JP6425397B2 - Nlrr1細胞外ドメインタンパク質を検出する方法 - Google Patents
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Description
(i)被験体由来の血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを測定するステップ、及び
(ii)測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを標準と比較するステップ、
を含み、測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが標準よりも高い場合には、前記被験体が疾患に罹患していると決定する前記方法。
[2] 疾患が、神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫、副甲状腺癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫及び神経疾患からなる群より選択される、[1]に記載の方法。
[3] 疾患が神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、前立腺癌又は骨肉腫である、[2]に記載の方法。
[4] 疾患が神経芽腫である、[3]に記載の方法。
[5] 被検体が1歳未満である、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 被検体が1歳以上5歳未満である、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[7] 被検体が5歳以上である、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[8] 被験体の神経芽腫のステージを決定するための検査方法であって、以下のステップ、
(i)神経芽腫を有する被験体由来の血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを測定するステップ、及び
(ii)測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを標準と比較するステップ、
を含み、測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが、標準よりも低い場合には神経芽腫がステージ1であると決定し、標準よりも高い場合には神経芽腫がステージ2〜4であると決定する、前記方法。
[9] 血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを、抗NLRR1細胞外ドメイン抗体又はその抗原結合断片を用いて測定する、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 抗NLRR1細胞外ドメイン抗体がモノクローナル抗体及び/又はポリクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片である、[9]に記載の方法。
[11] 抗NLRR1細胞外ドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、疾患診断用キット。
[12] 抗NLRR1細胞外ドメイン抗体がモノクローナル抗体及び/又はポリクローナル抗体である、[11]に記載のキット。
[13] 疾患が、神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、内分泌系癌、下垂体腺腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、尿管癌、精巣癌、副腎の癌、リンパ腫、肝臓癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、咽頭癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮筋腫、乳頭癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、軟組織肉腫、骨肉腫及び神経疾患からなる群より選択される、[11]又は[12]に記載のキット。
[14] さらにNLRR1細胞外ドメインタンパク質を標準物質又は陽性対照として含む、[11]〜[13]のいずれかに記載のキット。
[15] 抗NLRR1細胞外ドメイン抗体を含む疾患診断用キットの製造における、NLRR1細胞外ドメインタンパク質の使用。
[16] 疾患が神経芽腫である、[15]に記載の使用。
[17] NLRR1細胞外ドメインタンパク質を含む神経芽腫診断用マーカー。
本発明は、血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを測定する方法を提供する。これにより各種疾患を診断でき、また予後を判定することができる。
本願明細書においてNLRR1タンパク質の細胞外ドメイン、NLRR1細胞外ドメインタンパク質、NLRR1細胞外ドメイン、細胞外NLRR1タンパク質、NLRR1細胞外ドメインペプチド、細胞外NLRR1ペプチドは同義に用いるものとする。本願明細書においてこれをexN1と記号で表すことがある。NLRR1タンパク質の全長アミノ酸配列は配列番号1に示すとおりである。ある実施形態においてNLRR1細胞外ドメインタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸1位〜632位であり得る。しかしながら、本発明において用いるNLRR1細胞外ドメインタンパク質はこれに限れらず、1又は数個のアミノ酸配列がN末端及び/又はC末端からさらに欠失しているものであってもよい。本明細書で核酸又はアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加若しくは修飾に関連して用いる「1又は数個」とは、通常1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、例えば1〜4個、例えば1〜3個、例えば1〜2個をいう。本願明細書において「NLRR1細胞外ドメインタンパク質」という場合、これには前記のような欠失変異体も包含されるものとする。
本発明は、NLRR1タンパク質に関連する疾患の診断方法を提供する。この方法には、NLRR1細胞外ドメインタンパク質を検出する手段を用いる。被検体由来のサンプル血漿中から検出されたNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルは、適当な標準と比較することができる。これにより該被検体が疾患に罹患しているか決定することができる。検出はNLRR1細胞外ドメイン検出手段とサンプルとを接触させることにより行う。検出方法としては、抗原抗体反応を利用したあらゆる方法、例えば免疫沈降法、ELISA法、サンドイッチELISA法などが挙げられる。
本発明者らは、1歳未満の健常者ではNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが低いことを見出した(図4)。また本発明者らは1歳未満の神経芽腫患者に関し、ステージ2、3、4の患者由来の血漿サンプルにおいて、NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが有意に増大していることを見出した(図6)。本願明細書において「有意に」とは、統計学的有意性があることをいう(例えばp<0.05)。逆にステージ1の患者ではNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルは低いままであった。これらのことから、1歳未満の乳幼児の血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが標準よりも有意に高い場合は、当該乳幼児が神経芽腫を有すると診断し得る。さらに当該神経芽腫のステージを決定することができる。特に断らない限り本願明細書においてNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが標準よりも高い、とは標準よりも有意に高いことを意味するものとする。また、1歳未満の神経芽腫患者の血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを測定することにより、神経芽腫のステージを決定することができる。これに基づいて当該被験者の予後を「判定」することもできる。ステージ1であれば予後は良好、ステージ2〜4であれば予後は不良と判定しうる。本発明の方法により、医師の判断を介することなく、神経芽腫のステージをin vitroの工程のみで決定することができる。
本発明の検査方法では、用いる条件に応じて適当なカットオフ値を設定しても良い。カットオフ値とは、その値未満の検体を陰性とし、その値以上の検体を陽性とする任意に設定された閾値をいう。カットオフ値を高く設定すると一般に特異度は上がるが感度は下がる。逆にカットオフ値を低く設定すると感度を高めることができるが特異度は下がる。感度が高いとは、陽性と判定されるべきもの(真陽性)を正しく陽性と判定する可能性が高いことをいう。特異度が高いとは、ある検査において陰性の検体を正しく陰性と判定する確率が高いことをいう。
本発明者らは(ii)健常者における血中でのNLRR1細胞外ドメインのレベルが年齢によって異なることを見出した。成人ではNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルは低い。また1歳未満の幼児ではNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルは低く、逆に1歳〜5歳児ではNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルは高い。さらに(iv)1歳未満の神経芽腫患者については、ステージ1の神経芽腫患者はNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルは低く、ステージ2、3、4の神経芽腫患者はNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが増大していた。
本発明者らは以前に、抗NLRR1モノクローナル抗体を用いることにより、神経芽腫、皮膚癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、腺癌、扁平上皮癌、前立腺癌、及び骨肉腫においてNLRR1タンパク質の発現が増大していることを確認した。この以前の知見、及び本願明細書中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質に関する新たな知見(i)〜(v)に鑑みれば、これらの癌細胞ではNLRR1タンパク質の発現が増大していることから、それに応じ血中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルも増大していると合理的に考えられる。したがって、被検体由来の血漿サンプル中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを測定することにより、当該被検体がこれらの癌を有するか否か診断又は決定することができる。
本発明のNLRR1細胞外ドメイン検出には、NLRR1細胞外ドメインを特異的に検出できる限り、どのような検出手段を用いてもよい。ある実施形態において、NLRR1細胞外ドメインタンパク質を検出するためには、抗NLRR1細胞外ドメイン抗体又はその抗原結合断片を用いることができる。該抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、場合によってはサンドイッチELISA法などのように、これらを組み合わせて用いることもできる。検出はNLRR1細胞外ドメイン検出手段(例えば抗体)とサンプルとを接触させることにより行う。次いで抗体を用いる場合、抗原抗体反応により生じた複合体を慣用の手法、例えばイムノアッセイ法により検出する。サンプルは適当に希釈、濃縮又は緩衝化したものであってもよい。サンプルを電気泳動等により分離し、その後抗体等を用いて検出を行ってもよい。または先に抗体を作用させ、その後、場合により分離手段を用いてもよく、その後検出を例えば2次抗体を用いて行うこともできる。検出に際し検体の測定レベルを、陰性対照、陽性対照又は標準物質の測定レベルと比較することができる。予め標準曲線を作成しておき、これと比較してもよい。
抗原抗体反応などの生体特異的親和性に基づく解析法は当業者に良く知られており、例えばNLRR1細胞外ドメインタンパク質に対する抗体を用いたイムノアッセイが挙げられるがこれに限定されない。解析法は定性的であっても定量的であってもよい。具体的にはイムノアッセイとしては、ウエスタンブロットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ELISA法、サンドイッチイムノアッセイ法、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集測定、補体結合分析検定、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイにおいては、サンプル血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質に結合する抗体の存在を検出する及び/又はその量を定量する。具体的には、アッセイサンプルにおいて、検出すべきNLRR1細胞外ドメインタンパク質と当該タンパク質の抗体との免疫複合体が形成されうる条件下で、NLRR1細胞外ドメインタンパク質を含む可能性のある試験サンプルを当該抗体に接触させる。具体的なイムノアッセイプロトコルは、当業者であれば容易に選択することができる。例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Sambrookら,1989)Cold Spring Harbor Press、同第3版(2001年)、同第4版(2012年)を参照のこと。
本発明の抗NLRR1細胞外ドメインモノクローナル抗体を得る方法としては、抗原を、場合により適当なアジュバントと併用して、動物を免疫し、得られたリンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマを作製する方法が挙げられる。別の方法としては、ファージディスプレイライブラリーを用いることもできる。
本発明において、免疫抗原は、公知の方法により作製することができる。
抗体産生細胞は、免疫した動物の脾臓細胞又はリンパ節等から調製し、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離するのが好ましい。
上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞(骨髄腫細胞)とを融合させ、抗体を産生しながら増殖し得るハイブリドーマ細胞を作製するために細胞を融合させる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用できる。使用する細胞株としては、HAT選択培地(ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3U1、P3-X63-Ag8(ATCC TIB9)、P3-X63-Ag8-U1(JCRB 9085)、P3-NS1-1-Ag4-1(JCRB 0009)、P3-X63-Ag8・653(JCRB 0028)及びSP2/O-Ag-14(JCRB 0029)等が挙げられる。
細胞融合後に、目的ハイブリドーマを選別する。細胞融合後に例えばHAT培地で選択された陽性コロニーについて、96ウェル培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、抗原に対する抗体価の有無を確認する。確認は、ELISAやウェスタンブロット等の免疫測定法等により行うことができる。抗体陽性ウェルを確認できたらクローニングのために細胞を移す。その際、アミノプテリンを含まない培地を用いると、非融合細胞を除くことができる。
樹立したハイブリドーマから以下の方法で抗NLRR1細胞外ドメインモノクローナル抗体を精製する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を適当に調製し、1〜2週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマ細胞を投与し、ハイブリドーマを増殖させ、その後腹水を採取する。
本発明に用いる抗体はポリクローナル抗体であってもよい。この場合、抗原を、場合により適当なアジュバントと併用して、動物を免疫する。次いで動物より、例えば動物の血液より目的の抗体を慣用法により取得する。免疫する動物としては、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジなどが挙げられる。抗原の動物1匹あたりの投与量は、動物の体重にもよるが、例えば100〜1000μgである。アジュバント無し又はアジュバントを伴う抗原での免疫は、主として抗原を静脈内、皮下、腹腔内、筋中等に注射することにより行う。免疫は単回でも複数回でもよい。抗体価は吸光度等により評価することができる。ポリクローナル抗体として商業的に入手可能なものを用いてもよい。
ある実施形態において、本発明はNLRR1細胞外ドメインを検出する手段を含むキットを提供する。このキットは上記の種々の疾患の診断に用いることができる。NLRR1細胞外ドメインを検出する手段としては、例えばNLRR1細胞外ドメイン抗体又はその抗原結合断片が挙げられる。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、又はその組合せであり得る。例えばある実施形態において、本発明のキットがサンドイッチELISA法用である場合、適当な抗NLRR1細胞外ドメインポリクローナル抗体と抗NLRR1細胞外ドメインモノクローナル抗体を用いることができる。
以上をまとめると、本発明の方法又はキットを用いて血中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを測定することにより、種々の疾患を診断することができ、またその予後を判定することができる。さらに、あらゆる年齢の被検体について、血中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを測定することにより癌や神経疾患等の疾患の有無を診断できる。例えば1歳未満の乳幼児の血中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを測定することにより神経芽腫の有無を診断でき、また、そのステージを決定することができる。さらに1〜5歳の幼児、5〜20歳の被検体、20歳以上の成人の血中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを測定することにより神経芽腫の有無を診断することができ、そのステージを決定することができる。これにより患者の予後を判定することもできる。
本発明の診断方法及びキットは他の従来の手法と適宜組み合わせることができる。
細胞外NLRR1タンパク質(exN1)を分泌タンパク質として発現するベクターの構築
細胞外NLRR1タンパク質をコードする塩基配列をpSecTag2Bベクターに組み入れた。該ベクターの塩基配列を配列番号2に示す。このベクターは、マルチ・クローニング・サイトの上流にCMVプロモーターをもち、タンパク質分泌のためのIgκ-鎖リーダー配列をもち、C末側にmycタグおよびHisタグタンパク質を付加できるベクターである。コードされる細胞外NLRR1タンパク質の分子量は約70kDaである。このベクターを以下の方法に用いた。
(抗原固相化検出)
HEK293細胞に上記の細胞外NLRR1タンパク質(exN1)を分泌タンパク質として発現するベクターを導入し、培養上清中に分泌されたexN1を精製し、96 wellプレートに固相化した。exN1精製は、MBL社のHis tagged Protein PURIFICATION Kitを用いて抗体結合アガロースによりHEK293細胞の培養上清に含まれるHis tag融合細胞外NLRR1タンパク質を中性条件下で、スピンカラム内のビーズに結合させ、洗浄後溶出液で回収することにより行った。PBSで洗浄後、ブロッキング試薬(MBL社)を室温で1時間反応させ、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 μg/mLに希釈したヒツジ抗ヒトNLRR1ポリクローナル抗体(R&D社)、又は0.03、0.1、0.3、1、3、10,30 μg/mLに希釈した抗NLRR1モノクローナル抗体(#208, #240)を室温で1時間反応させた後、HPRが標識された抗ヒツジ又は抗マウスIgG抗体を1%BSAを含有したPBSに200倍に希釈した二次抗体試薬を室温で1時間反応させた。TMB/H2O2試薬(MBL社)で発色反応を行った後、マイクロプレートリーダーを用いて、検出を行った。
次に、ヒツジ抗ヒトNLRR1ポリクローナル抗体(R&D社)を固相化バッファー(MBL社)に200倍に希釈し、96 wellプレートにアプライし、4℃で12時間反応させ、各ウェルに固相化した。各ウェルをブロッキングバッファー(MBL社)を室温で1時間反応させた後、希釈バッファー(MBL社)で1、10、30、100、300、1000 ng/mLに希釈した精製exN1を室温で1時間反応させた。精製exN1は上記と同様の手法で取得したものである。洗浄後、希釈バッファー(MBL社)でそれぞれを5 μg/mLに希釈した抗NLRR1モノクローナル抗体(#208, #240)を室温で1時間反応させた後、洗浄し、HPRが標識された抗マウスIgG抗体を1%BSAを含有したPBSに200倍に希釈した二次抗体試薬を室温で1時間反応させた。検出は、TMB/H2O2試薬(MBL社)で発色反応を行った後、マイクロプレートリーダーを用いて行った。抗原の量に応じた吸収の標準曲線を図2に示す。
ELISA及び免疫沈降法による正常血漿に含まれるNLRR1細胞外ドメインの検出
健康な小児及び成人の血漿サンプル5μLに対して、ヒツジ抗ヒトNLRR1ポリクローナル抗体を用いた免疫沈降法を行い、血漿に含まれるexN1タンパク質を検出した。
免疫沈降法による神経芽腫患者血漿に含まれるNLRR1細胞外ドメイン検出の一例
神経芽腫患者由来の血漿サンプル(7例)5μL又は細胞外NLRR1タンパク質(exN1)を発現するベクターを導入したHEK293細胞の培養液100μLに対して、ヒツジ抗ヒトNLRR1ポリクローナル抗体を用いた免疫沈降法を行い、血漿に含まれるexN1タンパク質を検出した。具体的な手順としては、サンプルについてプロテインGビーズで予備洗浄を行い、次いで500μLのバッファー中の10μLの血漿サンプルについて、ヒツジ抗ヒトNLRR1ポリクローナル抗体1μLを添加して免疫沈降を行った。その後、ヒツジ抗NLRR1ポリクローナル抗体及び抗ヒツジマウスIgG-HRPを用いてウェスタンブロッティングを行った。
1才未満の神経芽腫における血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベル
1才未満の神経芽腫患者(29例)又は健康な小児(6例)由来の血漿サンプル5μLに含まれるexN1タンパク質をサンドウィッチELISA法により測定した。サンドウィッチELISA法の手順は上記と同様である。図2の標準曲線を利用し吸収から血漿中の抗原量を定量した。その結果、図6に示すとおりステージ2、3、4の神経芽腫患者由来の血漿において高いexN1濃度を示す臨床検体が認められ、その平均値では健康な小児及びステージ1の神経芽腫に比べ有意に高かった。
配列番号2 NLRR1細胞外ドメイン発現ベクターの塩基配列
Claims (7)
- 神経芽腫診断のための検査方法であって、以下のステップ、
(i)被験体由来の血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを測定するステップ、及び
(ii)測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを標準と比較するステップ、
を含み、測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが標準よりも高い場合には、前記被験体が神経芽腫に罹患していると決定する前記方法。 - 被検体が1歳未満である、請求項1に記載の方法。
- 被検体が1歳以上〜5歳未満である、請求項1または2に記載の方法。
- 被検体が5歳以上である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 被験体の神経芽腫のステージを決定するための検査方法であって、以下のステップ、
(i)神経芽腫を有する被験体由来の血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを測定するステップ、及び
(ii)測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルを標準と比較するステップ、
を含み、測定された血漿中NLRR1細胞外ドメインタンパク質レベルが、標準よりも低い場合には神経芽腫がステージ1であると決定し、標準よりも高い場合には神経芽腫がステージ2〜4であると決定する、前記方法。 - 血漿中のNLRR1細胞外ドメインタンパク質のレベルを、抗NLRR1細胞外ドメイン抗体又はその抗原結合断片を用いて測定する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 抗NLRR1細胞外ドメイン抗体がモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片である、請求項6に記載の方法。
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