JP2015081253A - 内毒素による臓器不全予防剤 - Google Patents

Abstract

【課題】内毒素による敗血症及びそれに伴う臓器不全を予防することができる新規な薬剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明として、例えば、ＴＬＲ４阻害剤（例、ＴＡＫ２４２）を含有することを特徴とする、内毒素による敗血症やそれに伴う臓器不全（肝障害など）の予防剤を挙げることができる。また、ＴＬＲ４阻害剤（例、ＴＡＫ２４２）を含有し、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術前に予め投与するものであることを特徴とする、内毒素による敗血症やそれに伴う臓器不全（肝障害など）の予防剤を挙げることができる。【選択図】図７

Description

本発明は、内毒素（エンドトキシン）による敗血症ないし臓器不全のための予防剤に関するものである。詳しくは、本発明は、Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）４阻害剤を含有することを特徴とする、内毒素による敗血症ないし臓器不全のための予防剤に関するものである。

胆管閉塞状態では、バクテリアルトランスロケーション（腸管から血中への菌の移行）が容易に発生する（非特許文献１参照）。バクテリアルトランスロケーションにより腸管から血中へ移行した菌は、門脈血流を介してまず肝臓に到達する。肝臓にはクッパー細胞が常在性マクロファージとして存在しており、門脈血流中のエンドトキシンは、このクッパー細胞によって処理されると考えられる。この時クッパー細胞は、大量の炎症性サイトカインを放出し、これが重篤な肝障害へとつながる（非特許文献２参照）。
また、大量肝切除術などの高度侵襲外科手術では、術中にバクテリアルトランスロケーションが誘発される（非特許文献３、４参照）。そのため胆管閉塞を伴う胆管癌などの症例で肝切除術を行うと、肝臓に流れ込んだエンドトキシンを処理するためクッパー細胞が肝臓に多く集積し、それが大量の炎症性サイトカインを放出する結果、時として術後に重篤な肝障害を引き起こす。
上記のような肝障害を防ぐため、経験的にステロイド剤の投与が行われているが、それ以外に有効な予防法が特にないのが現状である。

エンドトキシンの代表的な受容体はＴＬＲ４である。ＴＬＲ４は、エンドトキシンの外膜の成分であるリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：以下「ＬＰＳ」という。）等をリガンドとして認識する受容体である。
ＬＰＳは、肝臓で作られるＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）と結合する。この結合体は、細胞膜上のＣＤ１４に運ばれ、ＣＤ１４からＴＬＲ４とＭＤ２との複合体に受け渡され細胞内にシグナルが伝わる。かかるシグナルを受けて活性化したマクロファージなどは、ＴＮＦ−α等のサイトカインを分泌する。
エンドトキシン（ＬＰＳ）により上記シグナルが過剰になると、大量の炎症性サイトカインが放出され、それが重篤な肝障害等を引き起こし、死に至らしめる。
従って、ＴＬＲ４を有効に阻害することができれば、エンドトキシンによる大量の炎症性サイトカインの放出を抑制でき、重篤な肝障害等を軽減でき、ひいては生存率の向上につながる可能性がある。

ＴＬＲ４を競合的に阻害する薬剤の一つとして、レサトルビド（Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ、（６Ｒ）−６−［［（２−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］スルフォニル］−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸エチルエステル；以下「ＴＡＫ２４２」という。）が知られている（非特許文献５参照）。このＴＡＫ２４２がＴＬＲ４を阻害することから、エンドトキシンによる重症敗血症の治療に有効か否かが検証されている。その結果、マウスで菌性敗血症を盲腸結紮穿孔により誘導後、ＴＡＫ２４２を抗生剤と併用することにより生存率が改善され、重症敗血症におけるＴＡＫ２４２の有効性が示唆された（非特許文献６参照）。しかしながら、重症敗血症患者を対象に、このＴＡＫ２４２を投与した二重盲検試験では、用量依存的に生存率の改善はみられたものの、プラセボ投与群と統計学的な有意差はなく、その有効性が否定された（非特許文献７参照）。

なお、このＴＡＫ２４２は、武田薬品工業株式会社によって創製された化合物である（特許文献１参照）。武田薬品工業株式会社は、該化合物に対し、重症敗血症治療薬への承認申請に向けて日米欧の三極で臨床第３相試験まで行ったが、臨床試験を継続するための当社評価基準に合致しなかったためなどの理由から、該化合物の開発を中止された。

国際公開第９９／４６２４２号

Ｄｉｎｇ ＪＷ， Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ， １９９４；７５（２）：２３８−４５ Ｅｒｕ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１２；２４（１）：２５−３２ Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ， Ａｎｎ Ｓｕｒｇ， ２０１０；２５２（６）：１０１３−９ Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ Ｅ， Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２０１３ ｉｎ ｐｒｅｓｓ Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｎ， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２０１１；７９（１）：３４−４１ Ｓｈａ Ｔ， Ｓｈｏｃｋ， ２０１１；３５（２）：２０５−９ Ｒｉｃｅ ＴＷ， Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ， ２０１０；３８（８）：１６８５−９４

本発明は、内毒素による敗血症及びそれに伴う臓器不全を予防することができる新規な薬剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、上記課題を解決しうる新規な薬剤を見出し、本発明を完成した。
本発明として、例えば、次の（１）〜（４）を挙げることができる。
（１）ＴＬＲ４阻害剤を含有することを特徴とする、内毒素による臓器不全の予防剤。
（２）ＴＬＲ４阻害剤を含有することを特徴とする、内毒素による敗血症の予防剤。
（３）ＴＬＲ４阻害剤を含有し、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術前に予め投与するものであることを特徴とする、内毒素による臓器不全の予防剤。
（４）ＴＬＲ４拮抗阻害剤を含有し、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術前に予め投与するものであることを特徴とする、内毒素による敗血症の予防剤。
本発明の特徴は、敗血症や臓器不全を既に発症している患者にＴＬＲ４阻害剤を投与するものではなく、内毒素による敗血症ないし臓器不全に陥る前にＴＬＲ４阻害剤を予め投与するものである点にある。また、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのあるような侵襲外科手術に先立って予めＴＬＲ４阻害剤を投与するものである点にある。

ＴＬＲ４阻害剤は、ＴＬＲ４に結合し、ＴＬＲ４からのシグナル伝達を阻害する薬剤である。本発明に係るＴＬＲ４阻害剤は、そのような作用を有する薬剤であれば特に制限されない。具体的には、例えば、前記ＴＡＫ２４２や特許文献１に記載された化合物、エーザイ株式会社が重症敗血症治療剤として開発中のエリトラン（Ｅｒｉｔｏｒａｎ、開発番号Ｅ５５６４）、かかるエリトランを開示する特開２０１１−１２１９７０号公報に記載された化合物、ＬＰＳ−ＲＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製品)、ＣＲＸ−５２６、Ｅ５５３１、Ｅ５５６４（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００８；２５（８）：１７５１−６１参照）、ＩＡＸＯ−１０１（ＡｄｉｐｏＧｅｎ社製品）を挙げることができる。

後述の試験例では、ＴＡＫ２４２による結果を一例として掲げている。しかしながら、その他のＴＬＲ４阻害剤であっても、投与量や投与時期、投与方法等の点でＴＡＫ２４２とは異なり得るものの、同様の効果が期待される。後述の試験例から明らかな通り、胆管結紮により肝臓内のクッパー細胞が増え、そこに存在するＴＬＲ４の発現も肝臓全体で亢進する。そして、さらに微量のエンドトキシンの注入によりラット肝は著しい肝障害を惹起する。これは、肝臓全体に発現したＴＬＲ４にエンドトキシン（ＬＰＳ）が結合し、そのシグナル伝達により過剰な炎症性サイトカインが分泌されたからである。このシグナル伝達が行われる前にＴＬＲ４阻害剤（ＴＡＫ２４２）を予め投与すると、サイトカインの分泌が抑制され、肝障害も軽減された。従って、基本的にＴＬＲ４とＬＰＳとの結合を阻止することができるＴＬＲ４阻害剤であれば、一般に同様の効果があるものと考えられる。

エンドトキシンが血液中に入ると内毒素血症になり、そこから敗血症やそれに伴う臓器不全に陥っていくが、その内毒素血症になる原因は本発明では特に制限されず、例えば、胆管閉塞状態で発生する場合を挙げることができる。胆管閉塞状態は、例えば、胆管癌や膵臓頭部癌、胆道内結石症に伴って起こりうる。
「臓器不全」としては、例えば、肝障害、肺障害、心臓障害、腎障害を挙げることができる。なお、バクテリアルトランスロケーション等による内毒素血症により肝不全ないし肝障害がまず惹起され、続いて全身の様々な臓器が機能不全（多臓器不全）に陥っていくものと考えられる。従って、これら２つ以上の臓器が機能不全である多臓器不全や、また重篤な臓器不全の場合も本発明に係る臓器不全に含まれる。
「バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術」としては、例えば、肝切除術ないし胆管閉塞を伴う胆管癌、肝細胞癌、転移性肝癌、その他の肝腫瘍などの症例での（大量）肝切除術、膵頭十二指腸切除術、食道切除術を挙げることができる。

本発明の予防剤によれば、術後の敗血症及びそれに伴う重要な臓器の機能不全（肝障害等）を軽減することができる。本発明の予防剤を、例えば、胆管閉塞を伴う胆肝癌に対して肝切除術を行う前に有効量を投与しておくことによって、術後の敗血症及びそれに伴う重要な臓器の機能不全（肝障害等）を軽減することができる。

各群の操作手順、及びＬＰＳ等の投与量、投与時期などを表した模式図である。 ａは、ＴＬＲ４ ｍＲＮＡの発現量を表す。ｂは、ＴＬＲ４タンパク質の発現量を表す。各図の縦軸は任意単位（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）を示す。 クッパー細胞の数を表す。 上図は血中の、下図は尿中のエンドトキシンの濃度推移をそれぞれ表す。各図の縦軸は濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、各図の横軸は時間（時間）をそれぞれ示す。 上図は肝組織中の、下図は肺組織中のエンドトキシンの濃度推移をそれぞれ表す。各図の縦軸は濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、各図の横軸は時間（時間）をそれぞれ示す。 肝組織全体に対する壊死組織の割合を表す。縦軸は壊死組織の割合（％）を示す。 血中における肝酵素（ＡＳＴ、ＡＬＴ）量の推移を表す。各図の縦軸は酵素濃度（ＩＵ／Ｌ）を、各図の横軸は時間（時間）をそれぞれ示す。 血漿中サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）量の推移を表す。各図の縦軸は酵素濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、各図の横軸は時間（時間）をそれぞれ示す。

本発明の予防剤は、ＴＡＫ２４２などのＴＬＲ４阻害剤を、そのまま又は医薬上許容される無毒性かつ不活性な担体中に、０．０１〜９９．５重量％の範囲内で、好ましくは０．５〜９０重量％の範囲内で配合することによって製造することができる。
上記担体として、固形、半固形又は液状の希釈剤、充填剤、その他の処方用の助剤を挙げることができる。これらを一種又は二種以上用いることができる。
本発明の予防剤は、固形又は液状の用量単位で、末剤、カプセル剤、錠剤、糖衣剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤等の経口投与製剤、注射剤、点滴製剤、坐剤等の非経口投与製剤のいずれの形態をもとることができる。徐放性製剤であってもよい。それらの中で、特に注射剤が好ましい。注射剤は、用時調製の注射用キットないし点滴用キットであってもよい。

末剤は、ＴＬＲ４阻害剤を適当な細かさにすることにより製造することができる。
散剤は、ＴＬＲ４阻害剤を適当な細かさにし、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱粉、マンニトールのような可食性炭水化物と混合することにより製造することができる。任意に風味剤、保存剤、分散剤、着色剤、香料等を添加することができる。
カプセル剤は、まず上述のようにして粉末状となった末剤や散剤あるいは錠剤の項で述べるように顆粒化したものを、例えば、ゼラチンカプセルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造することができる。滑沢剤や流動化剤、例えば、コロイド状のシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、固形のポリエチレングリコールを粉末状のものに混合し、その後充填操作を行うことにより製造することもできる。崩壊剤や可溶化剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加すれば、カプセル剤が摂取されたときの医薬の有効性を改善することができる。また、ＴＬＲ４阻害剤の微粉末を植物油、ポリエチレングリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散し、これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤とすることもできる。
錠剤は、賦形剤を加えて粉末混合物を作り、顆粒化もしくはスラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えた後、打錠することにより製造することができる。
粉末混合物は、適当に粉末化された物質を上述の希釈剤やベースと混合することにより製造することができる。必要に応じて、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール）、溶解遅延化剤（例えば、パラフィン）、再吸収剤（例えば、四級塩）、吸着剤（例えばベントナイト、カオリン）等を添加することができる。
粉末混合物は、まず結合剤、例えば、シロップ、澱粉糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子物質溶液で湿らせ、攪拌混合し、これを乾燥、粉砕して顆粒とすることができる。このように粉末を顆粒化する代わりに、まず打錠機にかけた後、得られる不完全な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能である。このようにして作られる顆粒に、滑沢剤としてステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラルオイル等を添加することにより、互いに付着することを防ぐことができる。
また、錠剤は、上述のように顆粒化やスラグ化の工程を経ることなく、ＴＬＲ４阻害剤を流動性の不活性担体と混合した後に直接打錠することによっても製造することができる。
こうして製造された錠剤にフィルムコーティングや糖衣を施すことができる。シェラックの密閉被膜からなる透明又は半透明の保護被覆、糖や高分子材料の被覆及びワックスよりなる磨上被覆をも用いることができる。

他の経口投与製剤、例えば、液剤、シロップ剤、トローチ剤、エリキシル剤もまたその一定量がＴＬＲ４阻害剤の一定量を含有するように用量単位形態にすることができる。
シロップ剤は、ＴＬＲ４阻害剤を適当な香味水溶液に溶解して製造することができる。エリキシル剤は、非毒性のアルコール性担体を用いることにより製造することができる。
懸濁剤は、ＴＬＲ４阻害剤等を非毒性担体中に分散させることにより製造することができる。必要に応じて、可溶化剤や乳化剤（例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールエステル類）、保存剤、風味付与剤（例えば、ペパーミント油、サッカリン）等を添加することができる。
必要であれば、経口投与のための用量単位処方をマイクロカプセル化することができる。当該処方はまた、被覆をしたり、高分子・ワックス等中に埋め込んだりすることにより作用時間の延長や持続放出をもたらすこともできる。

非経口投与製剤は、皮下・筋肉又は静脈内注射用とした液状用量単位形態、例えば、溶液や懸濁液の形態をとることができる。当該非経口投与製剤は、ＴＬＲ４阻害剤の一定量を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は溶解し、次いで当該懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造することができる。注射液を等張にするために非毒性の塩や塩溶液を添加することができる。また、安定剤、保存剤、乳化剤等を添加することもできる。同様に点滴製剤とすることもできる。
坐剤は、ＴＬＲ４阻害剤を低融点の水に可溶又は不溶の固体、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、半合成の油脂［例えば、ウイテプゾール（登録商標）］、高級エステル類（例えば、パルミチン酸ミリスチルエステル）又はそれらの混合物に溶解又は懸濁させて製造することができる。

本発明の予防剤の投与量は、体重、年齢等の患者の状態、剤形、投与方法、投与経路、症状の程度等によって異なるが、一般的には成人（体重約６０ｋｇ）に対して、ＴＡＫ２４２などのＴＬＲ４阻害剤の用量として、１回当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内が適当であり、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内が好ましく、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲内がより好ましい。場合によっては、これ以下でも足りるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。

本発明の予防剤は、内毒素による敗血症やそれに伴う臓器不全が懸念される前に有効量を投与することができる。投与方法としては、例えば、経口投与、静脈内投与、門脈内投与、皮下投与、点滴投与、局所投与（例、経粘膜投与、経鼻投与、吸入投与、経皮投与）を挙げることができる。投与回数は、ＴＬＲ４阻害剤の種類や用量、剤形、患者の状態、侵襲手術の種類等によって異なるが、例えば、１日１回〜数回又は１日〜数日間の間隔で投与することができる。また、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術の前であれば、１回ないし数回に分けて、注射や点滴等により、当該侵襲手術の約２４時間前〜直前に投与することができる。

［試験例１］
（１）操作手順
図１に示す操作手順に従って実験を行った。
雄性ウィスターラット（２５０〜３００ｇ、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ社製）の腹部正中を麻酔下で切開し、胆管２箇所を絹糸で結紮した。この胆管結紮（ＢＤＬ）した群をＢＤＬ群とした。一方、切開や結紮をしない群を疑似群とした。また、ＢＤＬラットの中、ＢＤＬ７日後に腹部を開腹し、シリコンカテーテルで胆管をドレナージした群をドレナージ群とした。
ＢＤＬ群と疑似群については、結紮７日後にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４）０．５ｍＬを回盲静脈からゆっくりと注入した。ドレナージ群については、ドレナージ処置の２４時間後に同様にＬＰＳを注入した。
ＢＤＬ群の数ラットについて、ＬＰＳ注入の１時間前にＴＡＫ２４２（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈投与し、これをＴＡＫ群とした。また、別にクッパー細胞の機能を阻害する三塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３、１ｍｇ／ｋｇ）をＬＰＳ注入の２４時間に静脈投与し、これをＧｄＣｌ３群とした。
図２以降において、＊は、疑似群に対するＰ＜０．０５（ｔ検定）、◆は、ＢＤＬ群に対するＰ＜０．０５（ｔ検定）を表す。全ての結果は、平均値＋−標準誤差（ＳＥ）として表している。

（２）肝臓におけるＴＬＲ４量
疑似群、ＢＤＬ群、及びドレナージ群の各肝臓におけるＴＬＲ４量を、常法による定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に基づき、ＴＬＲ４ ｍＲＮＡの発現量として求めた。測定は、各群（ｎ＝６）について２回行った。その結果を図２ａに示す。
図２ａが示す通り、肝臓におけるＴＬＲ４ ｍＲＮＡの発現量は、ＢＤＬ群が疑似群と比較して有意に高かった。また、ドレナージ群が示すように、この増加したＴＬＲ４遺伝子発現は、胆管ドレナージの２４時間後には有意に減退した。
また、各群の肝臓におけるＴＬＲ４タンパク質の濃度を常法のウェスタンブロット法に基づき測定した（各群ともｎ＝６）。
肝臓検体をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで均質化し、それをドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリビニリデンジフルオライド膜に転写した。そして、ウェスタンブロッティングＥＣＬ化学発光検出システム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いて、抗ＴＬＲ４抗体を検出し、Ｘ線写真（富士フィルム社製）に感光した。電気泳動写真から各群のＴＬＲ４タンパク質発現量を解析した。その結果を図２ｂに示す。各群におけるＴＬＲ４の強度は、相当するβ−アクチン（内部コントロール）との割合である。
図２ｂが示す通り、３群におけるＴＬＲ４タンパク質の濃度は、ＴＬＲ４ ｍＲＮＡの発現量と同様の傾向を示した。
これらの結果から、ＢＤＬにより、肝臓でＴＬＲ４が多く発現することが明らかである。

（３）肝臓におけるクッパー細胞数
疑似群、ＢＤＬ群、及びドレナージ群の各肝臓におけるクッパー細胞数を次の方法により求めた。
蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されたラテックスビーズ（直径２μｍ）をラットの頸動脈から注入した。このラテックスビーズを注入してから１０分後、肝臓表面の左側葉がＬＥＤ励起システムで表面に照らされた。クッパー細胞に取り込まれた固着ラテックスビーズを生物顕微鏡により数えることにより、各群（ｎ＝３）におけるクッパー細胞の数を見積もった。その結果を図３に示す。
図３が示す通り、クッパー細胞の数は、ＢＤＬ群が疑似群と比較して有意に増加した。このＢＤＬ群の変化は、ドレナージで元に戻された。

（４）ＴＬＲ４の存在場所
擬似群、ＢＤＬ群、及びドレナージ群におけるＴＬＲ４タンパク質とＥＤ−１タンパク質（クッパー細胞によって発現される抗原）に対して、常法により二重免疫染色した（各群ともｎ＝３）。細胞核については、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色した。
抗ＴＬＲ４抗体と抗ＥＤ−１抗体を用いた二重免疫染色により、２つの抗原が同じ場所に存在し、ＴＬＲ４は、主としてクッパー細胞に存在することが明らかとなった。加えて、ＢＤＬ群におけるＴＬＲ４とＥＤ−１の発現量は、疑似群やドレナージ群のそれらと比べて非常に高かった。
以上のように、ＢＤＬにより、肝臓でクッパー細胞の数が増え、それに伴ってクッパー細胞に存在するＴＬＲ４の発現も増加したものと考えられる。そして、胆管のドレナージによりいずれも減少した。

（５）エンドトキシンの移行臓器
疑似群とＢＤＬ群について、ＬＰＳ注入の０．５時間後、２時間後、及び４時間後に、ラットを犠牲にし、ラットの血液、尿、肝臓、肺のサンプルを採取した。
血中と尿中のＬＰＳ量は常法により測定した（各群ともｎ＝６）。肝組織と肺組織のＬＰＳ量は、各組織の１００ｍｇを１０００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で混合し、均質化して遠心分離した後、上清のエンドトキシン量を常法により検出することにより行った（各群ともｎ＝６）。その結果を図４と図５に示す。
図４が示す通り、血中のエンドトキシン量は、両群においてＬＰＳ注入後有意に増加した。その量は、疑似群よりＢＤＬ群の方が低い傾向にあった。また、両群とも、時間経過と共に徐々に減少した。尿中におけるエンドトキシンは、両群ともほとんど検出されなかった。
図５が示す通り、組織中のエンドトキシンについては、ＬＰＳ注入後、肝組織での濃度が高かった。その時間経過は、血漿中のエンドトキシン量の変化とパラレルであった。一方、肺組織では、エンドトキシンはほとんど検出されなかった。
これらの結果から、門脈循環から侵入したエンドトキシンがまず移行する主要な臓器は肝臓であることが明らかである。

（６）肝組織全体における壊死組織の割合
ＬＰＳ注入４時間後の疑似群、ＢＤＬ群、及びドレナージ群の肝臓検体について、各群の肝臓検体を１０％緩衝ホルマリン、脱水エタノールで直ちに固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンとエオシンで染色して、その切片を光学顕微鏡下で観察することにより肝組織全体における壊死組織の割合を求めた（各群ともｎ＝６）。その結果を図６に示す。
図６が示す通り、ＬＰＳを微量注入しても、疑似群では肝臓の壊死は見られなかった（０％）。一方、ＢＤＬ群では、ＬＰＳの微量注入により肝臓の壊死は疑似群と比較して有意に見られた（約５％）。しかし、ドレナージによりその壊死の程度は軽減され、ドレナージ群はＢＤＬ群と比較して有意な減少を示した。ＢＤＬ群の壊死は、門脈領域（ゾーンＩ）で主として観察された。

（７）ＴＡＫ２４２とＧｄＣｌ３の事前投与効果
前記の通り、ＴＡＫ２４２又はＧｄＣｌ３をＬＰＳ注入前に静脈投与したＴＡＫ２４２群及びＧｄＣｌ３群について、ＬＰＳ注入の２時間後と４時間後の血中ＡＳＴ（アスパルテート アミノトランスフェラーゼ）及び血中ＡＬＴ（アラニン アミノトランスフェラーゼ）の濃度を常法により測定した（各群ともｎ＝６）。その結果を図７に示す。
図７が示す通り、ＬＰＳ注入の４時間後の血中ＡＳＴ及び血中ＡＬＴの濃度は、擬似群やドレナージ群と比較して、ＢＤＬ群で有意に高かった。一方、ＴＡＫ２４２又はＧｄＣｌ３を事前に投与した群では、ＬＰＳ注入後のＡＳＴとＡＬＴの上昇が有意に抑制された。これら酵素の濃度は、ドレナージ群の各濃度とほぼ同じであった。
また、同様にＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血漿中濃度を常法のＥＬＩＳＡ法により測定した（各群ともｎ＝６）。その結果を図８に示す。
図８が示す通り、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血漿中濃度も、ＬＰＳ注入の２時間後と４時間後においてＢＤＬ群で有意に高かった。しかし、ＴＡＫ群とＧｄＣｌ３群では、これらの変化は有意に減退した。
このように、ＢＤＬと極微量のＬＰＳによる肝障害の発症が、ＬＰＳを注入する前にＴＡＫ２４２を投与しておくことにより抑制されたことから、ＴＬＲ４阻害剤が内毒素による臓器不全の予防剤として有用となりうることが明からである。

（８）死亡率
全てのラットは、ＬＰＳ注入して８時間後まで生存したが、ＢＤＬ群の５０％のラットは、２４時間以上生存しなかった。胆管ドレナージ処置やＴＡＫ２４２、ＧｄＣｌ３による前処置で、ＬＰＳ注入から２４時間後の死亡率が各々９２％、１００％、８３％まで減少した。即ち、ＬＰＳを注入する前にＴＡＫ２４２を予め投与した群では、死亡例はなかった。

（９）結論
以上の結果から明らかな通り、ＢＤＬラットにおいてクッパー細胞の数が増加するのと同様に、ＴＬＲ４タンパク質の発現量が増加した。この変化は、胆管ドレナージで効果的に元に戻った。ＴＬＲ４は、主としてクッパー細胞で見出された。
ＢＤＬラットにおいて、微量のＬＰＳを門脈内注入すると、血中肝酵素や炎症性サイトカインの顕著な増加が観察された。しかしながら、この顕著な増加は、ＴＡＫ２４２をＬＰＳ注入前に予め投与しておくことにより、胆管ドレナージで見られたと同レベルまで有意に減退した。また、ラットの生存率が飛躍的に高まった。
これらの結果は、ＴＡＫ２４２等のＴＬＲ４阻害剤が、例えば、バクテリアルトランスロケーションを受け易い胆管閉塞患者等に対する治療薬となりうることを示すものである。

本発明は、内毒素による敗血症及びそれに伴う臓器不全を予防するのに有効なＴＬＲ４阻害剤を提供することができる。また、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術後の敗血症及びそれに伴う臓器機能不全を予防しうるＴＬＲ４阻害剤を提供することができる。
加えて、臨床試験まで行われたものの、開発が一旦中止されたＴＡＫ２４２を再活用することができる。

Claims (18)

1. ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）４阻害剤を含有することを特徴とする、内毒素による臓器不全の予防剤。
2. 内毒素による臓器不全が、胆管閉塞状態で発生する内毒素血症によるものである、請求項１記載の予防剤。
3. ＴＬＲ４阻害剤が、レサトルビド（Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ）、エリトラン（Ｅｒｉｔｏｒａｎ）である、請求項１又は２に記載の予防剤。
4. 臓器が、肝臓、肺臓、心臓、腎臓である、請求項１〜３いずれか１項に記載の予防剤。
5. ＴＬＲ４阻害剤を含有し、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術前に予め投与するものであることを特徴とする、内毒素による臓器不全の予防剤。
6. 内毒素による臓器不全が、胆管閉塞状態で発生する内毒素血症によるものである、請求項５記載の予防剤。
7. バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術が、胆管閉塞を伴う胆管癌に対する肝切除術である、請求項５又は６に記載の予防剤。
8. ＴＬＲ４阻害剤が、レサトルビド（Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ）、エリトラン（Ｅｒｉｔｏｒａｎ）である、請求項５〜７いずれか１項に記載の予防剤。
9. 臓器が、肝臓、肺臓、心臓、腎臓である、請求項５〜８いずれか１項に記載の予防剤。
10. ＴＬＲ４阻害剤を含有することを特徴とする、内毒素による敗血症の予防剤。
11. 内毒素による敗血症が、胆管閉塞状態で発生する内毒素血症によるものである、請求項１０記載の予防剤。
12. ＴＬＲ４阻害剤が、レサトルビド（Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ）、エリトラン（Ｅｒｉｔｏｒａｎ）である、請求項１０又は１１に記載の予防剤。
13. 臓器が、肝臓、肺臓、心臓、腎臓である、請求項９〜１１いずれか１項に記載の予防剤。
14. ＴＬＲ４阻害剤を含有し、バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術前に予め投与するものであることを特徴とする、内毒素による敗血症の予防剤。
15. 内毒素による敗血症が、胆管閉塞状態で発生する内毒素血症によるものである、請求項１４記載の予防剤。
16. バクテリアルトランスロケーションを誘発するおそれのある侵襲外科手術が、胆管閉塞を伴う胆管癌に対する肝切除術である、請求項１４又は１５に記載の予防剤。
17. ＴＬＲ４阻害剤が、レサトルビド（Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ）、エリトラン（Ｅｒｉｔｏｒａｎ）である、請求項１４〜１６いずれか１項に記載の予防剤。
18. 臓器が、肝臓、肺臓、心臓、腎臓である、請求項１４〜１７いずれか１項に記載の予防剤。