JP2011501226A - 物体の一連の断面画像から当該物体のボリュームを再現するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、不確かさおよび取得平面を免れ得ない異なる位置および／または向きに対応する一連の断面画像から物体の形状を再現するための方法であって、（ａ）再現すべき形状を分解することができる有限関数基底を選択するステップ、（ｂ）各々の断面の位置および／または実際の向きとその位置および／または向きとの間の範囲の第１の定量化関数を選択するステップ、（ｃ）再現された形状の空間コヒーレンスのための第２の定量化関数を選択するステップ、（ｄ）断面画像と再現された形状の該当する断面との間の範囲のための第３の定量化関数を選択するステップ、（ｅ）その値が前記第１、第２、および第３の量子化関数の値に依存する総コスト関数を選択するステップ、および（ｆ）前記全体コスト関数を最小化することによって、断面の実際の位置および／または向きを、物体の画像を前記関数基底へと分解するための係数と一緒に推定するステップを含む方法に関する。

Description

本発明は、物体の一連の断面画像から当該物体のボリュームを再現する方法であって、前記断面の物体に対する位置が、不確かな様相で知られている方法に関する。

本発明は、とくには、共焦点顕微鏡法に適用されるが、これに限られるわけではない。

物体の一連の二次元断面画像から、その物体のボリュームの三次元画像を再現することは、とくには生物学および医学における強力な研究ツールである。

再現という課題を解決するために、多数の数学的方法が開発されてきている。それらの方法は、通常は、再現すべき物体に対する切断面の位置および向きが、正確に知られているという仮定に基づいている。残念ながら、そのような仮定は、とくには再現すべき物体が微視的な寸法を呈する場合に、常に満足されるわけではない。

Ｓ．ＢｒａｎｔおよびＭ．Ｍｅｖｏｒａｈによる対象「Ｃａｍｅｒａ ｍｏｔｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｅｔｓ ｉｎ ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉ−ｉｍａｇｅ ａｎｄ Ｖｉｄｅｏ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ−ＥＣＣＶ ２００６、Ｇｒａｚ、Ａｕｓｔｒｉａ、２００６年５月）が、切断面の位置の不安定さを考慮に入れる再現技法を概説している。この方法によれば、切断面の回転移動が、一次元の時間系列の形態で表現される一連の画像の自己相関関数から推定され、切断面の平行移動が、画像をセグメント化し、それらの重心を配置し直すことによって推定される。その後に、これらの推定が、ベイズ反転（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）によって精緻化される。この方法の有効性は、とくには断面画像が走査式共焦点顕微鏡法または他の蛍光による画像化の技法によって得られる場合に、常には現実的でない仮定に依存している。

走査式共焦点顕微鏡法は、細胞などの物体の断面の画像を取得可能にする周知の顕微鏡検査技術であり、前記断面は、顕微鏡の焦点面に対応する。焦点面を連続的にずらすことによって、一連の二次元画像が取得され、それらから物体のボリュームを三次元に再現することができる。

この技法は、付着細胞など、基材へと固定することができる物品にしか適用することができない。残念ながら、多数の細胞（とくには、免疫系の細胞）は付着性でなく、したがって、この方法では再現が不可能である。

文献ＥＰ１４１３９１１が、一式の電極を有する容器が装着された顕微鏡を記載しており、電極によって、浮遊状態の物体を前記容器内で操作することができる。顕微鏡の焦点面を静止した状態に保ちつつ、浮遊状態にある前記物体を平行移動および／または回転移動させることによって、前記物体の一連の断面画像を取得することが可能になる。

回転移動によって得られる一連の断面の取得は、軸上収差（共焦点顕微鏡の軸方向の分解能が横方向の回転ほどには良好でない（約半分である）という事実に起因するアーチファクト）を最小にするように機能するため、とくに有利である。

この技法の主たる限界は、容器内の物体の動きを、ブラウン運動などのさまざまな理由で、不完全な方法でしか制御することができない点にある。結果として、上記物体のボリュームにおける断面の位置および／または向きが、不確かさを免れない。この状況を、無作為な平行移動および／または回転移動が物体の公称の平行移動および／または回転移動に重畳すると考えることによって、モデル化することができる。

そのような状況においては、従来技術において公知の再現技法を適用することが不可能である。

移動の不確かさを考慮に入れる第１の試みが、Ｐｒｏｃ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉ−ｉｍａｇｅ ａｎｄ Ｖｉｄｅｏ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、ＥＣＣＶ ２００６のＳ．ＢｒａｎｄｔおよびＭ．Ｍｅｖｏｒａｈによる対象「Ｃａｍｅｒａ ｍｏｔｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｅｔｓ ｉｎ ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」に記載されている。しかしながら、この刊行物において提案されている方法は、無作為な平行移動および／または回転移動について満足できる推定を提供しておらず、結果として、観察対象の物体について、満足できる再現を可能にしていない。

本発明の目的は、一連の断面画像に基づいて物体のボリュームを再現することを可能にする方法であって、たとえそのような物体のボリュームにおける断面の位置および／または向きが不確かさを免れない場合でも適用可能な方法を提供することにある。

したがって、一態様において、本発明は、物体に対する取得平面の位置および／または向きが異なる物体の一連の断面画像であって、前記位置および／または向きが不確かさを免れ得ない一連の断面画像から、前記物体のボリュームを再現する方法であって、
ａ）再現すべきボリュームを分解することができる関数の有限基底を選択するステップ、
ｂ）前記物体に対する各々の断面の実際の位置および／または向きと公称の位置および／または向きとの間の差を量子化するための第１の定量化関数を選択するステップ、
ｃ）再現されたボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための第２の定量化関数を選択するステップ、
ｄ）物体の断面画像と再現されたボリュームの該当する断面との間の差を量子化するための第３の定量化関数を選択するステップ、
ｅ）前記第１、第２、および第３の量子化関数の値に依存する値の総コスト関数を選択するステップ、および
ｆ）前記全体コスト関数を最小化することによって、断面の実際の位置および／または向きを、物体の画像を前記関数基底へと分解するための係数と一緒に推定するステップ
を含むことを特徴とする方法を提供する。

前記物体は、通常は三次元であるが、本発明は、一次元の断面の連続からの二次元の物体の再現にも適用可能である。したがって、用語「ボリューム」は、広く理解されるべきである。

本発明の特定の実施の形態においては、
・再現すべきボリュームを分解することができる前記関数の有限基底が、ガウス関数によって構成されていてよい。
・再現すべきボリュームを分解することができる前記関数の有限基底が、自己再生核ヒルベルト空間を定める基底であってよい。そのような状況においては、再現されたボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための前記第２の定量化関数が、前記自己再生核ヒルベルト空間のノルムに比例することができる。
・各々の断面の実際の位置および／または向きと公称の位置および／または向きとの間の差を量子化するための前記第１の定量化関数が、ユークリッドノルムおよび／または測地線ノルムに基づくことができる。
・各々の断面の実際の位置および／または向きと公称の位置および／または向きとの間の差を量子化するための前記第１の定量化関数は、前記物体の断面画像の取得に使用される器具に特徴的な少なくとも１つの較正パラメータに依存することができる。
・前記第２の定量化関数が、空間コヒーレンスを較正するための少なくとも１つの較正パラメータに依存することができ、前記第３の定量化関数が、前記差を較正するための少なくとも１つの較正パラメータに依存することができ、当該方法が、前記ステップｆ）の前に、前記物体の前記一連の断面画像から少なくとも前記差および空間コヒーレンスの較正パラメータを一緒に推定するステップｄ’）をさらに含んでいる。
・ステップｄ’）は、前記物体の前記一連の断面画像に基づく最尤法によって、少なくとも前記差および空間コヒーレンスの較正パラメータを一緒に推定することを含むことができる。とくには、前記最尤法による推定が、再現されたボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための前記第２の定量化関数、および物体の断面画像と再現されたボリュームの該当する断面との間の差を量子化するための前記第３の定量化関数が、ガウス分布に従うという仮定に基づくことができる。
・前記全体コスト関数は、前記第１、第２、および第３の定量化関数の一次結合であってよい。
・前記全体コスト関数を最小化することによって、断面の実際の位置および／または向きを、物体の画像を前記関数基底へと分解するための係数と一緒に推定する前記ステップｆ）を、勾配降下法を使用することによって実行することができる。
・前記物体の断面を、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が重畳している画像取得平面の連続的な公称の平行移動によって得ることができる。
・変形例においては、前記物体の断面を、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が重畳している共通の軸を中心とする画像取得平面の連続的な公称の回転移動によって得ることができる。そのような状況下では、前記ステップａ）〜ｆ）を、画像取得平面の連続的な公称の回転によって得られる少なくとも２つの一連の断面について有利に繰り返すことができ、前記２つの一連の断面に対応する回転軸は、実質的に互いに直角であり、前記２つの一連の断面から得られる物体のボリュームの再現を、補間（例えば、スプライン平滑化）によって融合させることができる。

別の態様において、本発明は、物体の複数の断面画像シーケンスから、前記物体のボリュームを再現する方法であって、各々のシーケンスが、取得平面の連続的な公称の平行移動によって得られる断面によって構成されており、前記取得平面の公称の向きが、各々のシーケンスごとに異なっておりかつ不完全な様相で既知である方法を提供する。この方法は、物体の断面の複数の「スタック」を利用するため、マルチプルスタック（Ｍ．Ｓ．）プロトコルと称される。異なるスタックの相対の向きが不完全にしか知られていないだけでなく、各々のスタックにおいても、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が、取得平面の公称の平行移動に重畳している。

そのような方法は、
Ａ）上述のような方法によって前記シーケンスの各々の断面の観察平面の相対的な位置および向きを推定するステップ、
Ｂ）異なるシーケンスの間のオフセットおよび向きの差ならびに前記物体に対するオフセットおよび向きの差を推定するステップ、
Ｃ）断面画像シーケンスの間のオフセットおよび向きの差を補償するステップ、および
Ｄ）単一のセットを構成すると考えられる前記シーケンスの断面画像からの補間によって前記ボリュームを再現するステップ
を含んでいる。

特定の実施例においては、
・前記物体の異なる断面画像シーケンスの間のオフセットおよび向きの差を推定するステップＢ）を、主成分分析によって実行することができる。この主成分分析を、とくには前記断面画像シーケンスの２値化版に対して実行することができる。より正確には、各々の断面画像シーケンスを、基準として選択されるシーケンスの２値化しきい値と一緒に推定される２値化しきい値を使用して２値化することができ、前記推定が、基準シーケンス以外の各々のシーケンスについて、該シーケンスの分散共分散行列の固有値と前記基準シーケンスの分散共分散行列の固有値との間の差の関数を最小化することによって実行される。とくには、前記差の関数を、

によって与えることができ、
ここで、λ_ｋおよびλ’_ｋが、それぞれ該当の２値化シーケンスおよび基準２値化シーケンスの分散共分散行列の固有値である一方で、τおよびτ’が、それぞれの２値化しきい値である。

本発明の別の態様は、異なる性質である物体の複数の断面画像シーケンスを使用することによって、前記物体のボリュームを再現する方法である。とくには、第１のシーケンスを、観察平面を前記物体に対して平行移動させることによって得ることができ（「スタック」が生成される）、少なくとも１つの第２のシーケンスを、観察平面を前記物体に対して回転移動させることによって得ることができる。上述した方法と同様に、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が、種々の断面に関する観察平面の前記平行移動または回転移動に重畳する可能性がある。そのような方法は、
ｉ）上述のような方法を使用して、前記第１の画像シーケンスから前記ボリュームを予備的に再現するステップ、
ｉｉ）前記第１および第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置するステップ、および
ｉｉｉ）前記再配置された断面の第２のシーケンスから、補間によって前記ボリュームを再現するステップ
を含んでいる。

換言すると、画像の第１のシーケンスによって構成される「スタック」が、回転移動によって得られる断面（第２のシーケンス）の配置を可能にするためだけに機能する予備的な再現を実行するために使用される。上述の軸上収差の現象ゆえに、第２のシーケンスがもたらす良好な空間分解能という利点を利用するために、第２のシーケンスがボリュームの再現に使用される。

この方法は、２つの異なる種類の取得を組み合わせているため、「２プロトコル」法と称される。

変形例においては、観察平面を前記物体に対して平行移動させることによって得られる物体の複数の第１の断面画像シーケンスを使用することができる。そのような状況において、本方法は、
ｉ）上述の「Ｍ．Ｓ．」プロトコルを使用して、前記第１の画像シーケンスから前記ボリュームを予備的に再現するステップ、
ｉｉ）前記第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置するステップ、および
ｉｉｉ）前記再配置された断面の第２の画像シーケンスに基づく補間によって前記ボリュームを再現するステップ
を含む。

変形例においては、物体の第１の断面画像シーケンスを、観察平面を該物体に対して回転移動させることによって得ることができる一方で、物体の第２の断面画像シーケンスが、前記観察平面を物体に対して平行移動させることによって得られる。換言すると、「スタック」の役割と回転移動によって得られるシーケンスの役割とが逆にされる。次いで、この方法は、
ｉ）上述の方法によって、前記第１の画像シーケンスから前記ボリュームを予備的に再現するステップ、
ｉｉ）前記第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置するステップ、および
ｉｉｉ）前記再配置された断面の第２のシーケンスから、補間によって前記ボリュームを再現するステップ
を含む。

この変形例は、軸方向の分解能が横方向の分解能よりも良好である場合に有利である。

「２プロトコル」式の方法の特定の実施例においては、
・前記第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置する前記ステップｉｉ）が、物体の断面画像と前記予備的に再現されたボリュームの該当の断面との間の差を量子化するための定量化関数を最小にすることを含むことができる。
・物体の断面画像と前記予備的に再現されたボリュームの該当の断面との間の差を量子化するための定量化関数を最小にすることは、前記第２のシーケンスまたは各々の第２のシーケンスの断面のすべてが前記観察平面の一定であるが未知である変位および／または平行移動によって得られたという仮定に基づいて、予備的な推定を行う第１の段階と、種々の断面に関して一定であると仮定した観察平面の平行移動または回転移動に重畳した無作為な回転−平行移動を推定することを含む洗練を行う第２の段階とを含むことができる。
・前記再配置された断面の第２の画像シーケンスから前記ボリュームを再現する前記ステップｉｉｉ）を、スプライン平滑化式の補間によって実行することができる。

「Ｍ．Ｓ．」および「２プロトコル」式の方法を、取得平面の公称の移動に重畳する無作為な平行移動−回転移動が存在しなくても使用できることに、気が付くことが有利である。

上述の方法は、とくには前記物体の断面画像シーケンスが共焦点顕微鏡法によって取得される状況に適用される。さらにより詳しくは、これらの方法は、前記物体が共焦点顕微鏡の容器内に配置され、該物体の断面画像シーケンスが該物体を容器に対して移動させることによって取得される状況に適用される。

しかしながら、本発明は、顕微鏡の焦点面が移動する一方で、物体が静止したままであるより慣習的な状況にも適用可能である。取得平面と物体との間に相対移動が存在することが重要である。

さらには、本発明は、顕微鏡法の分野には限定されない。

さらに別の態様において、本発明は、物体に対する取得平面の位置および／または向きが相違する該物体の一連の断面画像を取得するための手段と、前記物体の前記一連の断面画像から前記物体のボリュームを再現するためのデータ処理手段とを備えている物体のボリュームを再現するための装置であって、種々の断面に対応する取得平面の位置および／または向きが、不確かさを免れ得ず、前記データ処理手段が、後述のとおりの方法を実行するように構成されていることを特徴とする装置を提供する。

前記物体の一連の断面画像を取得するための前記手段は、とくには、前記物体を収容するための容器と、前記物体を容器に対して移動させるための手段とを備える共焦点顕微鏡を備えることができる。

本発明の他の特徴、詳細、および利点は、例として提示される添付の図面を参照して行われる説明を検討することで、明らかになる。

複数の一次元の断面からの二次元の物体の再現の単純な例を示している。 複数の一次元の断面からの二次元の物体の再現の単純な例を示している。 複数の一次元の断面からの二次元の物体の再現の単純な例を示している。 複数の一次元の断面からの二次元の物体の再現の単純な例を示している。 本発明の第１の実施例における再現方法のフロー図を示している。 本発明の第２の実施例における再現方法（「Ｍ．Ｓ．」プロトコル）のフロー図を示している。 本発明の第３の実施例における再現方法（「２プロトコル」）のフロー図を示している。 共焦点顕微鏡によって観察された複数の断面画像であって、取得平面を細胞に対して回転させることによって取得された複数の断面画像を示している。 それぞれ取得平面を前記細胞に対して平行移動（図６Ａおよび図７Ａ）および回転移動（図６Ｂおよび図７Ｂ）させることによって取得された一連の断面画像からの前記細胞の再現を示している。 それぞれ取得平面を前記細胞に対して平行移動（図６Ａおよび図７Ａ）および回転移動（図６Ｂおよび図７Ｂ）させることによって取得された一連の断面画像からの前記細胞の再現を示している。 それぞれ取得平面を前記細胞に対して平行移動（図６Ａおよび図７Ａ）および回転移動（図６Ｂおよび図７Ｂ）させることによって取得された一連の断面画像からの前記細胞の再現を示している。 それぞれ取得平面を前記細胞に対して平行移動（図６Ａおよび図７Ａ）および回転移動（図６Ｂおよび図７Ｂ）させることによって取得された一連の断面画像からの前記細胞の再現を示している。 本発明の再現方法を実行するための装置を示している。

図１Ａ〜図１Ｄが、本発明の目的を直感的に理解するための役に立つ。

図１Ａは、二次元の物体を示しており、より詳しくは、数字の「５」の白黒画像を示している。

図１Ｂは、二次元の物体を「探査」する複数の取得線を示している。これらの線は、公称的には、ベース線を角度Ｎψ_０（Ｎは、整数）だけ回転させることによって得られ、実際には、公称的には純粋な回転である上記の移動に無作為な回転−平行移動が重畳していることを、見て取ることができる。

図１Ｃは、各々の取得線の位置および向きが公称の位置および向きに一致すると仮定することによって得られた物体の再現を示している。一次元画像の取得を乱す無作為な回転−平行移動ゆえに、画像がきわめて劣化していることを、見て取ることができる。

最後に、図１Ｄは、本発明の方法によって実行された再現を示している。この再現は、各々の取得線の位置および向きに影響を及ぼす不確かさにもかかわらず、実質的に完璧である。当然ながら、これは単なるシミュレーションであり、したがって、取得線の実際の位置および向きが先験的に既知であるが、図１Ｄの画像は、そのような知識を利用せずに得られている（そのような知識は、実際の状況下では入手できないであろう）。

本発明の方法を正確に説明するために、取得平面を物体に対して変位および／または回転させることによって当該物体の一連の断面Ｉ＝｛Ｉ_ｉ、ｉ＝１、・・・、ｎ｝を取得可能にする器具（例えば、共焦点顕微鏡）が検討される。移動は、連続的または不連続であってよい。取得平面が移動する一方で、物体が静止したままであるのか、あるいはその反対であるのかは、あまり問題でなく、取得平面による物体のボリュームの「探査」を可能にする相対移動が存在することが重要である。

器具によって生じる取得平面の移動は、多少なりとも不安定である。例えば、器具が連続的な回転移動を実行するように設定されている場合に、回転の軸の位置が、最初に設定された位置の周囲で時間とともに変化する可能性がある。さらには、軸が寄生の平行移動を受ける可能性がある。その結果、一連の断面Ｉに対して、この移動が、一連の微細移動Φ＝｛φ_ｉ＝（Ｒ_ｉ，Ｔ_ｉ）、ｉ＝１、・・・、ｎ｝を生じさせ、ここでＲ_ｉおよびＴ_ｉは、それぞれ断面Ｉ_ｉの位置を定める微細回転および微細平行移動である。この一連の微細移動が、器具の調節の際に設定される公称の回転移動Φ^０＝｛φ_ｉ ^０＝（Ｒ，０）、ｉ＝１、・・・、ｎ｝の劣化版または「ノイジー」バージョンを構成する。

同様に、連続的な平行移動を実行するように設定された器具については、平行移動の軸の位置が、最初に設定された位置の周囲で時間とともに変化する可能性がある。一連の断面Ｉに対して、この移動が、一連の微細移動Φ＝｛φ_ｉ＝（Ｒ_ｉ，Ｔ_ｉ）、ｉ＝１、・・・、ｎ｝を生じさせ、ここでＲ_ｉおよびＴ_ｉは、それぞれ断面Ｉ_ｉの位置を定める微細回転および微細平行移動である。この一連の微細移動が、器具の調節の際に設定される公称の平行移動Φ^０＝｛φ_ｉ ^０＝（０，Ｔ）、ｉ＝１、・・・、ｎ｝の劣化版または「ノイジー」バージョンを構成する。

本発明の方法は、物体の一連の断面からその物体の３Ｄ画像を再現することを可能にする。再現は、その位置（Φ＝｛φ_ｉ、ｉ＝１、・・・、ｎ｝によって定められる）が正確には知られていない一連の断面

に基づいて、「密度」のボリューム

を割り出すことからなる。取得平面の「位置」という用語は、取得平面の向きを含む空間における取得平面の状況を完全に定めるパラメータ一式を指す。

「密度」関数ｆは、例えば、単色画像のグレーレベルを表すことができ、そのような状況においては、ｆは、空間座標のスカラ関数である。カラー（または、疑似カラー）の画像においては、ｆが、例えば輝度成分および２つのクロミナンス成分を有するベクトル関数である。

最初に、器具について設定される移動がφ^０＝（Ｒ^０、Ｔ^０）であって、純粋な回転において、Ｔ^０＝０であり、純粋な平行移動において、Ｒ^０＝Ｉｄであるように、器具が調節されると仮定する。本発明の基本的な考え方は、断面の位置｛φ_ｉ｝および物体の密度の関数ｆを、同時に推定することにある。推定による位置は、公称の移動φ^０の近傍にある。推定によるボリュームは、ボリュームの密度の空間コヒーレンスを最適にするように決定される。これら２つの推定は、相互依存の関係にあり、位置の推定が良好であるほど、密度のコヒーレンスが良好である。この手順が、ｄ次元（典型的には、ｄ＝２または３である）の「項目」へと適用され、断面は、ｄ−１の次元である。以下では、常にｄ＝３であると仮定する。

図２は、本発明の第１の実施例における再現方法のフロー図である。

Ｉ＝｛Ｉ_ｉ、ｉ＝１、・・・、ｎ｝が、φ^０によって設定される連続的な回転移動または平行移動のいずれかに対応する物体の一連の断面であるとする。基準平面Ｈ^０が、すべての断面画像をこの平面内の同じ平面に配置することによって最初に選択される。

が未知のボリュームであるとする。ｆにおける各々の断面の位置を、Ｈ_０をアフィン回転φ_ｉ＝（Ｒ_ｉ、Ｔ_ｉ）へと適用することによって定めることができる。Φ＝｛φ_ｉ、ｉ＝１、・・・、ｎ｝およびΦ^０＝｛φ^０、ｉ＝１、・・・、ｎ｝であるとする。その結果、本明細書に記載の手順は、ｆおよびΦを推定するように機能する。

本方法の第１のステップａ）は、再現のためのボリューム（あるいは、より正確には、このボリュームの密度を表す関数ｆ）を分解することができる関数の有限基底を選択することからなる。このステップは、空間関数ｆを有限数の係数によって表して、解くべき最適化問題に有限の次元を与えるように機能する。この基底を、例えば、一群のガウス関数によって構成することができる。

その後に、ステップｂ）において、関数Ｊ_０（Φ）が、公称の移動Φ^０に対する取得平面の「実際」の移動の間の差を量子化するために選択される。例えば、

であり、ここで

であり、

である。

パラメータσ_Ｒおよびσ_Ｔが、φ_ｉおよびφ^０の間の間隔を支配する。これらの不確かさパラメータは、器具の特徴的な較正パラメータであり、与えられるものと仮定される。

第３のステップｃ）は、ｆの密度の空間コヒーレンスを量子化するための関数を選択することからなる。この空間コヒーレンス関数の物理的な意味は、再現されるボリュームの空間的な「連続性」を表現することにあり、一般に、再現されるボリュームが「寸断」されておらず、すなわち関数ｆが多数の不連続を呈することがなく、ｆの変化がより緩やかである「連続的」なボリュームであることが期待される。当然ながら、再現すべき物体の空間コヒーレンスの程度は、先験的には知られていない。したがって、有利には、空間コヒーレンス関数は、さらに推定される必要がある１つ以上の較正パラメータに依存することができる。この点が、以下で明らかにされる。

本発明の変形例においては、ステップａ）において選択される関数の有限基底が、自己再生核を有するヒルベルト空間を定める基底であってよく、再現されるボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための前記第２の関数が、自己再生核を有する前記ヒルベルト空間のノルムに比例することができる。

例えば、再現されるボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための第２の関数を、

によって与えることができ、ここで、

は、「自己再生核」ｋに関するノルムである。

基底関数または「空間的相互作用関数」ρは、例えばガウス関数であってよい。Ｎは、ｆが計算される格子のノードの数である。パラメータ｛α_ｉ｝が、基底関数｛ｋ（ｓ_ｉ、・）｝におけるｆの座標である。パラメータσ_ｆおよびλ_ｆが、上述の較正パラメータを較正し、推定を必要とする。

本方法のステップｄ）は、物体の断面画像Ｉ_ｉと再現されるボリュームの対応する断面

との間の差を量子化するための第３の関数の選択を含む。例えば、

であり、ここで、σ_εは、物体に依存し、したがって推定されなければならない別の較正パラメータである。

ステップａ）からｄ）の順序があまり重要でないことを、理解すべきである。

較正パラメータσ_ｆ、λ_ｆ、およびσ_εは、ステップｄ’）において推定される。これを行うために、取得された断面と該断面の物体における対応物との間の差

（ここで、ＳはＨ_０に属する）が、ガウス関係Ｎ（０、σ_ε ^２）の適用において分布していると仮定される。また、Ｉが、ガウス関係

に従って分布していると仮定され、共分散行列Γ_θは、

である。

ここで、

は、空間Ｈ_０の次元に等しい次元のベクトルであり、要素が１に完全に等しい一方で、１_ｓ＝ｔは、ｓ＝ｔであれば１に等しく、さもなければ０に等しい。

したがって、最大尤度の原理が、

において

を最大にする値

におけるパラメータθ＝（μ_ｆ、σ_ｆ ^２、λ_ｆ、σ_ε ^２）を一緒に推定するために使用される。

続くステップｅ）は、先のステップにおいて定められる３つの量子化関数に依存する全体コスト関数または「コヒーレンス関数」を選択することを含む。例えば、一次結合

を選択することができる。

その後に、ステップｆ）において、例えば連続してΦの最小化およびｆの最小化の間を交互する勾配降下に基づく手順を使用することによって、再現されるボリューム

および断面の位置

を得るために最小化され、この手順は、Φ^０で初期化される。

移動が回転であり、Ｒ^０の回転の軸が取得平面にない場合、物体は、取得平面が横切ることが決してない円錐または双円錐形状の領域を有し、この領域の再現は不可能になる。そのような状況においては、
・第２の一連の回転Ｉ’が、先の回転の軸に多少なりとも直交する回転の軸を中心にして考慮され、
・先のステップａ）〜ｆ）が、この第２の一連の回転について繰り返される。この第２の再現を、

と書くことができる。

このようにして、各々が再現不可能なゾーンを呈する２つの画像が得られる。完全な再現を得るために、
・再現されたボリュームを重ねて「再配置」し、
・とくには「スプライン」式の平滑化によって、

の結合によって構成されるデータのすべてを

行の式において連続的に補間する
ことが可能である。

「平滑化」および「補間」の概念を、さらに詳しく説明する必要がある。ボリュームの再現は、三次元空間における密度フィールドｆを推定することを意味する。断面の位置に位置する点ｘについて、ｆ（ｘ）が、点ｘにおける断面の値を近似し、これがいわゆる平滑化操作である。断面の間に位置する点ｘについて、ｆ（ｘ）が、何も存在しない場所の値を生成し、これがいわゆる補間である。実際、２つの操作は密接に結び付いており、補間操作は、三次元空間に正則関数ｆ（ｘ）を生成する平滑化操作に根ざしている。上述した有限次元の関数基底への密度関数の分解が、平滑化／補間の形態を構成する。

少なくとも原理的には、再現されたボリュームを、図３を参照して以下で説明される方法に類似する方法によって再配置することができ、再現されたボリュームが分割され、それらの重心および慣性主軸が一致させられる。しかしながら、２つのボリュームに２つの異なる再現されないゾーンが存在することにより、このオフセッティングが難しくなることが、考慮されなければならない。

図２のアルゴリズムは、一般に、取得平面のあらゆる種類の（公称の）移動にあてはまり、すなわち一定または変化しうる角度での純粋な回転、一定または変化しうるピッチでの純粋な平行移動、あるいは回転移動および平行移動の組み合わせに当てはまる。図３および図４は、取得手順の特定の組み合わせを利用するより具体的な方法に関する。

図３は、本明細書において「マルチプルスタック」プロトコルまたはＭ．Ｓ．と称されるアルゴリズムのフロー図である。このプロトコルによれば、器具が、物体を所定の向きにて物体の全長に沿って「走査」するために純粋な平行移動で取得平面を移動させるように調節される。その後に、この操作が、少なくとも１つの他の向きについて繰り返される。平行移動でのこれらの取得が、お互いに対して再配置されたときにボリュームｆの推定を可能にする一式の「スタック」をもたらす。

２つの困難が存在する。第１に、各々の個別の一連の平行移動（各々のスタック）が、取得平面の無作為な回転−平行移動によって影響され、第２に、異なるスタックの相対的な位置および向きが、完全には知られていない。

が、φ^０＝（Ｉｄ、Ｔ^０）によって装置について設定される平行移動に対応する物体の第１の一連の断面であるとする。

などが、設定φ’^０、φ’’^０、などを有する器具に対応する別の一連の平行移動であるとする。

本方法の第１のステップＡ）は、該当のスタックの一連の断面画像の各々を「配置」するために、図２の方法を適用することからなる。このステップは、所与のスタックにおける断面の相互の位置および向きを決定するように機能するが、異なるスタック間の相対的な向きは決定しない。

このステップは、一連の断面画像が、公称の移動に重畳する無作為な回転−平行移動による影響を知覚可能なほどには受けていないと考えられる場合には、省略可能である。

その後に、１つのスタック

が、「基準スタック」として選択され、この基準スタックに対する他のスタック

などのオフセットおよび向きの相違が、ステップＢ）において推定され、次いで、ステップＤ）におけるボリュームの再現を可能にするために、ステップＣ）において補償される。

一般的なスタック

を基準スタック

へと「再配置」するために、手順は以下のとおりである。
・断面を２値化するために、しきい値設定τを有する関数が選択され、

が２値化断面

へと、

であるように変換される。濃色の背景上の淡色の物体においては、そのような関数は、例えば

であり、そうでない場合に０であってよい。τ’が、同じ方法で定められる

の２値化パラメータであるとする。しきい値パラメータτおよびτ’を決定する必要がある。
・各々のペア（τ、τ’）について、

の主成分分析が、

であるような画素ｉの座標で構成された

の点の集団について実行される。集団の分散共分散行列の固有値が、｛λ_ｋ、ｋ＝１、２、３｝と記述される（同様に、

の集団に関する値は、｛λ’_ｋ、ｋ＝１、２、３｝と記述される）。
・その後に、（τ、τ’）が、関数

を最小化することによって推定される。
・先に得られたペアを使用することによって、２つの対応する集団の再配置を、それらの重心を一致させ、それらの分散共分散行列の固有値も一致させることによって、行うことができる。この再配置操作のアフィン適用は、φ’＝（Ｒ’、Ｔ’）と記述され、

へと再配置されたスタックは、

などと記述される。

これらの種々の操作が、基準スタック以外のすべてのスタックについて繰り返される。しきい値パラメータτが、各々の場合において推定され、その値が、手順の各々の反復において同じではないことに留意されたい。

最後に、ステップＤ）において、今やただ１つのセットと考えられる再配置されたスタックが、三次元における「スプライン」平滑化によって補間される。

「２プロトコル」法と称される図４の方法は、回転によって得られた少なくとも１つの一連の断面

が利用可能であり、平行移動によって得られた少なくとも１つの一連の断面

が利用可能である場合に適用される。最初に、平行移動の一連の断面が、予備的な再現

を得るために使用される。その後に、断面

の位置が、

に配置することによって得られ、最終的な再現は

に基づく。このプロトコルは、

によってもたらされる情報が

によってもたらされる情報よりも少ない場合に、とくに適している。例えば、分解能が軸方向（取得平面に垂直）よりも横方向（すなわち、取得平面内）において高い場合、最終的な再現において回転での一連の断面を使用し、平行移動での一連の断面を予備的な再現にのみ使用することが好ましい。

が、一定の角度φ^０での取得平面の回転に対応する物体の一連の断面であるとする。

が、先の回転軸に多少なりとも直交する回転軸を中心とする連続的な回転移動に対応する第２の一連の断面であるとする。基準平面Ｈ_０が選択され、回転におけるすべての断面が、前記平面内の同じ平面に置かれる。

、平行移動に対応する物体の一連の断面または「スタック」であるとする。随意により、平行移動における第２の一連の断面

を得ることも可能であり、さらなる一連の断面

を得ることも可能である。平行移動が安定でない場合、断面の各々が、図２のアルゴリズムを適用することによって該当のスタックに配置される。この配置は、存在するシーケンスの数と同数のスタックをもたらす。

が再現すべき未知のボリュームであるとする。回転による断面

の各々のｆにおける位置が、以下のように推定される必要があるアフィン回転φ_ｉ＝（Ｒ_ｉ、Ｔ_ｉ）をＨ_０へと適用することによって定められる。

ステップＡ）：予備的な再現。ただ１つのスタック

で、例えば三次元スプライン平滑化を使用することによって

について連続的にスタックを補間するために十分であり、結果は

と記述される初期の再現を構成する。

複数のスタックが利用可能である場合、図３のアルゴリズムが使用される。スタックの配置に関する不確かさゆえに、この手順は、スタック

などの各々について、基準スタック

に対する位置を計算し、これらの位置をスタックを前記基準スタックに再配置するために使用する。これらの再配置されたスタックのすべてが、三次元スプライン平滑化を使用して補間され、結果が

と記述される初期の再現を構成する。

ステップＢ）：位置の推定および第２の一連の断面の推定、ならびにそれらの空間的な再配置。

このステップは、２つの段階で実行される。すなわち、予備的な推定において、取得平面の回転移動が正確にφ^０＝（Ｒ^０、０）であると仮定され（すなわち、不確かさが一時的に無視され）、洗練段階において、先ほど無視された不確かさが考慮される。

第１の段階においては、断面の位置が段階的に定められる。最初に、平面Ｈ_０に保存された断面が、それらをそれらの空間内の回転位置に置くために展開され、その結果、第１の切断面Ｐ_１の回転位置が、Ｈ_０へと加えられるアフィン回転Ψ_１＝（Ｒ_１、Ｔ_１）の結果（Ｐ_１＝Ｒ_１Ｈ_０＋Ｔ_１）である一方で、続く切断面Ｐ_ｉは、第１の切断面へとＲ^０を連続的に適用することによって得られる（Ｐ_ｉ＝（Ｒ^０）^ｉ−１Ｐ_１）。その後に、この回転における断面のセットが、

に配置される。回転移動が安定であると仮定されているため、

における

の位置は、Ｐ_ｉへと適用される単一のアフィン回転Ψ＝（Ｒ、Ｔ）によって与えられる。最後に、断面の位置が、

を最小化することによって推定されるパラメータφ^１＝（Ψ_１、Ψ）によって定められ、ここで、式Ｐ_ｉはΨ_１に依存している。

ステップＢ）の第２の段階において、推定が、不安定さを考慮に入れるために洗練される。先の推定からもたらされる位置が、Ｐ_ｉ ^１と記述される。最終的な位置はＰ_ｉ ^１に近く、Ｐ_ｉ ^１へと加えられるアフィン回転φ_ｉ＝（Ｒ_ｉ、Ｔ_ｉ）によって定められる。Φ＝｛φ_ｉ、ｉ＝１、・・・、ｎ｝が、

を最小化することによって推定される。

再現ステップＣ）は、例えば三次元スプライン平滑化を使用することによって、配置された断面

を

において連続的に補間することによって実行され、結果が

と記述されるボリュームｆの再現を構成する。

Ｒ^０の回転の軸が取得平面にない場合、取得平面が横切ることが決してない物体の領域が存在し、したがってこの領域の再現が不可能である。そのような状況においては、ステップＡ）およびＢ）がシーケンス

について繰り返され、次いで断面

のすべてが、三次元スプライン平滑化を使用して

において連続的に補間され、結果がやはり

と記述されるボリュームｆの再現を構成する。

より一般的には、回転における複数の「第２のシーケンス」を使用することが可能である。

上記の説明においては、予備的な再現が、平行移動での１つ以上の断面のシーケンスから得られ、最終的な再現が、回転での１つ以上の断面のシーケンスから得られている。この反対も可能であるが、上述のように、異なる軸を中心とする回転での２つの断面のシーケンスの画像を使用することは、困難である可能性がある。

本発明は、とくには共焦点顕微鏡法へと適用可能であるが、これに限られるわけではない。例として、この分野において、以下が可能になる。
・蛍光共焦点顕微鏡法によって得られる一連の二次元画像に基づき、個々の生きている非付着の細胞の三次元での仮想の再現が可能になり、
・顕微鏡法に固有の軸上収差の除去および空間分解能の改善が可能になる。

細胞の三次元の再現のための従来からの技法は、細胞を透明な表面に固定することを必要とする。細胞が、手作業にてさまざまな向きに配置される。各々の向きにおいて、「ｚスタック」プロトコルとして知られるプロトコルを使用して、垂直方向の平行移動で断面のシーケンスが取得される。次いで、それらのスタックを融合させることで、細胞の三次元の再現がもたらされるが、その再現は、それでもなお軸上収差および分解能の不足から完全には逃れることができない。さらに、この方法は、非付着の細胞へは適用が困難または不可能である。

４０００種類の細胞を研究者にとって利用できるようにしているＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）において、そのうちの約１５００種は非付着である。その中でも、２８０種は、三次元分析の欠如ゆえに十分に活用されていない人間の細胞である。

上述の文献ＥＰ１４１３９１１が、水溶液中に懸濁している細胞を捕捉し、顕微鏡のレンズの下方で回転移動または平行移動させることができる「細胞マニピュレータ」器具が装着された顕微鏡を記載している。この移動により、細胞をさまざまな向きのもとで調査することができる。この器具の中央部は、レンズの下方に置かれる捕捉「ケージ」である。ケージ内に生成される電界が、ケージにおいて調節することができる電界の設定に応じて、細胞を捕捉して移動させるように機能する。この器具の第１の実験的な利点は、懸濁している物品の分析を可能にする点にあり、これは非付着の細胞（免疫系の細胞など）においてとくに有利である。

残念ながら、再現には、細胞の向きが比較的正確に知られている必要がある。しかしながら、文献ＥＰ１４１３９１１の「マニピュレータ」は、細胞の向きを大まかにしか調節することができないため、この新規な技法をルーチン的に使用することは不可能である。

「細胞マニピュレータ」は、「回転」での取得を可能し、したがって光学顕微鏡につきものであり、焦点面に垂直な方向（ｚ軸）の分解能が焦点面内（ｘｙ）の分解能の半分であるという事実に関係している「軸上収差」による影響を受けないようにすることができるという利点も呈する。この影響ゆえに、球形の物体が、長軸がＯｚ方向を向いている楕円形であるように見える。これまでのところ、この問題が、三次元顕微鏡画像化の主たる妨げを構成している。なぜならば、そのような画像化は、基本的にｚスタック式の取得に基づくからである。しかしながら、文献ＥＰ１４１３９１１の装置によってもたらされる利点は、細胞の移動に関する不確かさの克服を可能にする再現方法が存在しないため、これまでは「仮想」のままであった。

本発明の主たる貢献は、ここに存在する。

図５は、文献ＥＰ１４１３９１１の共焦点顕微鏡によって見た取得平面を細胞に対して回転させることによって得られた複数の断面画像を示している。

図６Ａおよび図７Ａは、ｚスタックプロトコル（一連の断面画像が、細胞を焦点面に対して平行移動させることによって得られる）の適用において本発明の方法に従って実行された同じ細胞の再現の２つの図である。

図６Ｂおよび図６Ｃは、同じ細胞の再現に対応する２つの図であるが、再現が、最終的な再現を細胞を焦点面に対して回転させることによって取得される一連の断面画像に基づいて実行する「２プロトコル」法（図４を参照）を使用して、本発明の方法に従って実行されている。図６Ａ／図６Ｂおよび図７Ａ／図７Ｂの比較が、「回転」にて取得された一連の画像を使用することによって可能にされるとおり、軸上収差の減少が取り除かれることを示している。

図８は、細胞マニピュレータＣと本発明の再現方法を実行するためのデータ処理装置ＴＤとが備えられた共焦点顕微鏡Ｍのきわめて図式的な図である。

Claims (30)

1. 物体に対する取得平面の位置および／または向きが異なる物体の一連の断面画像であって、前記位置および／または向きが不確かさを免れ得ない一連の断面画像から、前記物体のボリュームを再現する方法であって、
   ａ）再現すべきボリュームを分解することができる関数の有限基底を選択するステップ、
   ｂ）前記物体に対する各々の断面の実際の位置および／または向きと公称の位置および／または向きとの間の差を量子化するための第１の定量化関数を選択するステップ、
   ｃ）再現されたボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための第２の定量化関数を選択するステップ、
   ｄ）物体の断面画像と再現されたボリュームの該当する断面との間の差を量子化するための第３の定量化関数を選択するステップ、
   ｅ）前記第１、第２、および第３の量子化関数の値に依存する値の総コスト関数を選択するステップ、および
   ｆ）前記全体コスト関数を最小化することによって、断面の実際の位置および／または向きを、物体の画像を前記関数基底へと分解するための係数と一緒に推定するステップ
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記物体が、三次元の物体である、請求項１に記載の方法。
3. 再現すべきボリュームを分解することができる前記関数の有限基底が、ガウス関数によって構成されている、請求項１または２に記載の方法。
4. 再現すべきボリュームを分解することができる前記関数の有限基底が、自己再生核ヒルベルト空間を定める基底である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 再現されたボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための前記第２の定量化関数が、前記自己再生核ヒルベルト空間のノルムに比例する、請求項４に記載の方法。
6. 各々の断面の実際の位置および／または向きと公称の位置および／または向きとの間の差を量子化するための前記第１の定量化関数が、ユークリッドノルムおよび／または測地線ノルムに基づく、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 各々の断面の実際の位置および／または向きと公称の位置および／または向きとの間の差を量子化するための前記第１の定量化関数が、前記物体の断面画像の取得に使用される器具に特徴的な少なくとも１つの較正パラメータに依存する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 前記第２の定量化関数が、空間コヒーレンスを較正するための少なくとも１つの較正パラメータに依存し、前記第３の定量化関数が、前記差を較正するための少なくとも１つの較正パラメータに依存し、
   当該方法が、前記ステップｆ）の前に、
   前記物体の前記一連の断面画像から少なくとも前記差および空間コヒーレンスの較正パラメータを一緒に推定するステップｄ’）
   をさらに含んでいる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. ステップｄ’）が、前記物体の前記一連の断面画像に基づく最尤法によって、少なくとも前記空間コヒーレンスおよび差の較正パラメータを一緒に推定することを含んでいる、請求項８に記載の方法。
10. 前記最尤法による推定が、再現されたボリュームの空間コヒーレンスを量子化するための前記第２の定量化関数、および物体の断面画像と再現されたボリュームの該当する断面との間の差を量子化するための前記第３の定量化関数が、ガウス分布に従うという仮定に基づく、請求項９に記載の方法。
11. 前記全体コスト関数が、前記第１、第２、および第３の定量化関数の一次結合である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記全体コスト関数を最小化することによって、断面の実際の位置および／または向きを、物体の画像を前記関数基底へと分解するための係数と一緒に推定する前記ステップｆ）が、勾配降下法を使用して実行される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記物体の断面が、画像取得平面の連続的な公称の平行移動によって得られるが、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が前記平行移動に重畳している、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記物体の断面が、共通の軸を中心とする画像取得平面の連続的な公称の回転移動によって得られるが、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が前記回転移動に重畳している、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ステップａ）〜ｆ）が、画像取得平面の連続的な公称の回転によって得られる少なくとも２つの一連の断面について繰り返され、
    前記２つの一連の断面に対応する回転軸は、実質的に互いに直角であり、
    前記２つの一連の断面から得られる物体のボリュームの再現が、補間によって融合させられる、請求項１４に記載の方法。
16. 物体の複数の断面画像シーケンスから、前記物体のボリュームを再現する方法であって、
    各々のシーケンスが、取得平面の連続的な公称の平行移動によって得られる断面によって構成されており、前記公称の平行移動に、先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が重畳しており、前記取得平面の公称の向きが、各々のシーケンスごとに異なっておりかつ不完全な様相で既知である方法であり、
    Ａ）請求項１から１３のいずれかに記載の方法によって前記シーケンスの各々の断面の観察平面の相対的な位置および向きを推定するステップ、
    Ｂ）異なるシーケンスの間のオフセットおよび向きの差ならびに前記物体に対するオフセットおよび向きの差を推定するステップ、
    Ｃ）断面画像シーケンスの間のオフセットおよび向きの差を補償するステップ、および
    Ｄ）単一のセットを構成すると考えられる前記シーケンスの断面画像からの補間によって前記ボリュームを再現するステップ
    を含んでいる方法。
17. 前記物体の異なる断面画像シーケンスの間のオフセットおよび向きの差を推定するステップＢ）が、主成分分析によって実行される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記主成分分析が、前記断面画像シーケンスの２値化版に対して実行される、請求項１７に記載の方法。
19. 各々の断面画像シーケンスが、基準として選択されるシーケンスの２値化しきい値と一緒に推定される２値化しきい値を使用して２値化され、
    前記推定が、基準シーケンス以外の各々のシーケンスについて、該シーケンスの分散共分散行列の固有値と前記基準シーケンスの分散共分散行列の固有値との間の差の関数を最小化することによって実行される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記差の関数が、
    

    

    によって与えられ、
    ここで、λ_ｋおよびλ’_ｋが、それぞれ該当の２値化シーケンスおよび基準２値化シーケンスの分散共分散行列の固有値である一方で、τおよびτ’が、それぞれの２値化しきい値である、請求項１９に記載の方法。
21. ・観察平面を物体に対して平行移動させることによって得られる該物体の第１の断面画像シーケンス、および
    ・観察平面を前記物体に対して回転移動させることによって得られる前記物体の少なくとも１つの第２の断面画像シーケンス
    を含んでおり、
    先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が、種々の断面に関する観察平面の前記平行移動または回転移動に重畳している前記物体の複数の断面画像シーケンスから、前記物体のボリュームを再現する方法であって、
    ｉ）請求項１から１３のいずれかに記載の方法を使用して、前記第１の画像シーケンスから前記ボリュームを予備的に再現するステップ、
    ｉｉ）前記第１および第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置するステップ、および
    ｉｉｉ）前記再配置された断面の第２のシーケンスから、補間によって前記ボリュームを再現するステップ
    を含んでいる方法。
22. ・観察平面を物体に対して平行移動させることによって得られる該物体の複数の第１の断面画像シーケンス、および
    ・観察平面を前記物体に対して回転移動させることによって得られる前記物体の少なくとも１つの第２の断面画像シーケンス
    を含んでおり、
    先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が、種々の断面に関する観察平面の前記平行移動または回転移動に重畳している前記物体の複数の断面画像シーケンスから、前記物体のボリュームを再現する方法であって、
    ｉ）請求項１６から２０のいずれかに記載の方法を使用して、前記第１の画像シーケンスから前記ボリュームを予備的に再現するステップ、
    ｉｉ）前記第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置するステップ、および
    ｉｉｉ）前記再配置された断面の第２の画像シーケンスに基づく補間によって前記ボリュームを再現するステップ
    を含んでいる方法。
23. ・観察平面を物体に対して回転移動させることによって得られる該物体の第１の断面画像シーケンス、および
    ・観察平面を前記物体に対して平行移動させることによって得られる前記物体の少なくとも１つの第２の断面画像シーケンス
    を含んでおり、
    先験的には知られていない無作為な回転−平行移動が、種々の断面に関する観察平面の前記平行移動または回転移動に重畳している前記物体の複数の断面画像シーケンスから、前記物体のボリュームを再現する方法であって、
    ｉ）請求項１から１２、１４、または１５のいずれかに記載の方法によって、前記第１の画像シーケンスから前記ボリュームを予備的に再現するステップ、
    ｉｉ）前記第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置するステップ、および
    ｉｉｉ）前記再配置された断面の第２のシーケンスから、補間によって前記ボリュームを再現するステップ
    を含んでいる方法。
24. 前記第２のシーケンスの断面の位置および向きを推定し、該推定に基づいて空間内に前記断面を再配置する前記ステップｉｉ）が、物体の断面画像と前記予備的に再現されたボリュームの該当の断面との間の差を量子化するための定量化関数を最小にすることを含んでいる、請求項２１から２３のいずれかに記載の方法。
25. 物体の断面画像と前記予備的に再現されたボリュームの該当の断面との間の差を量子化するための定量化関数を最小にすることが、
    ・前記第２のシーケンスまたは各々の第２のシーケンスの断面のすべてが前記観察平面の一定であるが未知である変位および／または平行移動によって得られたという仮定に基づいて、予備的な推定を行う第１の段階、および
    ・種々の断面に関して一定であると仮定した観察平面の平行移動または回転移動に重畳した無作為な回転−平行移動を推定することを含む洗練を行う第２の段階
    を含んでいる請求項２４に記載の方法、
26. 前記再配置された断面の第２の画像シーケンスから前記ボリュームを再現する前記ステップｉｉｉ）が、スプライン平滑化式の補間によって実行される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記物体の前記断面画像シーケンスが、共焦点顕微鏡法によって取得される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記物体が、共焦点顕微鏡の容器内に配置され、該物体の前記断面画像シーケンスが、該物体を容器に対して移動させることによって取得される請求項２７に記載の方法。
29. ・物体に対する取得平面の位置および／または向きが相違する該物体の一連の断面画像を取得するための手段、および
    ・前記物体の前記一連の断面画像から、前記物体のボリュームを再現するためのデータ処理手段
    を備えている物体のボリュームを再現するための装置であって、
    ・種々の断面に対応する取得平面の位置および／または向きが、不確かさを免れ得ず、
    ・前記データ処理手段が、請求項１から２８のいずれかに記載の方法を実行するように構成されている
    ことを特徴とする装置。
30. 前記物体の一連の断面画像を取得するための前記手段が、前記物体を収容するための容器と、前記物体を容器に対して移動させるための手段とを備える共焦点顕微鏡を備えている、請求項２９に記載の装置。

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