JP2015057974A

JP2015057974A - 患者原発性大腸癌の個別化転移モデルマウスの作製方法

Info

Publication number: JP2015057974A
Application number: JP2013193525A
Authority: JP
Inventors: 彰折茂; Akira Orimo; 水越幸輔; Kosuke Mizukoshi; 裕岡澤; Yu Okazawa; 五藤倫敏; Michitoshi Goto; 小見山博光; Hiromitsu Komiyama; 樋野興夫; Okio Hino; 坂本一博; Kazuhiro Sakamoto
Original assignee: Juntendo University
Current assignee: Juntendo University
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2015-03-30

Abstract

【課題】患者原発性癌組織を用いて動物体内で転移が生じる癌転移モデルの作製。【解決手段】患者原発性大腸癌組織をＮＯＧマウスの皮下に移植し、皮下で増殖した癌組織を別のＮＯＧマウスの盲腸に移植することを特徴とする、患者原発性大腸癌転移モデルの作製方法。【選択図】なし

Description

本発明は、患者の大腸癌転移を模倣した個別化動物モデルの作製方法に関するものである。

癌患者の死因の９０％は転移に起因するが、癌転移の分子機構は未だ明らかにされてない。転移の早期診断法や有効な治療法も乏しい。従来の多くの研究は、ヒト癌転移巣より転移性癌細胞株を樹立し、免疫不全マウスに移植後、遠隔臓器に誘導される転移を調査したものである（特許文献１）。またトランスジェニックマウスに特定な癌遺伝子を強制発現することにより生じた癌より自発的に誘導される転移が調査された。

従来、癌転移は癌細胞内のゲノムの変異により起こる稀な悪性癌細胞の増殖により生じると推測されていた。しかしながら、癌化と転移化の表現型の違いを説明する遺伝子変異や分子機構は未だ明確ではない。癌化と転移化の表現型の違いを明らかにするには、非転移性の癌細胞が動物体内で転移性癌細胞に変化する動物モデルの開発が必要と考えられる。本発明者は、細胞膜のＥ−カドヘリン陽性の上皮細胞の形態を維持したヒト癌上皮細胞を用いてヒト上皮癌転移モデルマウスを作製した（特許文献２）。

特開２００６−２７１３７６号公報特願２０１２−１７５５４４号

しかしながら、先に本発明者が作製したモデルマウスも既に株化されたヒト癌細胞を用いるものであり、患者由来の癌組織を使用するものではなかった。従って、本発明の課題は、患者原発性大腸癌組織を免疫不全マウスに移植後、大腸癌転移の好発部位である肝臓や肺に自活的に転移が誘発される、患者の大腸癌転移を模倣した個別化動物モデルを作製することにある。

そこで本発明者は、患者より切除された原発性大腸癌をＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒｅｃｅｐｔｏｒγ ｎｕｌｌ）マウスの皮下、盲腸や肛門に移植してその転移能について種々検討した。その結果、最初に皮下に癌小断片を移植し増殖させた後、その癌塊の一部を新たなＮＯＧマウスの盲腸に移植することにより、肝臓や肺への転移がより顕著に生じることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。

〔１〕患者原発性大腸癌組織をＮＯＧマウスの皮下に移植し、皮下で増殖した癌組織を別のＮＯＧマウスの盲腸に移植することを特徴とする、ヒト原発大腸癌転移モデルの作製方法。
〔２〕患者原発性大腸癌の転移組織が、肝臓及び／又は肺である〔１〕記載の作製方法。
〔３〕患者原発性大腸癌組織をＮＯＧマウスの皮下に移植し、皮下で増殖した癌細胞を別のＮＯＧマウスの盲腸に移植することにより得られるヒト原発性大腸癌転移モデル。
〔４〕患者原発性大腸癌の転移組織が、肝臓及び／又は肺である〔３〕記載の患者原発性大腸癌転移モデル。

本発明の患者原発性大腸癌の転移モデルの利点として、移植された患者の原発性大腸癌から肝臓や肺への転移増悪が経時的に観察できることが挙げられる。また患者由来の癌の転移の可能性、転移後の進展等が早期に予測できるため、実際の患者に転移が再発する以前に治療計画を立てることができる。

症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像である。症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＣＫ）抗体を使用した免疫染色像である。症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。抗ＣＫ２０抗体を使用した免疫染色像である。症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を使用した免疫染色像である。症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。抗Ｋｉ−６７抗体を使用した免疫染色像である。症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を使用した免疫染色像である。症例２の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。ＨＥ染色像である。症例２の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。抗Ｋｉ−６７抗体を使用した免疫染色像である。症例３の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。ＨＥ染色像である。

本発明の患者個別化原発性大腸癌転移モデルは、（１）患者原発性大腸癌組織の小断片をＮＯＧマウスの皮下に移植し、（２）皮下で増殖した癌組織の一部を別の新たなＮＯＧマウスの盲腸に移植することによって作製される。

移植に用いる原発性大腸癌組織は、大腸に原発癌を有する患者から採取されたものである。大腸癌組織は、開腹切除術により採取することができる。用いる大腸癌組織片の大きさとしては、マウスあたり2〜2.5ｍｍ^３あれば十分である。

マウスは免疫不全マウスのうちＮＯＧマウスが用いられる。他の免疫不全マウスでは、残存した免疫能により良好に転移が生じない。ＮＯＧマウスは、ＷＯ２００２／０４３４７７に記載のマウスであり、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配したマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配して得られたマウスである。TおよびBリンパ球に加えnatural killer (NK)細胞を欠如したNOGマウスは異種細胞の生着に適している。

ヒト原発性大腸癌組織の最初の移植部位はマウスの皮下である。ヒト原発性大腸癌組織は皮下に生着し易く、増殖し易い。皮下への移植後、３〜４か月間大腸癌細胞を増殖させる。

次いで、皮下で増殖した癌組織を採取し、その組織片の一部（2〜２.5ｍｍ^３)を別の新しいＮＯＧマウスの盲腸に移植する。盲腸に移植することにより患者大腸癌を模倣した肝臓や肺への転移を誘導することができる。患者原発性大腸癌を皮下移植することなしに、直接盲腸に移植した場合、癌組織の生着率が悪くその後の増殖も遅いことを観察している。

盲腸への移植後、１〜２ヶ月間後には肝臓や肺への転移が観察される。肝臓や肺に転移した癌が患者原発性大腸癌由来であることは、大腸癌上皮細胞のマーカーであるcytokeratinや細胞増殖のマーカーであるKi-67などが転移巣の癌細胞で陽性であることから確認できる。

本発明では、異なる3例の患者由来原発性大腸癌をNOGマウスへ盲腸移植後１〜２か月間以内に、全例で肝臓や肺（患者大腸癌の転移好発部位）に著明な転移形成を促すことに成功した。従来の患者大腸癌組織を免疫不全マウス(主にヌードマウス)へ同所移植した報告では、肝臓や肺への転移に必要な期間や転移の頻度に関する注意深い観察は示されていない。しかしながら多くの場合、同所移植された癌よりの転移形成は長期間に稀にしか観察されていない。以上より高感度に癌転移の検出を可能にした本発明により、患者の原発性大腸癌の転移再発の可能性が予測されるのみならずその後の治療計画の策定が可能になる。また、このモデルを使用し解析すれば、癌転移のメカニズムの解明、早期癌転移診断法の開発、治療効果の強い薬剤の選択や新規癌転移治療法の開発などが可能となる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例１
（１）３例の異なる患者から手術により切除された原発性大腸癌組織の小断片（２〜２．５ｍｍ^３)をＮＯＧマウスの皮下に移植した。移植後、３〜４ヶ月後に、マウスの皮下から増殖した癌塊を採取した。続いて癌塊の一部（２〜２．５ｍｍ^３)を別の新しいＮＯＧマウスの盲腸に移植した。この移植１〜２ヶ月後に、マウスの各臓器への癌の転移を観察した。原発性大腸癌組織、マウスの皮下に異種移植された癌組織、マウスの盲腸に異種移植された癌組織、盲腸に異種移植されたマウスの肝臓および盲腸に異種移植されたマウスの肺の組織像が示されている。患者大腸癌細胞の存在を確認するために、これらの組織は種々の抗体で染色された。以下に示すように、結果として３例のすべての患者原発性大腸癌組織がＮＯＧマウスの肝臓や肺に著明な転移巣を形成することが明らかになった。

（２）症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図１に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像である。図１より、肝臓と肺に転移した癌細胞が観察される。

（３）症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図２に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。癌上皮細胞のマーカーである抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＣＫ）抗体を使用した免疫染色像である。図２より、患者由来原発性大腸癌細胞が肝臓及び肺に転移したことがわかる。

（４）症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図３に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。癌上皮細胞のマーカーである抗ＣＫ２０抗体を使用した免疫染色像である。図３より、患者由来原発性大腸癌が肝臓及び肺に転移したことがわかる。

（５）症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図４に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。患者大腸癌細胞のマーカーである抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を使用した免疫染色像である。
図４より、患者由来原発性大腸癌が肝臓及び肺に転移したことがわかる。

（６）症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図５に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。細胞増殖のマーカーである抗Ｋｉ−６７抗体を使用した免疫染色像である。図５より、原発性大腸癌が肝臓及び肺に転移したことがわかる。

（７）症例１の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図６に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。上皮細胞のマーカーである抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を使用した免疫染色像である。図６より、ヒト原発性大腸癌細胞が、肝臓及び肺に転移していることが示唆される。

（８）症例２の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約１か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約１か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約１か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図７に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。ＨＥ染色像である。図７より、癌細胞が、肝臓及び肺に転移していることがわかる。

（９）症例２の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約３か月間異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約１か月間異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約１か月間異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約１か月間異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図８に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。細胞増殖のマーカーである抗Ｋｉ−６７抗体を使用した免疫染色像である。図８より、ヒト原発性大腸癌細胞が、肝臓及び肺に転移していることが示唆される。

（１０）症例３の（Ａ）患者の原発性大腸癌組織、（Ｂ）マウスの皮下に約４か月異種移植された癌組織、（Ｃ）マウスの盲腸に約２か月異種移植された癌組織、（Ｄ）盲腸に約２か月異種移植されたマウスの肝臓、（Ｅ）盲腸に約２か月異種移植されたマウスの肺各組織の拡大像（Ｘ100及び右上にＸ４００）を図９に示す。円（破線）で転移癌巣が示されている。ＨＥ染色像である。図９より、癌細胞が、肝臓及び肺に転移していることが示唆される。

Claims

患者原発性大腸癌組織をＮＯＧマウスの皮下に移植し、皮下で増殖した癌組織を別のＮＯＧマウスの盲腸に移植することを特徴とする、患者原発性大腸癌転移モデルの作製方法。
患者原発性大腸癌の転移組織が、肝臓及び／又は肺である請求項１記載の作製方法。
患者原発性大腸癌組織をＮＯＧマウスの皮下に移植し、皮下で増殖した癌細胞を別のＮＯＧマウスの盲腸に移植することにより得られる患者原発性大腸癌転移モデル。
患者原発性大腸癌の転移組織が、肝臓及び／又は肺である請求項３記載の患者原発性大腸癌転移モデル。