JP2015158473A - 気道内炎症検査用バイオマーカー - Google Patents
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Abstract
【課題】気道内炎症を迅速に精度よく診断するバイオマーカーの提供。
【解決手段】LRGからなる、気道内炎症検査用バイオマーカーなど。
【選択図】なし
【解決手段】LRGからなる、気道内炎症検査用バイオマーカーなど。
【選択図】なし
Description
本発明は、気道内炎症検査用バイオマーカーに関する。より詳しくは、ロイシンリッチα２グリコプロテイン（leucine rich alpha 2 glycoprotein:LRG）からなる気道内炎症検査用バイオマーカーに関し、さらに該バイオマーカーを検出又は定量することによる気道内炎症の検査方法に関する。
LRGは血清タンパク質のひとつで、約５０kDaの糖タンパク質であり、好中球から分泌されることが報告されている（非特許文献１）。過去に発明者らは潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis:UC)、クローン病(Crohn’s disease:CD)、関節リウマチにおいて血中LRG濃度が新規炎症性マーカーとなること、そして、従来の炎症マーカーであるC-reactive protein(CRP)よりもLRGの方がこれらの疾患活動性に対して強く相関するため、優れた疾患活動性マーカーとなり得る事を報告した(非特許文献２、３)。また、発明者らは血清LRG濃度を定量する事が結核の検査用バイオマーカーとなり得ることも報告している(特許文献１)。
気管支喘息は、慢性の気道内炎症（主として好酸球性炎症）、気流制限、気道過敏性の亢進を病態の基盤に有し、発作性に、呼吸困難、喘鳴、咳などの呼吸器症状をきたす症候群である。気管支喘息の病態は複雑であり、一部IgEが関与する型も存在するが、不明な点が多い疾患である。さらに、気管支喘息を含めた気道内炎症においては炎症を把握するバイオマーカーが開発されていないため、気道内炎症を的確に評価することが可能なバイオマーカーの開発が望まれている。LRGは、自己免疫疾患や結核のバイオマーカーとなりうることは開示されているものの、気道内炎症との関係性についての報告はこれまでにされていない。
J Leukoc Biol. 72(3):478-85 (2002)
Ann Rheum Dis. 69(4):770-4 (2010)
Inflamm Bowel Dis. 18(11):2169-79 (2012)
本発明は、気道内炎症を迅速に精度よく診断するバイオマーカーを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、検討を重ねた結果、気道内炎症患者の喀痰中のLRG濃度が対照としての慢性咳嗽患者と比較して有意に高いことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下よりなる。
［１］LRGからなる、気道内炎症検査用バイオマーカー；
［２］生体から分離した検体について、前記［１］に記載のバイオマーカーを検出または定量することを特徴とする気道内炎症検査方法；
［３］検体が喀痰である、前記［２］に記載の気道内炎症検査方法；
［４］下記（a）または（b）：
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を用いて検出または定量することを特徴とする、前記［２］又は［３］に記載の気道内炎症検査方法；
［５］下記（a）および／または（b）：
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を含有してなる、気道内炎症検査用キット。
［１］LRGからなる、気道内炎症検査用バイオマーカー；
［２］生体から分離した検体について、前記［１］に記載のバイオマーカーを検出または定量することを特徴とする気道内炎症検査方法；
［３］検体が喀痰である、前記［２］に記載の気道内炎症検査方法；
［４］下記（a）または（b）：
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を用いて検出または定量することを特徴とする、前記［２］又は［３］に記載の気道内炎症検査方法；
［５］下記（a）および／または（b）：
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を含有してなる、気道内炎症検査用キット。
本発明のLRGからなる気道内炎症検査用バイオマーカーは、気道内炎症の検査用バイオマーカーとなりうる。LRGをバイオマーカーとして検出又は定量することにより、気道内炎症の検査を行うことができる。
本発明の気道内炎症検査用バイオマーカーは、LRGからなる。ここでLRGとは、約50kDaの糖タンパク質であり、健常人血清では約3.0μg/mL濃度含まれていることが知られている。また、LRGは好中球から分泌されることが報告されている（非特許文献１）。また、LRGは顆粒球で発現することも報告されているが、LRGの発現はIL-6の刺激により誘導されるものではない。かかるLRGは、ベーチェット病、キャッスルマン氏病又は関節リウマチ等の自己免疫疾患、潰瘍性大腸炎、結核のバイオマーカーとなりうることが、本発明者らにより報告されている（非特許文献２、３、特許文献１）。
本発明は、生体から分離した検体について、LRGを検出または定量することを特徴とする気道内炎症検査方法を提供する。気道内炎症としては、気道内に炎症が生じる疾患であれば特に制限されないが、例えば、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺炎等が挙げられる。
本発明の検査方法において検出または定量されるLRGタンパク質のアミノ酸配列は公知であり（GenBank Accession No.NP_443204.1）、本発明においては、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有していてもよい。また、当該タンパク質をコードするDNA配列も公知であり（GenBank Accession No.NM_052972.2）、例えば、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸であってもよい。本発明の検査方法において検出または定量されるLRGは、タンパク質を構成するアミノ酸配列が、上記で特定されるアミノ酸配列であってもよいし、当該アミノ酸配列とは１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されていても良い。さらには、LRGタンパク質全体であってもよいし、部分タンパク質であってもよい。以下、本明細書において「LRGタンパク質」とは、上述のように、GenBank Accession No.NP_443204.1で特定されるアミノ酸配列、又は前記特定されるアミノ酸配列とは１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されているアミノ酸配列から構成されるタンパク質や、LRGの部分タンパク質も含む意味で用いられる。また、本発明の検査方法において検出または定量されるLRGの転写産物は、上記LRGをコードする塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を含有するDNAなどが挙げられる。LRGをコードする塩基配列と実質的に同一なDNAとしては、例えば、該塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、特に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが挙げられる。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center forBiotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
本発明の検査方法が適用できる生体は、特に制限されないが、例えば、気道内炎症に罹患しているおそれがある生体、もしくは罹患していることが疑われる生体、あるいは現に気道内炎症に罹患している生体であって、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
本発明の検査方法に用いられる検体としては、検査対象である上記生体から分離されるものであって、検出または定量する対象であるLRG遺伝子産物（例、RNA、タンパク質、その分解産物など）を含有し得る組織または分泌物等であれば特に制限されない。例えば、咽頭、喉頭または気管支の粘膜組織、ならびに該粘膜組織からの分泌物（例えば、喀痰）などが挙げられるが、好ましくは、咽頭、喉頭または気管支の粘膜組織からの分泌物、より好ましくは、喀痰である。
生体から分離した検体におけるLRGの検出または定量は、該検体からRNA（例：全RNA、mRNA）画分を調製し、該画分中に含まれるLRG遺伝子の転写産物を検出または定量することにより調べることができる。
従って、一実施態様において、本発明の検査方法は、LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて測定することを特徴とする。
従って、一実施態様において、本発明の検査方法は、LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて測定することを特徴とする。
RNA画分の調製は、グアニジン−CsCl超遠心法、AGPC法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のRNA抽出用キット（例：RNeasy Mini Kit；QIAGEN製等）を用いて、微量検体から迅速且つ簡便に高純度の全RNAを調製することができる。RNA画分中のLRG遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、DNAチップ解析等）を用いる方法、あるいはPCR（RT−PCR、競合PCR、リアルタイムPCR等）を用いる方法などが挙げられる。微量検体から迅速且つ簡便に定量性よくLRG遺伝子の発現変動を検出できる点で競合PCRやリアルタイムPCRなどの定量的PCR法が好ましい。
ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、LRG遺伝子の検出は、例えば、LRGの転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブを用いて行うことができる。そのような核酸プローブは、前述の公知のLRGヌクレオチド配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２００塩基、いっそう好ましくは約１８〜約５０塩基の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列をふくむポリヌクレオチドである。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。
また、本発明の検査方法に用いられる核酸プローブは、前述の公知のLRGに示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J． Sambrook et al．， Cold Spring Harbor Lab．Press，1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×SSC/０．１％SDS中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
LRG遺伝子の発現を検出し得るプローブとして機能する核酸は、該遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得る後述するプライマーセットを用い、生体（例：ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など］由来のcDNAもしくはゲノムDNAを鋳型としてPCR法によって所望の長さの核酸を増幅するか、前記した細胞・組織由来のcDNAもしくはゲノムDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション等により上記LRG遺伝子もしくはcDNAをクローニングし、必要に応じて制限酵素等を用いて適当な長さの断片とすることにより取得することができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。あるいは、該核酸は、公知のLRGに示される塩基配列情報に基づいて、該塩基配列および／またはその相補鎖配列の一部もしくは全部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによっても得ることができる。
該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔32P〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したRNA画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、特異的にハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、LRG遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、RNA画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し、スポットの標識量を測定することにより、LRG遺伝子の発現量を測定することができる。
別の好ましい実施態様によれば、LRG遺伝子の発現を測定する方法として定量的PCR法が用いられる。定量的PCRとしては、例えば、競合PCRやリアルタイムPCRなどがある。
PCRにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、例えば、LRGの転写産物を特異的に検出し得る核酸プライマーを挙げることができる。１つの好ましい態様においては、本発明の検査方法に用いられる核酸プライマーとしては、例えば、公知のLRGに示されるヌクレオチド配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約５０塩基、より好ましくは約１５〜約３０塩基、いっそう好ましくは約１５〜約２５塩基の連続したヌクレオチド配列の長さを有し、約１００bp〜数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたポリヌクレオチド（センス鎖）配列に相補的なポリヌクレオチド、及び前記のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのセットが挙げられる。
PCRにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、例えば、LRGの転写産物を特異的に検出し得る核酸プライマーを挙げることができる。１つの好ましい態様においては、本発明の検査方法に用いられる核酸プライマーとしては、例えば、公知のLRGに示されるヌクレオチド配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約５０塩基、より好ましくは約１５〜約３０塩基、いっそう好ましくは約１５〜約２５塩基の連続したヌクレオチド配列の長さを有し、約１００bp〜数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたポリヌクレオチド（センス鎖）配列に相補的なポリヌクレオチド、及び前記のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのセットが挙げられる。
あるいは、生体から分離した検体におけるLRGの検出または定量は、該検体からタンパク質画分を調製し、該画分中に含まれる該遺伝子の翻訳産物（即ち、LRG）を検出または定量することにより調べることができる。LRGの検出または定量は、LRGを特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ELISA、FIA、RIA、ウェスタンブロット等）によって行うこともできる。
従って、一実施態様において、本発明の検査方法は、LRGの翻訳産物を特異的に検出し得る抗体を用いて測定することを特徴とする。
従って、一実施態様において、本発明の検査方法は、LRGの翻訳産物を特異的に検出し得る抗体を用いて測定することを特徴とする。
LRGを特異的に認識する抗体は、LRGポリペプチドやその抗原性を有する部分ペプチド、具体的には、前述の公知のLRGに示されるペプチド配列の全部またはエピトープに当たる部分を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF（ab’）２、Fab’、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。また、本発明においては、LRGを特異的に認識する抗体として、市販の抗LRG抗体または抗LRG抗体を含むキットを使用することもまた好ましい。例えば、Anti-Human LRG (329) Rabbit IgG Affinity Purify（タカラバイオ株式会社）、Human LRG Assay Kit(IBL社)等を用いることができる。
個々の免疫学的測定法を本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてLRGの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
また、別の実施態様では、LRGの検出は、ハイスループットなタンパク質の発現・定量解析が可能なiTRAQTM試薬（ABI社）及び質量分析計の組み合わせによりプロテオーム解析を用いて測定することを特徴とする。
本発明の気道内炎症検査方法において、LRGの検出又は定量により、気道内炎症の検査を行うことができる。具体的には、以下の工程を含む方法であってよい。
（１）対照群および被験者の生体から分離した検体についてLRGを検出または定量する工程、
（２）対照群で検出または定量されたLRGと被験者で検出または定量されたLRGを比較する工程。
（１）対照群および被験者の生体から分離した検体についてLRGを検出または定量する工程、
（２）対照群で検出または定量されたLRGと被験者で検出または定量されたLRGを比較する工程。
後述の実施例に示されるように、慢性咳嗽患者（対照群）と比較して気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患または両疾患を併発した患者において喀痰中のLRG濃度が高い。気道内炎症の検査は、LRGの濃度と気道内炎症への罹患率との間のこのような正の相関に基づき行われる。
例えば、気道内炎症を発症していない対照群及び被験者からの検体におけるLRGの濃度を定量し、被験者からの検体におけるLRGの濃度を、対照群からの検体におけるLRGの濃度と比較する。あるいは、LRGの濃度と気道内炎症の発症の有無との相関図をあらかじめ作成しておき、被験者におけるLRG濃度をその相関図と比較してもよい。濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
そして、被験者においてLRGが、対照群に比べて高値で検出若しくは定量された場合には、上記のような気道内炎症を発症している可能性が高いと判断することができる。従って、本発明の検査方法は、上記（１）、（２）の工程に加えて、（３）被験者においてLRGが、対照群に比べて高値で検出若しくは定量された場合には、気道内炎症を発症していると判断する工程を含んでもよい。
さらに、本発明は、気道内炎症検査用のキット（診断剤）にも及ぶ。本発明の気道内炎症検査用キットは、上述の本発明の検査方法を簡便に実施するためのキットであればよく、特に限定されない。該検査するためのキットは、
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー、および／または
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を含有してなる。該判定するためのキットが２以上の上記核酸および／または抗体を含む場合、各核酸または抗体は互いにLRG遺伝子の塩基配列上の異なる部分を特異的に認識、またはLRGの異なるエピトープを特異的に認識し得るものである。
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー、および／または
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を含有してなる。該判定するためのキットが２以上の上記核酸および／または抗体を含む場合、各核酸または抗体は互いにLRG遺伝子の塩基配列上の異なる部分を特異的に認識、またはLRGの異なるエピトープを特異的に認識し得るものである。
本発明のキットが前記（a）の核酸を含有する試薬を構成として含む場合、該核酸としては、本発明の検査方法において前記したプローブ用核酸もしくはプライマー用オリゴヌクレオチドが挙げられる。
LRG遺伝子の発現を検出し得る核酸は、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。標識プローブとして用いられる場合、該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
該検査するためのキットに含有される核酸は、同一の方法（例：ノーザンブロット、ドットブロット、DNAアレイ技術、定量RT-PCR等）によりLRG遺伝子の発現を検出し得るように構築されていることが特に好ましい。
本発明のキットが前記（b）の抗体を含有する試薬を構成として含む場合、該抗体としては、本発明の検査方法において前記した抗体が挙げられる。
本発明のキットを構成する試薬は、LRG遺伝子の発現を検出し得る核酸や抗体に加えて、該遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、LRG遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、LRG遺伝子の発現を検出するための反応がPCRの場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ等が挙げられる。競合PCRやリアルタイムPCRを用いる場合は、competitor核酸や蛍光試薬（上記インターカレーターや蛍光プローブ等）などをさらに含むことができる。また、LRG遺伝子の発現を検出するための反応が抗原抗体反応の場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、competitor抗体、標識された二次抗体（例えば、一次抗体がウサギ抗ヒトLRG抗体の場合、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等で標識されたマウス抗ウサギIgGなど）、ブロッキング液等が挙げられる。プロテオーム解析による場合は、市販の試薬、例えばiTRAQTM試薬やICATTM試薬（いずれもABI社）などを用いることができる。
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではないことは明らかである。
（実施例１）気道内炎症患者のELISA法による喀痰中LRGの評価
慢性咳嗽(chronic cough)患者(n=10)、気管支喘息患者(n=14)、慢性閉塞性肺疾患患者(COPD)(n=14)、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患を併発した患者(Overlap)(n=10)より誘発痰を回収し、遠心上清中のLRG濃度をELISA法により定量した。抗ヒトLRGモノクローナル抗体を作成するため、CHO細胞に発現、精製した遺伝子組み換えヒトLRGタンパク質をマウスに免疫し、ヒトLRGを認識するモノクローナル抗体の樹立を試み、複数のクローンを樹立した。これらの抗ヒトLRGモノクローナル抗体を組み合わせることでヒトLRGを定量出来るサンドイッチELISAの構築を試み、抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC346-3)を固相化抗体、別の抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC390)を検出用抗体としてヒトLRGを定量するサンドイッチELISAを行った。96ウェルプレートに抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC346-3)を固相化し、1%BSA/PBSでブロッキング後、10倍希釈した誘発痰上清を添加しインキュベートした。洗浄後、HRP標識抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC390)を加えてインキュベート後、洗浄し、発色液としてTMBを加え30分発色させた。停止液として1N HClを添加し、プレートリーダーで450nmを測定した(副波長630nmも測定し、450nmでの吸光度から引き算した)。該結果をもとに、疾患別に誘発痰上清中LRG濃度の比較解析を行った。
慢性咳嗽(chronic cough)患者(n=10)、気管支喘息患者(n=14)、慢性閉塞性肺疾患患者(COPD)(n=14)、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患を併発した患者(Overlap)(n=10)より誘発痰を回収し、遠心上清中のLRG濃度をELISA法により定量した。抗ヒトLRGモノクローナル抗体を作成するため、CHO細胞に発現、精製した遺伝子組み換えヒトLRGタンパク質をマウスに免疫し、ヒトLRGを認識するモノクローナル抗体の樹立を試み、複数のクローンを樹立した。これらの抗ヒトLRGモノクローナル抗体を組み合わせることでヒトLRGを定量出来るサンドイッチELISAの構築を試み、抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC346-3)を固相化抗体、別の抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC390)を検出用抗体としてヒトLRGを定量するサンドイッチELISAを行った。96ウェルプレートに抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC346-3)を固相化し、1%BSA/PBSでブロッキング後、10倍希釈した誘発痰上清を添加しインキュベートした。洗浄後、HRP標識抗ヒトLRGモノクローナル抗体(クローンC390)を加えてインキュベート後、洗浄し、発色液としてTMBを加え30分発色させた。停止液として1N HClを添加し、プレートリーダーで450nmを測定した(副波長630nmも測定し、450nmでの吸光度から引き算した)。該結果をもとに、疾患別に誘発痰上清中LRG濃度の比較解析を行った。
誘発痰上清中のLRG濃度は、慢性咳嗽患者においては10例中9例で検出限界以下であり、1例においてLRGが検出された。ただし、LRGが検出された慢性咳嗽患者は、胃食道逆流症（gastro-esophageal reflux disease：GERD）の疑いがあり、疾患コントロール群として適していない可能性がある。慢性咳嗽患者と比較して、気管支喘息患者の喀痰上清中においては、LRG濃度が有意に上昇していることが明らかとなった。慢性閉塞性肺疾患、及び、気管支喘息患者と慢性閉塞性肺疾患を重複する患者においても、喀痰上清中にLRGが検出されていた。LRGは炎症局所で産生される糖タンパク質であるが、慢性咳嗽患者の各痰上清中にLRGが検出されにくいことを考慮すると、喀痰上清中のLRGを定量する事は気道内炎症を正確に把握することが可能となることを意味しているため、喀痰上清LRGはこれまでに無い有用性の高いマーカーである事を意味している。喀痰上清中のLRG濃度を測定するにより、呼吸器疾患の気道内炎症を検出する事により治療方針の補助にもなるため非常に有用性が高いことが示唆された。
（実施例２）
LRGが気道内炎症に応じて喀痰中に分泌される機序に関して、OVA吸入喘息誘導マウスを用いて検討した。OVA吸入喘息誘導マウスとしては、C57BL/6マウスに、OVA 10μg＋Alumを２週間間隔で２回腹腔内投与することで感作し、最終感作２週後から３日連続で１％OVAをネブライザーで吸入曝露し、４８時間後に気道過敏性を測定、気管支肺胞洗浄（total 1ml)を行い、併せて採血および肺の摘出を行った。一方、コントロールマウスとしては、C57BL/6マウスに、生理食塩水を２週間間隔で２回腹腔内投与し、最終投与２週後から３日連続で生理食塩水をネブライザーで吸入曝露し、OVA吸入喘息誘導マウスと同様、４８時間後に気道過敏性を測定、気管支肺胞洗浄（total 1ml)を行い、併せて採血および肺の摘出を行った。
マウス気管支肺胞洗浄液（BALF）中のLRG濃度を測定したところ、コントロールマウス(Control)と比較してOVA吸入喘息誘導マウス（BA）において有意にLRG濃度が上昇していることが明らかになった（図２）。一方、血清LRG濃度では両者の間に有意差を認めなかった。この結果は、喘息誘導マウスにおいて気道の炎症局所からLRGが産生され、気道内腔へと放出されたことを意味している。また、喘息誘導後のマウス肺において、免疫組織化学染色によりLRGを同定したところ、気道上皮細胞の一部においてLRG産生が認められた（図３）。さらにPAS染色により粘液産生細胞を同定したところ、気道上皮の杯細胞（粘液産生細胞）からLRGが産生され、粘液中に存在することが分かった（図４）。この結果より、ヒトにおいても炎症に起因する気道上皮細胞の杯細胞化により、LRGが産生され喀痰中に分泌されることが考察される。
LRGが気道内炎症に応じて喀痰中に分泌される機序に関して、OVA吸入喘息誘導マウスを用いて検討した。OVA吸入喘息誘導マウスとしては、C57BL/6マウスに、OVA 10μg＋Alumを２週間間隔で２回腹腔内投与することで感作し、最終感作２週後から３日連続で１％OVAをネブライザーで吸入曝露し、４８時間後に気道過敏性を測定、気管支肺胞洗浄（total 1ml)を行い、併せて採血および肺の摘出を行った。一方、コントロールマウスとしては、C57BL/6マウスに、生理食塩水を２週間間隔で２回腹腔内投与し、最終投与２週後から３日連続で生理食塩水をネブライザーで吸入曝露し、OVA吸入喘息誘導マウスと同様、４８時間後に気道過敏性を測定、気管支肺胞洗浄（total 1ml)を行い、併せて採血および肺の摘出を行った。
マウス気管支肺胞洗浄液（BALF）中のLRG濃度を測定したところ、コントロールマウス(Control)と比較してOVA吸入喘息誘導マウス（BA）において有意にLRG濃度が上昇していることが明らかになった（図２）。一方、血清LRG濃度では両者の間に有意差を認めなかった。この結果は、喘息誘導マウスにおいて気道の炎症局所からLRGが産生され、気道内腔へと放出されたことを意味している。また、喘息誘導後のマウス肺において、免疫組織化学染色によりLRGを同定したところ、気道上皮細胞の一部においてLRG産生が認められた（図３）。さらにPAS染色により粘液産生細胞を同定したところ、気道上皮の杯細胞（粘液産生細胞）からLRGが産生され、粘液中に存在することが分かった（図４）。この結果より、ヒトにおいても炎症に起因する気道上皮細胞の杯細胞化により、LRGが産生され喀痰中に分泌されることが考察される。
以上詳述したように、本発明のLRGは、気道内炎症の検査用バイオマーカーとなりうる。LRGをバイオマーカーとして、検出又は定量することにより、上記気道内炎症の検査を行うことができる。本出願は、日本で出願された特願２０１４−００９７１３（出願日：平成２６年１月２２日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (5)
- LRGからなる、気道内炎症検査用バイオマーカー。
- 生体から分離した検体について、請求項１に記載のバイオマーカーを検出または定量することを特徴とする気道内炎症検査方法。
- 検体が喀痰である、請求項２に記載の気道内炎症検査方法。
- 下記（a）または（b）：
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を用いて検出または定量することを特徴とする、請求項２又は３に記載の気道内炎症検査方法。 - 下記（a）および／または（b）：
（a）LRG遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（b）LRGを特異的に認識する抗体
を含有してなる、気道内炎症検査用キット。
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