられる。
上記のようにして培養することにより、反応液中に各種の有機化合物が生産される。反応液を回収することにより有機化合物を回収できるが、さらに、公知の方法で有機化合物を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、活性炭吸着溶離法等が挙げられる。有機化合物としては、アミノ酸（アラニン、バリン、スレオニン、リジン、トリプトファン、メチオニンなど）、有機酸（乳酸、コハク酸、酢酸など）、アルコール（エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノールなど）、核酸、生理活性物質、および有機性ガスなどなどが挙げられる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1 キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子のクローニングと発現
（1）微生物からの染色体DNAの抽出
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
（1）微生物からの染色体DNAの抽出
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）ATCC 21511からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ATCC 824からの染色体DNA（Catalog No. ATCC824D-5）は、American Type Culture Collection（ATCC）より入手した。
クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ATCC 824からの染色体DNA（Catalog No. ATCC824D-5）は、American Type Culture Collection（ATCC）より入手した。
(2) クローニングベクターの構築
クローニングベクターpCRB52Tk、pCRB11Tkの構築
プラスミドpCRB214 [FEBS Lett. 586:4228-4232 (2012)]を制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって回収したtacプロモーター（以降Ptac配列と記す）とコリネバクテリウム グルタミカム株由来tpi遺伝子のシャイン・ダルガノ（SD）配列及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を連結した約0.7-kbのDNA断片と、プラスミドpCRB52G（配列番号27）を制限酵素BamHIとBglIIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって回収したDNA複製起点pBY503 ori配列及びpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を含む5.0-kbpのpCRB52 DNA断片、またはプラスミドpCRB11G（配列番号28）を制限酵素BamHIとBglIIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって回収したDNA複製起点pCG1 ori配列及びpHSG398（タカラバイオ株式会社製）を含む4.5-kbpのpCRB11 DNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これらをそれぞれライゲーションA液、B液とした。
クローニングベクターpCRB52Tk、pCRB11Tkの構築
プラスミドpCRB214 [FEBS Lett. 586:4228-4232 (2012)]を制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって回収したtacプロモーター（以降Ptac配列と記す）とコリネバクテリウム グルタミカム株由来tpi遺伝子のシャイン・ダルガノ（SD）配列及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を連結した約0.7-kbのDNA断片と、プラスミドpCRB52G（配列番号27）を制限酵素BamHIとBglIIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって回収したDNA複製起点pBY503 ori配列及びpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を含む5.0-kbpのpCRB52 DNA断片、またはプラスミドpCRB11G（配列番号28）を制限酵素BamHIとBglIIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって回収したDNA複製起点pCG1 ori配列及びpHSG398（タカラバイオ株式会社製）を含む4.5-kbpのpCRB11 DNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これらをそれぞれライゲーションA液、B液とした。
得られたライゲーションA液またはB液を用い、塩化カルシウム法[J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml（ライゲーションA液）またはクロラムフェニコール50μg/ml（ライゲーションB液）を含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIとBamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、ライゲーションA液由来のプラスミドでは、tacプロモーターを含むクローニングベクターpCRB52約5.3-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片が認められた。このPtac配列を含むクローニングベクターをpCRB52Tと命名した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIとBamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、ライゲーションA液由来のプラスミドでは、tacプロモーターを含むクローニングベクターpCRB52約5.3-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片が認められた。このPtac配列を含むクローニングベクターをpCRB52Tと命名した。
また、ライゲーションB液由来のプラスミドでは、tacプロモーターを含むクローニングベクターpCRB11約4.8-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片が認められた。プラスミドPtac配列を含むクローニングベクターをpCRB11Tと命名した。
下記1対のオリゴヌクレオチドを52℃でアニーリングさせて作成した25-bpのDNA断片（以降リンカーと記す）と、pCRB52TまたはpCRB11Tを制限酵素NdeIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製したDNA複製起点pBY503 ori配列及びpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を含む5.7-kbpのDNA断片、またはDNA複製起点pCG1 ori配列及びpHSG398（タカラバイオ株式会社製）を含む4.2-kbpのDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これらをそれぞれをライゲーションC液、D液とした。
得られたライゲーションC液またはD液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
得られたライゲーションC液またはD液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
リンカー作成用オリゴヌクレオチド
(a-9) 5’- TATGGAATTCACGCGTGGTACCGA -3’(配列番号５)
(b-9) 5’- TATCGGTACCACGCGTGAATTCCA -3’(配列番号６)
尚、オリゴヌクレオチド(a-9)と(b-9)をアニーリングして作成されるリンカーの両端にはNdeIの付着末端が形成され、リンカー内部にはKpnI制限酵素部位が含まれる。
(a-9) 5’- TATGGAATTCACGCGTGGTACCGA -3’(配列番号５)
(b-9) 5’- TATCGGTACCACGCGTGAATTCCA -3’(配列番号６)
尚、オリゴヌクレオチド(a-9)と(b-9)をアニーリングして作成されるリンカーの両端にはNdeIの付着末端が形成され、リンカー内部にはKpnI制限酵素部位が含まれる。
得られたコロニーを直接鋳型として以下のPCR法により約250-bpのDNA断片が増幅することにより目的の方向にリンカーが挿入されたプラスミドを選別し、培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。pCRB52T(ライゲーションC液)から得られたリンカー配列を含むクローニングベクターをpCRB52Tkと命名した。またpCRB11T(ライゲーションD液) から得られたリンカー配列を含むクローニングベクターをpCRB11Tkと命名した。
コロニー選別用プライマー
(a-10) 5’- TATCGGTACCACGCGTGAATTCCA -3’ (配列番号６)
(b-10) 5’- GGGGTACCGGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC -3’(配列番号７)
尚、プライマー（a-10）はリンカー作成に用いたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドに相当し、プライマー（b-10）はPtac配列の5’末端に位置する。
(a-10) 5’- TATCGGTACCACGCGTGAATTCCA -3’ (配列番号６)
(b-10) 5’- GGGGTACCGGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC -3’(配列番号７)
尚、プライマー（a-10）はリンカー作成に用いたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドに相当し、プライマー（b-10）はPtac配列の5’末端に位置する。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてKAPA Taq EXtra DNA Polymerase（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
KAPATaq Extra DNA Polymerase (5 U/μl) 0.5μl
5x KAPATaq Extra Buffer (Mg2+ free) 10μl
25 mM MgCl2 solution 3.5μl
KAPA dNTP Mix (10mM each) 1.5μl
プライマー(a-10)と(b-10) 各々2μl（最終濃度 0.4μM）
滅菌蒸留水 30.5μl
以上を混合し、この50μlの反応液を10μl ずつに分注し、各反応液にコロニーを少量加えてPCRにかけた。
KAPATaq Extra DNA Polymerase (5 U/μl) 0.5μl
5x KAPATaq Extra Buffer (Mg2+ free) 10μl
25 mM MgCl2 solution 3.5μl
KAPA dNTP Mix (10mM each) 1.5μl
プライマー(a-10)と(b-10) 各々2μl（最終濃度 0.4μM）
滅菌蒸留水 30.5μl
以上を混合し、この50μlの反応液を10μl ずつに分注し、各反応液にコロニーを少量加えてPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：72℃ 30秒
以上を1サイクルとし、25サイクル行った。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：72℃ 30秒
以上を1サイクルとし、25サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的のプラスミドを含む場合、約250-bpのDNA断片が検出される。
（3) キシロオリゴ糖利用酵素遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム アルカノリティカム由来のキシロオリゴ糖利用酵素遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）由来のβ-キシロシダーゼをコードするxylD遺伝子、ABCトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質群（以後、ABCトランスポーター）とβ-キシロシダーゼをコードするxylEFGDオペロン、ATP-結合部位を有する蛋白質（以後、ATP結合蛋白）をコードするmsiK遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
コリネバクテリウム アルカノリティカム由来のキシロオリゴ糖利用酵素遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）由来のβ-キシロシダーゼをコードするxylD遺伝子、ABCトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質群（以後、ABCトランスポーター）とβ-キシロシダーゼをコードするxylEFGDオペロン、ATP-結合部位を有する蛋白質（以後、ATP結合蛋白）をコードするmsiK遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、xylD遺伝子、xylEFGDオペロン及びmsiK遺伝子をクローン化するべく、配列番号３（コリネバクテリウム アルカノリティカムxylD遺伝子）、配列番号１（コリネバクテリウム アルカノリティカムxylEFGD遺伝子）及び配列番号４ （コリネバクテリウム アルカノリティカムmsiK遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを使用した。
xylD遺伝子増幅用プライマー
（a-1）； 5’- GAGAATTCCATATGACCGCCCCCGGATCCGCA -3’（配列番号８）
（b-1）； 5’- GGGGTACCTCAGCTGACGGGTGCCTCGGCC -3’ （配列番号９）
尚、プライマー（a-1）には、NdeI制限酵素部位が、プライマー（b-1）には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
（a-1）； 5’- GAGAATTCCATATGACCGCCCCCGGATCCGCA -3’（配列番号８）
（b-1）； 5’- GGGGTACCTCAGCTGACGGGTGCCTCGGCC -3’ （配列番号９）
尚、プライマー（a-1）には、NdeI制限酵素部位が、プライマー（b-1）には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
xylEFGD遺伝子増幅用プライマー
（a-2）； 5’- GGGGTACCTCAGCTGACGGGTGCCTCGGCC -3’ （配列番号１０）
（b-2）； 5’- GGGAATTCCATATGAGAGCACACAGGATCCTGACG -3’（配列番号１１）
尚、プライマー（a-2）には、KpnI制限酵素部位が、プライマー（b-2）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
（a-2）； 5’- GGGGTACCTCAGCTGACGGGTGCCTCGGCC -3’ （配列番号１０）
（b-2）； 5’- GGGAATTCCATATGAGAGCACACAGGATCCTGACG -3’（配列番号１１）
尚、プライマー（a-2）には、KpnI制限酵素部位が、プライマー（b-2）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
misK遺伝子増幅用プライマー
（a-3）； 5’- GCGGTACCACTACGGATCGTCCGGCACGTA -3’（配列番号１２）
（b-3）； 5’- CCGGTACCTTACGCCGAGACGATCGCCTTG -3’（配列番号１３）
尚、プライマー（a-3）及びプライマー（b-3）には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
（a-3）； 5’- GCGGTACCACTACGGATCGTCCGGCACGTA -3’（配列番号１２）
（b-3）； 5’- CCGGTACCTTACGCCGAGACGATCGCCTTG -3’（配列番号１３）
尚、プライマー（a-3）及びプライマー（b-3）には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
クロストリジウム アセトブチリカム由来のキシロオリゴ糖利用酵素遺伝子のクローニング
クロストリジウム アセトブチリカム由来のシンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質（以後、シンポーター）をコードするxynT遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、xynT遺伝子をクローン化するべく、配列番号２（クロストリジウム アセトブチリカムxynT遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを使用した。
クロストリジウム アセトブチリカム由来のシンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質（以後、シンポーター）をコードするxynT遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、xynT遺伝子をクローン化するべく、配列番号２（クロストリジウム アセトブチリカムxynT遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを使用した。
xynT遺伝子増幅用プライマー
（a-4）； 5’- GGAATTCCATATGATAGGAAGTTTTAAAATTAAAATGAG -3’
（配列番号１４）
（b-4）； 5’- CGGGATCCTCATAAATTTAAATTCTCCCCTCTATTTA -3’
（配列番号１５）
尚、プライマー（a-4）にはNdeI制限酵素部位が、プライマー（b-4）にはBamHI制限酵素部位が付加されている。
（a-4）； 5’- GGAATTCCATATGATAGGAAGTTTTAAAATTAAAATGAG -3’
（配列番号１４）
（b-4）； 5’- CGGGATCCTCATAAATTTAAATTCTCCCCTCTATTTA -3’
（配列番号１５）
尚、プライマー（a-4）にはNdeI制限酵素部位が、プライマー（b-4）にはBamHI制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、コリネバクテリウム アルカノリティカムは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したコリネバクテリウム アルカノリティカムATCC 21511から抽出した染色体DNAを、クロストリジウム アセトブチリカムは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したクロストリジウム アセトブチリカム ATCC 824由来の染色体DNAを用いた。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー*) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) コリネバクテリウム アルカノリティカムxylD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-1) と (b-1) の組み合わせ、コリネバクテリウム アルカノリティカムxylEFGD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-2) と (b-2) の組み合わせ、コリネバクテリウム アルカノリティカムmsiK遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-3) と (b-3) の組み合わせ、クロストリジウム アセトブチリカムxynT遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-4) と (b-4) の組み合わせで行った。
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー*) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) コリネバクテリウム アルカノリティカムxylD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-1) と (b-1) の組み合わせ、コリネバクテリウム アルカノリティカムxylEFGD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-2) と (b-2) の組み合わせ、コリネバクテリウム アルカノリティカムmsiK遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-3) と (b-3) の組み合わせ、クロストリジウム アセトブチリカムxynT遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-4) と (b-4) の組み合わせで行った。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃
コリネバクテリウム アルカノリティカムxylD遺伝子 90秒
コリネバクテリウム アルカノリティカムxylEFGD遺伝子 180秒
コリネバクテリウム アルカノリティカムmsiK遺伝子 60秒
クロストリジウム アセトブチリカムxynT遺伝子 60秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃
コリネバクテリウム アルカノリティカムxylD遺伝子 90秒
コリネバクテリウム アルカノリティカムxylEFGD遺伝子 180秒
コリネバクテリウム アルカノリティカムmsiK遺伝子 60秒
クロストリジウム アセトブチリカムxynT遺伝子 60秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子の場合約2.4-kb、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子の場合約5.6-kb、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来msiK遺伝子の場合約1.1-kb、クロストリジウム アセトブチリカム株由来xynT遺伝子の場合約1.5-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
(4) キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子発現プラスミドの構築
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子のpCRB52Tkへのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeI及びKpnIで、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子を含む約5.6-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeI及びKpnIで、クロストリジウム アセトブチリカム株由来xynT遺伝子を含む約1.5-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeI及びBamHIで切断した。tacプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB52Tk 2μlをxylD遺伝子及びxylEFGD遺伝子の場合制限酵素NdeI及びKpnIで、xynT遺伝子の場合制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製し、それぞれ挿入する遺伝子と混合してこれにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液、F液、及びG液とした。
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子のpCRB52Tkへのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeI及びKpnIで、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子を含む約5.6-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeI及びKpnIで、クロストリジウム アセトブチリカム株由来xynT遺伝子を含む約1.5-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeI及びBamHIで切断した。tacプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB52Tk 2μlをxylD遺伝子及びxylEFGD遺伝子の場合制限酵素NdeI及びKpnIで、xynT遺伝子の場合制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製し、それぞれ挿入する遺伝子と混合してこれにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10 μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液、F液、及びG液とした。
得られたライゲーションE液、F液及びG液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB52Tk約5.7-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子（ライゲーションE液）の場合、約2.4-kbの挿入断片が、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子（ライゲーションF液）の場合、約5.6-kbの挿入断片が、クロストリジウム アセトブチリカム株由来xynT遺伝子（ライゲーションG液）の場合、約1.5-kbの挿入断片が認められた。
コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子を含むプラスミドをpCRF100 (図１)、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子を含むプラスミドをpCRF101 (図１)、クロストリジウム アセトブチリカム株由来xynT遺伝子を含むプラスミドをpCRF104 (図１)と命名した。
また、上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来msiK遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片10μl及びコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子を含むプラスミドpCRF101 10μlを各々制限酵素KpnIで切断し、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）による精製の後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションH液とした。
また、上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来msiK遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片10μl及びコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子を含むプラスミドpCRF101 10μlを各々制限酵素KpnIで切断し、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）による精製の後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションH液とした。
得られたライゲーションH液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)]によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
得られたコロニーを直接鋳型として以下のPCR法により約1.5-kbのDNA断片が増幅することにより目的の方向にリンカーが挿入されたプラスミドを選別し、培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子及びコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来msiK遺伝子を含むプラスミドをpCRF102 (図１)と命名した。
得られたコロニーを直接鋳型として以下のPCR法により約1.5-kbのDNA断片が増幅することにより目的の方向にリンカーが挿入されたプラスミドを選別し、培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylEFGD遺伝子及びコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来msiK遺伝子を含むプラスミドをpCRF102 (図１)と命名した。
コロニー選別用プライマー
（a-11）； 5’- GCGGTACCACTACGGATCGTCCGGCACGTA -3’ （配列番号１２）
(b-11)； 5’- GGGGTACCGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTC -3’（配列番号７）
尚、プライマー（a-11）はmsiK遺伝子増幅用のセンスプライマー、プライマー（b-11）はターミネーター配列に位置する。
（a-11）； 5’- GCGGTACCACTACGGATCGTCCGGCACGTA -3’ （配列番号１２）
(b-11)； 5’- GGGGTACCGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTC -3’（配列番号７）
尚、プライマー（a-11）はmsiK遺伝子増幅用のセンスプライマー、プライマー（b-11）はターミネーター配列に位置する。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてKAPA Taq EXtra DNA Polymerase（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
KAPATaq Extra DNA Polymerase (5 U/μl) 0.5μl
5x KAPATaq Extra Buffer (Mg2+ free) 10μl
25 mM MgCl2 solution 3.5μl
KAPA dNTP Mix (10mM each) 1.5μl
プライマー(a-11)と(b-11) 各々2μl（最終濃度 0.4μM）
滅菌蒸留水 30.5μl
以上を混合し、この50μlの反応液を10μl ずつに分注し、各反応液にコロニーを少量加えてPCRにかけた。
KAPATaq Extra DNA Polymerase (5 U/μl) 0.5μl
5x KAPATaq Extra Buffer (Mg2+ free) 10μl
25 mM MgCl2 solution 3.5μl
KAPA dNTP Mix (10mM each) 1.5μl
プライマー(a-11)と(b-11) 各々2μl（最終濃度 0.4μM）
滅菌蒸留水 30.5μl
以上を混合し、この50μlの反応液を10μl ずつに分注し、各反応液にコロニーを少量加えてPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：52℃ 5秒
エクステンション過程 ：72℃ 30秒
以上を1サイクルとし、25サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的のプラスミドを含む場合、約1.5-kbのDNA断片が検出される。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：52℃ 5秒
エクステンション過程 ：72℃ 30秒
以上を1サイクルとし、25サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的のプラスミドを含む場合、約1.5-kbのDNA断片が検出される。
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子導入株のpCRB11Tkへのクローニング構築
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子であるコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子の発現量を増加させるため、上記に示した発現プラスミドpCRF102と共存できる高コピープラスミドpCRB11TkにxylD遺伝子をクローニングすることにした。
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片10μlおよびtacプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB11Tk 2μlを制限酵素NdeI及びKpnIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した後に、各DNA断片を混合してこれにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションI液とした。
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子であるコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子の発現量を増加させるため、上記に示した発現プラスミドpCRF102と共存できる高コピープラスミドpCRB11TkにxylD遺伝子をクローニングすることにした。
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片10μlおよびtacプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB11Tk 2μlを制限酵素NdeI及びKpnIで切断し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した後に、各DNA断片を混合してこれにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションI液とした。
得られたライゲーションI液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)]によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB11Tk約5.2-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子約2.4-kbの挿入断片が認められた。本プラスミドをpCRF103 (図１)と命名した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB11Tk約5.2-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子約2.4-kbの挿入断片が認められた。本プラスミドをpCRF103 (図１)と命名した。
β-キシロシダーゼ遺伝子の大腸菌発現系ベクターへのクローニング
コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）XylDの酵素学的性質を解析するため、N末にヒスチジンタグを融合したXylDを大腸菌で発現させるための発現ベクターを構築した。
コリネバクテリウム アルカノリティカムのxylD遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片を下記1対のプライマーを用いてPCR法によって増幅させた。
コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）XylDの酵素学的性質を解析するため、N末にヒスチジンタグを融合したXylDを大腸菌で発現させるための発現ベクターを構築した。
コリネバクテリウム アルカノリティカムのxylD遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片を下記1対のプライマーを用いてPCR法によって増幅させた。
xylD遺伝子増幅用プライマー
（a-5）； 5’- GCCGGCAACCATATGACCGAACTGCCCCCTCT -3’（配列番号１６）
（b-5）； 5’- AGGAAGATCTCAGCTGACGGGTGCCTCGGCC -3’ （配列番号１７）
尚、プライマー（a-1）には、NdeI制限酵素部位が、プライマー（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
（a-5）； 5’- GCCGGCAACCATATGACCGAACTGCCCCCTCT -3’（配列番号１６）
（b-5）； 5’- AGGAAGATCTCAGCTGACGGGTGCCTCGGCC -3’ （配列番号１７）
尚、プライマー（a-1）には、NdeI制限酵素部位が、プライマー（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、コリネバクテリウム アルカノリティカムは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したコリネバクテリウム アルカノリティカムATCC 21511から抽出した染色体DNAを用いた。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg以下）
プライマー (a-5)と(b-5) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg以下）
プライマー (a-5)と(b-5) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子の場合約2.4-kbのDNA断片が検出できた。増幅したDNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
コリネバクテリウム アルカノリティカムxylD遺伝子の2.4-kb DNA断片10μlをNdeIおよびBglIIで切断し、N末にヒスチジンタグを融合して組み換えタンパクを発現できる発現ベクターpColdII(タカラバイオ株式会社製)2μlを制限酵素NdeI及びBamHIで切断して、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した後に、各DNA断片を混合してこれにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションJ液とした。
得られたライゲーションJ液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)]によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpColdII約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子約2.4-kbの挿入断片が認められた。本プラスミドをpCRF105と命名した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpColdII約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム アルカノリティカム株由来xylD遺伝子約2.4-kbの挿入断片が認められた。本プラスミドをpCRF105と命名した。
(5) キシロオリゴ糖分解酵素の大腸菌での発現と精製
上記の発現プラスミドpCRF105を塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)]により組み換えタンパク質発現用エシェリヒア コリBL21(DE3)株を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。得られた形質転換体をアンピシリン50μg/mlを含むLB培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム〕に植菌して37℃で１晩振盪培養した後、培養液1 mlを遠心して集菌し、菌体を新しい培地に懸濁してアンピシリン50μg/mlを含む100 ml LB培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム〕に添加して37℃で振盪培養した。培養液の濁度OD610が0.5に達したら0.5 mM IPTG (isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside)を培養液に添加して15℃で24時間振盪培養してタンパク質発現を誘導した。
上記の発現プラスミドpCRF105を塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)]により組み換えタンパク質発現用エシェリヒア コリBL21(DE3)株を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。得られた形質転換体をアンピシリン50μg/mlを含むLB培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム〕に植菌して37℃で１晩振盪培養した後、培養液1 mlを遠心して集菌し、菌体を新しい培地に懸濁してアンピシリン50μg/mlを含む100 ml LB培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム〕に添加して37℃で振盪培養した。培養液の濁度OD610が0.5に達したら0.5 mM IPTG (isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside)を培養液に添加して15℃で24時間振盪培養してタンパク質発現を誘導した。
発現誘導後24時間で遠心によって集菌し、菌体を10 ml 溶菌バッファー[100 mM (Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 25 mM imidazole, 10 mM 2-mercaptoethanol]で懸濁し、超音波破砕処理を行った。菌体破砕液を遠心した後に上精をHisTrap HP column (1 ml, GEヘルスケア・ジャパン 株式会社製)にアプライし、20 ml洗浄バッファー[100 mM (Tris-HCl [pH 8.0], 0.5 M NaCl, 25 mM imidazole]でカラムを洗浄後、4 ml 溶出バッファー[100 mM (Tris-HCl [pH 8.0], 0.5 M NaCl, 250 mM imidazole]でヒスチジンタグ融合XylDタンパクを溶出させた。溶出したタンパク液を透析によってバッファーA[20 mM NaPi [pH 7.0], 1mM EDTA, 5 mM MgCl2]にバッファー交換した後、HiTrap Q HP column (1 ml, GEヘルスケア・ジャパン 株式会社製)にアプライし、AKTA FPLC system (GEヘルスケア・ジャパン 株式会社製)にてNaCl濃度を連続的に1.0 Mまで変化させることでタンパクを溶出させた。回収した各フラクションについてSDS-PAGEを行い、約86kDaのバンドを単一に含むフラクションを集めて精製ヒスチジンタグ融合XylDタンパクを得た。タンパク質の濃度はBio-Rad protein assay kit (Bio-Rad 社製)を用いて定量した。
(6) キシロース利用株の構築 (X2AraE株の構築)
キシロオリゴ糖トランスポーターとβ-キシロシダーゼの導入によりキシロオリゴ糖を取り込み分解できるようになると考えられるが、キシロオリゴ糖を炭素源として利用するには、キシロオリゴ糖の分解によって生成するキシロースが利用できなければならない。コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株にはキシロース利用能がないが、染色体に1コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子を染色体導入したコリネバクテリウム グルタミカムX1株でキシロース利用が可能になることをすでに報告している[Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699 (2008)]。また今回、キシロース利用を更に高めるために、染色体に2コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子を導入したX2株[Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699 (2008)]に1コピーのコリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831株由来アラビノーストランスポーターaraE遺伝子を導入した。
キシロオリゴ糖トランスポーターとβ-キシロシダーゼの導入によりキシロオリゴ糖を取り込み分解できるようになると考えられるが、キシロオリゴ糖を炭素源として利用するには、キシロオリゴ糖の分解によって生成するキシロースが利用できなければならない。コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株にはキシロース利用能がないが、染色体に1コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子を染色体導入したコリネバクテリウム グルタミカムX1株でキシロース利用が可能になることをすでに報告している[Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699 (2008)]。また今回、キシロース利用を更に高めるために、染色体に2コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子を導入したX2株[Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699 (2008)]に1コピーのコリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831株由来アラビノーストランスポーターaraE遺伝子を導入した。
araE遺伝子マーカーレス染色体導入用プラスミドpCRD108 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:105-115 (2009)]は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドであり、コリネバクテリウム グルタミカム R株の生育に必須でないと報告されている配列SSIs 11領域 [Appl. Environ. Microbiol.、71:3369-3372(2005)] へのaraE遺伝子導入用プラスミドである。pCRD108を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX2株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。
プラスミドpCRD108が染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRD108上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRD108上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。
このコリネバクテリウム グルタミカムR株の染色体に2コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子及び1コピーのコリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831株由来araE遺伝子を導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraEと命名した（表１）。
このコリネバクテリウム グルタミカムR株の染色体に2コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子及び1コピーのコリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831株由来araE遺伝子を導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraEと命名した（表１）。
(7)マーカーレス用xynT遺伝子導入用ベクター LKSind8-xynTの構築
xynT遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraE株にマーカーレスで染色体に導入するために必要なDNA領域を、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの生育に必須でないと報告されている配列[Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372（2005）]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域（Indel8領域）を以下のPCR法により増幅した。
xynT遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraE株にマーカーレスで染色体に導入するために必要なDNA領域を、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの生育に必須でないと報告されている配列[Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372（2005）]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域（Indel8領域）を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際しては、以下の一対のプライマーセットを使用した。
xynT遺伝子導入用Indel8領域増幅用プライマーセット
(a-6)； 5’- GGACTAGTAAGGCCGCTGCGGAGGGAACTGT -3’
（配列番号１８）
(b-6)； 5’- CGACAACGGCTGCACACTCTAGACCGCGGATATCAATCTC -3’
（配列番号１９）
(a-7)； 5’- GAGATTGATATCCGCGGTCTAGAGTGTGCAGCCGTTGTCG -3’
（配列番号２０）
(b-7)； 5’- GGACTAGTGCATCTGCATGCGCAGTGGAC -3’
（配列番号２１）
xynT遺伝子導入用Indel8領域増幅用プライマーセット
(a-6)； 5’- GGACTAGTAAGGCCGCTGCGGAGGGAACTGT -3’
（配列番号１８）
(b-6)； 5’- CGACAACGGCTGCACACTCTAGACCGCGGATATCAATCTC -3’
（配列番号１９）
(a-7)； 5’- GAGATTGATATCCGCGGTCTAGAGTGTGCAGCCGTTGTCG -3’
（配列番号２０）
(b-7)； 5’- GGACTAGTGCATCTGCATGCGCAGTGGAC -3’
（配列番号２１）
尚、プライマー(a-6)と(b-7)には、SpeI制限酵素部位が、プライマー(b-6)と(a-7)には、XbaI制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rから抽出した染色体DNAを用いた。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rから抽出した染色体DNAを用いた。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg以下）
プライマー (a-6)と(b-6)または
プライマー (a-7)と(b-7) 各々1μl（最終濃度0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg以下）
プライマー (a-6)と(b-6)または
プライマー (a-7)と(b-7) 各々1μl（最終濃度0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、約1.5-kbのDNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、約1.5-kbのDNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
プライマー (a-6)と(b-6)から増幅されるDNA断片（Indel8-1とする）の3’端20-bpとプライマー (a-7)と(b-7)から増幅されるDNA断片（Indel8-2とする）の5’端20-bpは配列がオーバーラップするようにデザインしており、両DNA断片を熱変性後アニーリングさせることにより連結することができる。
実際の連結反応はTaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
実際の連結反応はTaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
DNA断片 Indel8-1とIndel8-2 各1μl
滅菌蒸留水 34μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
DNA断片 Indel8-1とIndel8-2 各1μl
滅菌蒸留水 34μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、15サイクル行った。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、15サイクル行った。
連結反応後の反応液を鋳型として以下の条件で2回目のPCRを行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
連結反応後の反応液 1μl
プライマー (a-6)と(b-7) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 34μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
連結反応後の反応液 1μl
プライマー (a-6)と(b-7) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 34μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 180秒
以上を1サイクルとし、20サイクル行った。
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、約3.0-kbのDNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：50℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 180秒
以上を1サイクルとし、20サイクル行った。
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、約3.0-kbのDNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
精製した増幅産物を制限酵素SpeIで切断し、マーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）]は制限酵素XbaIで切断後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理をした。各DNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）による精製の後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションK液とした。得られたライゲーションK液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.0-kbのDNA断片に加え、indel8領域の約3.0-kbのDNA断片が検出された。本プラスミドをLKSind8と命名した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.0-kbのDNA断片に加え、indel8領域の約3.0-kbのDNA断片が検出された。本プラスミドをLKSind8と命名した。
pCRF104を鋳型としてPtac-xynT-ターミネーター配列を含むDNA断片（以降xynT発現カセットと呼ぶ）を以下の条件でPCR法で増幅させた。
xynT発現カセット増幅用プライマー
(a-8)； 5’- GGACTAGTGGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC -3’ （配列番号２２）
(b-8)； 5’- GGACTAGTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTC -3’（配列番号２３）
尚、プライマー(a-8)と(b-8)には、SpeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、pCRF104を用いた。
xynT発現カセット増幅用プライマー
(a-8)； 5’- GGACTAGTGGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC -3’ （配列番号２２）
(b-8)； 5’- GGACTAGTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTC -3’（配列番号２３）
尚、プライマー(a-8)と(b-8)には、SpeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、pCRF104を用いた。
実際のPCRは、TaKaRaサーマルサイクラー（タカラバイオ株式会社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg）
プライマー (a-8)と(b-8) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl
鋳型DNA 1μl（DNA含有量1μg）
プライマー (a-8)と(b-8) 各々1μl（最終濃度 0.2μM）
滅菌蒸留水 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：60℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、20サイクル行った。
デナチュレーション過程：98℃ 10秒
アニーリング過程 ：60℃ 5秒
エクステンション過程 ：68℃ 90秒
以上を1サイクルとし、20サイクル行った。
上記で生成した反応液を0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、約2.0-kbのDNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
精製した増幅産物を制限酵素SpeIで切断し、LKSind8は制限酵素XbaIで切断後、Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)による脱リン酸化処理をした。各DNA断片をNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）による精製の後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションL液とした。得られたライゲーションL液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。本プラスミドをInd-xynTと命名した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。本プラスミドをInd-xynTと命名した。
(8) xynT遺伝子染色体導入株の構築
xynT遺伝子導入用プラスミドInd-xynTは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R内で複製不可能なプラスミドである。Ind-xynTを、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447 (1990)及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] の方法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraE株へ導入し、カナマイシン50μｇ／ｍlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。
xynT遺伝子導入用プラスミドInd-xynTは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R内で複製不可能なプラスミドである。Ind-xynTを、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447 (1990)及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] の方法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraE株へ導入し、カナマイシン50μｇ／ｍlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。
さらに、上記の培地で得られた株を、スクロース10％（wt/vol）を含有するA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。
プラスミドInd-xynTが染色体上の相同領域と１点相同組換えを起こした場合、Ind-xynT上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース致死性を示すのに対し、２点相同組換えを起こした場合は、Ind-xynTのカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性とを示す。従って、目的とするxynT遺伝子染色体導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraET（表1）と命名した。
カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X2AraET（表1）と命名した。
(9) キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子導入株の構築
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子導入株の構築には、コリネバクテリウム グルタミカムR株の染色体に1コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子を染色体導入したコリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株、またはコリネバクテリウム グルタミカムR株の染色体に2コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子と1コピーのコリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831株由来アラビノーストランスポーターaraE遺伝子を導入したコリネバクテリウム グルタミカムX2AraE株、更にはX2AraE株にクロストリジウム アセトブチリカム xynTを染色体導入したX2AraET株を宿主として用いた。
キシロオリゴ糖分解酵素遺伝子導入株の構築には、コリネバクテリウム グルタミカムR株の染色体に1コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子を染色体導入したコリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株、またはコリネバクテリウム グルタミカムR株の染色体に2コピーの大腸菌由来xylA-xylB遺伝子と1コピーのコリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831株由来アラビノーストランスポーターaraE遺伝子を導入したコリネバクテリウム グルタミカムX2AraE株、更にはX2AraE株にクロストリジウム アセトブチリカム xynTを染色体導入したX2AraET株を宿主として用いた。
上述のプラスミドpCRF100 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl Microbiol Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF100の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD1と命名した（表1）。
同様に、上述のプラスミドpCRF101 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl Microbiol Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF101の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD2と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、上述のプラスミドpCRF102 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl Microbiol Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF102の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD3と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、上述のプラスミドpCRF102とpCRF103 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl Microbiol Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlとクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF102とpCRF103の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD4と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、上述のプラスミドpCRF103とpCRF104 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX1 [Appl Microbiol Biotechnol. 81:691-699 (2008)] 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlとクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF103とpCRF104の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD5と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、発現ベクターpCRB52TkとpCRB11Tkを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX2AraE株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlとクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、発現ベクターpCRB52TkとpCRB11Tkの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD6と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、上述のプラスミドpCRF102とpCRF103 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX2AraE株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlとクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF102とpCRF103の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD7と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、上述のプラスミドpCRF103とpCRF104 (図１)を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX2AraE株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlとクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF103とpCRF104の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD8と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
同様に、上述のプラスミドpCRF102とpCRF103 (図１)を用いて、電気パルス法[Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990) 及びRes. Microbiol. 144:181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムX2AraET株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlとクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRF102とpCRF103の導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD9と命名した（表1）。液体培養の一部は等量の50％グリセロールを添加した後、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
実施例１に記した遺伝子組換えの概要を、表１および図１にまとめて示す。コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）XYD9は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託した（受託日：２０１４年３月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１２）。
＜遺伝子起源略語＞
ESC； エシェリヒア コリ
COG； コリネバクテリウム グルタミカム
COA； コリネバクテリウム アルカノリティカム
CLA； クロストリジウム アセトブチリカム
(10) グルコースとキシロビオースの分析
培養液中のグルコースおよびキシロビオースの分析は以下のHPLCによって行った。
培養液上精50μlを水950 μlで希釈したものをサンプルとし、HPLC装置（東ソー社製）にて、カラムにHPX-87P column (BIO-RAD社製) を用い、カラム温度85 oC、水を移動相として流速 0.6 ml min-1で糖を分離した。糖の検出は示差屈折率検出器によって行った。
培養液中のグルコースおよびキシロビオースの分析は以下のHPLCによって行った。
培養液上精50μlを水950 μlで希釈したものをサンプルとし、HPLC装置（東ソー社製）にて、カラムにHPX-87P column (BIO-RAD社製) を用い、カラム温度85 oC、水を移動相として流速 0.6 ml min-1で糖を分離した。糖の検出は示差屈折率検出器によって行った。
(11) キシロオリゴ糖および有機酸の分析
培養液中のキシロオリゴ糖の分析は以下のLC-ESIMSによって分析した。
培養液上精20μlをアセトニトリル 80μlと混合して遠心した後、その上精をサンプルとした。キシロオリゴ糖の分離はHPLC装置（島津製作所製）にて、カラムにTSKgel Amide-80 column (4.5 cm × 0.2 mm, 東ソー株式会社製) を用い、カラム温度60 oC、流速0.2 ml min-1で溶離液組成は10 mM アンモニウム酢酸/アセトニトリルを25/75から65/35までの連続的グラジエント（15分間）で行った。
キシロオリゴ糖の検出は、AB SCIEX QTRAP 5500 LC/MS/MS System (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies社製)を使用し、酢酸が付加した負イオンを検出することで行った。標品はMegazyme社より購入した。
培養液中の有機酸の分析は以下のHPLCによって分析した。
培養液上精50μlを0.75 mM H2SO4水溶液950μlと混合してサンプルとした。有機酸の分離はHPLC装置（島津製作所製）にて、カラムにTSKgel OApack-A colum （30 cm × 7.8 mm, 東ソー株式会社製) を用い、カラム温度40 oC、流速1.0 ml min-1で溶離液組成は0.75 mM H2SO4水溶液で行った。有機酸の検出はUV検出器にて行った。
培養液中のキシロオリゴ糖の分析は以下のLC-ESIMSによって分析した。
培養液上精20μlをアセトニトリル 80μlと混合して遠心した後、その上精をサンプルとした。キシロオリゴ糖の分離はHPLC装置（島津製作所製）にて、カラムにTSKgel Amide-80 column (4.5 cm × 0.2 mm, 東ソー株式会社製) を用い、カラム温度60 oC、流速0.2 ml min-1で溶離液組成は10 mM アンモニウム酢酸/アセトニトリルを25/75から65/35までの連続的グラジエント（15分間）で行った。
キシロオリゴ糖の検出は、AB SCIEX QTRAP 5500 LC/MS/MS System (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies社製)を使用し、酢酸が付加した負イオンを検出することで行った。標品はMegazyme社より購入した。
培養液中の有機酸の分析は以下のHPLCによって分析した。
培養液上精50μlを0.75 mM H2SO4水溶液950μlと混合してサンプルとした。有機酸の分離はHPLC装置（島津製作所製）にて、カラムにTSKgel OApack-A colum （30 cm × 7.8 mm, 東ソー株式会社製) を用い、カラム温度40 oC、流速1.0 ml min-1で溶離液組成は0.75 mM H2SO4水溶液で行った。有機酸の検出はUV検出器にて行った。
実施例２．キシロオリゴ糖分解酵素の酵素学的解析
上記の実施例１(5)で得られたN末にヒスチジンタグを融合したコリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylDについて酵素活性を測定した。
β-キシロシダーゼ活性の測定は、33℃の温度条件下で、1 mlの100 mM HEPES (pH 7.0)に基質のp-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside(以降pNPXと略す）を0.04, 0.1, 0.4, 0.8または2.0 mM各濃度で加えた反応液に1μg/μlの酵素液を1 μl添加することで反応を開始し、Beckman DU800 spectrophotometer (ベックマンコールター社製)によって遊離のp-nitrophenolの生成を410 nmの吸収をモニターすることによって行った。またα-アラビノフラノシダーゼ活性の測定についても上記と同様にして、基質としてp-nitrophenyl-α-arabinofuranoside (pNPA)を0.2, 0.4, 1.0, 2.0または4.0 mM各濃度で加えることで行った。1/vと1/[S]から得られるLineweaver-BurkプロットからKm, Vmaxを求めた。
上記の実施例１(5)で得られたN末にヒスチジンタグを融合したコリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylDについて酵素活性を測定した。
β-キシロシダーゼ活性の測定は、33℃の温度条件下で、1 mlの100 mM HEPES (pH 7.0)に基質のp-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside(以降pNPXと略す）を0.04, 0.1, 0.4, 0.8または2.0 mM各濃度で加えた反応液に1μg/μlの酵素液を1 μl添加することで反応を開始し、Beckman DU800 spectrophotometer (ベックマンコールター社製)によって遊離のp-nitrophenolの生成を410 nmの吸収をモニターすることによって行った。またα-アラビノフラノシダーゼ活性の測定についても上記と同様にして、基質としてp-nitrophenyl-α-arabinofuranoside (pNPA)を0.2, 0.4, 1.0, 2.0または4.0 mM各濃度で加えることで行った。1/vと1/[S]から得られるLineweaver-BurkプロットからKm, Vmaxを求めた。
その結果、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylDのβ-キシロシダーゼは、Km、Vmax、turn over numberはそれぞれ2.4 mM、1.3μmol s-1μg-1、111 s-1μg-1であった。バクテリアやカビのβ-キシロシダーゼでは一般的なβ-キシロシダーゼ活性のturn over nubmerは0.02〜30 s-1μg-1であることから、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylDのβ-キシロシダーゼ活性は既知のキシロシダーゼのなかでは高い部類に入ることが明らかとなった。またコリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylDのα-アラビノフラノシダーゼ活性はKm、Vmax、turn over numberはそれぞれ50.0 mM、0.06μmol s-1μg-1、5 s-1μg-1で、低いながらもα-アラビノフラノシダーゼ活性も有することが示された（表2）。
β-キシロシダーゼは一般的にキシロースによる生成物阻害を受けることが知られており、キシロースに対する一般的な阻害定数Ki値は2 〜10 mMである。そこでコリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylDについてキシロースによる生成物阻害を検討した。
阻害定数Ki値の測定は、基質のpNPXを0.4, 1.2または2.0mMの濃度で含む1 mlの100 mM HEPES (pH 7.0)について、キシロースを40, 60, 80または100mMの濃度で加えた反応液に1μg/μlの酵素液を1 μl添加することで反応を開始し、Beckman DU800 spectrophotometer (ベックマンコールター社製)によって遊離のp-nitrophenolの生成を410 nmの吸収をモニターすることによって行った。各 pNPX濃度条件についてキシロース濃度[I]と1/vでプロットし、pNPX各濃度から得られたLineweaver-Burkプロットの交点からKi値を求めた。その結果コリネバクテリウム アルカノリティカム XylDのキシロースに対するKi値は65 mMであり、既知のβ-キシロシダーゼの中ではキシロース阻害を受けにくい部類であることが明らかとなった。
実施例３．キシロオリゴ糖を炭素源とした好気増殖試験
コリネバクテリウム グルタミカムX1株、XYD1株、XYD2株（表１）について、グリセロールストック液50 μlを、カナマイシン 50μg/mlと4 % [wt/vol] グルコースを含む2.5 ml A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間振盪培養によって前培養した。
コリネバクテリウム グルタミカムX1株、XYD1株、XYD2株（表１）について、グリセロールストック液50 μlを、カナマイシン 50μg/mlと4 % [wt/vol] グルコースを含む2.5 ml A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間振盪培養によって前培養した。
前培養液2 mlを遠心によって集菌し、BT培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]で菌体を2回洗浄した。
カナマイシン 50μg/mlと2 % [wt/vol] キシロオリゴ糖（和光純薬）を含む10 ml のBT培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]に洗浄後の菌体をOD610が0.5になるように移し、33℃で80時間振盪培養した。その結果を図２に示す。図２の菱形（◆）はX1株、四角（■）はXYD1株、三角（▲）はXYD2株の増殖曲線を示している。
X1株とXYD1株は増殖できなかったが、XYD2株だけが増殖可能であった。
X1株とXYD1株は増殖できなかったが、XYD2株だけが増殖可能であった。
実施例４．XylEFGの基質特異性
コリネバクテリウム グルタミカムXYD2株（表１）について、グリセロールストック液50 μlを、カナマイシン 50μg/mlと4 % [wt/vol] グルコースを含む2.5 mlのA培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間振盪培養によって前培養した。
コリネバクテリウム グルタミカムXYD2株（表１）について、グリセロールストック液50 μlを、カナマイシン 50μg/mlと4 % [wt/vol] グルコースを含む2.5 mlのA培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間振盪培養によって前培養した。
前培養液2 mlを遠心によって集菌し、BT培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]で菌体を2回洗浄した。
カナマイシン 50μg/mlと0.5% [wt/vol] キシロオリゴ糖（和光純薬製）を含む10 ml のA培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に洗浄後の菌体をOD610が0.5になるように移し、33℃で30時間振盪培養した。
培養後の培地を遠心後、上精をLC-ESIMSによって分析した。培養直前の培地の分析の結果を図３（１）に示している。キシロオリゴ糖（和光純薬製）にはX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）に加え、分子量が3ユニット〜6ユニットのペントースオリゴマーに相当するオリゴ糖P3 〜 P6が含まれており、これらはアラビノキシロオリゴ糖と思われる。XYD2株の培養後の培地の分析の結果を図３（２）に示す。XYD2株ではX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）のキシロオリゴ糖に加え、アラビノキシロオリゴ糖と思われるオリゴ糖P3 〜P5もほぼ完全に消費されていた。
実施例５．MsiK（ATP結合蛋白）の高発現効果
XYD2株とXYD3株のグルコース、キシロオリゴ糖混合糖培地での糖消費を比較した。
コリネバクテリウム グルタミカム X1株にxylEFGD遺伝子クラスターを発現させることでキシロオリゴ糖を効率良く取り込めるようになった。しかしxylEFG遺伝子クラスター中には、ABCトランスポーターに必須なATP結合蛋白をコードする遺伝子がなく、ATP結合蛋白を相補する因子がコリネバクテリウム グルタミカムで発現しているものと考えられた。
xylEFG遺伝子クラスターと同様の遺伝子構造はStreptomyces属 [Appl. Environ. Microbiol. 65:2636-2643 (1999).及びJ Bacteriol. 186:1029-1037. (2004)] やBacillus属 [J Bacteriol. 192:5312-5318. (2010).] で報告されているキシロビオースやセロビオースなどのオリゴ糖取り込みに関与するABCトランスポーター遺伝子でも共通してみられ、ゲノム上で離れた位置に存在するATP結合蛋白 MsiK（Streptomyces属） [J Bacteriol. 179:2092-2095. (1997).]、またはMsmX （Bacillus属）[J Bacteriol. 192:5312-5318. (2010).] がこれらABCトランスポーターのATP結合蛋白として機能する。
異種バクテリア由来のホモログではなくnativeのMsiKを利用すればXylEFGから構成されるABCトランスポーターがより効率良く機能する可能性が考えられたことから、コリネバクテリウム アルカノリティカムから新規にクローニングしたmsiK遺伝子の高発現効果を確認した。
XYD2株とXYD3株のグルコース、キシロオリゴ糖混合糖培地での糖消費を比較した。
コリネバクテリウム グルタミカム X1株にxylEFGD遺伝子クラスターを発現させることでキシロオリゴ糖を効率良く取り込めるようになった。しかしxylEFG遺伝子クラスター中には、ABCトランスポーターに必須なATP結合蛋白をコードする遺伝子がなく、ATP結合蛋白を相補する因子がコリネバクテリウム グルタミカムで発現しているものと考えられた。
xylEFG遺伝子クラスターと同様の遺伝子構造はStreptomyces属 [Appl. Environ. Microbiol. 65:2636-2643 (1999).及びJ Bacteriol. 186:1029-1037. (2004)] やBacillus属 [J Bacteriol. 192:5312-5318. (2010).] で報告されているキシロビオースやセロビオースなどのオリゴ糖取り込みに関与するABCトランスポーター遺伝子でも共通してみられ、ゲノム上で離れた位置に存在するATP結合蛋白 MsiK（Streptomyces属） [J Bacteriol. 179:2092-2095. (1997).]、またはMsmX （Bacillus属）[J Bacteriol. 192:5312-5318. (2010).] がこれらABCトランスポーターのATP結合蛋白として機能する。
異種バクテリア由来のホモログではなくnativeのMsiKを利用すればXylEFGから構成されるABCトランスポーターがより効率良く機能する可能性が考えられたことから、コリネバクテリウム アルカノリティカムから新規にクローニングしたmsiK遺伝子の高発現効果を確認した。
尚、XYD2株とXYD3株（表１）のキシロシダーゼ活性はほぼ同等だった（表３）。
コリネバクテリウム グルタミカムXYD2株とXYD3株について、グリセロールストック液50 μlを、カナマイシン 50μg/mlと4 % [wt/vol] グルコースを含む2.5 mlのA培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間振盪培養によって前培養した。
前培養液2 mlを遠心によって集菌し、BT培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]で菌体を2回洗浄した。
カナマイシン 50μg/ml、0.4% [wt/vol] キシロオリゴ糖と0.4% [wt/vol] グルコースを含む10 ml のBT培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]に洗浄後の菌体をOD610が1.0になるように移し、33℃で振盪培養した。グルコースとキシロビオースの消費をHPLCでモニターした結果を図４に示す。図４において破線はXYD2株、実線はXYD3株の糖消費を示し、丸（●）はグルコース、三角（▲）はキシロビオースの消費を示している。結果は、XYD2株とXYD3株ともにグルコースとキシロビオースの同時利用が可能であったが、キシロオリゴ糖消費速度はXYD2株が0.4 mM/hなのに対してXYD3株では1.4 mM/hであり、コリネバクテリウム アルカノリティカム由来MsiKの高発現によってキシロビオース消費速度が3倍以上速くなった（表４）。
実施例６．シンポ―タ―型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質の利用
キシロオリゴ糖の取り込みには、XylEFG-MsiK のようなxyloside ABCトランスポーター以外に、クレブシエラ オキシトカ XynTなどの ATPのエネルギーを必要としないシンポ―タ― [Appl. Environ. Microbiol. 69:5957-5967. (2003).] が知られている。そこでクレブシエラ オキシトカ XynTと相同性を示すクロストリジウム アセトブチリカムのCA_C3451遺伝子をクローニングしてpCRB52Tk のtacプロモーター下流に組み込んだ。当該遺伝子を以降はxynTと呼ぶ。クロストリジウム アセトブチリカム XynTのクレブシエラ オキシトカ XynTに対する相同性はアミノ酸レベルでそれぞれ32.8 % identityであった。クロストリジウム アセトブチリカム xynT遺伝子を組み込んだ発現プラスミドpCRF104 （図１）とXylD高発現プラスミドpCRF103（図１）を同時導入してXYD5株（表1）を構築した。またxyloside ABCトランスポーター発現株として、コリネバクテリウム アルカノリティカム xylEFGD-msiK遺伝子を組み込んだpCRF102（図１）とXylD高発現プラスミドpCRF103（図１）を同時導入してXYD4株（表1）を構築し、両株でのキシロオリゴ糖消費速度を比較した。
キシロオリゴ糖の取り込みには、XylEFG-MsiK のようなxyloside ABCトランスポーター以外に、クレブシエラ オキシトカ XynTなどの ATPのエネルギーを必要としないシンポ―タ― [Appl. Environ. Microbiol. 69:5957-5967. (2003).] が知られている。そこでクレブシエラ オキシトカ XynTと相同性を示すクロストリジウム アセトブチリカムのCA_C3451遺伝子をクローニングしてpCRB52Tk のtacプロモーター下流に組み込んだ。当該遺伝子を以降はxynTと呼ぶ。クロストリジウム アセトブチリカム XynTのクレブシエラ オキシトカ XynTに対する相同性はアミノ酸レベルでそれぞれ32.8 % identityであった。クロストリジウム アセトブチリカム xynT遺伝子を組み込んだ発現プラスミドpCRF104 （図１）とXylD高発現プラスミドpCRF103（図１）を同時導入してXYD5株（表1）を構築した。またxyloside ABCトランスポーター発現株として、コリネバクテリウム アルカノリティカム xylEFGD-msiK遺伝子を組み込んだpCRF102（図１）とXylD高発現プラスミドpCRF103（図１）を同時導入してXYD4株（表1）を構築し、両株でのキシロオリゴ糖消費速度を比較した。
コリネバクテリウム グルタミカムXYD4株とXYD5株について、グリセロールストック液50 μlを、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/mlと4 % [wt/vol] グルコースを含む2.5 ml A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌後、33℃で16時間振盪培養によって前培養した。
前培養液2 mlを遠心によって集菌し、BT培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]で菌体を2回洗浄した。
カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール5μg/ml、0.8% [wt/vol] キシロオリゴ糖と4 % [wt/vol] グルコースを含む10 ml のA培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に洗浄後の菌体をOD610が0.2になるように移し、33℃で振盪培養した。グルコースとキシロビオースの消費をHPLCでモニターして比較した結果を図５に示す。破線はXYD4株、実線はXYD5株を示し、丸（●）がグルコースで三角（▲）がキシロビオースの消費を示している。結果は、キシロビオース消費速度はXYD4株が1.4 mM/h、XYD5株が1.8 mM/h（表５）でシンポーター型トランスポーターを発現するXYD5株の方がキシロビオース消費速度が速かった。
実施例７．XynTの基質特異性
本研究で用いているキシロオリゴ糖にはX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）に加え、分子量が3ユニット〜6ユニットのペントースオリゴマーに相当するオリゴ糖P3 〜P6が含まれており、これらはアラビノキシロオリゴ糖と思われる。図６（１）に培養直前の培地上精のLCMSの結果を示している。上記実施例４に示したようにXylEFGD発現株ではオリゴ糖P6以外の全てを消費できる。そこでクロストリジウム アセトブチリカムXynTの基質特異性を検討するため、上記実施例６に示したXYD4株とXYD5株の培養後の培地上精をLC-ESIMSで解析した。その結果、図６（２）に示すXYD4株ではオリゴ糖P6以外の全てを消費できるが、図6（３）に示すXYD5株ではX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）は完全消費されていたが、アラビノキシロオリゴ糖と思われるオリゴ糖P3 〜P6に関してはほとんど消費はみられなかった。このことはクロストリジウム アセトブチリカム XynTはキシロオリゴ糖の取り込み速度は速いが、アラビノキシロオリゴ糖はほとんど取り込めないことを示していた。
本研究で用いているキシロオリゴ糖にはX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）に加え、分子量が3ユニット〜6ユニットのペントースオリゴマーに相当するオリゴ糖P3 〜P6が含まれており、これらはアラビノキシロオリゴ糖と思われる。図６（１）に培養直前の培地上精のLCMSの結果を示している。上記実施例４に示したようにXylEFGD発現株ではオリゴ糖P6以外の全てを消費できる。そこでクロストリジウム アセトブチリカムXynTの基質特異性を検討するため、上記実施例６に示したXYD4株とXYD5株の培養後の培地上精をLC-ESIMSで解析した。その結果、図６（２）に示すXYD4株ではオリゴ糖P6以外の全てを消費できるが、図6（３）に示すXYD5株ではX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）は完全消費されていたが、アラビノキシロオリゴ糖と思われるオリゴ糖P3 〜P6に関してはほとんど消費はみられなかった。このことはクロストリジウム アセトブチリカム XynTはキシロオリゴ糖の取り込み速度は速いが、アラビノキシロオリゴ糖はほとんど取り込めないことを示していた。
実施例８．還元条件下での糖消費および有機酸生産
XYD6株、XYD7、XYD8株（表1）について、還元条件下でのグルコース、キシロオリゴ糖消費、および有機酸生産を検討した。
コリネバクテリウム グルタミカムXYD6株、XYD7、XYD8株のグリセロールストック液100 μlを、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。24時間後に菌体をカナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール5μg/ml、4 % [wt/vol] グルコースを含む10 ml A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌（A610 > 10）後、33℃で6時間振盪培養し、その培養液8 ｍｌをカナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール5μg/ml、4 % [wt/vol] グルコースを含む1L A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に添加して33℃、200rpmで14時間振盪培養により前培養した。
XYD6株、XYD7、XYD8株（表1）について、還元条件下でのグルコース、キシロオリゴ糖消費、および有機酸生産を検討した。
コリネバクテリウム グルタミカムXYD6株、XYD7、XYD8株のグリセロールストック液100 μlを、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布した。24時間後に菌体をカナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール5μg/ml、4 % [wt/vol] グルコースを含む10 ml A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に植菌（A610 > 10）後、33℃で6時間振盪培養し、その培養液8 ｍｌをカナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール5μg/ml、4 % [wt/vol] グルコースを含む1L A培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解]に添加して33℃、200rpmで14時間振盪培養により前培養した。
前培養液１Lを遠心によって集菌し、１LのBT-U培地[(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]で菌体を2回洗浄した。
洗浄後の菌体6 gを48 mlのBT-U培地[(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]に懸濁し、そのうち40 mlを反応容器に移してグルコース・キシロオリゴ糖混合液（15 % [wt/vol] グルコース + 7.5 % [wt/vol] キシロオリゴ糖）10 mlを添加して還元条件下で反応を開始した。反応温度は33℃、pHはpHコントローラーを用いて2.5 Nアンモニア水の添加によりpH7.5に維持しながら行った。
グルコースとキシロビオースの消費、および有機酸生産をHPLCでモニターした結果を図7に示す。実線は糖消費、破線は有機酸生産を示す。丸（●）はグルコース、三角（▲）はキシロビオースの消費を示している。菱形（◆）は乳酸、四角（■）はコハク酸の生産を示している。その結果、図７（１）に示すキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質遺伝子及びβ-キシロシダーゼ遺伝子を含まないベクター導入株XYD6 株ではグルコースの消費のみでキシロビオースの消費は全く見られず、図７（２）に示すXYD7株および図７（３）に示すXYD8株ではグルコースとキシロビオースの同時利用がみられた。キシロビオース消費速度は、キシロオリゴ糖トランスポーターとしてコリネバクテリウム アルカノリティカム由来XylEFG-MsiKを発現させたXYD6株では9.3 mM/h、クロストリジウム アセトブチリカム由来XynTを発現させたXYD7株では58.4 mM/h（表６）でXYD7株がXYD6株より約6倍のキシロビオース消費速度を示した。キシロオリゴ糖消費が可能となったXYD7株およびXYD8株では、キシロオリゴ糖消費できないベクター導入株のXYD6 株よりも有機酸生産量が顕著に増加していた。
実施例９．還元条件下での基質特異性
上記実施例８の還元条件下での反応24時間後の反応液上精をLC-ESIMS分析した結果を図８に示す。図８（１）に示すキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質遺伝子及びβ-キシロシダーゼ遺伝子を含まないベクターを導入したコントロール株XYD6 株では、オリゴ糖の消費は全くみられなかった。図８（２）に示すコリネバクテリウム アルカノリティカム XylEFGD-MsiK発現株ではX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）に加えてアラビノキシロオリゴ糖と思われるP3とP4ともにほとんど消費されていたが、上記実施例４の図３（２）に示している好気培養時と異なり、P5の消費はほとんどみられなかった。図８（３）に示すクロストリジウム アセトブチリカムXynTを発現させたXYD7株では上記実施例７の図６（３）に示している好気培養時と同様X2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）は完全消費されていたが、アラビノキシロオリゴ糖と思われるP4とP5は全く消費されていなかった。ただしP3はほとんど消費されていた。
上記実施例８の還元条件下での反応24時間後の反応液上精をLC-ESIMS分析した結果を図８に示す。図８（１）に示すキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質遺伝子及びβ-キシロシダーゼ遺伝子を含まないベクターを導入したコントロール株XYD6 株では、オリゴ糖の消費は全くみられなかった。図８（２）に示すコリネバクテリウム アルカノリティカム XylEFGD-MsiK発現株ではX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）に加えてアラビノキシロオリゴ糖と思われるP3とP4ともにほとんど消費されていたが、上記実施例４の図３（２）に示している好気培養時と異なり、P5の消費はほとんどみられなかった。図８（３）に示すクロストリジウム アセトブチリカムXynTを発現させたXYD7株では上記実施例７の図６（３）に示している好気培養時と同様X2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）は完全消費されていたが、アラビノキシロオリゴ糖と思われるP4とP5は全く消費されていなかった。ただしP3はほとんど消費されていた。
実施例１０．ABC型とシンポーター型トランスポーターの共発現株による還元条件下での糖消費
コリネバクテリウム アルカノリティカム XylEFGD-MsiKを発現するXYD7株はキシロオリゴ糖の取り込み速度は遅いが、取り込めるアラビノキシロオリゴ糖の種類が多い。一方、クロストリジウム アセトブチリカムXynTを発現するXYD8株はキシロオリゴ糖の取り込み速度はかなり速いが、アラビノキシロオリゴ糖はほとんど取り込めない。そこで両方のトランスポーターを共発現させればキシロオリゴ糖の取り込みが速く、なお且つアラビノキシロオリゴ糖も取り込めるようになるのではないかと考えた。
コリネバクテリウム アルカノリティカム XylEFGD-MsiKを発現するXYD7株はキシロオリゴ糖の取り込み速度は遅いが、取り込めるアラビノキシロオリゴ糖の種類が多い。一方、クロストリジウム アセトブチリカムXynTを発現するXYD8株はキシロオリゴ糖の取り込み速度はかなり速いが、アラビノキシロオリゴ糖はほとんど取り込めない。そこで両方のトランスポーターを共発現させればキシロオリゴ糖の取り込みが速く、なお且つアラビノキシロオリゴ糖も取り込めるようになるのではないかと考えた。
コリネバクテリウム グルタミカムXYD9株（表1）について上記実施例８に示すのと同様の条件で還元条件下での反応を行い、グルコースとキシロビオースの消費、および有機酸生産をHPLCでモニターした結果を図７（４）に示す。実線は糖消費、破線は有機酸生産を示す。丸（●）はグルコース、三角（▲）はキシロビオースの消費を示している。菱形（◆）は乳酸、四角（■）はコハク酸の生産を示している。キシロビオース消費速度は49.6 mM/hでXYD8株の58.4 mM/hよりも若干下がったが、XYD7株の9.3 mM/hと比較すると依然速い消費速度を示していた（表６）。
還元条件下での反応24時間後の反応液上精をLC-ESIMS分析した結果を図８（４）に示す。XYD9株ではX2（キシロビオース）、X3（キシロトリオース）、X4（キシロテトラオース）に加えてアラビノキシロオリゴ糖と思われるP3とP4と更にP5も完全に消費していた。これによりXYD9株はキシロオリゴ糖の取り込みが速く、なお且つアラビノキシロオリゴ糖も取り込めることが示された。
本発明のコリネ型細菌形質転換体は、農業残渣や木質バイオマス等の非可食バイオマスからバイオ化学品やバイオ燃料を効率的に製造するのに極めて有益である。
Claims (22)
- 宿主のコリネ型細菌に、(A)キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質をコードする外来遺伝子、及び(B)β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されているコリネ型細菌形質転換体。
- キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型の輸送体蛋白質である請求項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
- ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(b)配列番号１と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項２に記載のコリネ型細菌形質転換体。 - キシロオリゴ糖の細胞外から細胞内への取り込みを可能とするキシロオリゴ糖輸送体がシンポーター型の輸送体蛋白質である請求項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
- シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(d)配列番号２と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項４に記載のコリネ型細菌形質転換体。 - キシロオリゴ糖輸送能を有する蛋白質がＡＢＣトランスポーター型の輸送体蛋白質およびシンポーター型の輸送体蛋白質である請求項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
- ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(b)配列番号１と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＢＣトランスポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡであり、
シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体蛋白質をコードする外来遺伝子が
(c)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(d)配列番号２と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、シンポーター型の輸送体機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項６に記載のコリネ型細菌形質転換体。 - β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(e)配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、または
(f)配列番号３と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、β-キシロシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項１〜７の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。 - さらに、ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されている請求項１〜８の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- ＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が、
(g)配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡであるか、または
(h)配列番号４と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、若しくは配列番号４と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＴＰ結合部位を有する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項９に記載のコリネ型細菌形質転換体。 - 宿主のコリネ型細菌が、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌である請求項１〜１０の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、キシロース イソメラーゼをコードする外来遺伝子、及びキシルロキナーゼをコードする外来遺伝子を導入された形質転換体である請求項１１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
- 宿主のコリネ型細菌が、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来遺伝子を導入された形質転換体である請求項１〜１２の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- 宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルタミカムInd-araE/pCRA811 (受託番号 NITE BP−576)、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号 NITE BP−577)、コリネバクテリウム グルタミカムX5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号 NITE BP−581)である請求項１３記載のコリネ型細菌形質転換体。
- ＡＢＣトランスポーター型のキシロオリゴ糖輸送体をコードする外来遺伝子およびＡＴＰ-結合部位を有する蛋白質をコードする外来遺伝子が導入されており、これらの外来遺伝子が、それぞれ独立して、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）、またはゲオバシルス スタエロサーモフィルス（Geobacillus staerothermophilus）由来の遺伝子である請求項１〜３、および６〜１４の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- シンポーター型のキシロオリゴ糖輸送体をコードする外来遺伝子が導入されており、この外来遺伝子が、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylycum）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、バシルス サブチリス（Bacillus subtilis）、またはクレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来の遺伝子である請求項１、および３〜１５の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- β-キシロシダーゼをコードする外来遺伝子が、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、マイクロバクテリウム テスタセウム（Microbacterium testaceum）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、セルロモナス フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ストレプトマイセス スカビエイ（Streptomyces scabiei）、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、ラクトバシルス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、パエニバシルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、またはゲオバシルス サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）由来の遺伝子である請求項１〜１６の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- コリネ型細菌の形質転換体がCorynebacterium glutamicum XYD9 （受託番号NITE P-01812）である請求項１〜１７の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
- 請求項１〜１８の何れかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、キシロオリゴ糖を含むか、又はキシロオリゴ糖とグルコース若しくはグルコース単位からなるオリゴマー若しくはポリマーとを含む反応液中で反応させる工程と、培養物から有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
- 有機化合物が、アミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質、および有機性ガスからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１９に記載の方法。
- 還元条件下の反応液中で反応させる請求項１９または２０に記載の方法。
- 還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００ｍＶ〜−５００ｍＶである請求項２１に記載の方法。
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