JP2015020996A - Stem cell-derived growth factor production promoter - Google Patents
Stem cell-derived growth factor production promoter Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015020996A JP2015020996A JP2013152675A JP2013152675A JP2015020996A JP 2015020996 A JP2015020996 A JP 2015020996A JP 2013152675 A JP2013152675 A JP 2013152675A JP 2013152675 A JP2013152675 A JP 2013152675A JP 2015020996 A JP2015020996 A JP 2015020996A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rosa
- growth factor
- stem cell
- skin
- stem cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Description
本発明は、幹細胞由来成長因子産生促進剤、および該産生促進剤を含む皮膚外用組成物に関する。 The present invention relates to a stem cell-derived growth factor production promoter and an external composition for skin containing the production promoter.
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞に分化する多能性を有しており、この性質により損傷部の細胞・組織を再生することで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。 In the case of vertebrate, particularly mammalian tissue, when cell or organ damage occurs due to injury or disease, or aging, the regeneration system works to try to recover the damage of the cell or organ. Stem cells provided in the tissue play a major role in this effect. Stem cells have the pluripotency to differentiate into all kinds of cells, and it is considered that this property leads to recovery by regenerating the cells and tissues in the damaged part. Expectations have been gathered for regenerative medicine, which is the next generation of medicine using such stem cells.
一方、近年では、幹細胞が産生分泌する成長因子が注目を集めている。再生医療の基本戦略である幹細胞移植においては、実は幹細胞が産生分泌する成長因子が重要であり、これらが組織の再構築に寄与するのではないかと考えられるようになってきた。実際に、幹細胞から培養上清中に分泌された幹細胞由来の成長因子が、幹細胞移植と同等あるいはそれ以上の再生効果をもつことが、骨、皮膚、脊髄、脳を含む様々な組織において実証されている（非特許文献１)。また、幹細胞由来成長因子をシワの改善や発毛促進のために患部に注入して肌や髪を再生する再生美容も盛んになってきている。 On the other hand, in recent years, growth factors produced and secreted by stem cells have attracted attention. In stem cell transplantation, which is a basic strategy for regenerative medicine, growth factors produced and secreted by stem cells are actually important, and it has been considered that these may contribute to tissue reconstruction. In fact, it has been demonstrated in various tissues including bone, skin, spinal cord, and brain that stem cell-derived growth factors secreted from stem cells into the culture supernatant have a regeneration effect equivalent to or higher than that of stem cell transplantation. (Non-Patent Document 1). In addition, regenerative beauty that regenerates skin and hair by injecting stem cell-derived growth factor into affected areas to improve wrinkles and promote hair growth is also becoming popular.
これまでに、成長因子産生を促進する技術として、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｉ２アゴニスト、ＥＰ２アゴニストおよびＥＰ４アゴニストから選択される１種または２種以上を含有する内因性修復因子産生促進剤（特許文献１）、アムラ抽出物及びリンゴンベリー抽出物の少なくともいずれかを含有する血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）産生亢進剤（特許文献２）、シイタケ、エチナシ、プルーン、モヤシ、アマチャヅルの各抽出物から選択した１種又は２種以上を含有する血管内皮細胞増殖因子産生促進剤（特許文献３）などが報告されている。しかしながら、これらの成長因子産生促進剤はいずれも線維芽細胞や血管内皮細胞などの細胞から成長因子を産生促進するものであり、幹細胞から成長因子を産生促進するものではない。幹細胞から成長因子を産生促進させる技術として、低酸素や紫外線照射の物理的刺激と培地へのビタミン類の添加といった培養条件の検討により脂肪由来幹細胞から成長因子を大量に生産する方法が報告されているが（特許文献４）、培養条件の設定や調整が複雑であり、簡便な方法とはいえない。 To date, as a technique for promoting growth factor production, an endogenous repair factor production promoter containing one or more selected from prostaglandin (PG) I2 agonist, EP2 agonist and EP4 agonist (Patent Literature) 1) Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) production enhancer (Patent Document 2), Shiitake, Echinashi, Prunes, Moyashi, Achacharu each containing at least one of Amla extract and Lingonberry extract A vascular endothelial growth factor production promoter (Patent Document 3) containing one or two or more selected from those has been reported. However, these growth factor production promoters all promote production of growth factors from cells such as fibroblasts and vascular endothelial cells, and do not promote production of growth factors from stem cells. As a technique to promote production of growth factors from stem cells, a method has been reported in which growth factors are produced in large quantities from adipose-derived stem cells by examining culture conditions such as physical stimulation of hypoxia and ultraviolet irradiation and addition of vitamins to the medium. However, it is not a simple method because the setting and adjustment of culture conditions are complicated (Patent Document 4).
バラ（薔薇）はバラ科(Rosaceae)バラ属(Rosa)の種の総称であり、バラ科バラ属に属する植物は１５０種以上あるといわれ、多くの栽培品種がある。バラは花の豪華さ、花色の多さ、優美な香りから主には鑑賞用に用いられるが、これまでバラの花びらなどの抽出物に、抗菌作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、保湿作用、収斂作用、鎮静作用など様々な薬効があることが知られており、化粧品や医薬品などにも広く利用されている。しかしながら、幹細胞からの成長因子の産生促進効果についてはこれまで何ら知られていない。 Rose is a general term for the species of Rosaceae (Rosaceae), and there are more than 150 plants belonging to the genus Rosaceae, and there are many cultivars. Roses are mainly used for appreciation because of their gorgeous, richly colored flowers and graceful scents, but until now, extracts such as rose petals have antibacterial, antiallergic, anti-inflammatory, and moisturizing effects. It is known to have various medicinal effects such as astringent action and sedative action, and is widely used in cosmetics and pharmaceuticals. However, nothing has been known about the effect of promoting the production of growth factors from stem cells.
本発明の目的は、幹細胞による成長因子の産生を促進する物質を探索し、当該物質を皮膚の障害若しくは損傷、または肥満などの予防、改善または治療するための皮膚外用組成物として提供することにある。 An object of the present invention is to search for a substance that promotes the production of growth factors by stem cells, and to provide the substance as a composition for external use for the prevention, amelioration, or treatment of skin damage or injury or obesity. is there.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バラ科バラ属植物の特定の品種の抽出物が、幹細胞による成長因子の産生を促進する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that an extract of a specific variety of a Rosaceae plant belonging to the family Rosaceae has the effect of promoting the production of growth factors by stem cells. The invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１） ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞由来成長因子産生促進剤。
（２） （１）に記載の幹細胞由来成長因子産生促進剤を含む、皮膚外用組成物。
（３） 皮膚外用組成物が医薬品または医薬部外品である、（２）に記載の皮膚外用組成物。
（４） 皮膚外用組成物が化粧品である、（２）に記載の皮膚外用組成物。
（５） ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物の存在下で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞培養物の製造方法。
（６）幹細胞培養物から成長因子を単離する工程をさらに含む、（５）に記載の方法。
（７）（５）に記載の方法により得られる幹細胞培養物。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A stem cell-derived growth factor production promoter containing, as an active ingredient, an extract of at least one species of Rosaceae belonging to the family Rosaceae selected from Rosa Alba semiprena, Rosa Wikryana, and Rosa Fetida.
(2) A composition for external use on skin, comprising the stem cell-derived growth factor production promoter according to (1).
(3) The external composition for skin according to (2), wherein the external composition for skin is a pharmaceutical product or a quasi-drug.
(4) The external composition for skin according to (2), wherein the external composition for skin is a cosmetic.
(5) A method for producing a stem cell culture, comprising a step of culturing stem cells in the presence of an extract of at least one species of Rosaceae belonging to the family Rosaceae selected from Rosa Alba Semiprena, Rosa Wikryana, and Rosa Fetida .
(6) The method according to (5), further comprising the step of isolating a growth factor from the stem cell culture.
(7) A stem cell culture obtained by the method according to (5).
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、幹細胞による成長因子の産生および分泌を促進することができるので、加齢や紫外線暴露などに伴うシワやたるみ、シミなどの皮膚障害や劣化、外傷や熱傷による皮膚損傷、あるいは肥満を予防、改善または治療するための皮膚外用組成物として利用できる。また、本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を用いて幹細胞を培養することにより得られる幹細胞培養物または該培養物より単離した成長因子は、皮膚の再生や修復を目的として再生医療や再生美容に利用できる。 Since the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention can promote the production and secretion of growth factors by stem cells, skin damage and deterioration such as wrinkles and sagging due to aging and UV exposure, stains, trauma, The composition can be used as an external composition for preventing, ameliorating or treating skin damage caused by burns or obesity. In addition, the stem cell culture obtained by culturing stem cells using the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention or a growth factor isolated from the culture is used for regenerative medicine and regeneration for the purpose of skin regeneration and repair. Can be used for beauty.
以下に、本発明について詳細に述べる。 The present invention will be described in detail below.
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物を有効成分として含有する。 The stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention contains, as an active ingredient, an extract of at least one Rosaceae plant belonging to the family Rosaceae selected from Rosa Alba semiprena, Rosa Wikryana, and Rosa Fetida.
ロサ・アルバ・セミプレナ（学名：Ｒｏｓａ ａｌｂａ ｓｅｍｉ−ｐｌｅｎａ）は、１６世紀以前に作出されたオールドローズの一種であり、ロサ・カニナとロサ・ダマスケナの交雑種とされている。ロサ・ウィクライアナ（学名：Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ）は、日本の代表的なバラの原種の一つであり、別名は、テリハノイバラ、ハマイバラ、ハイバラといわれている。ロサ・フェティダ（学名：Ｒｏｓａ ｆｏｅｔｉｄａ）は中近東原産のバラ原種の一つである。 Rosa alba semi-plena (scientific name: Rosa alba semi-plena) is a kind of old rose created before the 16th century, and is considered a hybrid of Rosa Canina and Rosa Damasquena. Rosa Wikleyana (scientific name: Rosa wichuliana) is one of Japan's typical rose species, also known as Teri Hanoi Rose, Hamai Rose, and Hibara. Rosa Fetida (scientific name: Rosa footida) is one of the rose species from the Middle East.
本発明において、バラ科バラ属植物の抽出物は、植物体全体（全草）、あるいは、花、茎、葉、枝、枝葉、果実、根、種子等の植物体の一部またはそれらの混合物の抽出物をいうが、地上部の植物体の抽出物が好ましい。また、抽出には、これらの植物体をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。 In the present invention, the extract of the plant belonging to the family Rosaceae belongs to the whole plant body (whole plant), or a part of the plant body such as flowers, stems, leaves, branches, branches and leaves, fruits, roots and seeds, or a mixture thereof. The above-mentioned plant body extract is preferred. In addition, these plants may be used as they are for extraction, or may be subjected to treatments such as drying, pulverization and shredding.
抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、攪拌またはカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、アルコール類、エーテル類、エステル類などを用いることができるが、エタノール、メタノール、アセトン等の水溶性有機溶媒が好ましく、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、または水−エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば上記バラ科バラ属植物の地上部（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行なったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で、３０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間を例示することができる。また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。 The extraction method is not particularly limited, and can be performed by stirring or column extraction using water or hot water, or a mixed solvent of water and an organic solvent. As the organic solvent, alcohols, ethers, esters, and the like can be used, but water-soluble organic solvents such as ethanol, methanol, and acetone are preferable, and one or more of these may be used. Particularly preferred extraction solvents include water or water-ethanol mixed polar solvents. The amount of the solvent used is not particularly limited, and for example, it may be 10 times or more, preferably 20 times or more, with respect to the above-ground part (dry weight) of the Rosaceae, but it may be concentrated after extraction. In the case of isolation, it is preferably 100 times or less for convenience of operation. Moreover, although extraction temperature and time depend on the kind of solvent to be used, for example, it is 10-100 degreeC, Preferably it is 30-90 degreeC, 30 minutes-24 hours, Preferably it can illustrate 1 to 10 hours. In addition, the extract may be used as it is in the extracted solution, but if necessary, in a range that does not affect the effect, concentration (concentration by organic solvent, vacuum concentration, membrane concentration, etc.), dilution, filtration, You may use, after performing processing, such as decoloring by activated carbon, deodorizing, ethanol precipitation. Further, the extracted solution may be subjected to a treatment such as concentration to dryness, spray drying, freeze drying, etc., and used as a dried product.
本発明における「幹細胞由来成長因子の産生促進」とは、生体レベルでまたは培養レベルで幹細胞による成長因子の産生および分泌を促進させることをいう。 “Promoting production of stem cell-derived growth factor” in the present invention refers to promoting production and secretion of growth factor by stem cells at the living body level or at the culture level.
本発明における「成長因子」には、塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子(ａＦＧＦ）、上皮成長因子(ＥＧＦ)、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、インスリン様成長因子−１(ＩＧＦ−１)、インスリン様成長因子−２(ＩＧＦ−２)、トランスフォーミング成長因子−β１(ＴＧＦ−β１）、トランスフォーミング成長因子−β２(ＴＧＦ−β２）、ケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、神経栄養因子(ＮＧＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)が含まれるが、これらに限定はされない。 The “growth factor” in the present invention includes basic fibroblast growth factor (bFGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor. -1 (IGF-1), insulin-like growth factor-2 (IGF-2), transforming growth factor-β1 (TGF-β1), transforming growth factor-β2 (TGF-β2), keratinocyte growth factor (KGF) Vascular endothelial growth factor (VEGF), neurotrophic factor (NGF), hepatocyte growth factor (HGF), but are not limited thereto.
これらの「成長因子」は、生体において様々な効果を発揮する。例えば、ｂＦＧＦは、皮膚組織の再生を促すことが知られている(特開２００７−０６８８８４）。また、ＩＧＦ−１についても皮膚組織の再生に関与することが知られている（Endocr Rev. 2003 Dec;24(6):737-64.Epidermal homeostasis: the role of the growth hormone and insulin-like growth factor systems.Edmondson SR, Thumiger SP, Werther GA, Wraight CJ.）。また、ＩＧＦ−１については、皮膚組織の再生効果に加えて内臓脂肪の低下効果等を示すことが知られる（特表２００７−５０２８３４）。さらに、ＴＧＦ−β１は、皮膚の創傷治癒過程において非常に重要な役割を果たす（日皮会誌：119（10）．1971-1977. 2009）。 These “growth factors” exert various effects in the living body. For example, bFGF is known to promote the regeneration of skin tissue (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-068884). IGF-1 is also known to be involved in skin tissue regeneration (Endocr Rev. 2003 Dec; 24 (6): 737-64. Epidermal homeostasis: the role of the growth hormone and insulin-like growth factor systems. Edmondson SR, Thumiger SP, Werther GA, Wraight CJ.). In addition, it is known that IGF-1 exhibits a visceral fat reducing effect and the like in addition to a skin tissue regeneration effect (Tokuyo 2007-502834). Furthermore, TGF-β1 plays a very important role in the skin wound healing process (Journal of the Japanese Society for Skincare: 119 (10). 1971-1977. 2009).
本発明において「幹細胞」とは、上記成長因子を産生しうる各種の幹細胞をいい、骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）、脂肪、毛包、筋肉、脳、肝臓、その他の組織に存在する未分化な状態の細胞（総称して、体性幹細胞という）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などを含む。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、及びそれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。このようなＥＳ細胞は、例えば、自体公知の方法によって作製することができるが、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。また、これら幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞のいずれであってもよい。 In the present invention, “stem cell” refers to various stem cells capable of producing the above growth factor, and bone marrow, blood, skin (epidermis, dermis, subcutaneous tissue), fat, hair follicle, muscle, brain, liver, and other tissues. And undifferentiated cells (collectively referred to as somatic stem cells), embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like. Preferably, it is more effective against bone marrow, blood, skin, and adipose tissue-derived stem cells. Examples of ES cells include ES cells established by culturing early embryos before implantation, ES cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei, And ES cells obtained by modifying genes on the chromosomes of those ES cells using genetic engineering techniques. Such ES cells can be prepared, for example, by a method known per se, but can be obtained from a predetermined institution, and further commercially available products can be purchased. In addition, these stem cells may be primary cultured cells, subcultured cells, or frozen cells.
また、本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、幹細胞の成長因子産生分泌機構について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。 Furthermore, the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention can be applied to all mammals as long as they have equivalent characteristics with respect to the growth factor production and secretion mechanism of stem cells. For example, the effect can be exerted on stem cells of mammals such as human, monkey, mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, cat, dog, horse, cow, sheep, goat and pig.
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤の有効成分であるロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物は、幹細胞による成長因子の産生を培養レベルまたは生体レベルで促進する作用を有する。従って、本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、その有効量を添加した幹細胞培養用培地にて幹細胞を培養することによって、または、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって、幹細胞からの成長因子産生を促進することができる。 At least one kind of Rosaceae belonging to the genus Rosaceae selected from Rosa Alba semiprena, Rosa Wicliana, and Rosa Fetida, which is an active ingredient of the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention, produces production of growth factors by stem cells. It has an action of promoting at the culture level or the living body level. Therefore, the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention grows from stem cells by culturing the stem cells in a medium for culturing stem cells to which an effective amount thereof has been added, or by administration to mammals including humans. Factor production can be promoted.
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに皮膚外用組成物に配合して提供することが好ましい。本発明の皮膚外用組成物には、医薬品、医薬部外品、化粧品などが含まれる。 When the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention is administered in vivo, it can be administered as it is, but it is formulated in a composition for external use with an appropriate additive as long as the effects of the present invention are not impaired. It is preferable to provide them. The skin external composition of the present invention includes pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and the like.
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、幹細胞による成長因子の産生を促進することができるので、当該剤を含む皮膚外用組成物は、皮膚の障害若しくは損傷、または肥満を予防、改善、および治療するのに有効である。 Since the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention can promote the production of growth factor by stem cells, an external composition for skin containing the agent prevents, improves, and improves skin damage or damage, or obesity, and It is effective to treat.
ここで、皮膚の障害や損傷としては、限定はされないが、シワ、タルミ、シミ、くすみ、肌荒れ、皮膚の肥厚、毛穴のひらき、ニキビ痕、創傷（切創、裂創、刺傷、咬創、挫創、挫傷、擦過傷等）、褥瘡、熱傷、瘢痕、ケロイドなどが挙げられ、薄毛や脱毛などの頭皮や毛髪の損傷も含まれる。肥満には、顔の輪郭、頸部、腹部、臀部、大腿部などへの皮下脂肪の蓄積のほか、皮下脂肪沈着に起因するセルライトなどが含まれる。 Here, skin damage or damage is not limited, but wrinkles, tarmi, stains, dullness, rough skin, thickened skin, open pores, acne scars, wounds (cuts, lacerations, stab wounds, bites, wounds, Bruises, abrasions, etc.), pressure ulcers, burns, scars, keloids, etc., including scalp and hair damage such as thinning and hair loss. Obesity includes accumulation of subcutaneous fat in the face contour, neck, abdomen, buttocks, thighs, etc., as well as cellulite due to subcutaneous fat deposition.
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて賦形剤、増粘剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、保存剤、分散剤、乳化剤、ゲル化剤、色素、香料等を用いることができる。本発明の医薬品に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤などが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。 When the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention is added to a pharmaceutical product, it is mixed with a pharmacologically and pharmaceutically acceptable additive and formulated into various preparations suitable for application to the affected area. Can be Pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include excipients, thickeners, tonicity agents, pH regulators, stabilizers, preservatives, preservatives depending on the dosage form and application. , Dispersants, emulsifiers, gelling agents, pigments, fragrances and the like can be used. A form suitable for the pharmaceutical product of the present invention is an external preparation, and examples thereof include an ointment, a cream, a gel, a liquid, and a patch. The ointment refers to a homogeneous semi-solid external preparation, and includes an oily ointment, an emulsion ointment, and a water-soluble ointment. The gel is an external preparation in which a water-insoluble component hydrate compound is suspended in an aqueous liquid. The liquid preparation refers to a liquid external preparation and includes lotions, suspensions, emulsions, liniments and the like.
本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を医薬部外品や化粧品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、または水−油−粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該医薬部外品や化粧品は、幹細胞由来成長因子産生促進剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。 When the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention is blended into a quasi-drug or cosmetic, the dosage form is an aqueous solution system, a solubilization system, an emulsification system, a powder system, a powder dispersion system, an oil liquid system, a gel. Any of a system, an ointment system, an aerosol system, a water-oil two-layer system, or a water-oil-powder three-layer system may be used. In addition, the quasi-drug and cosmetics, together with the stem cell-derived growth factor production promoter, select various ingredients, additives, bases, etc. that are usually used in the composition for external use of skin according to the type, and mix appropriately However, it can be produced according to a technique known in the art. The form may be liquid, emulsion, cream, gel, paste, spray or the like. Examples of the ingredients include oils and fats (olive oil, coconut oil, evening primrose oil, jojoba oil, castor oil, hydrogenated castor oil, etc.), waxes (lanolin, beeswax, carnauba wax, etc.), hydrocarbons (liquid paraffin, squalene, Squalane, petrolatum, etc.), fatty acids (lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid etc.), higher alcohols (myristyl alcohol, cetanol, cetostearyl alcohol, stearyl alcohol, behenyl alcohol etc.), esters (myristin) Isopropyl acid, isopropyl palmitate, cetyl octanoate, glyceryl trioctanoate, octyldodecyl myristate, octyl stearate, stearyl stearate, etc., organic acids (citric acid, lactic acid, α-hydroxyacetic acid, pyrrolidone cal Acid, etc.), sugars (maltitol, sorbitol, xylobiose, N-acetyl-D-glucosamine, etc.), proteins and protein hydrolysates, amino acids and salts thereof, vitamins, plant / animal extracts, various interfaces Examples include activators, humectants, ultraviolet absorbers, antioxidants, stabilizers, preservatives, bactericides, and fragrances.
医薬部外品や化粧品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、ボディシャンプー、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤等が挙げられる。 The types of quasi-drugs and cosmetics include, for example, lotions, emulsions, gels, cosmetics, general creams, sun creams, packs, masks, facial cleansers, cosmetic soaps, foundations, funniers, bath preparations, body lotions, Examples include body shampoos, hair shampoos, hair conditioners, hair restorers and the like.
本発明の皮膚外用組成物における幹細胞由来成長因子産生促進剤の含有量は、幹細胞から成長因子の産生促進作用が発揮できる量である限り特に限定はされないが、例えばバラ科バラ属植物抽出物の乾燥固形物重量として０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１重量％がより好ましい。上記の量はあくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果、及びコストなどを考慮して適宜設定・調整すればよい。 The content of the stem cell-derived growth factor production promoter in the composition for external use of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount capable of exerting a growth factor production promoting action from stem cells. The dry solid weight is preferably 0.00001 to 10% by weight, more preferably 0.0001 to 1% by weight. The above amounts are merely examples, and may be appropriately set and adjusted in consideration of the type and form of the composition, the general usage amount, efficacy / effect, cost, and the like.
一方、幹細胞からの成長因子産生を幹細胞の培養により行う場合、培地に本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を添加する以外は、培養方法の条件及び操作は、当該技術分野で常套的な条件及び操作に従って行うことができる。幹細胞由来成長因子産生促進剤の培地への添加量は、バラ科バラ属植物抽出物の濃度として０．１〜１０００μｇ/mL、好ましくは１〜１００μｇ/mLである。 On the other hand, in the case where growth factor production from stem cells is performed by culturing stem cells, the conditions and operations of the culturing method are the conditions that are conventional in the art, except that the stem cell-derived growth factor production promoter of the present invention is added to the medium. And according to the operation. The amount of the stem cell-derived growth factor production promoter added to the medium is 0.1 to 1000 μg / mL, preferably 1 to 100 μg / mL, as the concentration of the rose family plant extract.
幹細胞の培養には、幹細胞の未分化性維持および増殖のために一般的に使用されている培地を用いればよい。例えば、幹細胞の生存および増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に、細胞の増殖速度を増大させるために、必要に応じて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質などが含有された培地を用いることができる。 For the culture of stem cells, a medium generally used for maintaining and proliferating undifferentiated stem cells may be used. For example, a basic medium containing components (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins, fatty acids) necessary for the survival and growth of stem cells, such as Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), Minimum Essential Medium (MEM), RPMI 1640, Basal Medium Eagle (BME), Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixed F-12 (D-MEM / F-12), Glasgow M 's balanced salt solution) as needed to increase cell growth rate Contains tumor necrosis factor (TNF), vitamins, interleukins, insulin, transferrin, heparin, heparan sulfate, collagen, fibronectin, progesterone, selenite, B27-supplement, N2-supplement, ITS-supplement, antibiotics, etc. Prepared medium can be used.
また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。 In addition to the above, it is preferable that serum is contained at a content of 1 to 20%. However, since serum has different components depending on the lot and there are variations in the effects, it is preferable to use the serum after a lot check.
市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。 Commercially available products include Mesenchymal stem cell basal medium manufactured by Invitrogen, Mesenchymal stem cell basal medium manufactured by Sanko Junyaku, MF medium manufactured by TOYOBO, Hank's balanced salt solution manufactured by Sigma, etc. Can be used.
幹細胞の培養に用いる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。 The incubator used for stem cell culture is not particularly limited as long as stem cells can be cultured. Examples thereof include flasks, petri dishes, dishes, plates, chamber slides, tubes, trays, culture bags, and roller bottles. .
培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。 The incubator may be non-cell-adhesive or adhesive, and is appropriately selected according to the purpose. As the cell-adhesive incubator, for the purpose of improving the adhesion with cells, a cell-treated culture vessel treated with a cell support substrate using an extracellular matrix or the like may be used. Examples of the extracellular matrix include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin and the like.
幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。 Stem cell culture conditions may be in accordance with normal conditions used for stem cell culture, and no special control is required. For example, the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The CO 2 gas concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 2 to 5%. In addition, it is preferable to perform culture | cultivation replacement | exchange once every 2-3 days, and it is more preferable to carry out every day. The culture conditions can also be set by varying as appropriate within the range in which the stem cells can survive and proliferate.
上記培養により得られる幹細胞培養物中の成長因子は、例えばその遺伝子の量を測定することにより確認できる。測定は、培養後の幹細胞中の総ＲＮＡを抽出し、成長因子をコードするｍＲＮＡの量をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行なえばよい。あるいは、成長因子に特異的な抗体を利用し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法などの免疫学的測定法により行ってもよい。 The growth factor in the stem cell culture obtained by the above culture can be confirmed, for example, by measuring the amount of the gene. The measurement may be performed by extracting the total RNA in the cultured stem cells and measuring the amount of mRNA encoding the growth factor by a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Alternatively, an antibody specific for a growth factor may be used to perform an immunoassay such as an enzyme immunoassay (ELISA, EIA), a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay (RIA), or a Western blot. Good.
本発明によれば、ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物の存在下で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞培養物の製造方法もまた提供される。また、本方法により得られた幹細胞培養物に含まれる成長因子を単離および精製してもよい。例えば、タンパク質の精製に用いられる一般的な方法、例えばゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、脱塩法、ＨＰＬＣ、電気泳動法などを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から成長因子を単離精製することができる。 According to the present invention, a stem cell culture comprising the step of culturing stem cells in the presence of an extract of at least one species of Rosaceae belonging to the family Rosaceae selected from Rosa Alba Semiprena, Rosa Wikryana, and Rosa Fetida Is also provided. Moreover, the growth factor contained in the stem cell culture obtained by this method may be isolated and purified. For example, a general method used for protein purification such as gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, etc., desalting method, HPLC, electrophoresis method etc. alone or By using a suitable combination, the growth factor can be isolated and purified from the culture.
上記製造方法により得られる幹細胞培養物は各種の成長因子を高濃度で含有する。ここで、幹細胞培養物とは、培養上清、培養幹細胞、培養幹細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の幹細胞培養物はそのままで、あるいは、それより成長因子を単離し、皮膚組織などに直接注入するといった方法により、再生医療や再生美容への応用が可能である。 The stem cell culture obtained by the above production method contains various growth factors at high concentrations. Here, the stem cell culture means any of culture supernatant, cultured stem cells, and disrupted cultured stem cells. The stem cell culture of the present invention can be applied to regenerative medicine and regenerative beauty by the method of isolating a growth factor from the culture as it is or directly injecting it into skin tissue or the like.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these.
（製造例１）ロサ・アルバ・セミプレナの熱水抽出物の調製
ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の乾燥物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してロサ・アルバ・セミプレナの熱水抽出物を１．５ｇ得た。
(Production Example 1) Preparation of hot water extract of Rosa Alba semiprena 500 mL of purified water was added to 25 g of dried product of above-ground parts of Rosa Alba semiprena, extracted at 90-100 ° C for 2 hours, filtered, The filtrate was concentrated and freeze-dried to obtain 1.5 g of a hot water extract of Rosa, Alba, and Semiprena.
（製造例２）ロサ・ウィクライアナの熱水抽出物の調製
ロサ・ウィクライアナの地上部の乾燥物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してロサ・ウィクライアナの熱水抽出物を０．６ｇ得た。
(Manufacture example 2) Preparation of hot water extract of Rosa Wikryana 500 mL of purified water was added to 25 g of the dried product of the ground part of Rosa Wikryana, extracted at 90-100 ° C for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated. And freeze-dried to obtain 0.6 g of a hot water extract of Rosa Wikiana.
（製造例３）ロサ・フェティダの熱水抽出物の調製
ロサ・フェティダの地上部の乾燥物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してロサ・フェティダの熱水抽出物を２．１ｇ得た。
(Production Example 3) Preparation of Rosa Fetida's hot water extract 500 g of purified water was added to 25 g of the above-ground dried product of Rosa Fetida, extracted at 90-100 ° C for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated. And freeze-dried to obtain 2.1 g of hot water extract of Rosa Fetida.
（製造例４）ロサ・アルバ・セミプレナの５０％エタノール抽出物の調製
ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の乾燥物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・アルバ・セミプレナの５０％エタノール抽出物を１．４ｇ得た。
(Production Example 4) Preparation of Rosa Alba Alba Semiprena 50% Ethanol Extract To 25 g dry product of Rosa Alba Alba Semiprena above ground, 500 mL of 50 (v / v)% aqueous ethanol solution was added and extracted at room temperature for 3 days. Thereafter, the mixture was filtered and the filtrate was concentrated to dryness to obtain 1.4 g of a 50% ethanol extract of Rosa Alba semiprena.
（製造例５）ロサ・ウィクライアナの５０％エタノール抽出物の調製
ロサ・ウィクライアナの地上部の乾燥物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・ウィクライアナの５０％エタノール抽出物を０．７ｇ得た。
(Manufacture example 5) Preparation of 50% ethanol extract of Rosa Wikryana 500 mL of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution was added to 25 g of the dried product of the ground part of Rosa Wikryana, extracted at room temperature for 3 days, and then filtered. The filtrate was concentrated to dryness to obtain 0.7 g of a 50% ethanol extract of Rosa Wikiana.
（製造例６）ロサ・フェティダの５０％エタノール抽出物の調製
ロサ・フェティダの地上部の乾燥物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・フェティダの５０％エタノール抽出物を１．８ｇ得た。
(Production Example 6) Preparation of Rosa Fetida 50% Ethanol Extract To 25 g dry product of Rosa Fetida above ground, add 500 mL of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution, extract at room temperature for 3 days, and filter. The filtrate was concentrated to dryness to obtain 1.8 g of a 50% ethanol extract of Rosa Fetida.
（製造例７）ロサ・アルバ・セミプレナのエタノール抽出物の調製
ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の乾燥物２５ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・アルバ・セミプレナのエタノール抽出物を０．８ｇ得た。
(Production Example 7) Preparation of Rosa Alba Alba Semiprena Ethanol Extract 500 mL of ethanol was added to 25 g of the above-ground dry product of Rosa Alba Alba Semiprena, extracted at room temperature for 3 days, filtered, and the filtrate was concentrated to dryness. Solidify to obtain 0.8 g of ethanol extract of Rosa Alba semiprena.
（製造例８）ロサ・ウィクライアナのエタノール抽出物の調製
ロサ・ウィクライアナの地上部の乾燥物２５ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・ウィクライアナのエタノール抽出物を０．４ｇ得た。
(Production Example 8) Preparation of ethanol extract of Rosa Wikryana 500 mL of ethanol was added to 25 g of the dried product of Rosa Wikryana above ground, extracted at room temperature for 3 days, filtered, and the filtrate was concentrated to dryness. 0.4 g of ethanol extract of Rosa Wikryana was obtained.
（製造例９）ロサ・フェティダのエタノール抽出物の調製
ロサ・フェティダの地上部の乾燥物２５ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・フェティダのエタノール抽出物を０．８ｇ得た
(Production Example 9) Preparation of Rosa Fetida's Ethanol Extract Add 500 mL of ethanol to 25 g of the above-ground dried product of Rosa Fetida, extract at room temperature for 3 days, filter, and concentrate the filtrate to dryness. 0.8 g of ethanol extract of Rosa Fetida was obtained.
（実施例１）幹細胞からの成長因子産生促進効果の評価
間葉系幹細胞増殖培地(ＭＦ培地)(ＴＯＹＯＢＯ社製)を用いて培養したヒト成体幹細胞（皮下脂肪細胞由来）(ＤＳファーマバイオメディカル社製)を６ｃｍディッシュに１x１０６個播種し、評価試料としてロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、またはロサ・フェティダの抽出物(製造例１〜９)を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。培養３日後に、細胞を回収し、ＰＢＳ(-)にて２回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からＲＮＡを抽出した。その後、２−ＳＴＥＰリアルタイムＰＣＲキット(Applied Biosystems社製)を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記成長因子(ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦＡ及びＶＥＧＦＡ)増幅用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ(９５℃:１５秒間、６０℃:３０秒間、４０サイクル)を実施し、各遺伝子の遺伝子発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
(Example 1) Evaluation of growth factor production promoting effect from stem cells Human adult stem cells (derived from subcutaneous fat cells) cultured using mesenchymal stem cell growth medium (MF medium) (manufactured by TOYOBO) (DS Pharma Biomedical) 1 × 10 6 seeds in a 6 cm dish, and the extract of Rosa Alba Semiprena, Rosa Wikryana, or Rosa Fetiida (Production Examples 1 to 9) is used as an evaluation sample so that the final concentration is 0.001%. The culture was continued for 3 days. After 3 days of culture, the cells were collected, washed twice with PBS (−), and RNA was extracted from the cells with Trizol Reagent (Invitrogen). Thereafter, RNA was reversely transcribed into cDNA using a 2-STEP real-time PCR kit (Applied Biosystems) and then the following growth factors (bFGF, IGF-1, TGF-β1, PDGFA) by ABI7300 (Applied Biosystems). And VEGFA) Real-time PCR (95 ° C .: 15 seconds, 60 ° C .: 30 seconds, 40 cycles) was performed using the amplification primer set, and the gene expression of each gene was confirmed. Other operations were carried out in accordance with established methods.
ｂＦＧＦ用プライマーセット：
フォワードプライマー：TGGTATGTGGCACTGAAACGAA（配列番号１）
リバースプライマー：TTCTGCCCAGGTCCTGTTTT（配列番号２）
ＩＧＦ−１用プライマーセット：
フォワードプライマー：AAGGAGGCTGGAGATGTATTGC（配列番号３）
リバースプライマー：CGGACAGAGCGAGCTGACTT（配列番号４）
ＴＧＦ−β１用プライマーセット：
フォワードプライマー：CGCGTGCTAATGGTGGAAA（配列番号５）
リバースプライマー：ATGCTGTGTGTACTCTGCTTGAACTT（配列番号６）
ＰＤＧＦＡ用プライマーセット：
フォワードプライマー：TCAGGAAGAAGCCAAAATTAAAAGA（配列番号７）
リバースプライマー：GCAGGCGCACTCCAAATG（配列番号８）
ＶＥＧＦＡ用プライマーセット：
フォワードプライマー：CTCTCTCCCTGATCGGTGACA（配列番号９）
リバースプライマー：GGAGGGCAGAGCTGAGTGTT（配列番号１０）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット：
フォワードプライマー：TGCACCACCAACTGCTTAGC（配列番号１１）
リバースプライマー：TCTTCTGGGTGGCAGTGATG（配列番号１２）
Primer set for bFGF:
Forward primer: TGGTATGTGGCACTGAAACGAA (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer: TTCTGCCCAGGTCCTGTTTT (SEQ ID NO: 2)
Primer set for IGF-1:
Forward primer: AAGGAGGCTGGAGATGTATTGC (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer: CGGACAGAGCGAGCTGACTT (SEQ ID NO: 4)
Primer set for TGF-β1:
Forward primer: CGCGTGCTAATGGTGGAAA (SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: ATGCTGTGTGTACTCTGCTTGAACTT (SEQ ID NO: 6)
PDGFA primer set:
Forward primer: TCAGGAAGAAGCCAAAATTAAAAGA (SEQ ID NO: 7)
Reverse primer: GCAGGCGCACTCCAAATG (SEQ ID NO: 8)
Primer set for VEGFA:
Forward primer: CTCTCTCCCTGATCGGTGACA (SEQ ID NO: 9)
Reverse primer: GGAGGGCAGAGCTGAGTGTT (SEQ ID NO: 10)
GAPDH primer set:
Forward primer: TGCACCACCAACTGCTTAGC (SEQ ID NO: 11)
Reverse primer: TCTTCTGGGTGGCAGTGATG (SEQ ID NO: 12)
成長因子産生促進効果は、試料を添加せずに培養した細胞における各成長因子ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として算出した各成長因子の遺伝子相対発現量（各成長因子の遺伝子発現量/ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量）の値を１．０とし、これに対し、試料を添加して培養した細胞における各遺伝子の相対発現量の値を算出し、評価した。結果を表１に示す。 The growth factor production promoting effect is expressed by the relative expression level of each growth factor gene (each growth factor) calculated as a ratio of the expression level of each growth factor mRNA in cells cultured without adding a sample to the expression level of GAPDH mRNA as an internal standard. The value of the factor gene expression level / GAPDH gene expression level was set to 1.0, and the relative expression level of each gene in cells cultured with the sample added was calculated and evaluated. The results are shown in Table 1.
表１の結果に示されるように、ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、ロサ・フェティダの抽出物（製造例１〜９）の全てに、顕著な幹細胞からの成長因子産生促進効果が認められた。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、骨髄由来幹細胞、造血幹細胞、胚性の幹細胞(ＥＳ細胞)についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞からの成長因子産生促進効果が認められた。また、各成長因子産生及び分泌促進効果はＥＬＩＳＡ法においても確認された。さらに、上記抽出物（製造例１〜９）以外にも、各植物の葉のみ又は全草から抽出した抽出物にも同様な効果が認められた。 As shown in the results of Table 1, all of the extracts of Rosa Alba Semiprena, Rosa Wikryana, and Rosa Fetida (Production Examples 1 to 9) have a remarkable effect of promoting growth factor production from stem cells. It was. In addition to the stem cells used in this experimental example, a similar test was performed on bone marrow-derived stem cells, hematopoietic stem cells, and embryonic stem cells (ES cells), and a remarkable effect of promoting growth factor production from stem cells was observed. It was. Moreover, each growth factor production and secretion promotion effect were confirmed also in ELISA method. Further, in addition to the above-mentioned extracts (Production Examples 1 to 9), similar effects were observed in extracts extracted from only the leaves of the plants or from the whole grass.
（実施例２）製品の処方例
以下に示す処方例に従い、製造例１〜９で製造したロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、またはロサ・フェティダの抽出物を配合したローション、クリームを常法により調製した。
(Example 2) Formulation example of product According to the formulation examples shown below, lotion and cream containing the extract of Rosa Alba semiprena, Rosa Wikryana, or Rosa Fetida manufactured in Production Examples 1 to 9 are used as usual. It was prepared by.
処方例１ ローション
処方 成分 配合量(部)
１ 製造例１〜９のバラ科バラ属植物抽出物 0.05
２ １,３−ブチレングリコール 8.0
３ グリセリン 2.0
４ キサンタンガム 0.02
５ クエン酸 0.01
６ クエン酸ナトリウム 0.1
７ エタノール 5.0
８ パラオキシ安息香酸メチル 0.1
９ ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.1
(40E.0.)
１０ 香料 0.1
１１ 精製水 84.52
Formulation Example 1 Lotion Formulation Ingredient Amount (parts)
1 Extract of Rosaceae from Production Examples 1-9 0.05
2 1,3-Butylene glycol 8.0
3 Glycerin 2.0
4 Xanthan gum 0.02
5 Citric acid 0.01
6 Sodium citrate 0.1
7 Ethanol 5.0
8 Methyl paraoxybenzoate 0.1
9 Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 0.1
(40E.0.)
10 Fragrance 0.1
11 Purified water 84.52
成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解した後、両者を混合し濾過してローションを調製した。 Components 1 to 6 and 11 and components 7 to 10 were uniformly dissolved, then both were mixed and filtered to prepare a lotion.
処方例２ クリーム
処方 成分 配合量(部)
１ 製造例１〜９のバラ科バラ属植物抽出物 0.03
２ スクワラン 5.5
３ オリーブ油 3.0
４ ステアリン酸 2.0
５ ミツロウ 2.0
６ ミリスチン酸オクチルドデシル 3.5
７ ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E. 3.0
0.)
８ ベヘニルアルコール 1.5
９ モノステアリン酸グリセリン 2.5
１０ 香料 0.1
１１ パラオキシ安息香酸メチル 0.2
１２ パラオキシ安息香酸エチル 0.05
１３ 1,3-ブチレングリコール 8.5
１４ 精製水 68.12
Formulation Example 2 Cream Formulation Ingredients Amount (parts)
1 Extract of Rosaceae from Production Examples 1 to 9 0.03
2 Squalane 5.5
3 Olive oil 3.0
4 Stearic acid 2.0
5 Beeswax 2.0
6 Octyldodecyl myristate 3.5
7 Polyoxyethylene cetyl ether (20E. 3.0
0.)
8 Behenyl alcohol 1.5
9 Glycerol monostearate 2.5
10 Fragrance 0.1
11 Methyl paraoxybenzoate 0.2
12 Ethyl paraoxybenzoate 0.05
13 1,3-Butylene glycol 8.5
14 Purified water 68.12
成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とした。また、成分１及び成分１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とした。次いで、油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却することで製品とした。 Components 2 to 9 were dissolved by heating and mixed, and kept at 70 ° C. to obtain an oil phase. Moreover, the component 1 and the components 11-14 were heat-dissolved and mixed, and it maintained at 75 degreeC and was set as the water phase. Next, the aqueous phase was added to the oil phase to emulsify, and the mixture was cooled while stirring. The component 10 was added at 45 ° C., and further cooled to 30 ° C. to obtain a product.
本発明は、皮膚の障害若しくは損傷、または肥満を予防、回復または治療を目的とした医薬品、医薬部外品、化粧品の製造分野において利用できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used in the field of manufacturing pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics for the purpose of preventing, recovering, or treating skin damage or damage or obesity.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013152675A JP6200714B2 (en) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | Stem cell-derived growth factor production promoter |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013152675A JP6200714B2 (en) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | Stem cell-derived growth factor production promoter |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015020996A true JP2015020996A (en) | 2015-02-02 |
| JP6200714B2 JP6200714B2 (en) | 2017-09-20 |
Family
ID=52485749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013152675A Active JP6200714B2 (en) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | Stem cell-derived growth factor production promoter |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6200714B2 (en) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001220353A (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | Noevir Co Ltd | Phospholipase a2 inhibitor |
| JP2003171302A (en) * | 2001-12-10 | 2003-06-20 | Nof Corp | Antiinflammatory agent and composition |
| JP2003342190A (en) * | 2002-03-19 | 2003-12-03 | Fancl Corp | Anti-helicobacter pylori composition |
| JP2004175678A (en) * | 2002-11-25 | 2004-06-24 | Geol Kagaku Kk | Cosmetic for skin |
| JP2008303147A (en) * | 2007-06-05 | 2008-12-18 | Noevir Co Ltd | External preparation for skin |
| JP2009232725A (en) * | 2008-03-26 | 2009-10-15 | Nippon Menaade Keshohin Kk | Stem cell cultured by specific method and method for producing the same |
| JP2011236147A (en) * | 2010-05-10 | 2011-11-24 | Nichirei Biosciences Inc | Cosmetic composition, food/drink composition and pharmaceutical composition each containing hybrid tea rose or extract thereof |
| JP2012001527A (en) * | 2010-05-17 | 2012-01-05 | Kao Corp | Skin preparation for external use |
| JP2012148988A (en) * | 2011-01-18 | 2012-08-09 | Nippon Menaade Keshohin Kk | External preparation or internal preparation |
| JP2013014582A (en) * | 2011-06-07 | 2013-01-24 | Ginza Tomato:Kk | Skin external preparation composition including culture with rose placental tissue or its extract, method for producing the same, functional food and antioxidant composition |
| WO2013087217A1 (en) * | 2011-12-14 | 2013-06-20 | Georgios Pandalis | Composition for the treatment of bacterial infections |
-
2013
- 2013-07-23 JP JP2013152675A patent/JP6200714B2/en active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001220353A (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | Noevir Co Ltd | Phospholipase a2 inhibitor |
| JP2003171302A (en) * | 2001-12-10 | 2003-06-20 | Nof Corp | Antiinflammatory agent and composition |
| JP2003342190A (en) * | 2002-03-19 | 2003-12-03 | Fancl Corp | Anti-helicobacter pylori composition |
| JP2004175678A (en) * | 2002-11-25 | 2004-06-24 | Geol Kagaku Kk | Cosmetic for skin |
| JP2008303147A (en) * | 2007-06-05 | 2008-12-18 | Noevir Co Ltd | External preparation for skin |
| JP2009232725A (en) * | 2008-03-26 | 2009-10-15 | Nippon Menaade Keshohin Kk | Stem cell cultured by specific method and method for producing the same |
| JP2011236147A (en) * | 2010-05-10 | 2011-11-24 | Nichirei Biosciences Inc | Cosmetic composition, food/drink composition and pharmaceutical composition each containing hybrid tea rose or extract thereof |
| JP2012001527A (en) * | 2010-05-17 | 2012-01-05 | Kao Corp | Skin preparation for external use |
| JP2012148988A (en) * | 2011-01-18 | 2012-08-09 | Nippon Menaade Keshohin Kk | External preparation or internal preparation |
| JP2013014582A (en) * | 2011-06-07 | 2013-01-24 | Ginza Tomato:Kk | Skin external preparation composition including culture with rose placental tissue or its extract, method for producing the same, functional food and antioxidant composition |
| WO2013087217A1 (en) * | 2011-12-14 | 2013-06-20 | Georgios Pandalis | Composition for the treatment of bacterial infections |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 医学のあゆみ, 2011, VOL.239 NO.8, P.813-816, JPN6017007168, ISSN: 0003613339 * |
| 医学のあゆみ, 2011, VOL.239 NO.8, P.851-854, JPN6017007165, ISSN: 0003511658 * |
| 薔薇大図鑑２０００, 2006，後藤みどり他監修， 株式会社草土出版発行，P.87,88, JPN6017007171, ISSN: 0003511659 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6200714B2 (en) | 2017-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5981947B2 (en) | Skin cream | |
| KR101894229B1 (en) | Functional composition comprising deer antlers derived stem cell culture medium | |
| KR101885501B1 (en) | Functional composition comprising deer antlers derived stem cell culture medium | |
| US20200230172A1 (en) | Stem cell conditioned media for clinical and cosmetic applications | |
| KR20100096447A (en) | Cosmetic composition comprising matrials cultured adult stem cells derived from swine placenta tissue and proteins extracted therefrom | |
| JP6843425B2 (en) | Stem cell undifferentiated state maintainer and growth promoter | |
| JP6159183B2 (en) | Stem cell-derived growth factor production promoter | |
| KR101902425B1 (en) | Agent for improving regeneration comprising Gardenia jasminodes extracts | |
| JP6535505B2 (en) | An agent for maintaining undifferentiated state of stem cells and an agent for promoting proliferation using the extract of Mannengtake mushroom | |
| JP6200714B2 (en) | Stem cell-derived growth factor production promoter | |
| JP6200713B2 (en) | Stem cell-derived growth factor production promoter | |
| JP6571494B2 (en) | Stem cell undifferentiated state maintenance agent and growth promoter using Ainu Wakame | |
| KR102153636B1 (en) | Serum-free medium composition for stem cell culture and methods for culturing stem cell | |
| JP6649050B2 (en) | Stem cell undifferentiated state maintenance agent and growth promoter | |
| KR101299658B1 (en) | Composition for Promoting Stem Cell Proliferation Comprising Equidae Placenta extracts | |
| JP5993299B2 (en) | Melanocyte differentiation induction promoter and method of using the same | |
| TWI679028B (en) | Chinese herbal medicine composition with skin epidermal stem cells caring function and mask using the same | |
| JP6529791B2 (en) | Agent for maintaining undifferentiated state of stem cells and growth promoter | |
| JP6697252B2 (en) | Stem cell undifferentiated state maintenance agent and growth promoter | |
| JP7205880B2 (en) | MELANOCYTE DIFFERENTIATION INDUCTIVE AND USAGE THEREOF | |
| US20230330183A1 (en) | Stem cell conditioned media for clinical and cosmetic applications | |
| KR101570808B1 (en) | Hair Care Composition Containing Human Adipocyte Conditioned Media Extracts and Pleuropterus Multiflorus Stem Cell Culture Extracts for Hair Growth | |
| KR20130055274A (en) | Composition for growth promotion and proliferation of hair comprising eucheuma cottonii extracts as effective ingredient | |
| JP7178087B2 (en) | Stem cell undifferentiated state maintenance agent and growth promoter | |
| JP7202610B2 (en) | Stem cell undifferentiated state maintenance agent and growth promoter |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160516 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170307 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170425 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170530 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170724 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170808 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170828 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6200714 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |