JP2015172080A - 癌の画像化と処置 - Google Patents

Abstract

【課題】癌の画像化と処置の提供。
【解決手段】構造：［（Ｐ１−Ｓ１_ｊ）_ｐ−Ｌ−（Ｓ２_ｑ−Ｐ２）_ｒ］_ｔを含む化合物、またはその薬学的に許容され得る塩もしくはエステルであって、式中：Ｐ１およびＰ２は、同じであっても異なっていてもよく、環状オリゴペプチド部分であり、Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は該環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有し、ここで、Ｂは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンもしくはその誘導体であり；Ｓ１およびＳ２は、スペーサー基であり、同じであっても異なっていてもよく；Ｌは、該環状オリゴペプチドまたはスペーサー基の結合のための少なくとも２つの官能基を含むリンカー部分であり；ｎおよびｑは独立して、０または１であり；ｐおよびｒは独立して、１以上の整数である。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌の画像化と処置に関する。特に、排他的ではないが、本発明は、放射性核種をケモカイン受容体ＣＸＣＲ４発現細胞に標的化するのに適した、その画像化と処置の目的のための組成物に関する。

腫瘍の転移の可能性および転移性拡散を早期評価するための方法は、治療の予測と管理に有益なツールとなろう。最近、転移における重要な役割がケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に原因があるとされた（非特許文献１）。乳癌および前立腺癌などのさまざまな腫瘍では、ＣＸＣＲ４が、腫瘍細胞ホーミングの際に支配的な役割を果たしていることがわかり、原発性腫瘍と転移腫瘍の両方で発現されることが示された。

ストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）は、ＣＸＣＲ４に対する内因性リガンドである（非特許文献２）。ＣＸＣＲ４に対するペプチド系アンタゴニスト、例えば、ＣＰＣＲ４（ＦＣ１３１としても知られており、配列シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を有する）が報告されている（非特許文献３参照）。ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対する共受容体であり、細胞内への該ウイルスの侵入を可能にする。特許文献１には、組織学試験用の放射性標識ＳＤＦ−１αが記載されている。また、この文献には、いくつかの比較的嵩高い、ＣＸＣＲ４の合成ペプチドアンタゴニストが開示されている。特許文献２には、ビオチンで標識したＣＸＣＲ４アンタゴニストが開示されている。かかる化合物の検出には、ストレプトアビジンを有する第２のレポーター化合物の添加が必要とされる。特許文献２に例示されているアンタゴニストは、４位と１３位のＣｙｓ残基の間のジスルフィド結合によって環化された１４アミノ酸のペプチドである。１位と２位、すなわち環状部分の外側にＡｒｇ−Ａｒｇモチーフが存在する。

これまで、ＣＸＣＲ４に対するアンタゴニスト（ペプチドおよび非ペプチドの両方）に関する研究は、本質的に、転移性過程またはＨＩＶ感染の抑制剤としての使用の可能性に限定されていた。同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００６８４において、本発明者らは、ＣＸＣＲ４に対するいくつかの新規な環状オリゴペプチドアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４発現のトレーサーとしてのＣＸＣＲ４アンタゴニストの適用を報告している。

欧州特許出願公開第１５４１５８５号明細書 国際公開第２００４／０８７６０８号パンフレット

Ｍｕｅｌｌｅｒら Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１０、５０ Ｎａｇａｓａｗａ Ｔ．ら ＰＮＡＳ．（１９９４）９１、２３０５ Ｆｕｊｉｉ Ｎ．ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ（２００３）４２、３２５１

本発明の第１の態様において、構造：
［（Ｐ１−Ｓ１_ｊ）_ｐ−Ｌ−（Ｓ２_ｑ−Ｐ２）_ｒ］_ｔ
（式中：
Ｐ１およびＰ２は、同じであっても異なっていてもよく、環状オリゴペプチド部分であり、Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は該環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有し、ここで、Ｂは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンもしくはその誘導体であり；
Ｓ１およびＳ２は、スペーサー基であり、同じであっても異なっていてもよく；
Ｌは、該環状オリゴペプチドまたはスペーサー基の結合のための少なくとも２つの官能基を含むリンカー部分であり；
ｊおよびｑは、独立して０または１であり；
ｐおよびｒは独立して、１以上の整数であり；そして
ｔは、１以上の整数であり、
ただし、ｔ、ｐまたはｒが１より大きいとき、該環状オリゴペプチド部分、スペーサー基および／またはｊもしくはｑの値は、多数の該（Ｐ１−Ｓ１_ｊ）部分または多数の該（Ｓ２_ｑ−Ｐ２）部分の間で同じであっても異なっていてもよいものとする）を含む化合物、またはその薬学的に許容され得る塩もしくはエステルを提供する。

リンカーまたはスペーサー基を用いて１つの受容体系に対する２つ以上の高親和性リガンドを共有結合させることにより、単量体リガンドと比べ、構造全体の見かけ上の結合親和性が増大し得る。この方法を、疾患の程度を可視化する目的、疾患の領域の位置および境界を特定する目的、または治療ストラテジーによって介入する目的で、疾患の「分子的相関性」または対応する経路に対処するための化合物または放射性標識化合物の開発のために使用すると、高選択性が得られ得る。したがって、この方法論は、単量体リガンドに対して有益な改善となる。本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４受容体に対する親和性および潜在的拮抗作用によって、該受容体が関与している状態（例えば、ＨＩＶ感染、新形成および転移性の疾患）に使用される可能性がある。さらに、検出可能な標識を含むように修飾した場合、本発明の化合物により、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のインビボ標的化のための効率的なプローブが提供され得る。該化合物は、高い親和性および特異性でその結合部位に結合し、容易な画像化を可能にし（さまざまな方法によって）、従ってインビボでのＣＸＣＲ４陽性腫瘍（およびあらゆる付随する転移）の明確な輪郭描写を可能にする。この新規なクラスのプローブ／トレーサーにより、腫瘍の転移の可能性の検討および早期画像化のための高度に有益なツールが提供され得、場合によっては、転移過程の放射性核種療法が提供され得る。

スペーサー基Ｓ１およびＳ２は１〜２０個の炭素原子のアルキル鎖を含むものであり得、該アルキル鎖は、分枝鎖または非分枝鎖、置換または非置換であり得、１つ以上のヘテロ原子、環式基および／または複素環式基で分断されていてもよく、該環状オリゴペプチドおよびリンカーＬの結合に適した少なくとも２つの官能基を有するものであり得る。Ｓ１およびＳ２のアルキル鎖は、１〜１４個の炭素原子；例えば４〜１０個の炭素原子を含むものであり得る。スペーサー基Ｓ１および／またはＳ２の全長は、任意の分断ヘテロ原子および／または環式基を考慮に入れると、およそ１〜２０個の炭素、例えば１〜１４個の炭素（４〜１０個の炭素など）の線状アルキル鎖に相当するものであり得る。特定のある実施形態において、スペーサー基Ｓ１および／またはＳ２は、環状オリゴペプチドのアミノ酸の１つの側鎖基から分枝状となるように結合されたアミノ酸（または短鎖オリゴペプチド鎖）を含むものであり得る。例えば、ＢがＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎ（あるいは類似の塩基性アミノ酸）である場合、該スペーサーは、グリシル基を含むものであり得る。その場合、このグリシル部分の遊離アミノ基は、例えばリンカー基Ｌがジカルボン酸を含む場合、リンカー基Ｌへの結合に利用可能となる。

２つ以上の単量体リガンド間の分離（該分離は、認識されるように、リンカーＬ、ならびに存在する場合はスペーサー基Ｓ１および／またはＳ２によって構成される）は、両方のリガンドの妨害が回避され、したがって多量体化合物に対する立体障害および受容体親和性の減少が回避されるのに充分長いことが必要である。本発明者らは、驚くべきことに、二量体および多量体に対する高親和性を得るための分離の最適な長さは比較的短く、２つ以上の受容体を架橋（ｂｒｉｄｇｅ）するにはおそらく短すぎる長さであることを見い出した。それにもかかわらず、「二価」相互作用は排除され得るが、親和性の有意な増大が種々の多量体で見られ、これは、ＣＸＣＲ４リガンドの開発に対する本発明のアプローチの有効性を示す。さらなる驚くべき知見は、単量体オリゴペプチドの１つがＣＸＣＲ４受容体に対して親和性が低いかまたはわずかであるが、その他は該受容体に対して高親和性を有する多量体（例えば、二量体）の環状オリゴペプチドの全体としての該受容体親和性が、「高親和性」の単量体単独の親和性と類似しているか、またはより大きいことがあり得るということである。このことは、結合しない第２のオリゴペプチドの存在により、高親和性ペプチドが該受容体に結合する能力が低下し得ると推測されていたため、予想外である。この興味深い知見により、広範囲の官能基を有する残基で構成されたオリゴペプチドを含む多量体が作製できる可能性が導かれ、それにより、該多量体のより多様な誘導体化と官能性付与が可能となる。

該環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有するＰ１またはＰ２の少なくとも一方は、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下で、対応するＰ１またはＰ２単量体のＩＣ５０として測定したとき、ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有するものであり得る。

該環状オリゴペプチド部分は、好ましくは２０個以下のアミノ酸残基、より好ましくは９個以下の残基を含む。好ましい実施形態において、該環状オリゴペプチドはペンタペプチドである。該環状オリゴペプチドは、好ましくはペプチド結合（これは、そのＮ末端とＣ末端の間のものであり得る）によって環化されたものであるが、存在する場合は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって環化されたものであってもよい。該化合物は、該環状オリゴペプチド部分、該リンカーおよびスペーサーに加えて他の部分を含むものであってもよい。したがって、該化合物の薬物動態学的および／または物理化学的特性が改変され得るさらなるペプチド配列または基（例えば、糖類またはポリエチレングリコール鎖などの親水性基）が結合され得る。

特定のある実施形態において、オリゴペプチドＰ１およびＰ２は、好ましくは合成のものである。本発明において、Ｐ１とＰ２の少なくとも一方がＣＸＣＲ４に、対応する単量体として、２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは５０ｎＭ以下の親和性（ＩＣ５０）で結合することが好ましい。用語「ＩＣ５０」は、ＣＸＣＲ４発現細胞に対する放射性標識参照ペプチド^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の結合を、最大結合の５０％まで低下させるのに必要とされる試験化合物の濃度をいう。当業者なら、所与の化合物のＩＣ５０を容易に決定することができよう。その方法は後述する。本発明の化合物はＣＸＣＲ４受容体に、該受容体を活性化せずに結合するものであり得る（すなわち、アンタゴニスト特性）。あるいはまた、本発明の化合物は、該受容体の内因性リガンドと競合するが、該受容体を低度に活性化するものであり得る（すなわち、部分アゴニスト特性）。さらなる代替として、本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４受容体に結合し、その後のシグナル伝達をベースラインより低い非活性化レベルまで低下させるものであり得る（すなわち、負の効力、または逆アゴニスト特性）。特定のある好ましい実施形態において、本発明の化合物はＣＸＣＲ４受容体に、該受容体を活性化せずに結合する。他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４において充分なアゴニスト特性を有するリガンドを含まない。

本明細書で用いる場合、表現「（Ｍｅ）Ｘａａ」は、アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体を意味する。表現「Ｘａａ（置換基）」は、アミノ酸の側鎖が、表示した置換基で誘導体化されていることを意味する。表現「Ｘａａ／（Ｍｅ）Ｘａａ」は、記載のアミノ酸がメチル化されていないものであってもよく、Ｎ^α−メチル基を有するものであってもよいことを意味する。本明細書で用いるアミノ酸の略号は、「Ｄ−Ｘａａ」という表現（この場合、Ｄエナンチオマーを表す）が使用されていない限り、それぞれのアミノ酸のＬ−エナンチオマーを示す。用語「塩基性アミノ酸」は、本明細書で用いる場合、通常の生理学的条件下でプロトンを受容して正電荷を有するものとなり得る側鎖を有する天然または合成の（好ましくは天然の）アミノ酸を表す。したがって、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、ヒスチジン、Ｄａｐ（２，３−ジアミノプロピオン酸）およびＤａｂ（２，４−ジアミノ酪酸）が挙げられる。好ましい塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、シトルリン、オルニチンおよびヒスチジンであり、より好ましくはアルギニンおよびオルニチンである。

特定のある実施形態において、Ｐ１および／またはＰ２内のモチーフは、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体である場合、Ｂ−Ａｒｇである。Ｐ１およびＰ２の各々が、該環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有するものであってもよい。

本発明の第１の態様の特別な実施形態において、Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は、配列：
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｂ−Ａｒｇ／（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｚ−（Ａｌａ）_ｎ−Ｘ］
（式中：
Ｂは上記に規定のとおりであるが、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体であるとき、該モチーフはＢ−Ａｒｇであるものとし；
Ｚは、側鎖内に芳香族基を含むアミノ酸であり；
ｎは１または０であるが、ただし、該環状部分の配列内の先の４つのアミノ酸がＤ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌであり、ＮａｌがＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであるときのみ、ｎが１であるものとし；そして
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される）を有する環状オリゴペプチドから選択される。

Ｚは、Ｎａｌ、Ｄａｐ（ＦＢ）、ＡＭＳ（ＦＢ）（アミノオキシセリン（Ｏ−アミノセリン）と４−フルオロベンズアルデヒドのオキシム）から選択され得、Ｂが（Ｍｅ）Ａｒｇである場合、（Ｍｅ）Ｎａｌである。Ｚは、好ましくはＮａｌである。

Ｘは、好ましくは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）およびＤａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される。Ｘは、好ましくはＧｌｙまたはＤａｐ（ＦＰ）である。

Ｂは、好ましくは塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、好ましくは、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、ＣｉｔおよびＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、またはそのＮ−置換誘導体から選択される。特に好ましいのは、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、ＣｉｔおよびＨｉｓ、またはそのＮ−置換誘導体である。最も好ましくは、Ｂは、ＡｒｇまたはＯｒｎである。オルニチン残基は、アミノ含有側鎖が比較的直接的に誘導体化されるという利点をもたらす。特定のある実施形態において、Ｂは、Ｍｅ基でＮ^α−置換されたものであり得る。好ましくは、環状オリゴペプチド部分内のＭｅ基でＮ^α−置換された残基は１個以下である。

ＢがＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎである場合、オルニチン残基は、Ｎ^δにおいて１つまたは２つの基で置換されたものであり得、該基は、フルオロベンゾイル（ＦＢ）、フルオロプロピオニル（ＦＰ）、アセチル（Ａｃ）、アミド（Ａｍ）（すなわち、尿素型部分が形成されるように）、メチル（Ｍｅ）、１−ナフチルメチル（Ｎ１）、２−ナフチルメチル（Ｎ２）、ベンジル（Ｂｚ）およびアシルスペーサー部分から選択され得る。好ましくは、該アシルスペーサー部分は、１〜１４個の炭素の鎖を含み、ヘテロ原子により任意選択で分断され、好ましくは、該オルニチンのＮ^δに対して遠位の末端に求核性官能基を有するアシル基である。該求核性官能基は、例えば、アミノ基またはヒドロキシル基であり得る。この基によって、さらなる部分が該スペーサーの末端に付加されることが可能になり、該スペーサーの目的は、該環状オリゴペプチドのＣＸＣＲ４結合能力に対する任意のさらなる基の効果を最小限に抑えることである。該アシルスペーサー部分は、アミノヘキサノイル（Ａｈｘ）、トリエチレングリコールアミノアシル（ＴＧＡＳ、すなわち、−ＣＯＣＨ_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨ_２）、（Ａｈｘ）_２、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２および（ＴＧＡＳ）_３から選択され得る。このようなスペーサーの多量体が存在する場合、その繰返し単位は、アミド結合によってともに連接されている。本発明において好ましいスペーサー基は、Ａｈｘ、ＴＧＡＳ、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２および（ＴＧＡＳ）_３である。オルニチンに関して記載したアシルスペーサー部分などの置換基は、ＢがＬｙｓ、ＤａｐまたはＤａｂである場合にも使用され得る。かかる場合において、該スペーサー部分は、好ましくは、該オリゴペプチドに対する結合点に対して遠位の末端（すなわち、ＢがＬｙｓである場合は、Ｎ^ε）に求核性官能基を有する。オリゴペプチドＰ１および／またはＰ２が、残基ＢによってリンカーＬあるいはスペーサーＳ１および／またはＳ２に連接されている状況下では、上記のアシルスペーサー部分がリンカー基Ｌあるいはスペーサー部分Ｓ１および／またはＳ２として使用され得ることは認識されよう。

特定のある実施形態において、Ｂは、Ｎ^αにおいてＭｅ基で置換されたＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎ（好ましくはＤ−Ｏｒｎ）である。ＢがＯｒｎである場合、これは、Ｎ^δにおいてＦＢ、ＦＰ、Ａｃ、Ａｍ、Ｎ１、Ｎ２、ＭｅとＮ１、ＭｅとＮ２、Ｂｚ、ＢｚとＦＢ、ＢｚとＦＰ、ＭｅとＦＢ、ＭｅとＦＰ、またはＭｅで置換されていてもよい。

また他の実施形態において、Ｂは、Ｎ^δにおいてＦＢ、ＦＰ、ＭｅとＦＢ、またはＭｅとＦＰで置換され、任意選択でＮ^αにおいてＭｅ基で置換されたＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎ（好ましくはＤ−Ｏｒｎ）である。この場合の好ましい置換基は、ＦＢ、およびＭｅとＦＢであり、任意選択で、Ｍｅ基によるＮ^αの置換との組合せである。

該環状オリゴペプチド部分は、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｂ−Ａｒｇ−Ｚ−Ｘ］（式中、Ｂ、ＺおよびＸは上記に列挙した選択肢から選択されるが、ただし、Ｎ^α−メチル化され得るのは前記配列内の残基の１つ以下であるものとする）を有するものであり得る。好ましくは、かかる実施形態において、ＢはＡｒｇである。あるいはまた、該環状オリゴペプチド部分は、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｂ−Ａｒｇ／（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｚ−Ｘ］（式中、ＺおよびＸは、上記に列挙した選択肢から選択され、Ｂは、Ａｒｇ、（Ｍｅ）Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｏｒｎ（ＦＢ）、Ｏｒｎ（ＦＰ）、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｏｒｎ（Ａｍ）、Ｏｒｎ（Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ、ＦＢ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ_２）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ_３）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_２）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_３）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、ＨｉｓおよびＰｈｅから選択されるが、ただし、Ｎ^α−メチル化され得るのは前記配列内の残基の１つ以下であるものとする）を有するものであり得る。かかる実施形態において、最初の残基は好ましくはＤ−Ｔｙｒである。また、かかる実施形態において、Ｚは好ましくはＮａｌである、また、かかる実施形態において、Ｘは好ましくはＧｌｙである。また、かかる実施形態において、３番目の残基は好ましくはＡｒｇである。

好ましい具体的な実施形態において、環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は、
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−（Ｍｅ）Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｉｔ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−（Ｍｅ）Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ｍｅ）Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ］
シクロ［（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＰ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｍ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｄａｐ（ＦＰ）］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｂｚ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｂｚ，ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｈｘ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｈｘ_３）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_３）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ｃｉｔ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
から選択される配列を有する。

より具体的には、環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は、
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｉｔ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＰ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｍ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
から選択される配列を有するものであり得る。

特別な実施形態において、環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方が、シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］およびシクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を除く上記に列挙したもののいずれかから選択される配列を有する。

特定のある実施形態において、環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は、
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
から選択される配列を有する。

好ましい実施形態において、環状オリゴペプチドＰ１とＰ２は同じである。かかる実施形態において、環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の各々は、上記に列挙して示したものから選択される配列を有するものであり得る。

本発明の特別な化合物において、Ｐ１および／またはＰ２は、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を有する。本発明の他の特別な化合物において、Ｐ１および／またはＰ２は、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を有する。

本発明の第１の態様の実施形態において、リンカー部分Ｌは少なくとも３つの官能基を含み、そのうちの２つが該環状オリゴペプチドまたはスペーサー部分の結合に適したものであり、そのうちの１つが検出可能な標識または細胞傷害性部分またはさらなるリンカー部分の結合に適したものである。

かかる「三官能性」（またはより高度に官能性付与された）リンカーを含む化合物により、２つのオリゴペプチド部分＋特定の官能性を有するさらなる基の容易な結合が可能になる。例えば、リンカーＬ上の第３の官能基は、転移の可能性を有する腫瘍およびそれに伴う転移（かかる組織によるＣＸＣＲ４の比較的高い発現の結果）の目的の化学療法のための細胞傷害性化合物の結合に使用され得る。好ましい細胞傷害性部分は、関係する腫瘍の化学療法に一般的に使用されている任意の細胞傷害性化合物から選択され得る。

あるいはまた、該第３の官能基は、標的化放射線療法または診断的画像化のための（例えば、キレート化放射性核種によって）放射性標識の結合に使用され得る。さらに、リンカーＬ上には、該化合物の親和性および特異性を増大させるために、さらなる環状オリゴペプチド部分を結合させるためのさらなる官能基が使用されることがあり得る。多種多様なリンカーＬが使用され得、該リンカーは、例えば、ペプチド系官能基の場合、多数の官能基を含むものであり得る。したがって、本質的に、リンカーＬに連接させ得る環状オリゴペプチドまたはスペーサー基の数（すなわち、ｐとｒの値）に上限はない。

さらに、多官能性リンカー（例えば、ペプチド）上の該さらなる官能基は、各々が２つ以上の環状オリゴペプチドを有する多数のリンカーを互いにカップリングさせるのに使用され得る。この様式では、高次多量体（およびデンドリマー）が作製され得る。かかる化合物において、ｔは１より大きいことは認識されよう。特定のある実施形態において、ｔは、１〜１００、例えば、１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜８または１〜４などであり得る。

本発明の化合物において、リンカー部分Ｌは、ジカルボン酸、アミノ酸、線状オリゴペプチド、アルキン、ジオキシム（例えば、ジアルデヒド含有リンカー基と、１つ以上のアミノオキシ基（アミノオキシアセチルなど）を含むように（例えば、ペンダント（ｐｅｎｄａｎｔ）アミノ基において）誘導体化された環状オリゴペプチドとの反応によって形成されるもの）、ポリ（アルキレングリコール）、カルボン酸−および／またはアミノ−置換ポリ（アルキレングリコール）、糖類、アミノ修飾型糖類、ポリアミンおよびオリゴ−またはポリ−アミノオキシ官能性付与された種（ｐｏｌｙ−ａｍｉｎｏｏｘｙ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）（官能性付与されたペプチドもしくは樹脂など）から選択される基を含むものであり得る。該リンカーは該環状オリゴペプチドに、アミノ酸の非修飾側鎖基（例えば、オルニチンもしくはリシンのペンダントアミノ基、あるいはチロシンの−ＯＨ基）を用いて、または修飾側鎖基（例えば、リシンもしくはオルニチンのアミノオキシ含有側鎖基など）によって結合され得る。また、含硫アミノ酸（システインなど）が該環状オリゴペプチドに含まれる場合、チオ基は、マレイミド、α−ハロケトンまたはα−ハロアミド官能基を含むリンカー（またはスペーサー基）とのチオエーテル結合の形成に使用され得る。また、含硫アミノ酸（システインなど）は、得られたペプチドをより複雑な系にカップリングさせる別の可能な官能基（例えば、ブロモエチルアミン）を有するハロゲン化アルカンによって修飾されたものであってもよい。

リンカーＬは、特定のある実施形態において、一連の繰返し単位を含むものであり得ることは認識されよう。したがって、Ｌは、各残基が該環状オリゴペプチドまたはスペーサーあるいは検出可能な標識または細胞傷害性部分の結合のための官能基を含む短鎖ホモポリペプチドを含むものであり得る。同様に、リンカーＬは、２つ以上の一連の単量体単位で構成されたものであり得る。リンカーが２つのかかる単量体単位で構成されている場合、各単量体単位は、その官能基の１つ以上にカップリングされた１つ以上の環状オリゴペプチドを有するが、各単量体単位の少なくとも１つの官能基は他方の単量体単位に連接されている。リンカーが３つ以上の（ｔｈｒｅｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）かかる単量体単位で構成されている場合、本発明の範囲に含まれる化合物全体として、かかる単位すべてが環状オリゴペプチドに連接されている必要はないことは認識されよう。懸念を回避するため、単量体単位は環状オリゴペプチドを１つだけ有するものであり得るが最終化合物は２つ以上の環状オリゴペプチドを有する単量体単位で構成されたリンカーＬを含む化合物が本発明の範囲の含まれるものとすることを強調しておく。

好ましい実施形態において、該化合物は検出可能な標識または細胞傷害性部分を含む。検出可能な標識または細胞傷害性部分は、リンカー部分Ｌに直接または間接的に共有結合されたものであり得る。検出可能な標識または細胞傷害性部分はＬに、スペーサー基Ｓ３を介して間接的に結合されていてもよい。Ｓ３は、Ｓ１およびＳ２について上記に規定のものであり得る。特に、該標識は、環状オリゴペプチド部分Ｐ１もしくはＰ２またはリンカーＬに共有結合された錯化剤によって結合され得る（例えば、放射性金属標識の場合）。

検出可能な標識は、好ましくは、蛍光部分、磁性または常磁性部分、または放射性核種から選択される。多くの適用用途では、放射性核種が好ましい。該標識は、好ましくは、さらなる試薬の添加なしで、標識自体からの検出可能な電磁性放射線もしくは他の核放射線の出力によって、またはそれ自体の磁性または常磁性の性質の結果として検出可能なものである。該標識は、場合によっては、該環状オリゴペプチドの１つに直接共有結合されたものであり得る。

スペーサー基Ｓ３が使用される場合、上記のように、該標識および／または錯化剤は、該スペーサーの遠位末端の求核性基によって結合され得る。該リンカーと標識間の間接的結合を容易にする他の中間基は、当業者に自明であろう。

環状ペンタペプチドであるシクロ（Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ）（ＣＰＣＲ４またはＦＣ１３１としても知られる）は、ＣＸＣＲ４に高親和性で結合する。また、これは、例えば、チロシン残基に結合させたヨウ素放射性核種を使用することにより、放射性標識することが比較的容易である。動物での予備試験において、放射性標識ＣＰＣＲ４は、対照腫瘍と比べ、ＣＸＣＲ４＋腫瘍においてほぼ１０倍の蓄積の増大が示された。ＣＰＣＲ４の薬物動態学的特性および他の特性は、アミノ酸残基の修飾によって改変され得る。特に、得られたヘキサペプチドにおけるＡｒｇ残基のＮ−メチル化、Ａｒｇ^２の別のカチオン性アミノ酸（例えば、オルニチン）での置換、ＮａｌとＧｌｙ間へのＡｌａの挿入、およびＴｙｒのＮ−メチル化は、すべて、修飾型ＣＸＣＲ４アンタゴニストをもたらし、該受容体に対する有用な親和性を維持している。本発明の二量体化合物または多量体化合物は、ＣＸＣＲ４受容体に対して親和性がより高く、潜在的特異性がより高い化合物を作製するための上記の知見に基づいたものである。

本発明の特定のある化合物において、放射性標識は、存在する場合、^１８Ｆ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉおよび^１２５Ｉから選択され得る。^１２３Ｉは、該化合物がインビボでのシングルフォトンエミッションＣＴ（ＳＰＥＣＴ）試験に使用される場合、特に有用である。^１２５Ｉは、該化合物のインビトロまたはエキソビボ使用に好ましい場合があり得る。^１８Ｆおよび^１２４Ｉは、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）画像化を使用するインビボ試験に特に有用である。

本発明の化合物が１つ以上のＤａｐ（ＦＢ）、Ｄａｐ（ＦＰ）、Ｄａｂ（ＦＢ）、Ｄａｂ（ＦＰ）、ＦＢまたはＦＰ基を含む場合、フッ素置換基は^１８Ｆであり得る。これは、かかる化合物を放射性標識するための簡便な手段を提示する。この型の好ましい化合物において、^１８Ｆは、ＯｒｎまたはＤ−ＯｒｎのＮ^δにおけるＦＢまたはＦＰ置換基上に存在している。

あるいはまた、放射性標識は、^２１１Ａｔ、^２２５Ａｃ、^２１１Ｂｉおよび^２１２Ｂｉから選択され得る。これらの放射性核種はすべて、本発明の化合物が標的化放射線療法に使用されることを可能にする比較的低レンジのα−放射体である。低レンジの放射により、転移に対するより安全な放射線治療アプローチが提供される。本発明の化合物を用いた原発性腫瘍の放射線療法には、高レンジ（ｌｏｎｇｅｒ−ｒａｎｇｅ）の放射を有する放射性核種を使用することが好ましい場合があり得、したがって、この場合、放射性標識は、低レンジおよび高レンジのβ−放射体、例えば、それぞれ^１７７Ｌｕまたは^９０Ｙ、^１８８Ｒｅおよび^１３１Ｉから選択され得る。

一般に、本発明による使用のための有用な診断用同位体（ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ系検出ならびに画像化用）としては、^１８Ｆ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２ｍＭｎ、^５６Ｎｉ、^５７Ｎｉ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^１９１Ｐｔ、^１９７Ｈｇ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^１１０ｍＩｎ、^１２０Ｉが挙げられる。

一般に、本発明による使用のための有用な治療用同位体としては、^３２Ｐ、^６７Ｃｕ、^７７Ａｓ、^９０Ｙ、^９９Ｍｏ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１４ｍＩｎ、^１１７ｍＳｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４０Ｎｄ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｔｂ、^１４９Ｐｍ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１６６Ｄｙ、^１６９Ｅｒ、^１６９Ｙｂ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２５Ａｃが挙げられる。

本発明の特定のある化合物において、放射性標識は該リンカーまたは環状オリゴペプチドに、有機錯化剤と放射性核種との錯体によって結合されており、該錯体は該化合物の残部に、ＣＸＣＲ４受容体での結合特性が破壊されないような様式で結合されている。かかる実施形態において、錯化剤は、好ましくは、該リンカーまたは環状オリゴペプチド（最も好ましくはリンカー）に共有結合されているが、放射性標識は錯化剤に共有結合されていても非共有結合されていてもよい。

錯化剤の使用により、本発明の化合物に結合され得る放射性核種の範囲が広がる。好ましい錯化剤としては、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−四酢酸）およびその誘導体、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）ならびにＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）が挙げられる。錯化剤は、本発明の化合物の環状オリゴペプチドのアミノ酸の適切な側鎖に結合され得るか、または一般的には本発明の化合物の環状オリゴペプチドのアミノ酸の適切な側鎖に結合されているリンカー基に結合され得る、すなわち、該化合物のＣＸＣＲ４結合特性の破壊が最小限となるように結合され得る。あるいはまた、上記のように、介在スペーサー基Ｓ３が使用されることがあり得る。特別な実施形態において、アミノ酸（特に、合成アミノ酸）が、錯化剤を本発明の化合物に連接するためのリンカー基として使用され得る。例えば、Ａｈｘ基は、錯化剤（例えば、ＤＯＴＡ）のペンダントカルボン酸基に連接され、それにより、本発明の化合物にカップリングのための遠位ペンダント酸基が、直接または酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸基）などのさらなる基のいずれかによって提供され得る。かかる場合において、アスパラギン酸基の残りの遊離の二酸は、２つの環状オリゴペプチド単量体間のリンカーＬとしての機能を果たし得る。

また、本発明の化合物を、１つ以上の親水性部分（例えば、炭水化物またはポリエチレングリコール鎖）の付加によって修飾することも可能である。かかる修飾は、インビボでの該化合物の薬物動態を改善するために使用され得る。例えば、本発明の炭水化物修飾型ペプチド含有化合物は、肝臓内取込みの減少を示すことが予測され、したがって、親油性ペプチドと比べ、投与後、いくらかの血中クリアランスの遅延および主として腎臓での排出を示すはずである。これにより、画像を投与直後に得ることができ、かつＣＸＣＲ４陽性とＣＸＣＲ４陰性組織とのコントラストがよりはっきりすることが予測される画像が得られる。

本発明の第５の態様の態様によれば、上記の第１、第２、第３または第４の態様に記載の本発明の化合物を、１種類以上の薬学的に許容され得る賦形剤とともに含む医薬組成物が提供される。好ましくは、該組成物は、注射に適したものである。

本発明の医薬組成物は、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る塩もしくはエステルのいずれかを、薬学的に許容され得る任意の担体、佐剤またはビヒクルとともに含むものである。意図される製剤および投与経路に応じて本発明の医薬組成物に使用され得る薬学的に許容され得る担体、佐剤およびビヒクルとしては、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩など）、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入噴霧、直腸、鼻、口腔内、膣または埋入レザバーによって投与されるものであり得る。上記のように、非経口投与が好ましい。本発明の医薬組成物には、慣用的な無毒性の薬学的に許容され得る任意の担体、佐剤またはビヒクルが含有され得る。本明細書で用いる非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内および頭蓋内注射または注入手法を含む。ほとんどの適用では、静脈内または病変内（例えば、腫瘍内）注射が想定される。

医薬組成物は、例えば、滅菌注射用の水性または油性懸濁剤としての滅菌注射用調製物の形態であってもよい。このような懸濁剤は、当該技術分野で知られた手法に従い、適当な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０など）および懸濁化剤を用いて製剤化され得る。また、滅菌注射用調製物は、無毒性の非経口に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液剤または懸濁剤（例えば、１，３−ブタンジオール中の液剤として）であってもよい。中でも、使用され得る許容され得るビヒクルおよび溶媒は、マンニトール溶液、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌された固定油も、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用されている。この目的のためには、任意の無刺激性固定油、例えば、合成モノ−またはジグリセリドが使用され得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は注射用剤の調製に有用であり、かかる脂肪酸は、天然の薬学的に許容され得る油（オリーブ油またはヒマシ油など）、特にそのポリオキシエチル化形態である。また、このような油性液剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤（Ｐｈ．Ｈｅｌｖに記載のものなど）または同様のアルコールも含有するものであってもよい。

本発明の医薬組成物は、経口に許容され得る任意の投薬形態で、例えば限定されないが、カプセル剤、錠剤、ならびに水性懸濁剤および液剤で経口投与されるものであり得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用されている担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた、通常添加される。カプセル剤の形態での経口投与では、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤を経口投与する場合、活性成分を乳化剤および懸濁化剤と合わせる。所望により、ある種の甘味剤および／または矯味矯臭剤および／または着色剤を添加してもよい。

また、本発明の医薬組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与されるものであり得る。このような組成物は、本発明の化合物を、室温で固形であるが直腸温度では液状となり、したがって直腸内で融解して活性成分を放出する適当な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製され得る。かかる物質としては、限定されないが、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、鼻エーロゾル剤または吸入によって投与されるものであり得る。かかる組成物は、医薬用製剤の技術分野でよく知られた手法に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存料、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野で知られた他の可溶化剤もしくは分散剤を使用し、生理食塩水中の液剤として調製され得る。

本発明の第３の態様によれば、環状オリゴペプチドＰ１およびＰ２、リンカーＬならびに、任意選択でスペーサーＳ１および／またはＳ２を、該オリゴペプチドの官能基が、リンカーＬの官能基あるいは、存在する場合はスペーサーＳ１および／またはＳ２の官能基と反応し、該スペーサーのその他の官能基がリンカーＬの官能基と反応するような条件下で合わせることを含む、第１の態様による化合物の合成方法が提供される。

当業者には理解され、また上記に示唆され得るように、さまざまな官能基、例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アミド、グアニジノ、チオール、アルキン、アミノオキシおよびかかる基の活性化型誘導体（例えば、カルボキシル基の活性化型エステル）が好適であり得る。当業者であれば、スペーサーおよび選択した環状オリゴペプチドの官能基への結合に適切な官能基を有するリンカーを容易に選択することができよう。また、該オリゴペプチドの種々の基の保護および活性化に対するアプローチは、当業者の周知の一般知識の範囲内であろう。

該方法は、さらに、任意選択でスペーサー基Ｓ３を有する細胞傷害性部分または検出可能な標識を、該細胞傷害性部分もしくは該検出可能な標識上の官能基または存在する場合はスペーサー基Ｓ３の官能基が、リンカーＬあるいは環状オリゴペプチドＰ１および／またはＰ２上の官能基と反応するように導入することを含むものであってもよい。

好ましい実施形態において、環状オリゴペプチドおよび／またはスペーサー基Ｓ１および／またはＳ２とリンカーＬとの反応に使用される条件は、該細胞傷害性部分もしくは該検出可能な標識または存在する場合はスペーサーＳ３とリンカーＬまたは該環状オリゴペプチドとの反応に使用される条件と異なる。環状オリゴペプチドあるいはスペーサーＳ１および／またはＳ２の結合と、該細胞傷害性部分、該検出可能な標識またはスペーサーＳ３の結合に対して異なる官能基を選択することにより、保護および脱保護化学反応は、該構築物全体を形成する２つの段階で異なることがあり得る。換言すると、該細胞傷害性部分、該検出可能な標識もしくはＳ３（またはこれらの成分の官能基）の結合のためのリンカーの官能基が、Ｐ１、Ｐ２もしくはＳ１、Ｓ２（またはこれらの成分の官能基）の結合のためのリンカーの官能基の脱保護に適した条件下で保護されたままであり得る、直交した（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）アプローチが使用され得る。後者の官能基は、脱保護されると、Ｐ１、Ｐ２もしくはＳ１、Ｓ２（またはＰ１、Ｐ２、Ｓ１、Ｓ２の官能基が脱保護を必要とする保護された種である場合は該リンカー）と、これらの成分が該細胞傷害性部分、該標識またはＳ３と直接結合することなく、該リンカー自体が種々の成分の結合に対して異なる官能基を含む場合は、おそらくＰ１、Ｐ２、Ｓ１またはＳ２が該細胞傷害性部分、該検出可能な標識またはＳ３の結合のためのリンカーの官能基に結合することなく、反応することができる（場合によっては活性化工程を含む）。当業者であれば、該官能基に適した保護、脱保護および必要であれば活性化の条件を容易に決定することができよう。かかる保護基の付加および除去の方法は、具体的な分子の型または保護対象の基に関して慣用的に使用され得るもの、例えば、Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ（２００４）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ．第４版．Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇなどの合成方法論の標準的な参考資料に記載された方法である。

また、第４の態様において、本発明は、治療または診断における使用のための本発明の第１の態様による化合物を提供する。

また、関連する態様において、本発明は、新形成状態の処置のための医薬の調製における本発明の第１の態様による化合物の使用を提供する。同様に、新形成状態の処置および／または診断における使用のための本発明の第１の態様による化合物もまた提供する。

ＣＸＣＲ４受容体をブロックすることにより、特に、適切な放射性核種または細胞傷害性成分を、ＣＸＣＲ４受容体を有する組織に標的化させることと組み合わせると、転移の可能性を有する新形成の比較的選択的な化学療法を提供することが可能なはずである。また、かかる腫瘍に起因する転移または循環腫瘍細胞はいずれも、標的化された該放射性核種または細胞傷害性成分によって標的化されるはずである。

また、本発明は、新形成状態の診断的画像化のための医薬の調製における使用であって、該化合物が検出可能な標識を含む、本発明の第１の態様による化合物の使用を提供する。

本発明の化合物の使用の特定のある実施形態において、新形成は、転移の可能性を有するか、または有することが疑われるものである。新形成状態は、特に、乳癌または前立腺癌であり得る。

また、新形成を有するか、または有することが疑われる被験体に、本発明の第１の態様による化合物を投与する工程、およびインビボでの該化合物の分布後に該化合物を検出する工程を含み、該化合物が検出可能な標識を含む、新形成組織の画像化方法を提供する。該方法は、該検出する工程の後、検出された化合物の画像を生成するさらなる工程を含むものであってもよい。

上記のように、本発明の第１の態様の化合物は、検出可能な標識を有する場合、ＣＸＣＲ４受容体を有し、したがって転移の可能性を有する細胞の選択的検出および画像化のための高度に有用なツールを提供する。該化合物は常套的な方法（例えば、ｉ．ｖ．注射）によって投与され得、短時間（この段階までに、比較的高発現のＣＸＣＲ４を有するあらゆる組織は検出可能な本発明の化合物の相対濃度を示す）の後に患者の画像が撮影され得る。

検出工程は、特に、標識が放射性核種である場合ではＰＥＴまたはシングルフォトンエミッションＣＴ（ＳＰＥＣＴ）を用いて行なわれ得る。磁性または常磁性標識が使用される場合は、磁気共鳴画像法が好ましい。

本発明は、さらに、新形成の細胞の転移の可能性を判定する方法であって、該細胞を本発明の第１の態様による化合物に、該化合物が該細胞の表面上のＣＸＣＲ４受容体に結合することが可能となるように曝露する工程、未結合化合物を該細胞の近傍から除去する工程、ならびに該細胞に結合された該化合物の存在および／または量を測定する工程を含む方法を提供する。前記の細胞の転移の可能性の判定方法は、インビボまたはインビトロで（すなわち、患者から採取された細胞もしくは組織の試料を用いて）行なわれ得る。

細胞の転移の可能性の判定方法が、検出可能な標識を有する本発明の第１の態様による化合物を用いて行なわれる場合、結合された該化合物の画像化あるいは存在および／または量の測定は、特に、標識が放射性核種である場合では、ＰＥＴまたはシングルフォトンエミッションＣＴ（ＳＰＥＣＴ）を用いて行なわれ得る。磁性または常磁性標識が使用される場合は、磁気共鳴画像法が好ましい。

本発明の化合物における使用のための他の検出可能な標識としては、蛍光成分（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ローダミン）が挙げられる。

さらに、本発明は、また別の態様において、被験体の、転移の可能性を有するか、または有することが疑われる新形成状態の処置方法であって、該被験体に本発明の第１の態様による化合物、または上記の組成物を投与することを含む方法を提供する。特定のある実施形態において、新形成状態は乳癌または前立腺癌であり得る。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
構造：
［（Ｐ１−Ｓ１_ｊ）_ｐ−Ｌ−（Ｓ２_ｑ−Ｐ２）_ｒ］_ｔ
を含む化合物、またはその薬学的に許容され得る塩もしくはエステルであって、式中：
Ｐ１およびＰ２は、同じであっても異なっていてもよく、環状オリゴペプチド部分であり、Ｐ１とＰ２の少なくとも一方は該環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有し、ここで、Ｂは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンもしくはその誘導体であり；
Ｓ１およびＳ２は、同じであっても異なっていてもよいスペーサー基であり；
Ｌは、該環状オリゴペプチドまたはスペーサー基の結合のための少なくとも２つの官能基を含むリンカー部分であり；
ｊおよびｑは、独立して０または１であり；
ｐおよびｒは独立して、１以上の整数であり；そして
ｔは、１以上の整数であり、
ただし、ｔ、ｐまたはｒが１より大きいとき、該環状オリゴペプチド部分、スペーサー基および／またはｊもしくはｑの値は、多数の該（Ｐ１−Ｓ１_ｊ）部分または多数の該（Ｓ２_ｑ−Ｐ２）部分間で同じであっても異なっていてもよいものとする、
化合物、またはその薬学的に許容され得る塩もしくはエステル。
（項目２）
前記スペーサー基Ｓ１およびＳ２が１〜２０個の炭素原子のアルキル鎖を含み、該アルキル鎖は、分枝鎖または非分枝鎖、置換または非置換であり得、１つ以上のヘテロ原子、環式基および／または複素環式基で分断されていてもよく、前記環状オリゴペプチドおよびリンカーＬの結合に適した少なくとも２つの官能基を有するものであり得る、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｓ１およびＳ２の前記アルキル鎖が１〜１４個の炭素原子を含む、項目２に記載の化合物。
（項目４）
Ｓ１およびＳ２の前記アルキル鎖が４〜１０個の炭素原子を含む、項目３に記載の化合物。
（項目５）
前記環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有するＰ１またはＰ２の少なくとも一方が、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下で、対応するＰ１またはＰ２単量体のＩＣ５０として測定したとき、ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
（項目６）
Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体であるとき、前記モチーフはＢ−Ａｒｇであるものとする、項目１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
（項目７）
Ｐ１とＰ２の各々が前記環状部分内にＢ−ＡｒｇまたはＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇモチーフを有する、項目１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
（項目８）
Ｐ１とＰ２の少なくとも一方が、配列：
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｂ−Ａｒｇ／（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｚ−（Ａｌａ）_ｎ−Ｘ］
を有する環状オリゴペプチドから選択され、式中：
Ｂは、項目１に規定のとおりであるが、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体であるとき、前記モチーフはＢ−Ａｒｇであるものとし；
Ｚは、側鎖内に芳香族基を含むアミノ酸であり；
ｎは１または０であるが、ただし、該環状部分の配列内の先の４つのアミノ酸がＤ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌであり、ＮａｌがＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであるときのみ、ｎが１であるものとし；そして
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される、
項目１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
（項目９）
Ｚが、Ｎａｌ、Ｄａｐ（ＦＢ）またはＡＭＳ（ＦＢ）（アミノオキシセリンと４−フルオロベンズアルデヒドのオキシム）から選択される、項目８に記載の化合物。
（項目１０）
Ｂが、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、ＣｉｔおよびＨｉｓ、またはそのＮ−置換誘導体から選択される、項目１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１１）
Ｂが、Ｍｅ基でＮ^α−置換されている、項目１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１２）
ＢがＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎであり、該オルニチン残基が、Ｎ^δにおいて、フルオロベンゾイル（ＦＢ）、フルオロプロピオニル（ＦＰ）、アセチル（Ａｃ）、アミド（Ａｍ）、Ｍｅ、１−ナフチルメチル（Ｎ１）、２−ナフチルメチル（Ｎ２）、ベンジル（Ｂｚ）およびアシルスペーサー部分から選択される１つまたは２つの基で置換されており、該アシルスペーサー部分は、１〜１４個の炭素の鎖を含み、ヘテロ原子により任意選択で分断され、該オルニチンのＮ^δに対して遠位の末端に求核性官能基を有するアシル基である、項目８〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１３）
前記アシルスペーサー部分が、アミノヘキサノイル（Ａｈｘ）、トリエチレングリコールアミノアシル（ＴＧＡＳ）、（Ａｈｘ）_２、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２および（ＴＧＡＳ）_３から選択される、項目１２に記載の化合物。
（項目１４）
Ｂが、Ｎ^αにおいてＭｅ基で置換されたＤ−Ｏｒｎである、項目１２に記載の化合物。
（項目１５）
Ｂが、Ｎ^δにおいて、ＦＢ、ＦＰ、Ａｃ、Ａｍ、Ｎ１、Ｎ２、ＭｅとＮ１、ＭｅとＮ２、Ｂｚ、ＢｚとＦＢ、ＢｚとＦＰ、ＭｅとＦＢ、ＭｅとＦＰ、またはＭｅで置換されたＯｒｎである、項目１２に記載の化合物。
（項目１６）
Ｂが、Ｎ^δにおいて、ＦＢ、ＦＰ、ＭｅとＦＢ、またはＭｅとＦＰで置換され、任意選択でＮ^αにおいてＭｅ基で置換されたＤ−Ｏｒｎである、項目１２に記載の化合物。
（項目１７）
前記環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方が、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｂ−Ａｒｇ−Ｚ−Ｘ］を有し、式中、Ｂ、ＺおよびＸは、項目８に規定のとおりであるが、ただし、Ｎ^α−メチル化され得るのは該配列内の残基の１つ以下であるものとする、
項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１８）
ＢがＡｒｇである、項目１７に記載の化合物。
（項目１９）
前記環状オリゴペプチド部分の少なくとも一方が、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｂ−Ａｒｇ／（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｚ−Ｘ］を有し、式中、ＺおよびＸは、項目８に規定のとおりであり、Ｂは、Ａｒｇ、（Ｍｅ）Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｏｒｎ（ＦＢ）、Ｏｒｎ（ＦＰ）、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｏｒｎ（Ａｍ）、Ｏｒｎ（Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ，ＦＢ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ_２）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ_３）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_２）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_３）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、ＨｉｓおよびＰｈｅから選択されるが、ただし、Ｎ^α−メチル化され得るのは該配列内の残基の１つ以下であるものとする、項目１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２０）
最初の残基がＤ−Ｔｙｒである、項目１９に記載の化合物。
（項目２１）
３番目の残基がＡｒｇである、項目１９または項目２０に記載の化合物。
（項目２２）
ＺがＮａｌである、項目１７〜２１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２３）
ＸがＧｌｙである、項目１７〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２４）
前記環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方が、
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−（Ｍｅ）Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｉｔ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−（Ｍｅ）Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ｍｅ）Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ］
シクロ［（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＰ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｍ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｄａｐ（ＦＰ）］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｂｚ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｂｚ，ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｈｘ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｈｘ_３）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_３）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ｃｉｔ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
から選択される配列を有する、項目１〜２３のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２５）
前記環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方が、
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｉｔ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＰ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ａｍ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ２）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
から選択される配列を有する、項目２４に記載の化合物。
（項目２６）
前記環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の少なくとも一方が、
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］
から選択される配列を有する、項目２５に記載の化合物。
（項目２７）
Ｐ１とＰ２が同じである、項目１〜２６のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２８）
前記環状オリゴペプチド部分Ｐ１とＰ２の各々が、項目２４に列挙して示したものから選択される配列を有する、項目２４に記載の化合物。
（項目２９）
Ｐ１およびＰ２が、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を有する、項目２７または２８に記載の化合物。
（項目３０）
Ｐ１およびＰ２が、配列：シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を有する、項目２７または２８に記載の化合物。
（項目３１）
前記リンカー部分Ｌが少なくとも３つの官能基を含み、そのうちの２つが前記環状オリゴペプチドまたはスペーサー部分の結合に適したものであり、そのうちの１つが検出可能な標識または細胞傷害性部分の結合に適したものである、項目１〜３０のいずれか１項に記載の化合物。
（項目３２）
前記リンカー部分Ｌが、ジカルボン酸、アミノ酸、線状オリゴペプチド、アルキン、ジオキシム、ポリ（アルキレングリコール）、カルボン酸−および／またはアミノ−置換ポリ（アルキレングリコール）、糖類、ポリアミンおよび官能性付与されたペプチドもしくは樹脂などのオリゴ−またはポリ−アミノオキシ−官能性付与された種から選択される基を含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目３３）
検出可能な標識または細胞傷害性部分を含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
（項目３４）
前記リンカー部分Ｌに直接または間接的に結合された検出可能な標識または細胞傷害性部分を含む、項目３１〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
（項目３５）
前記検出可能な標識または細胞傷害性部分がＬに、スペーサー基Ｓ３を介して間接的に結合されている、項目３４に記載の化合物。
（項目３６）
Ｓ３が、項目２のＳ１およびＳ２について規定されるとおりである、項目３５に記載の化合物。
（項目３７）
検出可能な標識として放射性標識を含む、項目３３〜３６のいずれか１項に記載の化合物。
（項目３８）
前記放射性標識が、放射性核種と有機錯化剤との錯体の形態である、項目３７に記載の化合物。
（項目３９）
１つ以上のＤａｐ（ＦＢ）、Ｄａｐ（ＦＰ）、ＦＢまたはＦＰ基を含み、該フッ素置換基の１つが^１８Ｆである、項目１〜３８のいずれか１項に記載の化合物。
（項目４０）
^１８Ｆが、ＯｒｎまたはＤ−ＯｒｎのＮ^δにおけるＦＢまたはＦＰ置換基上に存在する、項目３９に記載の化合物。
（項目４１）
^１８Ｆ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２ｍＭｎ、^５６Ｎｉ、^５７Ｎｉ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１９１Ｐｔ、^１９７Ｈｇ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^１１０ｍＩｎ、^１２０Ｉから選択される放射性標識を有する、項目３７に記載の化合物。
（項目４２）
前記錯化剤が、前記環状オリゴペプチドまたはリンカー部分Ｌの一方にスペーサー基Ｓ３によって結合されている、項目３８に記載の化合物。
（項目４３）
前記放射性標識が、^３２Ｐ、^６７Ｃｕ、^７７Ａｓ、^９０Ｙ、^９９Ｍｏ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１４ｍＩｎ、^１１７ｍＳｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４０Ｎｄ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｔｂ、^１４９Ｐｍ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１６６Ｄｙ、^１６９Ｅｒ、^１６９Ｙｂ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２５Ａｃから選択される、項目３７に記載の化合物。
（項目４４）
前記放射性標識が、^９０Ｙ、^１８８Ｒｅおよび^１３１Ｉから選択される
、項目４３に記載の化合物。
（項目４５）
１つ以上の親水性部分の結合によって修飾されたものである、項目１〜４４のいずれか１項に記載の化合物。
（項目４６）
前記１つ以上の親水性部分が前記リンカー基Ｌに結合されている、項目４５に記載の化合物。
（項目４７）
項目１〜４６のいずれか１項に記載の化合物を、１種類以上の薬学的に許容され得る賦形剤とともに含む医薬組成物。
（項目４８）
注射に適した、項目４７に記載の組成物。
（項目４９）
項目１に記載の化合物の合成方法であって、環状オリゴペプチドＰ１およびＰ２、リンカーＬならびに、任意選択でスペーサーＳ１および／またはＳ２を、該オリゴペプチドの官能基が、該リンカーＬの官能基あるいは、存在する場合は該スペーサーＳ１および／またはＳ２の官能基と反応し、該スペーサーのその他の官能基が該リンカーＬの官能基と反応するような条件下で合わせることを含む、方法。
（項目５０）
さらに、任意選択でスペーサー基Ｓ３を有する細胞傷害性部分または検出可能な標識を、該細胞傷害性部分もしくは該検出可能な標識上の官能基または存在する場合は該スペーサー基Ｓ３の官能基が、前記リンカーＬあるいは前記環状オリゴペプチドＰ１および／またはＰ２上の官能基と反応するように導入することを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記環状オリゴペプチドと前記リンカーＬおよび／またはスペーサー基Ｓ１および／またはＳ２との反応に使用される条件が、前記細胞傷害性部分もしくは前記検出可能な標識または存在する場合はスペーサーＳ３と該リンカーＬまたは該環状オリゴペプチドとの反応に使用される条件とは異なる、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
治療または診断における使用のための項目１〜４６のいずれか１項に記載の化合物。
（項目５３）
新形成状態の処置のための医薬の調製における項目１〜４６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目５４）
新形成状態の処置および／または診断における使用のための項目１〜４６のいずれか１項に記載の化合物。
（項目５５）
新形成状態の診断的画像化のための医薬の調製における項目３３〜４６のいずれか１項に記載の化合物の使用であって、該化合物が検出可能な標識を含む、使用。
（項目５６）
前記新形成が転移の可能性を有するか、または有することが疑われる、項目５３または項目５４に記載の使用。
（項目５７）
前記新形成状態が乳癌または前立腺癌である、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の使用。
（項目５８）
新形成組織を画像化する方法であって、新形成を有するか、または有することが疑われる被験体に、項目３３〜４６のいずれか１項に記載の化合物を投与する工程、およびインビボでの該化合物の分布後に該化合物を検出する工程を含み、該化合物が検出可能な標識を含む、方法。
（項目５９）
前記検出する工程後、前記検出された化合物の画像を生成するさらなる工程を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
新形成の細胞の転移の可能性を判定する方法であって、該方法は、該細胞を項目１〜４６のいずれか１項に記載の化合物に、該化合物が該細胞の表面上のＣＸＣＲ４受容体に結合することが可能となるように曝露する工程、未結合化合物を該細胞の近傍から除去する工程、ならびに該細胞に結合された化合物の存在および／または量を測定する工程を含む、方法。
（項目６１）
前記新形成から前記細胞を取り出し、インビトロで該化合物に曝露する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
結合された化合物の画像化あるいはその存在および／または量の測定が、前記標識が放射性核種を含む場合ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いて行われる、項目５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
被験体の新形成状態の処置方法であって、該新形成が転移の可能性を有するか、または有することが疑われ、該方法は、該被験体に項目１〜４６のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、方法。
（項目６４）
前記新形成状態が乳癌または前立腺癌である、項目５８〜６３のいずれか１項に記載の方法。

次に、本発明を、ほんの一例として添付の図面を参照しながら、より詳細に説明する。

図１は、ＣＸＣＲ４とＧＦＰレポーターをコードするベクターによるインビトロでの細胞のトランスフェクションの蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）の結果を示す。 図２ａおよび２ｂ（ならびに表）は、ジャーカット細胞上のＣＸＣＲ４における^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４結合パラメータの測定および（図２ｂ）^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αとの比較を示す。 図２ａおよび２ｂ（ならびに表）は、ジャーカット細胞上のＣＸＣＲ４における^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４結合パラメータの測定および（図２ｂ）^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αとの比較を示す。 図３（および表）は、ヌードマウスにおける静脈内注射後の^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の体内分布を示す。 図４は、ＣＸＣＲ４陽性および陰性腫瘍を有するマウスにおける放射性標識ＣＰＣＲ４の分布のＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ画像を示す。 図５は、検出可能な標識を有する本発明の多量体化合物を概略的に示す。

実施例１−放射性標識ＣＰＣＲ４のＳＰＥＣＴ／ＰＥＴ画像化
１．１ 概要
１．１．１ 材料および方法：
腫瘍の転移の可能性の早期評価方法は、治療の予測と管理のための有益なツールとなり得る。最近、転移における重要な役割がケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に原因があるとされた。乳癌および前立腺癌などのさまざまな腫瘍において、ＣＸＣＲ４は、腫瘍細胞ホーミングの際に支配的な役割を果たしていることがわかり、原発性腫瘍と転移腫瘍の両方において発現されることが示された。この試験の目的は、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴ画像化による腫瘍および転移腫瘍上のＣＸＣＲ４発現のインビボでの画像化のための新規な放射性標識プローブを開発することであった。

環状ペプチド（シクロ（Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ）であるＣＰＣＲ４を放射性標識し、ＣＸＣＲ４発現ジャーカット細胞での結合アッセイにおいて評価した。腫瘍形成性の線維肉腫細胞株ＣＭＳ５をレトロウイルスにより形質導入して安定にＣＸＣＲ４／ＧＦＰを発現させ、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）および放射性リガンド結合アッセイで特徴付けた。体内分布試験およびＳＰＥＣＴ／ＰＥＴ画像化は、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４^＋マウスにおいて行なった。腫瘍をさらに、オートラジオグラフィ、ＩＨＣおよびＧＦＰ蛍光によって解析した。

１．１．２ 結果および結論：
放射性標識ＣＰＣＲ４は、高い親和性（Ｋ_Ｄ：０．４±０．１ｎＭ）および特異性（＞９０％）で、拮抗的様式で内因的にＣＸＣＲ４を発現するジャーカット細胞および形質導入したＣＸＣＲ４／ＧＦＰ発現ＣＭＳ５細胞に結合する。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４^＋−線維肉腫は、オートラジオグラフィ、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）およびＧＦＰ蛍光によって確認されるように、マウスの信頼のおけるＣＸＣＲ４腫瘍モデルであることがわかった。ｉ．ｖ．注射された放射性標識ＣＰＣＲ４の体内分布試験では、注射１時間後、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４^＋腫瘍において５．５±１．５％ＩＤ／ｇ（注射用量／ｇ）、およびＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４⁻対照において０．６±０．２％ＩＤ／ｇが示された。急速な血中クリアランスおよび低いバックグラウンド蓄積（＜１．０％ＩＤ／ｇ）の他、より高いトレーサーの取込みが、肝臓（１９．５±２．８％ＩＤ／ｇ）、腸（１７．２±２．９％ＩＤ／ｇ）および腎臓（１２．２±２．３％ＩＤ／ｇ）において見られた。マウスのＣＰＣＲ４−ＳＰＥＣＴおよび動物ＰＥＴ画像化を使用すると、ＣＸＣＲ４^＋腫瘍の明確な輪郭描写が可能となったが、同じ動物のＣＸＣＲ４⁻対照では、活性蓄積が可視的ではなかった。

本発明者らは、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のインビボ標的化のための最初の放射性標識プローブの開発に成功した。トレーサーは、高い親和性および特異性で、拮抗的様式でその結合部位に結合し、インビボでのＣＸＣＲ４^＋腫瘍の明確な輪郭描写を可能にした。本発明者らは、この新規なクラスのトレーサーが、腫瘍の転移の可能性の検討ならびに転移過程の早期画像化および放射性核種療法のための非常に有望なプローブであるという仮説を立てる。

環状オリゴペプチド部分としてＣＰＣＲ４およびその類似体を含む本発明の二量体および多量体は、したがって、転移過程の処置および画像化において相当有用である可能性がある。ＣＸＣＲ４受容体でのかかる二量体および多量体の結合親和性は、下記に示すように、対応する単量体オリゴペプチドと比べて有意に改善される。

１．２ 実施例１の詳細説明
１．２．１ 材料および方法
１．２．１．１ ペプチドの合成および放射性標識
ペプチドは、Ｆｍｏｃストラテジーに従う標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用することにより合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）およびＦｍｏｃ−Ｇｌｙは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、Ｆｍｏｃ−２−ナフチルアラニンはＢａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。ペプチド合成は、ＴＣＰ（塩化トリチルポリスチレン）樹脂上で手作業にて行なった。Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）およびジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）は、それぞれ、ＡｌｅｘｉｓおよびＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＩｏｄｏＧｅｎ（１，３，４，６−テトラクロロ−３Ｒ，６Ｒ−ジフェニルグリコールウリル）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）から入手し、ナトリウムのヨウ化物−１２５はＨａｒｔｍａｎｎ−Ａｎａｌｙｔｉｃ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ナトリウムのヨウ化物−１２３は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｅａｌｔｈ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。ナトリウムのヨウ化物−１２４は、Ｗ．Ｂｒａｎｄａｕ教授（Ｅｓｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のご好意によって提供して頂いた。他の試薬はすべて、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。特に指定のない限り、溶媒は、さらに精製せずに使用した。

環状ペンタペプチドＣＰＣＲ４およびその誘導体の合成は、最近報告されたとおりに行なった（わずかな変更を伴った）［１，２］。簡単には、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをＴＣＰ樹脂に結合後、残りのアミノ酸を、それぞれＴＢＴＵでの活性化後にカップリングさせ、続いて、２０％ピペリジン含有ＤＭＦを使用することによりＦｍｏｃ基を脱保護した。ペプチド鎖の組立て後、樹脂結合ペプチドを、酢酸、２，２，２−トリフルオロエタノールおよびジクロロメタン（２：２：６）の混合物で室温にて２時間処理した。その後、樹脂を濾過し、この切断混合物で２回洗浄した。合わせた濾液を石油エーテルの存在下、真空にてエバポレートした。

環化のため、側鎖を保護したペプチドをＤＭＦに２．５ｍＭの濃度で溶解させた。−４０℃で５当量のＮａＨＣＯ_３および３当量のＤＰＰＡを添加し、室温まで昇温させながら一晩溶液を撹拌した。固形のＮａＨＣＯ_３を濾過後、ＤＭＦを真空にてエバポレートした。残基を水とともに摩砕し、濾過し、水とジエチルエーテルで洗浄した。完全に保護された環化ペプチドを９５％ＴＦＡと５％水の溶液で室温にて２時間処理した。脱保護されたペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、５℃で遠心分離した。非放射性ヨード化参照ペプチドの合成では、アミノ酸の基本要素Ｆｍｏｃ−Ｄ−３−ヨード−Ｔｙｒ−ＯＨを既報のとおりに合成した［２］。このアミノ酸の組込みおよびその後のペプチド環化のため、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）／コリジン活性化を使用した。その後、粗製環状ペプチドを凍結乾燥させ、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。最後に、このペプチドを、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いたＬＣＱ ＬＣ−ＭＳシステム（Ｆｉｎｎｉｇａｎ（Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製）の分析用ＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳによって特徴付けた。

このペプチド合成のさらなる詳細は以下のとおりである。

材料および方法
概要
市販の化学試薬はすべて、さらに精製せずに使用した。工業用溶媒は、使用前に蒸留した。

トリチル樹脂はＰｅｐＣｈｅｍから、アミノ酸誘導体はＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ａｌｄｒｉｃｈから購入したが、他の化学薬品はすべて、特に記載のない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦｌｕｋａまたはＭｅｒｃｋから購入した。

ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）はＢＡＳＦから入手し、さらに蒸留せずに使用した。乾燥溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦｌｕｋａまたはＭｅｒｃｋから購入した。乾燥ジクロロメタンは、アルゴン下、水素化カルシウムとともに蒸留し、４Åモレキュラーシーブに維持した。ＲＰ−ＨＰＬＣ用の水は、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐａｋ４０）に通して濾過した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ解析は、Ｏｍｎｉｃｒｏｍ ＹＭＣカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ Ｃ_１８、１ｍＬ／分）を用いて行なった。溶離剤は、３０分間で水（０．１％ＴＦＡ）からアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配（１０％〜１００％、１０％〜６０％、および２０％〜５０％）とし、２２０ｎｍおよび２５４ｎｍで検出した。解析用ＲＰ−ＨＰＬＣの保持時間（Ｒ_ｔ）は単位：分で示し、勾配は、単位：アセトニトリルのパーセンテージで示す。純度は、２２０ｎｍでＵｎｉｃｏｒｎソフトウエアパッケージを用いて測定し、出発化合物に対して示す。半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣは、高圧モジュール１２５、ＵＶ検出器１６６を取り付けたＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄにおいて行ない、Ｏｍｎｉｃｒｏｍ ＯＤＳ−Ａ Ｃ１８（１２０Å、５μｍ、２５０ｍｍ×２０ｍｍ）カラムを上記のものと同じ溶媒と組み合わせて使用した。

ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ２５０またはＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ
５００において２９８Ｋで記録した。化学シフトを単位：使用した溶媒シグナルに対するδ目盛上のｐｐｍで報告する。^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、^１Ｈ−ブロードバンドデカップリングを用いて記録した。パルスプログラムはＢｒｕｋｅｒライブラリーから採用したもの、または本発明者らが開発したものとした。試料は、０．５ｍｌの重水素化溶媒を用いて、５ｍｍの直径を有するチューブ内で調製した。得られたスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＴＯＰＳＰＩＮ １．３ソフトウエアを使用し、ＰＣワークステーションにて処理した。

ＥＳＩ質量スペクトルは、０．２ｍＬ／分の流速でＯｍｎｉｃｒｏｍ ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ Ｃ１８カラム（１２０Å、３μｍ、１２５ｍｍ×２ｍｍ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ／ＨＰ １１００ ＲＰ−ＨＰＬＣシステムと組み合わせたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱにおいて記録した。溶離剤は、２０分間で水からアセトニトリル（０．１％ギ酸含有）の線形勾配（１０％〜１００％アセトニトリル）とし、検出は２２０ｎｍとした。

ＴＣＰ樹脂の負荷（一般手順）
ペプチドの合成は、ＴＣＰ樹脂（０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用し、標準的なＦｍｏｃストラテジーに従って行なった［１３］。Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（１．２当量）をＴＣＰ樹脂に、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（２．５当量）含有無水ＤＣＭ（０．８ｍｌ／ｇ樹脂）を用いて室温で１時間結合させた。ＭｅＯＨとＤＩＥＡ（５：１；ｖ：ｖ）溶液の添加により、残りの塩化トリチル基を１５分間キャップした。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（５回）とＭｅＯＨ（３回）で徹底的に洗浄した。真空乾燥後の樹脂の重量によって負荷容量を測定すると、０．４〜０．９ｍｍｏｌ／ｇの範囲であった。

樹脂上でのＦｍｏｃ脱保護（一般手順）
樹脂結合Ｆｍｏｃペプチドを２０％ピペリジン含有ＮＭＰ（ｖ／ｖ）で１０分間処理し、２回目は５分間処理した。樹脂をＮＭＰ（５回）で洗浄した。

ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔカップリング（一般手順）
Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（２当量）、ＴＢＴＵ（２当量）、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）（２当量）、ＤＩＥＡ（５．２当量）のＮＭＰ（１ｍｌ／ｇ樹脂）の溶液を、樹脂結合遊離アミンペプチドに添加し、室温で６０分間振とうし、ＮＭＰ（５回）で洗浄した。

ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（ｏ−Ｎｓ）保護
Ｎ−アルキル化は、最適化されたプロトコル［１４］を用いて行なった。塩化ｏ−ニトロベンゼン（ｂｅｎｚｅｎｅｌ）スルホニル（ｏ−Ｎｓ−Ｃｌ）（５当量）とコリジン（１０当量）のＮＭＰ（１ｍｌ／ｇ樹脂）の溶液を、樹脂結合遊離アミンペプチドに添加し、室温で１５分間振とうした。樹脂をＮＭＰ（３回）および乾燥ＴＨＦ（３回）で洗浄した。

ミツノブ条件下でのＮ−アルキル化
トリフェニルホスフィン（５当量）、ＤＩＡＤ（ジイソプロピルアゾジカルボキシレート）（５当量）とアルコールＲＯＨ（１０当量）の乾燥ＴＨＦ（１ｍｌ／ｇ樹脂）溶液を、樹脂結合ｏ−Ｎｓ保護ペプチドに添加し、室温で１０分間振とうした。樹脂を濾別し、乾燥ＴＨＦ（３回）とＮＭＰ（３回）で洗浄した。

樹脂上でのｏ−Ｎｓ脱保護
ｏ−Ｎｓ脱保護のため、樹脂結合ｏ−Ｎｓ−ペプチドを、メルカプトエタノール（１０当量）とＤＢＵ（５当量）のＮＭＰ（１ｍｌ／ｇ樹脂）溶液で５分間処理した。脱保護手順をもう一度繰り返し、樹脂をＮＭＰ（５回）で洗浄した。

ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔカップリング（一般手順）
Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（２当量）、ＨＡＴＵ（２当量）、ＨＯＡｔ（ヒドロキシアゾベンゾトリアゾール）（２当量）、ＤＩＥＡ（４当量）のＮＭＰ（１ｍｌ／ｇ樹脂）の溶液を、樹脂結合ペプチドに添加し、室温で３時間振とうし、ＮＭＰ（５回）で洗浄した。

Ａｌｌｏｃおよびアリル脱保護
Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．１２５当量）含有乾燥ＤＣＭ（０．５ｍｌ／ｇ樹脂）を樹脂結合Ａｌｌｏｃペプチドに添加した後、フェニルシラン含有乾燥ＤＣＭ（０．５ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、１時間振とうした。樹脂をＤＣＭで５回洗浄した。

樹脂上でのＤｄｅ脱保護
Ｄｄｅ基の脱保護のため、樹脂結合ペプチドを、２％ヒドラジンのＮＭＰ（１ｍｌ／ｇ樹脂）溶液中で５分間振とうした。脱保護手順をもう一度繰り返し、樹脂をＮＭＰで５回洗浄した。

樹脂上でのＡｌｌｏｃ保護基の存在下でのＤｄｅ脱保護
Ｄｄｅ基の脱保護のため、樹脂結合ペプチドを６．５％ヒドラジンのＮＭＰ（１ｍｌ／ｇ樹脂）溶液（２００当量のアリル型アルコール含有）中で５分間振とうした。脱保護手順をもう一度１０分間繰り返し、樹脂をＮＭＰで５回洗浄した。

ペプチド切断
樹脂からの完全な切断のため、ペプチドをＤＣＭとＨＦＩＰ（４：１；ｖ：ｖ）の溶液で室温で０.５時間で３回処理し、溶媒を減圧下でエバポレートした。

環化
ペプチドを含有するＤＭＦ（１ｍＭペプチド濃度）とＮａＨＣＯ_３（５当量）の溶液にＤＰＰＡ（３当量）を室温で添加し、一晩中または線状ペプチドがＥＳＩ−ＭＳで観察され得なくなるまで撹拌した。溶媒を小容量になるまで減圧下でエバポレートし、ペプチドを飽和ＮａＣｌ溶液中で沈殿させ、ＨＰＬＣ等級水中で２回洗浄した。

溶液中でのアシル化
完全に脱保護したペプチドを、ＨＡＴＵ（１．１当量）およびＤＩＥＡ（２．２当量）ならびに対応する酸（１当量）を含むＤＭＦ（１０ｍＭペプチド濃度）とともに室温で３０分間撹拌した。この溶液をＨＰＬＣ分離によって直接精製した。

オキシムライゲーション
完全に脱保護したペプチドを、対応するカルボニル（１当量）を含む水（ｐＨ１〜２；ＴＦＡ；１０ｍＭペプチド濃度）中で室温で３０分間撹拌した。この溶液をＨＰＬＣ分離によって直接精製した。

溶液中でのＦｍｏｃ脱保護
環状ペプチドを２．５ｍｌの２０％ピペリジンを含むＤＭＦ（ｖ／ｖ）で３０分間処理し、飽和ＮａＣｌ溶液中で沈殿させ、ＨＰＬＣ等級水中で２回洗浄した。

溶液中でのｏ−Ｎｓ脱保護
ｏ−Ｎｓ脱保護のため、環化ペプチドを、メルカプトエタノール（１０当量）とＤＢＵ（５当量）の２．５ｍｌのＤＭＦ溶液で３０分間処理し、飽和ＮａＣｌ溶液中で沈殿させ、ＨＰＬＣ等級水中で２回洗浄した。

溶液中でのＤｄｅ脱保護
Ｄｄｅ基の脱保護のため、ペプチドを２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液中で１５〜３０分間撹拌し、飽和ＮａＣｌ溶液中で沈殿させ、ＨＰＬＣ等級水中で２回洗浄した。

酸不安定性側鎖保護基の除去
環化ペプチドをＴＦＡ、水およびＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）の溶液中、室温で１時間または保護されたペプチドがＥＳＩ−ＭＳで観察され得なくなるまで撹拌し、ジエチルエーテル中で沈殿させ、さらに２回洗浄した。

ＤＯＴＡ ｔ−Ｂｕ基の除去
二量体ペプチドを含むカップリング溶液に、激しく撹拌しながら氷浴上で、同容量の濃ＨＣｌを添加した。脱保護を室温で行い、完全に行なわれたかをＥＳＩ−ＭＳによって３０分毎にモニターし、氷浴上で濃ＮＨ_４ＯＨで中和することにより終了させた。

ＤＯＴＡリガンドとのＩｎのキレート化
ＤＯＴＡリガンドを５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ（０．５ｍｌ；ｐＨ４．５）に溶解させ、５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ（０．０５ｍｌ）に溶解させたＩｎＣｌ_３（５当量）で処理した。室温で１５分間撹拌後、溶液を、ＨＰＬＣ精製に供した。

アミノ酸の合成
Ｎ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^δ−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチンおよびＮ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^δ−Ｂｏｃ−Ｄ−オルニチン

Ｎ^ε−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチン（１．００ｇ，４．３ｍｍｏｌ）を、Ｎａ_２ＣＯ_３（１．１４ｇ，１０．７５ｍｍｏｌ）を含む水とＴＨＦ（５０ｍｌ，１：１，ｖ／ｖ）の溶液に溶解した。クロロギ酸アリル（０．４６ｍｌ，４．３ｍｍｏｌ）の添加後、溶液を１．５時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下でエバポレートし、水相をジエチルエーテル（１×５０ｍＬ）で洗浄し、濃ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、生成物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、真空乾燥させ、無色で粘着性の油状物を、充分に純粋な生成物として得た（１．２０ｇ，９０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ １２．５２ （ｓ，１Ｈ，ＯＨ），７．４９ （ｄ，７．７２ Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ^α），６．７８ （ｔ，５．０５ Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ^ε），５．９１ （ｂｒ ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{Ａｌｌｏｃ}），５．３０ （ｄｄ，１７．１５ Ｈｚ，１．６９ Ｈｚ，Ｈ^{ＡｌｌｏｃＴｅｒｍ１}），５．１９ （ｄｄ，１０．１７ Ｈｚ，１．６８ Ｈｚ，Ｈ^{ＡｌｌｏｃＴｅｒｍ２}），４．４８ （ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^{Ａｌｌｏｃ}），３．９１ （ｂｒ ｍ，１Ｈ，Ｈ^α），２．９１ （ｍ，２Ｈ，Ｈ^β），１．８１−１．４０ （ｂｒ ｍ，４Ｈ，Ｈ^γ，Ｈ^δ），１．３８ （ｓ，９Ｈ，Ｈ^Ｂｏｃ）。^１３Ｃ ＮＭＲ （６３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：１７４．４，１５６．５，１５６．１，１３４．１，１１７．４，７７．９，６５．１，６０．２，５４．１，２８．８，２６．７，１４．６． Ｒ_ｔ （１０〜１００％）：１６．７分。

Ｎ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^δ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−オルニチンおよびＮ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^δ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−オルニチン

Ｎ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^ε−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチン（１．２０ｇ，３．８７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（５ｍＬ）をゆっくり添加した。４５分間撹拌後、液体をエバポレートした。

粗生成物を、Ｎａ_２ＣＯ_３（１．０２ｇ，９．６８ｍｍｏｌ）を含む水とＴＨＦ（４０ｍｌ，１：１，ｖ／ｖ）の溶液に溶解した。ＦｍｏｃＯＮスクシンイミド（１．３１ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）の添加後、溶液を１．５時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下でエバポレートし、水相をジエチルエーテル（１×５０ｍＬ）で洗浄し、濃ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、生成物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、真空乾燥させ、無色のシロップ状物質を、充分に純粋な生成物として得た（１．６５ｇ，９７％）。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ １２．５ （ｓ，１Ｈ，），７．９ （ｄ，２Ｈ），７．７ （ｄ，２Ｈ），７．５ （ｄ，１Ｈ），７．４ （ｔ，２Ｈ），７．３２ （ｔ，２Ｈ），７．２８ （ｍ，１Ｈ），５．９ （ｍ，１Ｈ），５．３ （ｄ，１Ｈ），５．２ （ｄ，１Ｈ），４．５ （ｄ，２Ｈ），４．３ （ｄ，２Ｈ），４．２ （ｔ，１Ｈ），３．９ （ｍ，１Ｈ），３．０ （ｄ，２Ｈ），１．７ （ｍ，１Ｈ），１．５ （ｍ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：１７４，１５６．０，１５５．９，１４４，１４１，１３３，１２８，１２７．０，１２６．９，１２５．１，１２５．０，１２０．１，１１９．９，６５，６４，５３．５４，５３．５０，４７，２８，２６． Ｒ_ｔ
（１０〜１００％）：２１．９分。

反応スキームを以下に示す。

グルタル酸モノアミド（ナトリウム塩）の合成

無水グルタル酸（０．５０ｇ；４．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解し、不溶性のグルタル酸を濾別した。水酸化アンモニウム水溶液を７０℃まで加熱し、撹拌ＤＣＭ溶液中でガスを起泡させた。白色固形物の沈殿後、アンモニアをさらに３０分間加熱し、ＤＣＭ溶液を一晩中撹拌した。白色固形物を濾過し、ＤＣＭ（１０ｍｌ）で２回洗浄し、乾燥させ、０．５８ｇ（３．９ｍｍｏｌ；８９％）のグルタル酸モノアミドアンモニウム塩を得た。

このアンモニウム塩を水（１０ｍｌ）に溶解し、等モル量の水酸化ナトリウム（０．１６ｇ）で処理し、凍結乾燥させ、該ナトリウム塩を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ ７．３１ （ｓ，１Ｈ，），６．６３ （ｓ，１Ｈ），２．０３ （ｑ，４Ｈ），１．６５ （ｍ，２Ｈ）。

１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン臭化水素酸塩［１・ＨＢｒ］の合成
ＪＡＣＳ，２００８，１３０，７９４−７９５を適合。さらなる解析データは、これを見るとよい。

１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（２ｇ；１２ｍｍｏｌ；１当量）とＮａＨＣＯ_３（５ｇ；６０ｍｍｏｌ：５当量）をアセトニトリル（８０ｍｌ）中、Ａｒ下で０℃にて撹拌し、次いで、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（５ｍｌ；３４ｍｍｏｌ；２．９当量）を３０分間にわたって滴下した。反応混合物を室温で反応させ、Ａｒ下で２４時間撹拌した。無機固形物を濾過によって除去し、濾液を減圧下でエバポレートすると、ベージュ色の固形残渣が残った。トルエン（１０〜１５ｍｌ）からの再結晶により、１・ＨＢｒを白色固形物として得た（２．８６ｇ；４．８ｍｍｏｌ；４１％収率）。

１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１０−（ベンジルオキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［２］の合成
ＪＡＣＳ，２００８，１３０，７９４−７９５を適合。さらなる解析データは、これを見るとよい。

１・ＨＢｒ（２．８６；４．８ｍｍｏｌ；１当量）のアセトニトリル溶液（１１４ｍｌ）に、ＮａＨＣＯ_３（２．０２ｇ；２４ｍｍｏｌ；５当量）とブロモ酢酸ベンジル（０．９７ｍｌ；６．２９ｍｍｏｌ；１．３当量）を添加した。この混合物を１００℃で３０時間還流した。反応混合物を冷却し、次いで濾過した。濾液を減圧下でエバポレートすると、黄色ゴム状物が残った。生成物をＤＣＭに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製（ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）し、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（Ｒ_ｆ：０．０８〜０．０６）で溶出し、２（３．１５ｇ；４．８ｍｍｏｌ；９９％収率）を得た。

１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１０−酢酸［３］の合成
ＪＡＣＳ，２００８，１３０，７９４−７９５を適合。さらなる解析データは、これを見るとよい。

化合物２（２．８１ｇ；４．２ｍｍｏｌ；１当量）をＭｅＯＨ（１１０ｍｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（１１０ｍｇ）を添加した。反応混合物をＨ_２下、室温で５時間激しく撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下でエバポレートし、３（２．２３ｇ；３．９ｍｍｏｌ；９３％収率）を得た。

（Ｒ）−１−（カルボニル）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）プロパン−２−イルカルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル［４］の合成

Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ｔＢｕ）ＯＨ（２．０ｇ；４．９ｍｍｏｌ；１当量）を、無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した。Ｎｅｔ_３（０．７４ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；１．１当量）とクロロギ酸エチル（０．５２ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；１．１当量）を、逐次、−１５℃で添加した。撹拌を１５分間継続し、次いで、溶液を０℃まで昇温させた。その間、Ｎ−メチルニトロソウレア（２．５ｇ；２４．３ｍｍｏｌ；５当量）を氷冷Ｅｔ_２Ｏ（２０ｍｌ）中で撹拌し、４０％ＫＯＨ（２０ｍｌ；氷冷）を、完全に溶解するまで滴下する。黄色のジアゾメタンＥｔ_２Ｏ溶液を、０℃でこのアミノ酸溶液に滴下し、次いで、室温まで昇温させ、さらに２．５時間撹拌した。ＨＯＡｃの滴下により、過剰のジアゾメタンを分解させた。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３、飽和ＮＨ_４Ｃｌおよびブラインで洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下でエバポレートした。得られたジアゾケトンを水／ジオキサン（１：５；ｖ／ｖ；１６０ｍｌ）に溶解した。安息香酸銀（０．１２ｇ；０．５ｍｍｏｌ；０．１当量）の添加後、混合物を超音波浴中で、完全に変換されるまで（３０分間）超音波処理し、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；１：２０；Ｒ_ｆ：０．１〜０．２）によってモニターした。ジオキサンを減圧下でエバポレートした後、溶液を５％ＨＣｌで酸性化し、沈殿物をＥｔＯＡｃ（３回）で抽出した。有機層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下でエバポレートし、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；１：２０；Ｒ_ｆ：０．１〜０．２）によって精製し、［４］（１．３ｇ；３．１ｍｍｏｌ；６３％収率）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ １２．２ （ｓ，ｂｒ，１Ｈ，），７．９０ （ｄ，２Ｈ），７．６９ （ｄｄ，２Ｈ），７．４２ （ｔ，２Ｈ），７．３３ （ｍ，３Ｈ），４．２７ （ｍ，３Ｈ），３．５９ （ｍ，１Ｈ），２．４１
（ｍ，４Ｈ），１．３８ （ｓ，９Ｈ），^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：１７２．４９，１７０．２４，１４４．３５，１４１．１９，１２８．０７，１２７．５１，１２５．６３，１２０．５６，８０．３９，６５．８０，６０．２０，４７．１７，４５．８１，２８．１３． Ｒ_ｔ （１０〜１００％）：２３．５分． ＥＳＩ （ｍ＋Ｎａ）：４４８．１。

（Ｒ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）プロパン−２−イルカルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル［５］の合成

［４］（０，９８ｇ；２．３ｍｍｏｌ；１当量）を、臭化アリル（５．５２ｍｌ；６，４ｍｍｏｌ；２．８当量）とＤＩＥＡ（０．７８ｍｌ；４．６ｍｍｏｌ；２当量）を含むＡＣＮ（４．６ｍｌ）とともに４５℃で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：２０；ｖ／ｖ）によってモニターした。この溶液を室温に至らせた。ＥＥ（２０ｍｌ）の添加後、有機層を飽和ＫＨＳＯ_４、飽和ＮａＨＣＯ_３および半飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下でエバポレートし、［５］（０．７７ｇ；１．７ｍｍｏｌ；７４％収率）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７６ （ｄ，２Ｈ，），７．５８ （ｄ，２Ｈ），７．４０ （ｔ，２Ｈ），７．３１ （ｍ，２Ｈ），５．９１ （ｍ，１Ｈ），５．６３ （ｄ，１Ｈ），５．３２ （ｍ，１Ｈ），５．２４ （ｄ，１Ｈ），４．６０ （ｄ，２Ｈ），４．３６ （ｍ，３Ｈ），４．２１ （ｍ，１Ｈ），２．６６ （ｍ，４Ｈ），１．４５ （ｓ，９Ｈ），^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１４３．９１，１４１．２９，１３１．８４，１２７．６７，１２７．０４，１２５．０８，１１９．９５，１１８．５７，６６．８６，６５．３８，４７．２１，４５．１３，３９．２６，３８．０８，２８．０５． Ｒ_ｔ （１０〜１００％）：２７．６分． ＥＳＩ （ｍ＋Ｎａ）：４８８．３。

（Ｓ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−３−（カルボニル）プロパン−２−イルカルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル［６］の合成

［５］（０．７７ｇ；１．６５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。蒸発乾固後、固形物を飽和ＮａＨＣＯ_３に溶解し、エーテルで洗浄し、ＨＣｌ（５％）で酸性化すると（ｐＨ２）白色沈殿物が形成され、これをＥＥで２回抽出した。有機層を酸性化水（ＨＣｌ、ｐＨ１）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下でエバポレートし、［６］（０．５８ｇ；１．４ｍｍｏｌ；８５％収率）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７５ （ｄ，２Ｈ，），７．６８ （ｓ，１Ｈ），７．５７ （ｄ，２Ｈ），７．４０ （ｔ，２Ｈ），７．３１ （ｍ，２Ｈ），５．８９ （ｍ，１Ｈ），５．６６ （ｄ，１Ｈ），５．２８ （ｍ，２Ｈ），４．６０ （ｄ，２Ｈ），４．３８ （ｍ，ｂｒ，２Ｈ），４．２２ （ｍ，１Ｈ），２．６２ （ｍ，４Ｈ），^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１４３．６９，１４１．３３，１３１．６０，１２７．７７，１２７．１０，１２５．００ １２０．０１，１１８．８７，６７．２５，６５．６５，４７．１３，４４．４７，３７．８７，３７．６４． Ｒ_ｔ （１０〜１００％）：２２．０分． ＥＳＩ （ｍ＋Ｎａ）：４３２．２。

Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ｔ−Ｂｕ）アリルエステル［７］の合成

Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（β−ｔ−Ｂｕエステル）（０１０３ｇ；２．５０ｍｍｏｌ；１当量）を、臭化アリル（６．０ｍｌ；７．０ｍｍｏｌ；２．８当量）とＤＩＥＡ（０．７８ｍｌ；５．０ｍｍｏｌ；２当量）を含むＡＣＮ（５．０ｍｌ）とともに、４５℃で１００分間撹拌した。反応をＴＬＣ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：２０；ｖ／ｖ）によってモニターした。溶液を室温に至らせた。ＥＥ（４０ｍｌ）の添加後、有機層を飽和ＫＨＳＯ_４、飽和ＮａＨＣＯ_３および半飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下でエバポレートし、［８］（１．０１ｇ；２．２４ｍｍｏｌ；９０％収率）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７４ （ｄ，２Ｈ，），７．５８ （ｍ，２Ｈ），７．３８ （ｔ，２Ｈ），７．２９ （ｔ，２Ｈ），５．８９ （ｍ，１Ｈ），５．８１ （ｄ，１Ｈ），５．３２ （ｄ，１Ｈ），５．２３ （ｄ，１Ｈ），４．５６ （ｍ，３Ｈ），４．３７ （ｍ，３Ｈ），４．２３ （ｍ，１Ｈ），２．８６ （ｍ，２Ｈ），１．４２ （ｓ，９Ｈ），^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１７０．６２，１７０．００，１５５．９８，１４３．９１，１４３．７３，１４１．２９，１３１．４９，１２７．７１，１２７．０７，１２５．１３，１１９．９８，１１８．８０，８１．８９，６７．２８，６６．３０，５０．６１，４７．１０，３７．７９，２８．０３． Ｒ_ｔ （１０〜１００％）：２７．８分． ＥＳＩ （ｍ＋Ｎａ）：４７４．３。

Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ＯＨ）アリルエステル［８］の合成

［７］（１．０１ｇ；２．２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。蒸発乾固後、固形物を飽和ＮａＨＣＯ_３に溶解し、エーテルで洗浄し、ＨＣｌ（５％）で酸性化すると（ｐＨ２）白色沈殿物が形成され、これをＥＥで２回抽出した。有機層を酸性化水（ＨＣｌ、ｐＨ１）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下でエバポレートし、［８］（０．７７ｇ；１．９４ｍｍｏｌ；８７％収率）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （２５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ ７．９０ （ｍ，２Ｈ，），７．８３ （ｍ，１Ｈ），７．７０ （ｄ，２Ｈ），７．４２ （ｍ，２Ｈ），７．３２ （ｍ，２Ｈ），５．８７ （ｍ，１Ｈ），５．３０ （ｄ，１Ｈ），５．１８ （ｍ，１Ｈ），４．５８ （ｄ，２Ｈ），４．４５ （ｍ， １Ｈ），４．２６ （ｍ，３Ｈ），２．７０ （ｍ，２Ｈ），^１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１７１．８５，１７１．２９，１４４．２２，１４１．２０，１３２．７２，１２８．１１，１２７．５４０，１２５．６６ １２０．５９，１１８．０３，６６．２４，６５．５２，５１．０２，４７．０７，３６．３２． Ｒ_ｔ （１０〜１００％）：２２．０分． ＥＳＩ （ｍ＋Ｎａ）：４１８．１。

３ｔＢｕＤＯＴＡ−Ａｈｘ−Ａｓｐ［９］の合成

［９］は、固形支持体上にて［３］、［８］、およびＦｍｏｃ−６−アミノカプロン（ｃａｐｒｏｎｉｃ）−１−酸を用いて合成し、ＨＰＬＣによって精製した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ：Ｒ_ｔ＝８．３７分；ｍ／ｚ（ｍ＋Ｈ）＝８０１．４
３ｔＢｕＤＯＴＡ−Ａｈｘ−βＡｓｐ［１０］

［１０］は、固形支持体上にて［３］、［６］、およびＦｍｏｃ−６−アミノカプロン−１−酸を用いて合成し、ＨＰＬＣによって精製した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ：Ｒ_ｔ＝８，２９分；ｍ／ｚ（ｍ＋Ｈ）＝８１５．４
上記のＤＯＴＡ誘導体をオリゴペプチド基に結合させるため、上記のアプローチ「溶液中アシル化」を使用した。

１．２．１．２ ペプチドの放射性ヨウ素化
ＣＰＣＲ４を、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を用いて^１２３Ｉ−、^１２４Ｉ−または^１２５Ｉ−ヨウ化物で標識した［２］。０．２ｍｇのペプチドを２５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液を、１５０μｇのＩｏｄｏｇｅｎをコートしたエッペンドルフカップに添加し、放射ヨウ化物溶液と合わせた。室温で１５分後、この溶液を、固形の酸化試薬から除去した。勾配ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製を行なった。放射化学的純度は概ね＞９５％であった。動物実験のため、放射性標識ペプチドを含む画分を水で希釈し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラムに結合させた。その後、カラムを水で洗浄し、放射性標識ペプチドをメタノールで溶出した。メタノールを真空除去後、残渣をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させて希釈した。４℃での保存のため、溶液を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む２０％エタノール含有Ｈ_２Ｏで酸性化した。

１．２．１．３ 脂肪親和性
脂肪親和性の測定のため、０．４〜２．７μＣｉの^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４を含む５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を５００μｌのオクタノールと混合し、激しくボルテックスした。定量的相分離のための遠心分離後、各相から１００μｌを採取し、放射能をガンマカウンターで測定した。実験は３連で行ない、独立して２回繰り返した。

１．２．１．４ 細胞株および組織培養
マウス線維肉腫細胞株ＣＭＳ５［３］およびヒト２９３Ｔ細胞株［４］（Ｒ．Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｉｅｌ ｄｅｎ Ｈｏｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりご好意によって提供して頂いたもの）は、両方とも、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＰＡＡ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。Ｔリンパ球ジャーカット細胞株（ＡＴＣＣ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で維持した。培地および補充物は、特に記載のない限り、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したものとした。

１．２．１．５ レトロウイルスベクターの構築および標的細胞の形質導入
増強型蛍光タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＮｃｏＩ ＳｔｕＩ消化によって切り出し、クレノウ酵素を用いて平滑末端とし、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の独特なＳｍａＩ部位内に挿入し、ｐＩＲＥＳｅＧＦＰｎｅｏ３を得た。次の工程では、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを有するＮｏｔＩ断片をｐＢｕｌｌｅｔ（Ｓｃｈａｆｔら ２００３）のＮｏｔＩ部位内にクローニングし、ｐＢｕｌｌｅｔＩＲＥＳｅＧＦＰを得た。ヒトケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）ｃＤＮＡを有するｐｃＤＮＡ３ＣＸＣＲ４［５］の１２９２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ断片（Ｂ．Ｍｏｓｅｒ（Ｂｅｒｎ）によりご好意によって提供して頂いたもの）を単離し、すべての部位をクレノウ酵素で平滑末端とした後、レトロウイルスベクター ｐＢｕｌｌｅｔＩＲＥＳｅＧＦＰのＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。得られたベクターをｐＢｕｌｌｅｔＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰと命名した。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションおよびＣＭＳ５細胞の形質導入によるレトロウイルス作製は、別途報告されている［６］。

１．２．１．６ ＦＡＣＳ分取および解析
トリプシン処理した細胞のＥＧＦＰおよびＣＸＣＲ４発現を、蛍光励起細胞分取器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、４８８ｎｍで励起エネルギー４０ｍＷのアルゴンレーザー光線（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて解析した。ＥＧＦＰ発現は、ＦＬ１（５３０／３０ｎｍ）フィルターを用いて直接測定した。死細胞を、細胞へのヨウ化プロピジウムの添加によって測定し、蛍光を、ＦＬ２ ５８５／４２ｎｍフィルターを用いて測定した。死細胞のパーセンテージは常に≦０．２％であった。ＣＸＣＲ４発現ＣＭＳ５細胞の集団を、最小蛍光が２０であるＦＬ１についてＣＸＣＲ４−ＥＧＦＰ共発現細胞を分取することにより富化した。

トリプシン処理した細胞の細胞表面上でのＣＸＣＲ４発現を、ヒトＣＸＣＲ４に対する特異性を有するフィコエリトリン（ＰＥ）標識モノクローナルラット抗体（１Ｄ９、ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調べた。トリプシン処理した細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．５％ＦＣＳ）で洗浄し、１×１０^６細胞を０．５μｇの抗体で、４℃で暗所にて３０分間染色した。細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで充分に洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。非特異的染色をＰＥコンジュゲートラットＩｇＧ_２ｂ，κ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって評価した。細胞表面上のＣＸＣＲ４の検出はＥＧＦＰと同じ試料中とし、５７５／２６ｎｍフィルターを用いて検出した（ＦＬ２）。ＣＸＣＲ−４染色をＥＧＦＰ蛍光に対してプロットした（ＦＬ１）。

このとき、示された細胞は、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した培地に再懸濁させ、１００ｎＭの組換えヒトＳＤＦ−１α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに３７℃で１時間インキュベートした（以前に公開されたプロトコルを適合）［７，８］；対照は、希釈剤（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）とともにインキュベートした。さらなるインターナリゼーションを回避するため試料をすぐに氷に移し、遠心分離し、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄し、ＣＸＣＲ４のＦＡＣＳ染色を上記のようにして行なった。

１．２．１．７受容体結合アッセイ
受容体結合アッセイのため、細胞をＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中に再懸濁させた。４００，０００個のジャーカット細胞を含む懸濁液総量２００μｌを、２５μｌのトレーサー溶液（３．１ｋＢｑ、ほぼ０．１ｎＭ含有）および２５μｌの希釈剤または種々の濃度の競合物質とともにインキュベートした。ＩＣ_５０値の測定のため、シクロ（Ｄ−Ｔｙｒ^１［^１２５Ｉ］−Ａｒｇ^２−Ａｒｇ^３−Ｎａｌ^４−Ｇｌｙ^５）をトレーサーとして使用した。非特異的結合を、１μＭのコールドなシクロ（Ｄ−Ｔｙｒ^１［^１２７Ｉ］−Ａｒｇ^２−Ａｒｇ^３−Ｎａｌ^４−Ｇｌｙ^５）の存在下で調べた。室温で２時間振とう後、５分間の１３００ｒｐｍでの遠心分離によってインキュベーションを終了させた。細胞ペレットを冷ＰＢＳで１回洗浄した後、第２の遠心分離工程を行なった。細胞結合放射能を、ガンマカウンターを使用することにより測定した。実験は、３連で２〜３回繰り返した。化合物のＩＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた非線形回帰によって計算した。各データ点は、３回の測定の平均である。

１．２．１．８ インビボ試験
動物実験のため、ＣＭＳ５親細胞および形質導入ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞を雌Ｓｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）に皮下注射した。したがって、各マウスについて、製造業者のプロトコルに従い、１．５´１０^６個のＣＭＳ５細胞および２´１０^６個のＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞を、それぞれ７５μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、同じ容量のＭａｔｒｉｇｅｌ−Ｍａｔｒｉｘ ＨＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した。続いて、細胞懸濁液を、それぞれの肩に接種した。１４〜１６日間の腫瘍成長後、マウスを画像化および体内分布の目的に使用した。動物実験はすべて、地方当局に承認されたものであり、当該当局のガイドラインを順守したものである。

１．２．１．９ 体内分布試験
３７０ｋＢｑ（１０μＣｉ）の^１２５Ｉ標識ＣＰＣＲ４を、腫瘍を有するマウスの尾静脈（ｖａｉｎ）に静脈内注射した。動物を屠殺し、トレーサー注射の３０、６０および１２０分後に解剖した。対象の器官を取り出し、重量測定した組織試料中の放射能を、１４８０ Ｗｉｚａｒｄ３ガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃ（Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）製）を用いて測定した。結果を組織重量１グラムあたりの注射用量に対するパーセント（％ＩＤ／ｇ）として示す。各値は、４〜６匹の動物の平均を示す。

１．２．２ 結果
１．２．２．１ ＣＰＣＲ４合成および放射性標識
ＣＸＣＲ４受容体に対して高い親和性と選択性を示すＣＰＣＲ４すなわち環状ペンタペプチドであるシクロ（Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ）の合成は、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成プロトコルを使用することにより、酸不安定性トリチルクロリド樹脂において既報のとおりに行なった［１，２］。Ｎ−アルキル化でのさらなる修飾は、Ｎ−メチル化のために設計された変形プロトコルを使用し、フクヤマ−ミツノブ反応によって行なった［１４］。ペプチド鎖の組立て後、側鎖保護ペプチドを樹脂から切断し、ＤＰＰＡ法を用いて環化した［２］。すべての保護基を除去した後、粗環状ペンタペプチドを、分取用ＨＰＬＣによってさらに精製した。解析用ＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ解析により、ペプチドの均一性と正体が示された。

ＣＰＣＲ４のＴｙｒ側鎖の放射性標識はＩｏｄｏｇｅｎ法を使用し、^１２３Ｉ−または^１２５Ｉ−いずれかのヨウ化物を用いて行ない、続いて、ＨＰＬＣによって非標識前駆物質を分離した。適用したＨＰＬＣ条件では、非標識前駆物質と副生成物からの放射ヨウ化物含有ペプチドの非常に効率的な分離が可能であり、したがって、高い放射化学的純度（＞９９％）および比放射能が得られた。標識ペプチドの比放射能は、標識に使用した放射ヨウ化物のものであると推定された（^１２５Ｉでは＞２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、^１２３Ｉでは＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。放射ヨウ化物の取込みは通常＞９５％であったが、ＨＰＬＣ精製および生体適合性製剤化後の^１２３Ｉ−および^１２５Ｉ標識ペプチドの全体的な放射化学的収率は５０％の範囲であった。ＰＢＳ中での生体適合性製剤化後、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の脂肪親和性を、オクタノール／水（ＰＢＳ）分配係数として測定した。−０．０４（±０．０１）のｌｏｇＰ値が得られた。

１．２．２．２ ＣＸＣＲ４ベクターの構築およびウイルス感染
マウス線維肉腫細胞株ＣＭＳ５を、ＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰでレトロウイルスにより形質導入した。該細胞プールにおいて、レトロウイルスによるＣＸＣＲ４形質導入ＣＭＳ５細胞の７０〜８０％がｅＧＦＰ発現について陽性であり（ＦＡＣＳ解析によって測定）、平均蛍光強度は１３０であった。増殖曲線および生存アッセイ（ＸＴＴ）により、両細胞株とも、インビトロで類似した増殖反応速度論を有することが示された（データ示さず）。ＣＭＳ５細胞とＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞をヒトＣＸＣＲ４について染色すると、ＣＭＳ５では２．２％のバックグラウンド染色が示され、一方、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞の６１．６％がヒトＣＸＣＲ４について陽性に染色され、６６の平均蛍光強度を示し、該細胞の５７．９％がＣＸＣＲ４とｅＧＦＰの両方について陽性であった（図１）。細胞株は、経時的に安定であった（反復ＦＡＣＳ解析（データ示さず）によって表示）。

１．２．２．３ 受容体結合試験
^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４のＣＸＣＲ４放射性リガンドとしての適性を、まず、ＣＸＣＲ４受容体を内因的に発現するジャーカット細胞において試験し［９，１０］、続いて、ＣＸＣＲ４発現のためにレトロウイルスにより形質導入したＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞において試験した。両方の細胞株で、^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１α（５０−７０％）および^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４（＞９０％）を使用することにより、再現性のある高特異的結合が見られた。ＣＭＳ５親細胞では、ジャーカット細胞および形質導入ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞の非特異的結合の範囲において、両方のトレーサーで示された結合はごくわずかであった。飽和結合曲線から、ナノモル以下の範囲（０．３〜０．４ｎＭ）において、ほぼ同一のＫ_Ｄ値が両方の細胞株で得られ、ＣＸＣＲ４受容体に対する^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の高い親和性を示す（図２および関連する表Ａ）。さらに、多数の^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４結合部位（Ｂｍａｘ）を調べた。ジャーカット細胞では、Ｂｍａｘ値は、起源に対する依存性が高く、培養条件によって大きく異なるが、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞上の結合部位（Ｂｍａｘ）の数は一定であり、再現性がより良好であった（２３±６ｆｍｏｌ受容体タンパク質）。

新規な放射性リガンドとしての^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４により、異なるＣＸＣＲ４選択的リガンドの親和性プロフィールを、競合的放射性リガンド結合アッセイにおいて確認した（図２，表Ｂ）。ＳＤＦ−１α、ＣＰＣＲ４およびその非放射性ヨード化参照化合物Ｉｏｄｏ−ＣＰＣＲ４では、ナノモルのＩＣ_５０値を有する高い親和性が、ＣＸＣＲ４受容体において^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４または^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αのいずれかで見られた。ＳＤＦ−１αと環状ペンタペプチドＣＸＣＲ４との比較において、選択的ビシクラムＡＭＤ３１００では、両方のトレーサーで親和性の低下が示された。トレーサーおよび競合物質に応じて、２つのＣＸＣＲ４結合部位を既報のとおりにモニターした［９］。結合曲線の解析では、必要に応じて、一部位および二部位競合曲線フィットを使用した。得られた高親和性結合部位および低親和性結合部位を（１）および（２）と表示した（図２，表Ｂ）。

ＣＸＣＲ４受容体への^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の結合後の受容体インターナリゼーションを、酸性バッファー（ｐＨ５．０）での２回の短時間洗浄工程後に解析した。その後、トレーサーは、大部分が該受容体から放出可能であった（＞８０％）。これは、受容体アンタゴニストから予測されるとおり、受容体インターナリゼーションが起こらないことを示す（データ示さず）。

１．２．２．４ 受容体の機能性
ヒトＣＸＣＲ４がマウス細胞において機能性であるかどうかを調べるため、細胞をヒトＳＤＦ−１αとともにプレインキュベートし、表面ＣＸＣＲ４について染色し、続いてＦＡＣＳ解析を行なった。ヒトＳＤＦ−１αとのプレインキュベーション後、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞の５４．７％がＣＸＣＲ４について陽性に染色されたのに比べて対照処理細胞では７９．２％であり、これは、マウスＣＭＳ５細胞における該ヒト受容体の機能性を示す。ＣＭＳ５細胞におけるＣＸＣＲ４バックグラウンド染色は、ＳＤＦ−１αの存在下で７．９から２．７％に減少した。ジャーカット細胞を陽性対照として供した。この細胞では、陽性細胞％の減少は示されなかったが、平均蛍光強度は３８５．４から１５５．４に低下した。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞では、平均蛍光強度が、ｍｏｃｋ処理細胞の２０９．０からＳＦＤ−１α処理細胞の８０．５に低下した。これは、ジャーカット細胞がＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞よりも多くのＣＸＣＲ４受容体を含むことを示す。

１．２．２．５ インビボ試験
^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の体内分布および腫瘍蓄積を注射の３０、６０および１２０分後に、ＣＭＳ５およびＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４腫瘍を有するヌードマウスにおいて調べた。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４腫瘍における^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の腫瘍蓄積は６０分後に最高に達し、１グラムあたり注射用量に対して５．５（±１．５）パーセント（％ＩＤ／ｇ）であったが、この時点で親ＣＭＳ５腫瘍で観察されたのは、わずか０．６（±０．２）％ＩＤ／ｇであった。３０分後、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４はＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４腫瘍において４．７（±１．３）％ＩＤ／ｇの蓄積を示し、１２０分後では３．８（±１．４）％ＩＤ／ｇの蓄積を示している。すべての時間点で、高いトレーサー蓄積が観察されたのは、肝臓、腸および腎臓のみであった。他の器官では、非常に低いバックグラウンド蓄積が示されたにすぎなかった。肝臓では、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の蓄積は、３０分後の２７．７（±４．９）％ＩＤ／ｇから１２０後では１５．０（±１．８）％ＩＤ／ｇに時間とともに減少しているが、腸内のトレーサー蓄積は、３０分後の１６．０（±４．７）％ＩＤ／ｇから１２０分後では１９．２（±４．５）％ＩＤ／ｇに若干増加しており、これらの器官における代謝過程を示す。腎臓内のトレーサー蓄積は、６０分後に１２．２（±２．３）％ＩＤ／ｇでピークを示しており、１２０分後では８．２（±１．１）％ＩＤ／ｇに減少している（図３および表）。

図４は、ＣＸＣＲ４−陽性（ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４）および陰性（ＣＭＳ５対照）腫瘍の両方を有するマウスにおける放射ヨウ化物含有−ＣＰＣＲ４分布に関するＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ結果を示す。２つの型の腫瘍のＣＰＣＲ４取込みの差による明確な輪郭描写が観察され得る。比較のため、ＭＲＩの結果を示す。ＣＸＣＲ４陽性腫瘍は、注射の２５時間後でもＰＥＴにより認識可能であった。^１８Ｆ標識放射性リガンドを用いたＰＥＴおよび^１２３Ｉ標識を用いたガンマカメラを使用しても同様の結果が得られた。同様に、マイクロ撮像装置を用いた腫瘍の凍結切片のエキソビボ解析でも、陽性腫瘍と陰性腫瘍間で、放射線における顕著な差がみられた。

実施例２−ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体発現の標的化のための環状ペプチドの開発
ＨＩＶ−１感染、癌の転移、関節リウマチおよびＢ細胞性慢性リンパ球性白血病などのいくつかの疾患は、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体と、その天然リガンドである６８アミノ酸含有タンパク質ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）との相互作用に関連している［１１］。このような疾患の処置のためのストラテジーの一例は、小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストによりＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１α間の相互作用をブロックすることができたことである。さらに、適当な化合物を適切な放射性同位体で放射性標識することにより、ＰＥＴによってインビボでＣＸＣＲ４発現を画像化するための薬剤を提供することが可能となった。

ＦｕｊｉｉらによるＣＸＣＲ４アンタゴニストに関する以前の研究により、配列シクロ［Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ］を有する高親和性環状ペンタペプチドＣＰＣＲ４がもたらされた［１］。この構造をさらに改善するため、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、立体配座の剛性および放射性標識の化学的多様性に関して種々のアプローチが選択されている。

まず、立体配座の自由度に影響を及ぼすため、および代謝安定性とバイオアベイラビリティを増大させるため、アミド主鎖のＮ−メチルスキャン（N-methylscan）が行なわれ
た。アルギニン残基のＮ^α−メチル化により、有用な親和性を有するペプチドが得られたが（それぞれ、ＩＣ_５０値が２３ｎＭ（Ｎ−Ｍｅ）のＡｒｇ^３および３１ｎＭ（Ｎ−Ｍｅ）のＡｒｇ^４、Ａｒｇ残基の番号付けは、先のパラグラフに示した配列の位置に従っている）、他のアミノ酸のＮ−メチル化では、親和性が顕著に減少した（ＩＣ_５０＞１００ｎＭ）。オルニチンによるＡｒｇ^３の置換により、親和性の大部分が保持された［１２］。Ｏｒｎのδ−アミノ基は、短寿命の同位体を含む放射性標識基によってアルキル化またはアシル化され得る。さらに、２つのグアニジノ基の高い塩基性度が低減され得るため、バイオアベイラビリティが改善されるはずである。第１オルニチンアシル化誘導体では１１〜３５ｎＭのＩＣ_５０値が示され、インビボでのＰＥＴ画像化のための小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストの^１８Ｆ−放射性標識が初めて可能になった。以下のパネルは、Ｏｒｎが、それぞれＦＢ、ＦＰ、ＡｃおよびＡｍでδ−Ｎ置換された環状のＯｒｎ含有ペンタペプチドで得られた結果を示す。

Ｎ^α−モノメチル化環状ペンタペプチド（Ｎ^α−メチルスキャン）での結合アッセイの結果を、以下の表１に示す（以下の表において、ＩＣ_５０値＞２５０ｎＭを有し、従って本発明の第１〜第３の態様の範囲に含まれないペプチドを比較目的で含めており、ＩＣ_５０値の後ろに＊印を付していることに注意のこと）。

ＯＤ１（ｃｙｃ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］）の構造は、以下のとおりである。

この結果から、Ａｒｇ残基がメチル化されると、得られる親和性の低下はわずか５分の１〜１０分の１であることが観察され得る。他の残基がメチル化された場合、より大きな低下が得られる。

Ｎ^α−ジメチル化ペンタペプチドでの対応する結果を以下に示す（表２）。かかる修飾により、さらなる親和性の低下が示される。

Ａｒｇがオルニチンまたはシトルリンで置換されたペンタペプチドでの結合アッセイの結果を、以下の表３に示す。

表３の結果は、環状ペンタペプチドの最初のＡｒｇ残基が、劇的な親和性の低下なく、オルニチンなどのカチオン性残基で置換され得ることを示す。

^１８Ｆ含有補欠分子族の取込みに関する側鎖アシル化オルニチン誘導体の評価では、フルオロベンゾイル化誘導体が最も高い親和性を示すことがわかった（１１ｎＭ−上記のパネル参照）。この化合物は、比較的高い脂肪親和性を示した（ＬｏｇＰ １．０６）。

また、いくつかの他のＯｒｎ−Ｎ^δおよび／またはＯｒｎ−Ｎ^α−修飾ペンタペプチド（例えば、Ｎ^δスペーサー部分を有する一連の誘導体）も作製した。ＣＸＣＲ４結合の結果を表４に示す。

また、Ｄ−Ｏｒｎの誘導体を含む一連のペンタペプチドを、ＢがＨｉｓまたはＰｈｅであるペンタペプチドとともに作製した。ＣＸＣＲ４結合の結果を表５に示す。

Ａｌａまたは類似残基が鎖内に挿入されたいくつかの環状のヘキサペプチドを、ＣＸＣＲ４に対する結合親和性について試験した。結果を表６に示す（注−Ｄａｐ（ＦＰ）は、（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸である）。

表６の結果は、親和性の低下がほんの中程度で、ＡｌａがＮａｌとＧｌｙ間に挿入され得ること、および／またはＧｌｙがＡｌａで置き換えられ得ることを示す。他の残基のこの位置への挿入、または表６の試験した残基のいずれかの他の位置への挿入は、充分許容されるものではなかった。

さらなるＮ^α−メチルスキャンを、一連の環状のヘキサペプチド（Ｎ−モノ−、ジ−およびトリメチル化型）で行ない、これを表７に報告する。

この結果は、環状のヘキサペプチドのＮ^α−メチル化後の明白な結合親和性の低下を示すが、Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒヘキサペプチドは、その他のほとんどの誘導体と同様、かかる有意な親和性の低下がなかった。

標識のための補欠分子族の結合をより柔軟性にするため、ＣＰＣＲ４内のＧｌｙ残基をＤａｐで置換することにより、アミノ基の導入を調べた。結果（表８）は、この置換後の親和性の低下は中程度にすぎないことを示す（注−ＦＰ：２−フルオロプロピオニル；ＦＢ：４−フルオロベンゾイル）。

ＣＰＣＲ４または本明細書に記載のその他のペプチドの他の考えられ得る修飾としては、対応する^１８Ｆ標識化合物の類似化合物としての他のフッ素含有芳香族部分でのＮａｌ置換体が挙げられる。例えば、

ＡＭＳ（ＦＢ）は、アミノオキシ−セリン部分と４−フルオロベンズアルデヒドとのオキシムである。

蛍光ＣＸＣＲ４リガンドの開発のため、Ｎａｌを蛍光Ｄａｐ誘導体（Ｄａｐ（ＮＢＤ）など）で置換することが可能である（ＮＢＤは、７−ニトロ−１，２，３−ベンゾキサジアゾールである）。この誘導体は、ＣＰＣＲ４と比べて低下した親和性を示したが、ＦＡＣＳ解析の結果により、かかるリガンドは依然として、かかる手法によるＣＸＣＲ４発現の研究に適したものであり得ることが示されている。

実施例３−ペプチド系ＰＥＴプローブおよび生物発光を用いたＣＸＣＲ４ケモカイン受容体発現の複数様式の分子画像化
腫瘍細胞の転移と器官特異的ホーミングにおける重要な役割は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４とその内因性リガンドＳＤＦ−１αに因る。インビボでのＣＸＣＲ４発現の標的化のため、本発明者らは、放射性標識環状ペプチドＣＰＣＲ４を開発した。^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４は、高親和性でＣＸＣＲ４に結合し（Ｋ_Ｄ＝０．４ｎＭ）、インビボでＣＸＣＲ４発現腫瘍内において高い蓄積を示し（注射１時間後５．５％ＩＤ／ｇ）、ＣＸＣＲ４陽性腫瘍の明確な輪郭描写を可能にする最初のＰＥＴ画像化用プローブである。

腫瘍の発達と受容体発現の相関を可能にするため、および複数様式（multimodality）
（生物発光および核）画像化により非放射性標識プローブを用いて治療的介入の可能性をモニターするため、腫瘍細胞をルシフェラーゼ（ｌｕｃ）で形質導入した。ＣＸＣＲ４とｌｕｃ、あるいは対照としてｌｕｃまたはｅＧＦＰのみの遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築した。これらのベクターは、マウスＣＭＳ５線維肉腫細胞の安定な形質導入に成功裡に使用された。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４／ｌｕｃ細胞上のＣＸＣＲ４の表面発現を、放射性リガンド結合アッセイおよびＦＡＣＳ試験において調べた。ＣＰＣＲ４結合の高い親和性と特異性およびｌｕｃの機能性発現が細胞アッセイで確認された。この形質導入細胞をヌードマウスに皮下注射した。動物をμ−ＰＥＴにより、放射性標識ＣＰＣＲ４および生物発光（ｌｕｃ）／蛍光（ｅＧＦＰ）画像化を用いて解析した。オートラジオグラフィ、生物発光測定および免疫組織化学検査により、エキソビボ解析を行なった。ＣＰＣＲ４結合のより良好な理解のため、および改善された薬物動態学特性を有するリガンドを設計するため、新規に提案されたＣＸＣＲ４受容体モデルが開発されており、現在、ＣＸＣＲ４受容体変異型を調べることにより確認されている。このコンピューターモデルに基づき、トレーサー最適化と他の標識選択肢の検討のために、ＣＰＣＲ４誘導体の構造と活性の関係に関する試験が行なわれている。

結論として、このアプローチにより、インビボでのＣＸＣＲ４発現の画像化が可能となり、腫瘍の転移の可能性の非侵襲的研究用および個別治療のためのＣＸＣＲ４発現の測定用の向上した画像化用プローブの開発が可能となる。

実施例４−多量体オリゴペプチド系ＣＸＣＲ４受容体結合化合物の作製および特徴付け
４．１． いくつかの環状オリゴペプチド二量体を、本明細書に記載のオリゴペプチド単量体を基にして作製した。かかる二量体（合成に使用されたスペーサーおよび／またはリンカー基を含む）は、本発明の範囲に含まれるあらゆる二量体、ならびにさらなる環状オリゴペプチドを組み込むことによって作製される高次多量体の合成の一般原理を例示するものである。

最初に、以下の単量体（化合物Ａと表示、シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］、および化合物Ｂ、シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］を有する二量体を調べた。

Ｆｕｊｉｉら［１］によるＣＸＣＲ４アンタゴニストに関する研究により、高親和性環状ペンタペプチドシクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］（ＣＰＣＲ４またはＦＣ１３１としても知られている）がもたらされた。ＣＰＣＲ４の単量体誘導体シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］（化合物Ａ）およびシクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）−Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］（化合物Ｂ）では、ＣＰＣＲ４と比べて親和性の改善が示された（それぞれ、９．１ｎＭおよび６．１５±１．２ｎＭ）。

このような単量体ＣＸＣＲ４リガンドの親和性をさらに改善するため、いくつかの多量体ＣＸＣＲ４リガンドを合成した。最初に化合物Ａの二量体ペプチドを、グルタルアルデヒド（５８．０±４．２ｎＭ）とグルタル酸（４．３±０．３ｎＭ）によって、以下に示すようにして合成した。

グルタル（ｇｌｕａｔａｒｉｃ）アルデヒドは、単量体Ａの１対のオルニチンＮ^δ−アミノオキシアセチル誘導体に、ジオキシム共役体が形成されるようにカップリングさせたことに注意のこと。

一般に、該二量体化合物は、環状ペプチドのアミン基（Ｏｒｎ、Ｌｙｓまたは側鎖に末端アミン官能性を有する他のアミノ酸）の、三官能性リンカーのカルボン酸基（例えば、Ｂｏｃ保護アスパラギン酸、Ｂｏｃ保護グルタミン酸）へのカップリングによって合成される。Ｂｏｃ基はＴＦＡでの処理によって切除される。次いで（ｔｈａｎ）、遊離アミノ基がＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、蛍光基などのカップリングに使用され得る。続く四量体およびオリゴマーの合成には、例えば、本発明の二量体化合物（例えば、リンカーとしてＧｌｕまたはＡｓｐを有する）が使用され、リンカーの遊離アミノ基が、別のＢｏｃ保護ＧｌｕまたはＡｓｐ残基のカルボン酸基へのカップリングに使用される。この場合も遊離アミノ基によってＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、または蛍光基にカップリングされ得る。あるいはまた、このアミノ基は、次の二量体にカップリングして「分枝ツリー」を合成するのに使用され得る。

また、多量体化合物は、官能基選択的Ｈｕｉｓｇｅｎ反応、アシル化、ヒドラゾン形成、チオエーテルなどによって合成され得る。これらの方法は文献に記載されている。

該二量体の合成条件に関しては、リンカーとしてグルタル酸が使用される上記の化合物が例示的である。これを溶液中でのアシル化によって作製した。オルニチン側鎖のアシル化では、環化して充分脱保護したペプチドを、ＨＡＴＵおよび対応する酸を含むＤＭＦならびに塩基としてのＤＩＥＡとともに撹拌した。反応をＥＳＩ−ＭＳによってモニターした。完全に変換されたら、溶媒を減圧下でエバポレートし、アセトニトリルと水に溶解後、精製のためにＨＰＬＣ内に注入した。

本明細書に記載の本発明の化合物すべてに関する解析結果を以下の表９に示す。

本明細書に報告した該二量体のＩＣ５０の結果（以下の表１０）は、上記の方法に従って求めた。

４．２． この実施例では二量体として、化合物Ｂを有する多量体を合成した。オリゴペプチドを連結するためのスペーサーとして、以下に概略的に示したような、いくつかのジカルボン酸を使用した。スペーサーの長さは、至適親和性が達成されるように最適範囲にする必要があることは明らかである。例えば、スベリン酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_６−ＣＯＯＨ）およびセバシン酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_８−ＣＯＯＨ）が最適なスペーサーであった（それぞれ、ＩＣ_５０＝２．５１±０．７ｎＭおよび２．１２±０．９ｎＭ）。より短いか、またはより長いスペーサー、例えば、グルタル酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_３−ＣＯＯＨ）、アジピン酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_４−ＣＯＯＨ）、またはトリデカン二酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１−ＣＯＯＨ）などを使用すると、親和性が低下した（それぞれ、４．２８±２．３ｎＭ、４．４２ｎＭ、１１．１±３．４ｎＭ）。

種々の長さのリンカー／スペーサー（ｎの値は、上記概略図のメチレン基数を示す）を有する化合物Ｂの二量体の結合親和性の結果を表１０に報告する。

４．３． 結合しない環状ペンタペプチドを有し、グルタル酸がスペーサーとして使用された化合物Ｂからなる二量体（「混合型二量体」、以下に図示）は、２つのＢ単位（Ｂ_２１）からなるその類似体と比べて低い親和性を有することがわかった。これは、多量体ＣＸＣＲ４リガンドが、その単量体対応物と比べて改善された親和性を有すること、およびＢ_２１などの二量体の高い結合親和性は、単量体と比べた大きさ、電荷または形状の違いによるものではないこと（これは、ヘテロ二量体によって確認される）を示す。

結果は以下のとおりであった。単量体Ｂ単独（すなわち、上記概略図の左側の単量体）ＩＣ_５０＝６．１５ｎＭ；「不活性」なシトルリン含有単量体単独（すなわち、上記概略図の右側の単量体）ＩＣ_５０＞１０ｍＭ；および単量体Ｂと該不活性な単量体からなる二量体：ＩＣ_５０＝１９．５±８．９。

ホモ二量体Ｂ_２１を以下に示す。

これらの結果から、ＣＸＣＲ４リガンドの親和性は多量体化（例えば、二量体化）によって改善され得ると結論付けられ得る。二量体化合物の親和性は、後述（４．４）するように、少なくともスペーサーの長さ（上記４．２）およびスペーサーの構造に依存する。

４．４． 例えば、二量体ペプチドであるグルタルアルデヒド−（シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ（アミンオキシアセチル）−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］）_２（Ａ_２２）は、トリデカン二酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１ＣＯＯＨ）スペーサーで連結されたシクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）−Ｄ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］二量体（下記参照）と比べて、有意に低い親和性（５８．０±４．２ｎＭ）を有する。両方のスペーサーは同じ数の原子からなるが、スペーサーの構造のみが異なる。競合アッセイでのＩＣ_５０値によって示される両化合物の親和性の有意な差は、異なる単量体が使用されていることでは説明され得ない（上記に示したように、ペプチド鎖内にＬ−ＯｒｎまたはＮＭｅ−Ｄ−Ｏｒｎのいずれかを有する単量体Ａと単量体Ｂは、非常に類似した親和性を有する）。この差は、スペーサーの構造が異なることによってのみ説明され得る。以下の上側の概略図（単量体Ａ）に示すように、Ｏｒｎ側鎖に連結されたアミノオキシアセチル基に結合しているグルタルジアルデヒドスペーサーによって連結されたシクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］単量体からなる二量体を作製した。リンカー（スペーサー）全体は、Ｏｒｎのδ−アミノ基に連接された２つのカルボニル基を除いて１１個の原子からなる。下側の概略図（単量体Ｂ）は、Ｏｒｎ側鎖に直接結合しているトリデカン二酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１ＣＯＯＨ）スペーサーによって連結されたシクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｒｇ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］単量体からなる二量体である。このスペーサー（該２つのカルボニル基を除く）も１１個の原子からなる。

４．５． また、単量体Ｂ、すなわち、シクロ［Ｄ−Ｔｙｒ−（Ｍｅ）−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｃｉｔ−２−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］においてＡｒｇとＣｉｔの交換によって作製した、ＣＸＣＲ４に対して親和性のない環状ペプチドを、化合物／単量体Ａを有する二量体に導入すると、対応する高親和性単量体単独および対応するホモ二量体（Ａ_２１）と類似した、またはほんの少し低下した親和性が示されることが実証された（下記参照）。

ホモ二量体Ａ_２１は、上記の４．１に示しており、４．３±０．３ｎＭのＩＣ５０を有する。

４．６． したがって、ＣＸＣＲ４受容体に対して高い親和性を有する多量体化合物（例えば、二量体、三量体、四量体およびそれより大きいオリゴマー（デンドリマー）など）が作製され得る。このような多量体は、種々のスペーサーおよび／またはリンカー部分にカップリングされた単量体の環状ペンタペプチドを用いて合成される。スペーサーは、該環状ペプチド内のアミノ酸（Ｏｒｎ、Ｄ−ＯｒｎまたはＮＭｅ−Ｄ−Ｏｒｎなど）に連結される。さまざまなスペーサー、例えば、ジカルボン酸、アミノ酸（リシン、グルタミン酸）およびアミノ酸鎖（小分子ペプチド）、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）またはアルキンが使用され得る。このようなリンカーは、ａ）多数の単量体ペプチドリンカー単位、およびｂ）シグナル伝達単位、例えば、放射性標識基（放射性金属含有キレート化剤もしくは補欠分子族（ｐｒｏｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）など）、または錯体構築物の１つに対する蛍光基のカップリングを可能にする多数の官能基を有する。

いくつかのかかるアプローチを、一例として以下に概略的に示す。

上記概略図は、該環状ペプチドに対するスペーサーのカップリングのための異なるストラテジーを示す。上側の図では、修飾チロシンがスペーサーのカップリングに使用されている。また、Ｔｙｒは、スペーサーを非修飾Ｔｙｒに直接結合されるようにＯ−アルキル化されていてもよい。また、結合のための官能基を提供するため、Ｃｙｓなどの他のアミノ酸を導入してもよい。マレイミドまたはチオエーテルの形成、ならびに特にα−ハロケトンおよびα−ハロアミドとの反応は、このアミノ酸にスペーサーを導入するのに好適な修飾である（概略図の下側の例）。

４．７． いくつかのカルボン酸系スペーサーを以下に示す。

スペーサーおよび／またはリンカー基のこれらの例に加え、さらなるスペーサー、すなわち、アルコールまたはハロゲンによるカルボン酸残基の１つまたは２つの定型的な（ｆｏｒｍａｌ）交換によって作製される、アルキル化のためのスペーサーが好適なリンカーまたはスペーサーである。アミノ酸鎖または小分子の線状ペプチドもまた、考えられ得るリンカーおよび／またはスペーサーである。

４．８． また、驚くべきことに、該環状オリゴペプチド内のＯｒｎの側鎖に大型の嵩高い基が直接連結されていることは、例えば、以下の単量体の例で示されるように、親和性に有意に影響しないこともわかった。

この知見により、さまざまな官能基を含み、必ずしも大きさまたは嵩に制限がなく、かつ結合体の薬物動態学特性および薬力学特性を改変するために他のオリゴペプチド、標識、細胞傷害性部分および他の基を結合するためのリンカーおよびスペーサーによって環状オリゴペプチドを結合させ、二量体および多量体にするさらなる可能性が開かれる。

４．８． 結論として、図５に概略的に示した構築物は、ＣＸＣＲ４受容体が関与している状態において、治療的および診断的介入のための有意な影響を有することが期待される。図５の構築物は、親和性が比較的高い２つの単量体のホモ二量体がリンカー基によってともに連接されて構成されている。リンカー基は少なくとも三官能性であり、^１８Ｆを有する置換基またはキレート化剤（ＤＯＴＡなど）との錯体状態の放射性金属のいずれかの形態である放射性標識を、任意選択のスペーサー基によってカップリングさせることを可能にするものである。

多量体化は、多数のペプチド単位またはペプチド−スペーサー単位を、多官能性部分（すなわち、リンカー）（これは、シグナル伝達単位／検出可能な標識のカップリングのためにも使用される）にカップリングさせることによって行なわれ得ることは認識されよう。さらに、リンカーの構造は非常に柔軟性であり得、したがって、例えば、糖（この場合、ＯＨ官能基はアルキル化されている）、またはオリゴ−もしくはポリアミンまたはオリゴ−もしくはポリアミノオキシ官能性付与された分子、ペプチドもしくは樹脂からなるものであってもよいことは容易に理解されよう。

多量体は、多数のペプチド単位またはペプチド−スペーサー単位を単一のリンカーにカップリングさせることによって、または多数のリンカーのカップリングによって作製され得る。したがって、一実施形態において、３つの三官能性リンカーが、４つのオリゴペプチド単位およびキレート化剤（ＤＯＴＡ）とともに直列に連接され、構築物（Ｐ１−スペーサー）_２−リンカー−リンカー（ＤＯＴＡ）−リンカー−（スペーサー−Ｐ１）_２が形成される。

オリゴペプチドまたはポリアミンなどの多官能性リンカーにより、多数の環状オリゴペプチドが同じリンカーに、必要に応じて検出可能な標識ととも連接され得るだけでなく、多数のリンカーが互いにカップリングされることもあり得ることは理解されよう。したがって、別の実施形態では、各々が典型的には２つ以上の環状オリゴペプチド部分を有する多数のリンカーをカップリングさせる。したがって、２つのリンカー基間のカップリングにより二量体は四量体に変換され得る。かかるリンカー−リンカーカップリングは、さらなるスペーサー基によるものであってもよい。デンドリマーなどの高次多量体が、かかる乗法的合成アプローチによって作製され得ることは認識されよう。かかる多量体によって、有意に高い結合親和性および選択性が得られる可能性がもたらされ、さらに、化合物の特性を変更するためのさらなる基の結合のための有意な機会がもたらされる。

新規な環状オリゴペプチド単量体に関して本明細書に示した結果は、かかるオリゴペプチドを含む二量体または高次多量体で得られるであろう結果の例示である。また、本発明による二量体は、既知の環状オリゴペプチドＣＸＣＲ４リガンドを含むものであってもよく、本明細書において、比較的弱い結合性オリゴペプチドを使用した場合であっても、ＣＸＣＲ４受容体親和性において驚くべき改善が得られ得ることが示された。

さらに、本明細書に記載した二量体の結果は、該環状オリゴペプチドの三量体および高次多量体で予測され得る結果の例示であることは認識されよう。

実施例５−ＣＸＣＲ４結合性環状オリゴペプチドとキレート化剤との結合体の作製
当業者なら、本発明による環状オリゴペプチド、適当なスペーサー部分（好ましくは、本明細書に記載のリンカー部分の１つ）、キレート化剤または放射性金属の錯体形成に適した他の部分の多量体からなる構築物または結合体を容易に作製することができよう。典型的には、近年の数多くの刊行物に記載されているように、例えばＤＯＴＡを、リンカーを有する完全に保護されたオリゴペプチドに、標準的な活性化手順を用いた三重保護（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル三重保護）ＤＯＴＡの使用、または予め活性化したＤＯＴＡ種（例えば、ＤＯＴＡのモノ−、ジ−、トリ−もしくはテトラＮ−スクシンイミジルエステルもしくは４−ニトロフェニルエステル）の使用のいずれかによってカップリングさせる。あるいはまた、この目的は、標準的なペプチドカップリング条件を用いて達成され得る。

同様に、ＴＥＴＡまたはＤＴＰＡなどの他のキレート化剤／錯体形成部分をカップリングさせてもよい。また、ＤＴＰＡは、環状のビス無水物を用いてカップリングさせ得る。また、明らかに、キレート化剤をスペーサーに予めカップリングさせ、したがって最終工程でペプチド−スペーサー結合の形成がもたらされるようにしてもよい。

好適なアプローチの一例としては、本明細書に記載のＤＯＴＡ−Ａｈｘ−Ａｓｐリンカー−キレート化剤結合体を主成分とする化合物が挙げられよう。このような化合物は、関連する金属を放射性医薬品にキレート化する能力を示す（ＩｎＤＯＴＡ類似体での結果に示すように）が、依然として、標的ＣＸＣＲ４受容体に対して強い結合能力を示す（表１０）。

また、キレート化剤または錯化剤のカップリングは、当業者により、放射性医薬品の分野で確立された充分報告されたカップリング手順を用いて行なわれ得る。他のカップリング経路（オキシムまたはヒドラゾンの形成など）、ならびに他の選択的な方法（チオールとマレイミドとの反応など）の使用により、同様の結果が達成され得る。

前述の実施例は、本発明の具体的な実施形態を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。本明細書に挙げた文献はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。

参考文献

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。