JP2015077122A - 心筋細胞への分化をモニタリングする方法 - Google Patents
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Abstract
Description
幹細胞由来の胚様体に蛍光タンパク質励起用の励起光を当てた際に、自家蛍光の影響がどれほどあるかマウスES細胞を用いて調べた。
マウスES細胞(BRC6株、理研BRC)の培養には、KO DMEM培地(15% FBS、Penicillin−Streptomycin(SIGMA 100倍希釈)、NEAA(SIGMA 100倍希釈)、L−Glutamine(終濃度2mM)、2−メルカプトエタノール(終濃度0.1mM)入り)を用いた。マウスES細胞の培養は、マイトマイシンC処理で分裂を停止させたマウス胎児線維芽細胞(mouse embryonic fibro−blast;MEF細胞)上で行った。
培養したマウスES細胞をPBSで洗浄し、0.25%トリプシンEDTAで剥がした後、KO DMEM培地を加え、37℃インキュベーターで4時間インキュベートした。フィーダー細胞(MEF)を固着させることでマウスES細胞のみが浮遊する状態にした。マウスES細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、1mlのKO DMEM培地又はIMDM培地(15% FBS、Penicillin−Streptomycin(SIGMA 100倍希釈)、NEAA(SIGMA 100倍希釈)、2−メルカプトエタノール(終濃度0.1mM)入り)に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、IMDM培地を加えたLipidure−Coat培養培地(96ウェル丸底;日油株式会社)の各ウェルに細胞数が2500個又は5000個になるように細胞混濁液を加え、3乃至7日間37℃で培養し、胚様体を形成させた。
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した35mmディッシュに移し、37℃で一晩インキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させた。その後、EGFP用のフィルター(460−480nm、495−540nm)を用いて励起光を照射し、自家蛍光の影響がどれだけあるかを、倒立型蛍光顕微鏡IX70及び顕微鏡デジタルカメラDP70(オリンパス株式会社製)を用いて観察した。
心筋特異的トロポニンT(cardiac troponinT;cTnT)は心筋に特異的に発現するタンパク質である。cTnTは、心筋分化のマーカー遺伝子として利用されている。このcTnT遺伝子の発現を指標に、ES細胞及びiPS細胞の心筋への分化誘導過程の可視化が可能であるかを検討した。
(1)cTnT遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸が導入されたマウスES細胞の作製
cTnT遺伝子のためのプロモーター領域のクローニングを、非特許文献「Jin et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1995 Vol.214, No.3, p1168-1174」を参考に行い、プロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムDNAを鋳型として使用した。また、プライマーは、以下の2つを使用した。
Forward primer 1:GCCTCGAGTCTAGACTGAGATACAATGCAAAAGCTGG(配列番号1)
Reverse primer 1:GCAGATCTGGTTGAGGGCAGGGCATGGGGAGAGC(配列番号2)。
培養したcTnT−GL4発現マウスES細胞をPBSで洗浄し、0.25%トリプシンEDTAで剥がした後、KO DMEM培地を加え、37℃インキュベーターで4時間インキュベートした。フィーダー細胞(MEF)を固着させることで、マウスES細胞のみが浮遊する状態にした。マウスES細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、1mlのKO DMEM培地又はIMDM培地に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、IMDM培地を加えたLipidure−Coat培養培地(96ウェル丸底;日油株式会社)の各ウェルに細胞数が2500個又は5000個になるように細胞混濁液を加え、3乃至7日間37℃で培養し、胚様体を形成させた。
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した35mmディッシュに移し、37℃で一晩インキュベートしてディッシュ表面に胚様体を接着させた。その後、37℃で5乃至14日間ほど培養し、拍動する心筋細胞への分化誘導を行った。
37℃で培養を続け、一部に拍動する心筋細胞が見られるようになったcTnT―GL4発現マウスES細胞の胚様体について、D−Luciferin(和光純薬製)を終濃度1mMとなるよう加え、拍動する細胞を解析ソフトウェアであるアクアコスモス(浜松ホトニクス株式会社)を搭載した発光顕微鏡LV200(オリンパス株式会社製)を用いて観察した。
(1)cTnT遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸が導入されたマウスiPS細胞の作製
cTnT遺伝子のためのプロモーター領域のクローニングを、非特許文献「Jin et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1995 Vol.214, No.3, p1168-1174」を参考に行い、プロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムDNAを鋳型として使用した。また、プライマーには、上記のForward primer 1及びReverse primer 1を使用した。
培養したcTnT−GL4発現マウスiPS細胞をPBSで洗浄し、0.25% トリプシンEDTAで剥がした後、KO DMEM培地を加えて、37℃インキュベーターで4時間インキュベートした。フィーダー細胞(MEF)を固着させることで、マウスiPS細胞のみが浮遊する状態にした。マウスiPS細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、1mlのKO DMEM培地又はIMDM培地に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、IMDM培地を加えたLipidure−Coat培養培地(96ウェル丸底;日油株式会社)の各ウェルに細胞数が2500個又は5000個になるように細胞混濁液を加え、3乃至7日間37℃で培養し、胚様体を形成させた。
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した35mmディッシュに移し、37℃で一晩インキュベートしてディッシュ表面に胚様体を接着させた。その後、37℃で5乃至14日間ほど培養することで、拍動する心筋細胞への分化誘導を行った。
37℃で培養を続け、一部に拍動する心筋細胞が見られるようになったcTnT―GL4発現マウスiPS細胞の胚様体について、D−Luciferin(和光純薬製)を終濃度1mMとなるよう加え、拍動する細胞をアクアコスモス(浜松ホトニクス株式会社)を搭載した発光顕微鏡LV200(オリンパス株式会社製)を用いて観察した。撮影条件を以下としてcTnT遺伝子の発現を観察した。CCDカメラ ImagEM(浜松ホトニクス株式会社製)をbinning1×1の条件で使用した。露光時間15分として、cTnT―GL4発現マウスiPS細胞を撮像した。
実施例2−2で作製したcTnT―GL4発現マウスiPS細胞が心筋に分化する過程を長時間経時的に観察し、cTnTの発現の変化を解析した。
cTnT―GL4発現マウスiPS細胞を、G418(終濃度250μg/ml)入りKO DMEM培地を用い、マイトマイシンC処理で分裂を停止させたネオマイシン耐性MEF細胞上で培養した。
cTnT−GL4発現マウスiPS細胞をPBSで洗浄し、0.25% トリプシンEDTAで剥がした後、KO DMEM培地を加え、37℃インキュベーターで4時間インキュベートした。フィーダー細胞(MEF)を固着させることで、cTnT−GL4発現マウスiPS細胞のみが浮遊する状態にした。cTnT−GL4発現マウスiPS細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、1mlのIMDM培地に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、IMDM培地を加えたLipidure−Coat培養培地(96ウェル丸底;日油株式会社)の各ウェルに細胞数が2500個又は5000個になるように細胞混濁液を加え、3乃至7日間37℃で培養し、胚様体を形成させた。
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した35mmディッシュ(IMDM培地、ルシフェリン終濃度1mM入り)に移し、37℃で24hインキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させた。培地を新しいIMDM培地(ルシフェリン終濃度1mM)に交換し、アクアコスモス(浜松ホトニクス株式会社)を搭載した発光顕微鏡LV200(オリンパス株式会社製)を用いて約5日間長期観察を行った。撮影条件は以下として、cTnT遺伝子の発現を観察した。CCDカメラImagEM(浜松ホトニクス株式会社製)をbinning1×1の条件で使用した。cTnT―GL4発現マウスES細胞を露光時間10分、撮影間隔15分で撮影した。その際、心筋に分化した細胞が拍動している様子を観察するために、明視野撮影時にアクアコスモスのHDレコーディング機能を使用した動画撮影を同時に行った。動画の撮影条件は撮影時間124ms、撮影間隔124msとし、50乃至100枚連続撮影することにより動画を取得した。得られたデータはアクアコスモス(浜松ホトニクス株式会社)で解析した。撮影画像によって認識する場合は、収縮及び弛緩の過程に要する時間に比べて早いフレームレートによって連続的に撮影された連続画像(動画)が必要である。各フレームにおける個々の細胞位置は、前後の時間のフレーム画像を手がかりとして、手動又は各種の画像認識手法によって決定することができる。また、個々の細胞位置を特定せずに、画像の明暗パターンの運動をオプティカルフローや画像相関法などの手法によって解析することによっても拍動を認識することが可能である。
本実施例では、画像相関法による運動解析のうちSTICSに基づいて、マウスiPS細胞の心筋分化過程における拍動の解析を行った。
実施例2−3で用いたものと同様のcTnT−GL4発現マウスiPS細胞の心筋への分化過程において明視野連続画像及び発光画像を取得した。明視野連続画像については、観察期間を通して15分おきに61秒又は74秒の連続画像を取得した。連続画像に含まれる各画像の撮影間隔は0.61秒又は0.37秒とした。撮影した512×512ピクセルの画像から、右中央部分の横264ピクセル×縦256ピクセルの解析領域を抽出した。抽出した解析領域を図13に領域R10として示した。抽出した解析領域内で32×32ピクセルのサブ領域を、相互に縦又は横に8ピクセルずつずれるように隈なく設定し、各サブ領域において各々以下のような運動解析を行い、サブ領域内の局所的な運動を定量的に評価した。
本実施例の解析結果について説明する。上述の通り図13における画像に含まれる四角形の領域R10は、本実施例2−4において図14乃至21に示す解析に用いた画像の領域を示す。また、図13に丸印で示した3つの位置は、本実施例2−4で解析対象とするデータを取得した領域である。これらの領域を第1の点P1と第2の点P2と第3の点P3と称することにする。
実施例2−3と同様に、実施例2−1で作製したcTnT―GL4発現マウスES細胞が心筋に分化する過程を長時間経時的に観察し、cTnTの発現の変化を解析することができる。
cTnT以外の心筋特異的マーカー、例えばGATA4、NCX1等を用いても、実施例2と同様に、マウスES細胞又はiPS細胞の心筋への分化過程を経時的に解析することができる。また、例えば上述の複数の心筋特異的マーカーのうち、複数の心筋特異的マーカーを用いて、マウスES細胞又はiPS細胞の心筋への分化過程を解析することができる。
上記実施例2及び実施例3において、心筋分化促進因子を添加した際のマウスES細胞又はiPS細胞の心筋への分化過程を経時的に解析することができる。
上記実施例2及び実施例3のような心筋分化マーカーや、例えばNanog、Tcf3といった未分化マーカーを組み合わせて、複数の遺伝子の発現の解析を行うこともできる。
細胞シートを解析対象としても、上記実施例2乃至実施例5のような解析を行うことができる。
上述の心筋細胞への分化の解析には、蛍光イメージングが併用されてもよい。
カルシウム応答性ルシフェラーゼを用いることにより、心筋に分化し拍動を開始した細胞内のカルシウムのイメージングを行うことができる。
カルシウム応答性ルシフェラーゼが導入されたマウスES細胞及びiPS細胞を、KO DMEM培地を用いて、マイトマイシンC処理で分裂を停止させたMEF細胞上で培養する。
培養したカルシウム応答性ES細胞又はカルシウム応答性iPS細胞をPBSで洗浄し、0.25%トリプシンEDTAで剥がした後、KO DMEM培地を加え、37℃インキュベーターで4時間インキュベートする。フィーダー細胞(MEF)を固着させて、マウスiPS細胞のみが浮遊する状態にする。細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、1mlのKO DMEM培地又はIMDM培地に細胞を再混濁する。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、IMDM培地を加えたLipidure−Coat培養培地(96ウェル丸底;日油株式会社)の各ウェルに細胞数が2500個又は5000個になるように細胞混濁液を加え、3乃至7日間37℃で培養し、胚様体を形成させる。
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した35mmディッシュに移し、37℃で一晩インキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させる。その後、37℃で5乃至14日間ほど培養することで、拍動する心筋細胞への分化誘導を行う。
37℃で培養を続け、一部に拍動する心筋細胞が見られるようになったカルシウム応答性ES細胞又はカルシウム応答性iPS細胞の胚様体について、セレンテラジン(和光純薬製)を終濃度1mMとなるよう加え、拍動する細胞をアクアコスモス(浜松ホトニクス株式会社)を搭載した発光顕微鏡LV200(オリンパス株式会社製)を用いて観察する。撮影条件は以下である。CCDカメラ ImagEM(浜松ホトニクス株式会社製)をbinning1×1の条件で使用した。露光時間15分として、カルシウム応答性ES細胞又はカルシウム応答性iPS細胞についてカルシウムイメージングを行う。
ES細胞又はiPS細胞由来細胞シートにおける拍動電位を測定することができる。
例えばマルチエレクトロードアレイ上で細胞を培養することによって、細胞の拍動電位が測定され得る。
Claims (14)
- 心筋細胞への分化能を有する細胞に、心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することと、
前記細胞を生存状態で維持し、前記細胞から放射される発光を撮像して発光画像を取得することと
を含む心筋細胞への分化をモニタリングする方法。 - 前記細胞の明視野画像を取得することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記明視野画像は動画を含み、
前記動画に基づいて運動解析を行うことをさらに含む、
請求項2に記載の方法。 - 前記運動解析は、画像相関法を用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- 前記運動解析によって、前記細胞の拍動を解析することと、
前記発光画像に基づいて前記心筋分化マーカー遺伝子の発現を解析することと、
前記拍動と前記発現との関係性を評価することと、
をさらに含む請求項3又は4に記載の方法。 - 前記発光画像を取得することは、経時的に撮像することによって複数の前記発光画像を取得することを含み、
前記複数の発光画像に基づいて、前記細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を取得することをさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記発光量の変化を数値化することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 未分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することをさらに含む、請求項1乃至7のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子は、複数種類の前記心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成されている、請求項1乃至8のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、幹細胞又は心筋前駆細胞である、請求項1乃至9のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、胚様体又は細胞シートの形態を有する、請求項1乃至10のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞の分化の状態を判定することをさらに含む、請求項1乃至11のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞の内部のカルシウム濃度を解析することをさらに含む、請求項1乃至12のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞の電位を測定することをさらに含む、請求項1乃至12のうち何れか1項に記載の方法。
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