JP2015118378A - 顕微鏡およびspim顕微鏡検査方法 - Google Patents
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Abstract
Description
記載されている「シート光顕微鏡検査」(Light sheet microscopy)は、検出対物レンズの焦点面(xy平面)を側方向では完全に、薄いシート光によって照明することにより、光学的断面を、位置分解性カメラ(CCDカメラ)による広視野検出と組み合わせている。シート光照明は、検出軸(z軸)に直角に行われる。
図1では、本発明による方法を実施するためのSPIM顕微鏡の基本構造が示されている。試料チャンバPK内にあることができる試料Pが検出用ビーム経路によって捕捉され、この試料または試料チャンバは、X、Y、およびZで調節可能に、かつ図平面に対して垂直なY軸の周りを回転可能に配置されている。検出用ビーム経路は、検出軸または光軸がZ方向に延びる検出対物レンズO、ならびに検出方向において検出対物レンズに続いている好ましくは交換可能な光フィルタF、結像レンズTL、および平面受光器CCDからなっている。
一般的には計算機および表示ユニット(ディスプレイ)によって構成される共通のチェックおよび制御ユニットCUは、本発明による方法を実施し得るために、AOTF、(試料または試料チャンバのX、Y、およびZでの調節ならびにYの周りの回転を可能にする)試料調節部または試料チャンバ調節部、および照明アライメント部BLjustのようなすべての調節機構と接続されている。
・ 位置合わせのために、前述のZ軸およびY軸に沿った投射だけでなくX軸に沿った投射も使用することができる。
・ 最大強度投射の代わりに、投射のほかの形態が可能である。例えばサブボリューム最大強度投射または最小強度投射。
図2は、本発明による方法の原理的な進行を方法ステップS1〜S11で示している。
S1.少なくとも2つの方向から画像スタックを撮影する。
S2.一方の画像スタックをもう一方の画像スタックの座標上に位置合わせする。
S3.画像スタックを重ね合わせる。
S4.3次元空間から2次元表示へと投射する。
S5.表示に含まれる様々な方向から撮影された試料特徴を相互に位置補正する。
S6.位置補正から変換マトリクスを確定し、かつS3の重ね合わせた画像スタックに適用する。
S7.XおよびYで補正された重ね合わせた画像スタックの面を変更する。図5では上の面が選択されている。
S8.3次元空間から2次元表示へと投射する。
S9.表示に含まれる試料特徴を改めて相互に位置補正する。
S10.位置補正から変換マトリクスを確定し、かつS7の重ね合わせた画像スタックに適用する。
S11.S10の画像スタックの面をS3の当初の面に変更する(例では前の面)。
図3では、垂直軸の周りを回転可能な試料チャンバPKが示されている(図1を参照)。
シート光がZ方向に通過する際に、それぞれ撮影された画像のスタックが生じ、このスタックは画像メモリに格納される(図1のCU)。
本発明による方法を実施するには、スタックごとの単一画像の数は同一でなくてよい。
次のステップS3では、同一に配向された画像スタックST1とST2の、共同スタックST1+ST2への重ね合わせが行われる。この場合、単一画像の正確な順番は重要ではなく、例えばST2がST1の後ろに配置されてもよい。
画像スタックは横方向にずれている可能性もあり、またはST1とST2の単一画像の側方向の寸法が異なっている可能性がある。
この際、Z方向に重ね合わせた画像から、ピクセルごとに、例えばST1の画像の画像ピクセルに基づき、Z方向(軸方向)での単一画像の、最大強度を有する画像ピクセルが確定される。最大強度の代わりに特定の強度閾値を選択してもよく、またはZ方向での最小強度の決定を行ってもよい。
これは例えば、および制限なく、アフィン変換であり得る。
上で言及したように、2つより多い画像スタック、例えば3つのそれぞれ30度で撮影された画像スタックであることもできる。
Claims (16)
- 照明光源と、シート光により試料を照明するための照明用ビーム経路とを含む照明機構と、
対物レンズにより、該試料から放射された光を検出するための検出機構と
を備えた顕微鏡によるSPIM顕微鏡検査方法であって、
該シート光が、該対物レンズの焦点内または該対物レンズの焦点の付近の規定の平面内では実質的に平らであり、かつ該対物レンズが、該シート光の平面とゼロとは異なる角度で、好ましくは垂直に交差する光軸を有しており、
該試料が、該シート光により様々な試料平面を捕捉するため、該対物レンズの該光軸の方向に変位され、かつ該試料の照明が、少なくとも第1および第2の照明角度で行われ、かつそれぞれの照明角度で複数の試料平面が検出され、かつ少なくとも第1および第2の画像スタックとして保存されるSPIM顕微鏡検査方法において、
1.画像スタックの相互の位置合わせが、すべての画像スタックの座標系を該第1の画像スタックの座標系に位置合わせすることによって行われ、
2.該画像スタックが1つの画像スタックへとまとめられ、
3.3次元画像スタックの2次元表示への投射が行われ、
4.異なる照明方向から撮影された試料特徴の位置が相互に位置合わせされ、
5.該位置合わせの座標から座標変換が確定され、
6.位置合わせのための該座標変換が、該まとめられた画像スタックに適用される
ことを特徴とするSPIM顕微鏡検査方法。 - 前記まとめられた画像スタックの配向が変更され、かつ3次元で位置合わせされた画像スタックを生成するため、新たに配向されたまとめられた画像スタックに工程2〜6が適用される、請求項1に記載の方法。
- 3次元で位置合わせされた画像スタックの配向が、当初の照明方向に位置合わせされる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記座標変換が、剛性変換またはアフィン変換または弾性変換または局所的弾性変換である、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程3では、前記まとめられた画像スタック内で、画像の個々のピクセルに関し、それぞれ画像間の強度比較が行われる、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 最大値または最小値または設定された閾値または平均値または中央値を有するピクセルが考慮の対象にされる、請求項5に記載の方法。
- 工程4による前記位置合わせが、コンピュータでの画像分析、および/またはユーザのための入力手段のうちの少なくとも一方を用いて、行われる、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- コンピュータでの大まかな位置合わせおよび入力手段を用いた精緻な位置合わせが規定されている、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも第1および第2の画像スタックが、異なる蛍光マーカを捕捉するために、少なくとも2つのスペクトル領域内で検出される、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- 工程1〜6を実施するために、それぞれスペクトル領域が同じまたは類似の第1および第2の画像スタックが考慮の対象にされる、請求項9に記載の方法。
- 時系列撮影では、第1の時点で前記工程1〜6が、また好ましくは請求項2に従っても実施され、前記確定された座標変換が、その後の時点で撮影された画像スタックに適用される、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。
- 時系列撮影では、工程1〜6が、時系列の複数の時点で繰り返される、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法を実施するために構成されたコンピュータプログラム。
- 請求項13に記載のコンピュータプログラムを有するデータ媒体。
- 請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法を実施するためのSPIM顕微鏡検査のための顕微鏡。
- ユーザにより少なくとも工程4が実施されるために、グラフィカル・ユーザ・インターフェイス(GUIインターフェイス)を有している、請求項15に記載の顕微鏡。
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