JP2015007063A - 循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 - Google Patents
循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015007063A JP2015007063A JP2014154915A JP2014154915A JP2015007063A JP 2015007063 A JP2015007063 A JP 2015007063A JP 2014154915 A JP2014154915 A JP 2014154915A JP 2014154915 A JP2014154915 A JP 2014154915A JP 2015007063 A JP2015007063 A JP 2015007063A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pim
- cell
- heart
- cells
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/12—Dual-specificity kinases (2.7.12)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
Abstract
Description
MPEP第1730章II.B.2(a)(C)において承認および説明されているUSPTO EFS-WEB serverによる以下の配列表の電子的提出の内容は全て、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。この配列表は、以下のとおり電子的に提出されたテキストファイル上で確認される:
本発明の一部は、連邦政府から得た資金を利用し、一つ以上の以下の補助金交付番号第5R01HL067245号、第1R01HL091102号、第1P01HL085577号および第1P01AG023071号(全て米国国立衛生研究所による)の下で創作された。従って、連邦政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、一般的に、細胞生物学および分子生物学、心臓疾患または心臓損傷の治療または予防、ならびに再生医療に関する。セリン/トレオニンキナーゼPIM-1をコードする核酸(および関連のPIM酵素)を含む組成物(例えば医薬組成物)、ならびに心臓または血管系の細胞もしくは組織におけるPIM利用性の改変あるいはPIM利用性(心臓または血管の組織もしくは環境における幹細胞、前駆細胞、または成体細胞の分化、移植、生存、および機能の誘導または増強など)に関する医学的用途および医学的方法が開示される。また、PIMをコードする核酸を含む組成物、ならびに血管または心臓の環境において幹細胞および前駆細胞の再生能を高める方法も開示される。
細胞内分子シグナル伝達ネットワークは、標的基質をリン酸化して成長および生存の重大な側面を調節するキナーゼを介してコミュニケーションを取っている。癌原性セリン/トレオニンキナーゼであるPIM-1は、最初はモロニーマウス白血病ウイルスのプロウイルス組込部位として発見された。PIM-1は、前立腺癌においてアップレギュレートされる。この遺伝子は、胎児の造血中に肝臓および脾臓において高発現し、主にBリンパ細胞および骨髄細胞系において発現する。
本発明は、セリン/トレオニンキナーゼPIMをコードする核酸を含む組成物(例えば医薬組成物)、ならびにその製造および使用方法(例えば心臓または血管の細胞増殖を誘導し、心臓または血管の細胞を低酸素症および細胞アポトーシスから保護する方法)を提供する。1つの態様において、本発明の組成物および方法は、PIM-1を発現して(例えば、PIMキナーゼ発現および/または活性をアップレギュレートすることにより)心筋細胞を肥大から保護し、梗塞によって誘導される心筋アポトーシスを抑制し、梗塞サイズを減少させるために用いられる。別の実施形態において、本発明の組成物および方法は、PIMを発現して心臓または血管の細胞脱分化および幹細胞マーカーの再発現を誘導するために用いられ、また1つの態様においては、PIMを過剰発現して幹細胞の再生能(例えば心筋梗塞後(MI後)の心臓に生着する幹細胞能)を増強するために用いられる。
心筋への投与のために製剤化される医薬組成物であって:
(i)(a) PIM-1コード核酸;
(b) 発現構築物または発現ビヒクル中に挿入されたPIM-1コード核酸、またはプロモーターに機能的に連結されたネイキッド(裸の)(naked)PIM-1コード核酸;
(c) 発現構築物または発現ビヒクルが、ベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体を含む、またはベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体からなる、(b)の医薬組成物;
(d) 発現構築物または発現ビヒクルが、組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターを含む、または組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターからなる、(c)の医薬組成物;
(e) 発現構築物または発現ビヒクルが、免疫不全ウイルス由来ベクターを含む、または免疫不全ウイルス由来ベクターからなる、(d)の医薬組成物;
(f) 免疫不全ウイルス由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターを含む、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターからなる、(e)の医薬組成物;
(g) ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターを含む、またはヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターからなる、(f)の医薬組成物;
(h) PIM-1コード核酸がプロモーターに機能的に連結されている、(a)〜(g)のいずれかの医薬組成物;
(i) プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、(h)の医薬組成物;あるいは
(j) プロモーターが、心臓細胞(筋細胞)中で構成的または誘導的に活性である、(i)の医薬組成物;および、
(ii) 製薬上許容される賦形剤
を含む、上記医薬組成物を提供する。
(a) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1キナーゼ活性を増加させることによる、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、あるいは圧過負荷誘発性肥大または圧過負荷誘発性心不全の後の、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防;
(b) 低酸素症、低酸素血症または無酸素症が、梗塞、外傷、手術、再移植、移植または毒素によって引き起こされる、(a)の使用;
(c) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞脱分化および/または幹細胞マーカーの再発現の誘導;
(d) 細胞、組織または器官においてPIM-1を過剰発現または発現させることによる、生着した、または移植された細胞、組織または器官の保持の増強;
(e) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における、bcl-2、bcl-XLの発現および/またはBadタンパク質のリン酸化の増加;
(f) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における、虚血/再灌流損傷の改善、治療または予防;
(g) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓または他の器官である、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓または他の器官に含まれている、(a)〜(f)のいずれかの使用;
(h) 幹細胞または多能性細胞の再生能を増強し、および/または増殖を誘導するための、幹細胞または多能性細胞におけるPIM-1の過剰発現または発現;
(i) 心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるBcl-XLの発現を増加させて、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を誘導し、および/または心筋生存シグナル伝達を増加させるための、心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるPIM-1の過剰発現または発現;
(j) 細胞が、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit+幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(i)のいずれかの使用;あるいは
(k) 上記の使用が、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、または圧過負荷誘発性肥大もしくは圧過負荷誘発性心不全の後の、または肥大心筋、加齢心筋、不全心筋、虚血心筋、再構築心筋、炎症、感染、慢性的ストレス、疾患、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって損傷を受けた心筋による、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防のためである、(a)〜(j)のいずれかの使用を含む。
(a) (i)PIM-1コード核酸を提供し、該PIM-1コード核酸を心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入し、(ii)PIM-1キナーゼを発現および/または分泌する細胞を提供し、(iii)Pim-1キナーゼまたはPIM-1発現核酸を、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に投与し、または(iv)心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導またはアップレギュレートする化合物を提供するステップ;
(b) Pim-1コード核酸が、PIM-1コードメッセージ(PIM-1コードmRNA)もしくはPIM-1遺伝子を含む、またはPIM-1コードメッセージ(PIM-1コードmRNA)もしくはPIM-1遺伝子からなる、(a)の方法;
(c) PIM-1コード核酸が、ヒトPIM-1コード核酸、もしくはヒトPIM-1コードメッセージ(mRNA)、もしくはヒトPIM-1遺伝子、もしくはヒトPIM-1遺伝子座を含む、またはヒトPIM-1コード核酸、もしくはヒトPIM-1コードメッセージ(mRNA)、もしくはヒトPIM-1遺伝子、もしくはヒトPIM-1遺伝子座からなる、(a)または(b)の方法;
(d) 細胞が、ヒト細胞、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit+幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(c)のいずれかの方法;
(e) PIM-1コード核酸を、ex vivoまたはin vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入する、(a)〜(d)のいずれかの方法;
(f) PIM-1コード核酸を、発現構築物または発現ビヒクルに挿入する、(a)〜(e)のいずれかの方法;
(g) 発現構築物または発現ビヒクルが、ベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体を含む、またはベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体からなる、(f)のいずれかの方法;
(h) 発現構築物または発現ビヒクルが、組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターを含む、または組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターからなる、(g)のいずれかの方法;
(i) 発現構築物または発現ビヒクルが、免疫不全ウイルス由来ベクターを含む、または免疫不全ウイルス由来ベクターからなる、(h)のいずれかの方法;
(j) 免疫不全ウイルス由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターを含む、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターからなる、(i)のいずれかの方法;
(k) ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターを含む、またはヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターからなる、(j)のいずれかの方法;
(l) PIM-1コード核酸を、野生型(正常)レベルのPIM-1タンパク質を発現しない細胞に挿入する、(a)〜(k)のいずれかの方法;
(m) PIM-1コード核酸を、野生型(正常)レベルのPIM-1タンパク質コードメッセージ(mRNA)を発現しない細胞に挿入する、(l)の方法;
(n) PIM-1コード核酸を、野生型(正常)PIM-1遺伝子またはゲノムPIM-1コード核酸を含まない細胞に挿入する、(m)の方法;
(o) PIM-1コード核酸を、ex vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入し、該心臓または血管の細胞、組織もしくは器官を、それが必要な個体に移植する、(a)〜(n)のいずれかの方法;
(p) PIM-1コード核酸を、ex vivoで心臓細胞、心臓もしくは血管の組織または心臓もしくは血管の器官あるいは筋細胞に挿入し、該細胞を、それを必要とする心臓または血管の細胞、組織もしくは器官あるいは心筋(心臓)に移植する、(a)〜(o)のいずれかの方法;
(q) PIM-1コード核酸を、in vivoでそれを必要とする個体の心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入する、(a)〜(n)のいずれかの方法;
(r) PIM-1コード核酸を、in vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官または心臓細胞もしくは筋細胞または心臓に挿入する、(q)の方法;
(s) 個体が、鬱血性心不全を有する、または心筋梗塞、もしくは心筋損傷を有していたことがある、(r)の方法;
(t) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓または他の器官である、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓または他の器官に含まれている、(a)〜(s)のいずれかの方法;
(u) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1核酸またはPIM-1キナーゼ活性を誘導またはアップレギュレートする化合物が、生存および/または増殖シグナル伝達に関与するインターロイキン、サイトカインおよび/またはパラクリン因子;AKTセリン/トレオニンキナーゼのアップレギュレーター;インスリン様成長因子-1(IGF-1);インスリン;白血病抑制因子(LIF);顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF);または表皮成長因子(EGF)を含む、(a)の方法;
(v) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官におけるPIM-1活性が、該細胞集団に外因性PIM-1キナーゼを投与することによって増加する、(a)〜(u)のいずれかの方法;
(w) PIM-1活性が、細胞集団を、外因性PIM-1遺伝子を発現するトランスフェクト細胞と接触させることによって増加する、(v)の方法;
(x) 細胞集団が幹細胞を含む、(v)の方法;または
(y) PIM-1キナーゼ活性が、本発明の医薬化合物、本発明のリポソーム、もしくは本発明のナノ粒子またはこれらのいずれかの組み合わせを投与することにより、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において増加および/またはアップレギュレートされる、(a)〜(y)のいずれかの方法
を含む、上記方法も含まれる。
(a) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1キナーゼ活性を増加またはアップレギュレートさせることによる、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、または圧過負荷誘発性肥大もしくは圧過負荷誘発性心不全の後の、または肥大心筋、加齢心筋、不全心筋、虚血心筋、再構築心筋、炎症、感染、慢性的ストレス、疾患、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって損傷を受けた心筋による、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防;
(b) 細胞アポトーシスおよび/もしくは損傷、または低酸素症、低酸素血症もしくは無酸素症が、梗塞、外傷、手術、再移植、移植もしくは毒素によって、または炎症、感染、慢性的ストレス、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって引き起こされる、(a)の方法;
(c) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において細胞脱分化および/または幹細胞マーカーの再発現を誘導するステップ;
(d) 生着したまたは移植された細胞、組織または器官においてPim-1を過剰発現または発現させることにより、該細胞、組織または器官の保持を増強するステップ;
(e) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において、bcl-2、bcl-XLの発現および/またはBadタンパク質のリン酸化を増加させるステップ;
(f) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における虚血/再灌流損傷の改善、治療または予防;
(g) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓または他の器官である、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓または他の器官に含まれている、(a)〜(f)のいずれかの方法;
(h) 幹細胞または多能性細胞の再生能を増強し、および/または増殖を誘導するため、幹細胞または多能性細胞においてPIM-1を過剰発現または発現させるステップ;あるいは
(i) 心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるBcl-XLの発現を増加させて、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を誘導し、および/または心筋生存シグナル伝達を増加させるために、心臓細胞(筋細胞)または心臓組織においてPIM-1を過剰発現または発現させるステップ;
(j) 細胞が、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit+幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(i)のいずれかの方法
を含む、上記方法を含む。
本開示は、PIM-1、そのアイソフォーム、および同等のまたは重複する標的および基質を有する他のPIM酵素の新たな役割の知見を包含する。具体的には、これらの酵素は、心臓のおよび他の循環系の保護、生存、修復、再生、および回復における役割、さらに循環系組織に導入された幹細胞、前駆細胞、または分化した細胞の移植、分化、機能、および生存における役割を有する。これらの知見は、損傷した心臓の修復ならびに、機能的心臓組織に分化する、移植された幹細胞または前駆細胞の移植、拡張、および生存を含む新たな心臓治療の基礎を形成する。本発明の以前は、PIM活性の増強が、心臓組織、心臓細胞における、または他の循環系細胞もしくは組織における任意の予防的または治療的有用性を有することは知られていなかった。
循環組織内でPIM活性を増強させるための詳細な戦略を以下に提供する。PIM活性を増加させる方法が何であれ、発明者らは、心臓および他の循環系組織において、PIM活性の増強が、多くの有益な効果を有することを見出した。
第1に、本明細書中で検討される組成物、方法、または技術を用いて治療し得る、公知の心臓または他の循環組織の疾患もしくは損傷などの容易に診断可能な既存の症状を有する個体がある。それらの場合、当該疾患または損傷の診断もしくは同定は、特定の治療を必要とする個体の診断、選択、または同定を構成するであろう。
一部の実施形態は、PIM-コード配列(例えばPIM-1発現メッセージまたはPIM-1遺伝子)を含む核酸構築物を包含する。1つの態様において、本発明の実施に用いるPIM-発現核酸としては、PIM-1ゲノム配列、またはそのコード配列または非コード配列(例えば、イントロン、5’または3’非コード配列などを含む)を含む断片が挙げられる。また、PIM-コードmRNA配列も含まれる。
1つの態様において、本開示は、ex vivoまたはin vitro遺伝子治療ビヒクルとして使用するための、あるいは本発明の方法を実施するための心臓組織、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官におけるPIM-1の発現のための、また研究、薬の発見または移植のための、PIM-コード配列(例えば、PIM-1コードメッセージもしくはPIM-1a遺伝子)を含む構築物または発現ビヒクル、例えば発現カセット、ベクター、ウイルス(例えば、レンチウイルス発現ベクター、例えば配列番号4参照)などを提供する。
本発明は、医薬組成物などの組成物、およびPIMを発現させる(例えば、心筋細胞を肥大からを保護し、梗塞によって誘導される心筋アポトーシスを抑制し、また梗塞サイズを減少させるためPIM-1または他の機能的に同等なキナーゼを発現させる)方法を提供する。(機能的同等性は、同じ基質に作用して同じ産物を産生する能力に基づいて存在すると考えられ、また同一の動態を必要としない。)別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、心臓または血管の細胞脱分化および幹細胞マーカーの再発現を誘導するためにPIM-1を発現させ、また1つの態様においては、幹細胞の再生能(例えば心筋梗塞後(MI後)に心臓に生着する幹細胞能)を増強するためPIM-1を過剰発現させるために用いられる。
また本発明は、例えばポリペプチド(例えば心臓または血管の幹細胞の表面ポリペプチド(心臓細胞(例えば筋細胞)の細胞表面ポリペプチドなど))のような生物学的分子をはじめとする特定の分子を標的とする、本発明のPIM-1発現化合物を含むナノ粒子およびリポソーム膜も提供する。別の実施形態において、本発明は、疾患のあるおよび/または損傷した心臓細胞または幹細胞(任意の多能性細胞など)を標的とするナノ粒子およびリポソーム膜を提供する。
本発明のPIM-1発現核酸組成物は、PIM-1コード核酸を送達するex vivo遺伝子治療またはin vivo遺伝子治療のために送達され得る。1つの態様において、本発明のPIM-1発現核酸組成物(例えば高レベルのヒトPIM-1タンパク質を発現する非複製ウイルス構築物)は、ex vivo伝子治療またはin vivo遺伝子治療のために送達される。
細胞および核酸のアプローチに加えて、PIMタンパク質を罹患した心臓または他の循環組織に直接送達することもできる。PIMは細胞内で作用するため、PIMの細胞内送達を容易にする送達戦略を利用することが好ましい。
本発明は、本発明のPIMを発現させる、またはPIMを誘導もしくはアップレギュレートする組成物および/または核酸(例えば、ベクター、組換えウイルスなど)、トランスフェクト剤、形質導入剤、心臓または血管の細胞および/または細胞株、使用説明書(本発明の方法に関する)、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明の組成物を含むキットおよび本発明の方法を提供する。キット、細胞、ベクターなどは、それ自体、本明細書で提供される。
この実施例は、セリン/トレオニンキナーゼPIM-1をコードする核酸を含む本発明の組成物および本発明の方法が、細胞増殖を誘導し、細胞を低酸素症および細胞アポトーシスから保護し;PIM-1キナーゼを発現させて心筋細胞を肥大から保護し、および/または梗塞によって誘導される心筋アポトーシスを抑制し、梗塞サイズを減少させ;PIM-1を発現させて幹細胞マーカーの細胞脱分化および再発現を誘導し;またPIM-1を過剰発現させて幹細胞の再生能(例えば心筋梗塞後(MI後)の心臓に生着する幹細胞能)を増強するために有効であることを示す。これらのデータは、本明細書中に記載の組成物および方法の使用において、心筋梗塞、圧過負荷誘発性肥大、および心不全に起因する虚血/再灌流損傷中に誘導されるアポトーシス刺激に対する防御としてのPIM-1の機能を示す。
PIM-1はヒト心筋中で発現され、不全においてアップレギュレートされる
正常ヒト心臓および不全ヒト心臓のサンプルの免疫組織化学は、正常成人の心筋において、PIM-1発現が細胞質全体に分布していることを示す。対照的に、不全ヒト心臓サンプルにおいては、PIM-1は大部分が核性となる。ヒト心臓溶解物の免疫ブロッティングは、正常対照と比較した場合、不全ヒト心筋においてはPIM-1発現が2.65倍増加することを示す。類似のパターンがトロポモジュリン過剰発現トランスジェニック(TOT)マウス、DCMモデルにおいて見られる。PIM-1は、6月齢の野生型(NTG)マウスにおいて低レベルで発現したが、TOTマウスにおける発現は5.9倍増加し、大部分が核性であった。
生後様々な時点のマウスから得た心筋溶解物の免疫ブロット分析は、加齢に伴うPIM-1発現の低下を示す。新生児の心臓サンプルは、30週齢のマウスより6.3倍多いPIM-1を示す。出生後発現レベルは低下するが、8週齢まで著しく上昇し続け、そこで30週齢の心臓と同程度となる。様々な発達時点のマウスの心臓の共焦点顕微鏡検査は、PIM-1の発現が、新生児では主に核性であり、成体早期に次第に細胞質性となり、30週齢の成体では実質的に消失することを示す。このことは、PIM-1について細胞内分画を行った心筋の免疫ブロッティングによって裏付けられる。PIM-1発現は、30週齢のマウスの心筋と比較した場合、それぞれ、新生児の心臓においては10.5倍より核性であって5.0倍細胞質性でなく、8週齢の心臓においては5.2倍より核性であって4.6倍細胞質性でない。
これらのデータは、当技術分野で認められた動物モデルを用いて、in vivoでのPIM-1の発現が心臓保護効果を有することを示す。PIM-1の局在化および発現は、偽手術(sham)、または梗塞(MI)もしくは圧過負荷(TAC)に起因する心筋症損傷の4日後に処理した、3月齢の正常マウスから得た心臓において検証した。圧過負荷肥大を誘発するためのTAC結紮の4日後、主要血管の周囲の心筋細胞においてPIM-1の免疫活性が核周囲で著しく増加していることが観察された。同様に、核周囲でのPIM-1の免疫活性は、境界域の心筋細胞中では増加するが、遠隔心筋の正常領域中では影響を受けない。PIM-1陽性の境界域の心筋細胞は、「末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTP-ビオチンニック末端標識」(TUNEL)標識に陰性であって、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を示すBcl-XL発現の増加を示し、心筋生存シグナル伝達におけるPIM-1の役割を実証し、また本発明の組成物および方法が、PIM-1キナーゼ発現および/または活性を発現させおよび/またはアップレギュレートすることによって心筋生存シグナル伝達において有効であり得ることも実証する。
これらのデータは、本発明の組成物および方法が、PIM-1の発現を増加させて心臓保護効果を与える(例えば心筋梗塞後)ために使用し得ることを示す。新生児ラット心筋細胞培養物を、アッセイの2時間前に心臓保護剤(白血病抑制因子(LIF)、インスリン様成長因子(IGF-1)、デキサメタゾン、およびPMAなど)で処理すると、共焦点顕微鏡検査によって可視化されるとおり、対照細胞と比較してPIM-1の免疫反応性が誘導された。PIM-1の免疫反応性は、フェニレフリン、エンドセリン1、フォルスコリン、またはエストラジオールによっては誘導されなかった(図4A)。LIF、IGF、PMA、およびデキサメタゾンは、PIM-1発現をそれぞれ2.8、2.7、2.3、および2.0倍誘導した(*p<0.05、**p<0.01)。アデニル酸シクラーゼ活性剤であるフォルスコリンは、対照培養物に対してPIM-1発現を45%低下させた(**p<0.01)。
IGF-1処理に応答するPIM-1発現は、PI3キナーゼ阻害剤であるウォルトマンニンの存在下で著しく低下し、またはAKT(AKT-DN)をそれぞれ4.0倍および9.1倍不活性化させる(**p<0.001)。核標的AKT(参考文献12)の過剰発現が、培養心筋細胞中のPIM-1発現を非感染の対照と比較して2.1倍増加させるという、IGF刺激後の結果として生じるAKTの核蓄積の役割(参考文献11)が確認された(*p<0.05)。対照的に、野生型AKT(AKT-wt)の過剰発現は、PIM-1の発現を非感染の対照に対して1.4倍低下させた(*p<0.05)。培養心筋細胞の共焦点顕微鏡写真は、核標的AKTの発現が、PIM-1の核局在化の増加を誘導することを示す(図5C)。In vitroの結果と一致して、6月齢の心臓特異的核標的AKTトランスジェニックから得た心臓の免疫組織化学は、対照と比較してPIM-1の免疫活性および核局在化の増加を示し、代表的な免疫ブロットは、PIM-1発現の増加を裏付ける。
AKTの発現およびリン酸化(S473)は、培養心筋細胞におけるGFP-PIM-DNの過剰発現に応答して増加する(図6A)。これに匹敵するホスホAKT473の増加の所見が、2月齢のPIM-KOマウスから得た免疫標識された心筋片の共焦点顕微鏡検査で観察された。PIM-KOマウスから得た全心臓溶解物の免疫ブロットにおけるホスホAKT473と全AKTの増加は免疫染色と相関しており、Aktの発現および活性の調節が、部分的にはPIM-1レベルに依存していることを示している。
これらのデータは、当技術分野で認められた動物モデルを用いて、本発明の組成物および方法が、例えば心筋梗塞後に、PIM-1の発現を増加させて心臓保護効果(心筋保護効果)を与えるために使用し得ることを示す。心臓保護の分子調節は、心筋損傷および心不全の治療における治療的介入戦略のための極めて重要な研究手方法として耐えうる。本明細書中に示されるデータで実証されるとおり、本発明の心臓保護におけるPIM-1の中心的役割の発見で、心筋細胞生存の調節およびAKT媒介効果について意味深いシグナル伝達の新たな側面が明らかにされた。総合すれば、本明細書に示されるデータは、心筋におけるPIM-1発現および保護効果の最初の証拠を提供し、PIM-1とAKTの相互フィードバック機構を示す。造血系において先に実証されているAKTとPIM-1の共依存相互関係(参考文献7)は、両分子が協調して作用することを示す。
PIM-1は、心筋に関する研究においては、以前は研究されていなかった。例えば参考文献1(下記参照)で概説されるとおり、非心臓細胞においては、PIM-1は増殖および細胞生存のシグナル伝達の重要な調節因子として示されていた。本発明の組成物および方法を用いて、PIM-1は、心筋梗塞、圧過負荷誘発性肥大、および心不全に起因する虚血/再灌流損傷中に誘導されるアポトーシス刺激に対する防御として機能する。PIM-1レベルは発生的にダウンレギュレートされるが、TAC結紮によって誘導された圧過負荷および心筋梗塞による心臓損傷後、心筋細胞において発現が再現する。PIM-1は、心臓損傷の後に発現する「前初期応答」遺伝子プロファイル(参考文献13)に関与するいくつかの癌原遺伝子(c-fos、c-myc(参考文献14)、RafおよびRasなど)の1つである。PIM-1は、他の組織中でc-Myb依存性細胞増殖の活性化においてc-mycと協力することが示されており(参考文献15〜17)、癌遺伝子間の相乗効果が、損傷に対する応答における心筋の維持に役立ち得ることを示唆している。
その増殖効果に加えて、これらのデータは、PIM-1が細胞内抗アポトーシスシグナル伝達を増強することも示す。非心臓細胞における知見(参考文献17、18、19)と一致して、アデノウイルスによるPIM-1の過剰発現は、新生児ラット心筋細胞を、ドキソルビシンおよびデオキシグルコースで誘導したアポトーシスから、bcl-2およびBcl-XLの発現の誘導ならびにBadのリン酸化の誘導を通して保護する(図3)。mdm2発現、リン酸化およびp53分解の誘導はPIM-1によって媒介され(参考文献17)、AKTはp53依存性機構を通じてドキソルビシン誘導性アポトーシスを防御するため(参考文献20)、PIM-1はAKT誘導性p53抑制の下流エフェクターとしての役割を果たすこともできる。さらに、PIM-1の不活性化は、心筋細胞に関してアポトーシスシグナル伝達を誘導し、ドキソルビシン誘導性アポトーシスを悪化させた。他の細胞に関して見出されているとおり(参考文献18)、PIM-1の不活性化は、活性酸素種の生成およびミトコンドリア孔透過性の増加を通してアポトーシス活性も増加させ得る。
新生児ラット心筋細胞培養物の感染および処理
新生児ラット心筋細胞培養物を、以前に記載されたとおりに調製した(参考文献12)。処理に供する細胞を、2%血清を含む培地中に一晩置いた後適当な薬剤で処理し、以前に記載された時点後に回収または固定した。心筋細胞をアデノウイルスで2時間感染させ、PBS中で洗浄し、その後2%FBSおよび50μg/mlのpen/strep、ならびに100μMのグルタミンを含むM199を再供給した。
心臓をPBS中で洗浄し、2mμlの0.57M STEAKM(0.57Mスクロース、25mM KCL、5%MgCl2、1mM DTT、0.5mM PMSF、500μlのプロテアーゼ阻害剤および50μlのホスファターゼ阻害剤)に移し、ポリトロンを用いて氷中で均質化し、1000xgで10分間遠心分離した。
感染心筋細胞を、感染の24時間後にSDS変性サンプルバッファー中で回収し、超音波処理して10分間煮沸し、Bradfordアッセイを用いて定量した。乳鉢と乳棒で粉砕した急速冷凍心臓からマウス全心臓溶解物を作製し、その後SDS変性サンプルバッファー中に再懸濁し、超音波処理して10分間煮沸し、Bradfordアッセイを用いて定量した。各サンプルの約50μgを4〜15%勾配ビスアクリルアミドトリスグリシンゲル(Bis-Acrylamide Tris Glycine gel)上にロードし、PVDFに転写した。ブロットを、3%BSA中で1時間ブロックし、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体(PIM-1(Cell Signaling Technology)、c-jun(Cell Signaling Technology)、HISTONE3TM(Cell Signaling Technology)、GFP(Molecular Probes)、bcl-2(Santa Cruz)、bcl-XL(Cell Signaling Technology)、ホスホ-BADS112TM(Biosource)、AKT(Cell Signaling Technology)、GAPDH(Research Diagnostics Inc.)、ホスホ-AKTS473TM(Cell Signaling Technology)、全PARP(Biosource)、切断PARP(Biosource)、および切断カスパーゼ3(Cell Signaling Technologies))を用いて、4℃で一晩プローブした。ブロットをTBS-0.5%Tween中で3回洗浄し、ブロッキング溶液中に1:5000希釈した蛍光ホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて室温で1時間プローブし、その後TBS-0.5%Tween中で3回洗浄した。TYPHOON 9410 IMAGERTM(GE Healthcare)を用いてブロットをスキャンし、IMAGEQUANT 5.2TMソフトウェア(GE Healthcare)を用いて定量した。定量は全て、ローディングコントロールに対する標準化に基づく。
以前に記載のとおりにAKT-nucアデノウイルスおよびAKT野生型アデノウイルスを調製した(参考文献12参照)。PIM-wtアデノウイルスおよびPIM-DNアデノウイルスは、以前に記載されたpEGFP-N1 PIM-1プラスミドおよびpEGFP-N1PIM-DNTMプラスミド(参考文献10)から得たNheI/SmaI断片を、pDC315ioTM(Microbix)アデノウイルスシャトルベクター中にサブクローニングすることによって調製した(参考文献32)。配列確認シャトルベクターをゲノムpBHGloxΔE1,3Creと共に293iqTM細胞(Microbix)中に同時トランスフェクトして、上記のアデノウイルスを作製した。実験で使用するため、精製したプラークを単離して拡張した。
以前に記載のとおりに心臓を固定して埋め込み、心筋細胞を固定して透過処理した(参考文献12)。10%ウマ血清を含むPBS中に1:25希釈した上記の抗体を用いて、培養新生児ラット心筋細胞の染色を4℃で一晩行った。スライドをPBS中で洗浄し、蛍光結合二次抗体(1:100)を用いて室温で1時間プローブし、テキサスレッドファロイジン(1:50 Molecular Probes)でプローブしてアクチンフィラメントを同定した。スライドをPBS中で3回洗浄し、TOPRO-3TM(1:5000 Molecular Probes)で30分間染色して核を同定し、1回洗浄して、VECTRASHIELDTM(Vectra Labs)を用いてカバースリップした。パラフィン埋め込みサンプルを4μmに切断し、標準的な一連のキシレンおよび段階的エタノールステップ(水まで)を通して脱パラフィンした。10mMクエン酸塩(pH6.0)中で抗原回復を行った。PIM-1とホスホ-AKTのシグナルを、両抗体の1:500の一次濃縮液および1:3000の二次濃縮液を含むTYRAMIDE AMPLIFICATION KITTM(Perkin Elmer)を用いて増幅した。増幅過程の後にスライドを洗浄し、TOPRO-3(Molecular Probes)で染色して核を同定し、洗浄して、VECTRASHIELDTM(Vectra Labs)でカバースリップした。Leica LCS共焦点顕微鏡上で、染色したスライドの共焦点イメージングを行った。比較のため、各実験においてスライドは全てあらゆる点で等しく処理し、同一の設定を用いてスキャンした。
先に記載のとおり、心筋細胞をGFPウイルス、PIM-wtウイルス、およびPIM-DNウイルスで感染させた。感染の24時間後、細胞を1μMのドキソルビシンまたは1mMのデオキシグルコースで16時間処理し、その後製造者の使用説明書によりIN SITU CELL DEATH DETECTION KITTM、TMR red(Roche Applied Science)を用いてTUNEL用に標識化した。Nikon DIAPHOT 420TM蛍光顕微鏡上で、各処理について感染したTUNEL陽性細胞の数を計数した。
マウスを麻酔下に置き、胸壁を外科的に切開した。急性虚血事象を誘発するため、左前下行枝(LAD)の位置を確認し、8-0ナイロン縫合糸を用いて結紮した。圧過負荷を誘発するため、27ゲージの針をガイドとして用いて、大動脈を8-0プロレンで縛った。偽手術(sham)動物を、LADまたは大動脈が結紮されていない点を除いてあらゆる点で等しく処理した。動物心臓を上記のとおりに回収し、パラフィンに埋め込んだ。
以前に記載のとおりにex vivo虚血/再灌流を行った(参考文献34)。各実験群から得た4つの心臓から得た切片を切断し、キットの指示書に従ってTUNEL標識(IN SITU CELL DEATH DETECTION KITTM、TMR red(Roche Applied Science))を用いて細胞死について分析した。
Student Tテスト、および必要に応じて分散分析(ANOVA)を用いて統計的分析を行った。0.05未満のP値を有意と考えた。
この実施例もまた、セリン/トレオニンキナーゼPIM-1をコードする核酸を含む本発明の組成物、および本発明の方法が、細胞増殖を誘導し、低酸素症および細胞アポトーシスから細胞を保護し、またPIM-1キナーゼを発現させて心筋細胞を肥大から保護し、および/または梗塞によって誘導される心筋アポトーシスを抑制し、梗塞サイズを減少させるために有効であることを実証する。
PIM-1は、心臓保護的刺激に曝露された心筋細胞中で発現する。Aktとは異なり、PIM-1は構成的に活性であり、タンパク質の産生/分解速度によって調節される。培養細胞ならびに正常心筋の両方において、基底条件下の心筋細胞中で構成的な低レベルのPIM-1産生を検出することができる。発明者らは、新生児ラット心筋細胞を培養し、これらをIGF-1、PMA、デキサメタゾン、LIF、フェニルエフェドリン、エンドセリン1、エストラジオール、およびフォルスコリンで処理した後、PIM-1タンパク質レベルについてアッセイした。2時間を通して、最初の4つの因子はPIM-1の発現を顕著に増加させたが、他の因子では増加はほとんどまたは全く見られなかった。
以下のデータは、Pim-1キナーゼが心筋においてAKTの下流で強力な心臓保護効果を与えること、またPIM-1が心臓肥大に関与することを示す。トランスジェニックマウスにおいて、Pim-1(Pim-wt)またはPim-1のドミナントネガティブ変異型(Pim-DN)の心臓特異的発現を、これらのPim-1構築物のアデノウイルス媒介性過剰発現と共に用いて、肥大におけるPim-1の役割を明らかにした。Pim-1のトランスジェニック過剰発現は、攻撃後の血行動態機能の改善、アポトーシスの低下、抗肥大性タンパク質の増加、筋細胞サイズの縮小、肥大性シグナル伝達の抑制によって証明されるとおり、野生型対照と比較してマウスを圧過負荷誘発性肥大から保護する。同様に、新生児ラット心筋細胞培養物におけるPim-1の過剰発現は、エンドセリン1によって誘発される肥大を抑制する。細胞レベルでは、肥大性攻撃の後に、Pim-wtマウスの心臓が、野生型対照と比較して、筋細胞へのBrdUの組み込みの強化ならびに過形成の表現型を示す。これに対して、Pim-DNのトランスジェニック過剰発現は、アポトーシスの増加、線維症の増加および心臓機能の大幅な低下によって特徴付けられる拡張型心筋症を引き起こす。さらに、Pim-DNの過剰発現は、単離された筋細胞におけるCa2+過渡電流の振幅の低下および細胞短縮のパーセントの減少によって証明されるとおり、収縮性の低下をもたらす。これらのデータは、分子、細胞、および器官レベルでの衝撃応答による肥大の調節におけるPim-1の中心的役割を裏付ける。
ヒトPIM-1の野生型(Pim-wt)およびドミナントネガティブタンパク質として機能するキナーゼデッド変異型(Pim-DN)(参考文献16)を、心臓特異的ミオシン重鎖プロモーターの制御下でGFPに融合させた。これらの構築物を用いて作出したマウス系のPCRは、導入遺伝子のゲノムへの組み込みを示す。トランスジェニックサンプルから得た全心臓溶解物の免疫ブロットは、Pim-1抗体とGFP抗体の両方によって認識される64kDaのGFP-Pim-1融合タンパク質を明らかにした。GATA-1転写を活性化させるPim-1の能力を利用して、Pim-DN構築物の正真正銘の抑制性機能が立証された(Magnuson、未公開データ)。C2C12筋芽細胞において、Pim-wtは転写因子GATA-1をリン酸化し、GATA-1ルシフェラーゼレポーター発現を誘導して、同時にGATA-1活性を抑制するPim-DNの滴定を増加させる。Pim-1がp21をリン酸化することを示した以前の研究(参考文献29)に基づき、GFP-Pim-1-wt、GFP-Pim-1-DNトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック(NTG)マウスから調製した全心臓溶解物を用いて、in-vitroキナーゼアッセイで発明者らのPim-wt構築物の活性を確認した。全心臓溶解物からGFP-Pim-1タンパク質(wtまたはKD)を免疫沈降させ、[γ-32P]ATPの存在下で、基質としてのGST-p21と共にインキュベートした。サンプルをSDS-PAGE上で解像し、32P標識されたタンパク質をオートラジオグラフィーによって検出した。Pim-wt過剰発現はp21をリン酸化するが、この活性はPim-DN構築物中では消失した。
Pim-1の遺伝子欠失を用いて作出したマウス(Pim-1 KO)から得た心臓は、NTG(非トランスジェニック)対照と比較して、筋細胞中のアポトーシスの増加を示すが、明らかな心筋症再構築の証拠は示さない(参考文献12)。これに対して、Pim-DN過剰発現マウスは、3〜4月齢で始まる進行性の壁菲薄化によって特徴付けられる心筋症を患う。図12は、野生型NTGマウスの特徴を、活性PIM-1欠損マウスの特徴と比較する。図12aでは、長時間にわたる後壁径の心エコー測定が、PIM-DNマウスが進行性の菲薄化を有することを示す。これは図12bの前壁径にも見られる。図12cに示されるとおり、PIM-DNマウスでは、生後10週と22週における心臓:体重の比も顕著に増加する。In vitroでPim-DN過剰発現は心筋細胞アポトーシスを誘導する(参考文献12)ため、Pim-DN動物の心筋中のアポトーシス筋細胞の評価は、TUNEL染色によって行った。Pim-DN動物は、齢が一致する対照と比較して、mm2当たりのアポトーシス心筋細胞の2倍の増加を示し(図12d、それぞれ1.2/mm2および2.4/mm2、**p<0.01)左心室において線維症およびコラーゲン沈着の増加をもたらす。さらに、Pim-DN動物において壊死の量を定量し(**p<.01)、基底レベルで顕著に増加していることを見出した。
心エコー分析により、Pim-DNマウスの心臓は、17週齢(*p<0.05)から27週齢(*p<0.05、**p<0.01)まで、付随する短縮率および駆出率の低下(それぞれ36.6%および74.2%)を伴う進行性拡張を示す。NTGとPim-DNの両方の心臓上で行った形態計測分析は、Pim-DNの心臓が顕著に拡張したことをさらに裏付けた。In vivo血行動態評価は、±dP/dtの低下、左心室拡張終期圧(LVEDP)の増大、および左心室発生圧(LVDP)の低下を伴って血行動態が損なわれたことを実証した。機構的に、Pim-DN筋細胞は、NTG筋細胞に対して、細胞短縮パーセントの低下を伴うCa2+過渡電流の振幅の低下を示した。さらに、Ca2+過渡電流減衰の時定数(τ)は、Pim-DN筋細胞においてより大きかった。これらの結果は、Pim-DN筋細胞の収縮機能の低下が、少なくとも部分的には、筋小胞体からのCa2+放出の減少と再取り込みの減速によって媒介されることを示す。このように、心筋におけるPim-DNによるPim-1の不活性化は、心臓機能にネガティブな影響を与える。
損傷した心筋におけるPim-1の誘導は、心筋細胞中で起こる保護的生存応答(参考文献12)(例えばPim-1が心房性ナトリウム利尿ペプチドを発現する細胞に共局在化している梗塞境界域における保護的生存応答)であると考えられる。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)は、抗肥大性および心臓保護性のいずれでもある(参考文献24)ため、これらのタンパク質の一致は、肥大性シグナル伝達の緩和においてPim-1蓄積が果たす役割の評価を促す。
るレベルではあるが、Pim-1が過剰発現される場合の抗肥大的役割を裏付ける。
In vivoでPim-1過剰発現が肥大に及ぼす影響を、圧過負荷を誘導するための横断大動脈狭窄(TAC)に供したPim-wtマウスを用いて、齢と性別が一致するNTG対照と比較して評価した。図14a〜14fについて、NTGおよびPim-wt shamおよびTAC結紮の心臓の、前壁径(AWD、14d、14a)、後壁径(PWD、14d、14b)、拡張終期径(EDD、c)、収縮末期径(ESD、14d)、短縮率パーセント(FS、14e)、および駆出率(EF、14f)についての週1回の心エコー評価を表す折れ線グラフを作成した(NTG sham n=6、Pim-wt sham n=6、NTG TAC n=9、Pim-wt TAC n=9;*p<0.05、**p<0.01)(図14a〜14b、*p<0.05、**p<0.01)。
NTGマウスは、TAC攻撃後、心臓サイズの顕著な増加を示し、Pim-wtトランスジェニックマウスと比較して著しく速い速度で死ぬ。肥大の分子mRNAマーカー(ANP、BNP、α骨格アクチン(αSKA)、βミオシン重鎖(β-MHC)およびc-fosなど)は、偽手術(sham)と比較して、NTGのTAC攻撃された心臓において顕著に増加する。これに対して、分子肥大マーカーは、Pim-wtの心臓が基底条件下でより多くのc-fos mRNAを発現しても、TAC攻撃に供されたPim-wtマウスの心臓において著しく増加することはない。切片のTUNEL標識によってアポトーシス筋細胞を定量すると、NTGのTAC攻撃された心臓中では、偽手術(sham)と比較して3.72倍増加(それぞれ3.2/mm2と0.86/mm2)したことが明らかになるが、Pim-wt動物ではTUNEL陽性細胞の顕著な増加は示されない(1.31/mm2対1.05/mm2)。心筋生存率の改善と一致して、Pim-wtのTAC攻撃された心臓は、NTGのTAC攻撃された対応物と比較して、血管周囲線維症の減少ならびに壊死の減少を示す。さらに、Pim-wtのTAC結紮された心臓は、NTGの対応物と比較して、Bcl-xl、Bcl-2などの抗アポトーシスタンパク質のレベルを著しく増加させ、Badのリン酸化を増加させた。これらのデータは、Pim-1過剰発現によって与えられる保護が、部分的には生存シグナル伝達の増加によるものであるという見解を裏付ける。
TAC結紮の後、Pim-wtの心臓において線維症の減少が見られ、Pim-1過剰発現が収縮機能を維持することを示唆している。TAC攻撃後4週間と10週間で実施したin vivo血行動態測定によって評価されたPim-wtとNTG対照を用いて、Pim-1過剰発現が心臓収縮性に及ぼす作用を検証した。図15a〜cは、偽手術(sham)またはTAC手術(それぞれ14週齢と20週齢)の4週間後と10週間後(それぞれ黒棒と灰色棒)の、NTGおよびPim-wtの心臓のin vivo血行動態評価を示す。図15aは±dP/dt測定を示し、図15bは左心室発生圧(LVDP)を示し、図15cは左心室拡張終期圧(LVEDP)を示す。両方の時点において、NTGのTAC攻撃された心臓では収縮機能が低下しているが、Pim-wtの心臓は、TAC攻撃後に、偽手術(sham)したNTG対照と比較して優れた機能を有する(+dP/dtは若干減少し、また−dP/dtに著しい変化はない)。4週と10週のdP/dtの評価の比較は、Pim-wtのTAC攻撃された心臓の能力が比較的改善されているにもかかわらず、NTGとPim-wtの両方のTAC攻撃された心臓の機能が著しく低下していることを示す。測定は、TACの4週間後と10週間後のNTGの心臓における左心室発生圧(LVDP)と左心室拡張終期圧(LVEDP)の増加を明らかにするが、Pim-wtの心臓は、LVDPの相対的な維持(図15b、Pim-wtは19.75%増加、**p<0.01)と、LVEDPの無変化(図15c **p<0.01、$$p<0.01 vs. NTG TAC)を示す。4週と10週の時点で、±dP/dとLVDPに反映される血行動態機能は、NTGと比較して、Pim-wtの心臓で改善されている(図15a〜図15b、ψp<0.05、ψψp<0.01)。
心筋のPim-1過剰発現によって生じる筋細胞の量と細胞充実性を、筋細胞体積分布の定量によって評価した。結果は、Pim-wtの心臓が、NTG対照と比較して、これらの心臓中の平均筋細胞サイズの低下にも反映される小筋細胞のパーセントの増加を有し、Pim-wtにおいて、NTGと比較して筋細胞が約33%多い過形成の表現型をもたらすことを示す。さらに、単離されたPim-DN筋細胞は、NTG筋細胞より11%大きく、トランスジェニック心臓においてPim-1活性の低下がより大きな筋細胞の形成を引き起こす逆効果を示している。
Pim-1は、最小限の標的基質認識配列要件(参考文献16)と自己リン酸化能力(参考文献17)に基づく比較的乱交雑なキナーゼであり得るため、Pim-1-媒介性心臓保護に関与する分子メカニズムを検証した。
トランスジェニック動物の作出と動物の使用
Pim-wtとPim-DNのcDNA断片(参考文献16)を、遺伝子組換えのためにα-MHCプラスミドにサブクローン化した。先の刊行物は、TAC結紮とエコーの方法(参考文献9)、ならびにHW(心臓重量):BW(体重)比の測定および血行動態について記載している(参考文献12)。オンラインの付録でさらなる詳細が提供される。動物研究は全て、機関内動物管理使用委員会(Institutional Animal Use and Care Committee)によって承認された。
In vitroキナーゼアッセイにおいて、心臓溶解物から免疫沈降したGFP-Pim-1タンパク質を、基質としてのGST-p21と共に用いた。ルシフェラーゼアッセイに関して、指示プラスミドとpGATA-Lucレポーター構築物でトランスフェクトしたC2C12細胞を、GATA依存性ルシフェラーゼ活性について分析した。以下に挙げられる参考文献26に記載のとおりに免疫蛍光顕微鏡法を行い、以下に挙げられる参考文献24に記載のとおりに免疫ブロッティングを行い、以下に挙げられる参考文献9に記載のとおりに定量RT-PCRとTUNEL(「末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性dUTP-ビオチンニック末端標識」(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling))染色を行った。
新生児ラット心筋細胞培養物を、以前に記載のとおりに調製した(参考文献10)。以下に挙げられる参考文献12、22、25に先に記載されるとおりに、成体筋細胞単離、体積計算、細胞短縮およびCa2+過渡電流実験を行った。
Pim-1は心臓前駆細胞の増殖を増加させる
CGW-Pim-wt CPC(心臓前駆細胞)の成長速度を評価するため、6日間の時間経過にわたるトリパンブルー排除によって生存細胞の数を測定した(図17A)。6日目には、CGW-Pim-wt CPCは、CGW(p<.05)および未処理(p<.001)のCPCを著しく超えて拡張し続けていた。またCGW-Pim-wt CPCは、MTTアッセイによって測定されるとおり、1日目(p<.001)および3日目(p<.001)にCGW CPCを上回る代謝速度の増加も示した(図17B)。特異的Pim-1活性阻害剤であるクエルセタゲンチンを用いて、CGW-Pim-wt CPCが獲得する成長優位性がPIM-1の過剰発現に起因することを確認した。このPim-1阻害剤を培地に添加すると、2日目および3日目に(p<.001)、未処理のCGW-Pim-wt CPCと比較してCGW-Pim-wt CPCの成長速度を著しく低下させた(図17C)。
以前の研究は、Pim-1トランスジェニックマウスが、病理学的攻撃に対して顕著な回復力を生じさせることを示していた。Pim-1改変CPCも梗塞損傷に対して実質的な抵抗性を与えるかか否かを試験するため、12週齢の雌のFVBマウスに心筋梗塞を与え、境界域の周囲にCGW CPCまたはCGW-Pim-wt CPCを心筋内注射した(n=15-20/群)。2週間の時点の心エコー測定は、CGW-Pim-wt CPCの注射を受けたマウスの前壁径(AWD)が、生理食塩水(p<.001)およびCGW CPC(p<.01)を注射されたマウスの前壁径と比較して厚いことを示した(図18A)。Pim-1改変CPCの心筋内注射が、病理学的攻撃後に機能的改善の長期間の増加をもたらすかどうかを決定するため、梗塞後12週間マウスを追跡調査した。梗塞後6週間の時点で、CGW-Pim-wt CPCの注射を受けたマウスが駆出率(EF)と短縮率(FS)を維持し(図18B、C)、CGW CPCの注射を受けたマウスを上回って統計的に改善された。7週間目までに、CGW CPCは心臓機能(FSとEF)を維持することができず、生理食塩水の注射を受けた動物と統計的に異ならなかった。12週間の時点で、心エコーは、CGW-Pim-wt CPCの注射を受けた動物がEFとFSを維持し続けており、これにより対照CPCの注射を受けた動物のEFとFSはそれぞれ2倍と1.6倍低下したことを再び示した(図18B、C)。DP(図18D)、Ped(図18E)、および±dp/dtの変化(図18F)の血行動態測定は、CGW-Pim-wt CPCの注射を受けたマウスでは、CGW CPCの注射を受けた動物および生理食塩水の注射を受けた動物を上回って、心臓機能が著しく強化されていることを裏付けた。
左心室自由壁領域(LVFW)全体のトロポミオシンの定量は、Pim-1改変CPCを注射されたマウスの梗塞領域が著しく2倍低下したことを示した(p=.02)(図3B)。図19は、梗塞した心臓組織中のCGW-Pim-wt CPC型の筋細胞および血管系が、梗塞領域を減少させることを示すデータを図示する;またCPC注射の12週間後の梗塞領域の定量を示す。結果は平均±SEMとして表される(n=3動物、*p<.02)。
発明者らの以前の研究を広げる努力の中で、発明者らは、最初の実験を繰り返し、PBS、CGW、およびCGW-Pim-wt CPCを注射したマウスを、32週間にわたり心エコーと血行動態評価によってモニターした。3日目には、全マウス群のFS(図20A)とEF(図20B)が低下しており、生理食塩水対照群と統計的に異ならなかった。以前見られたとおり、CGW CPCの注射を受けたマウスは、1週間目に初期の早期改善が見られ、6週間目に心不全が発症し、8週間目までに生理食塩水対照群に対して統計的に有意でなくなった。しかし、Pim-1改変CPCの注射を受けたマウスは、1週間目にFSとEFが増加し、それが32週間を通してずっと維持された(図20A、B)。
ベクターは、MNDプロモーターがPIM-1発現を駆動し、レポーター(強化緑色蛍光タンパク質(eGFP))がウイルス内部リボソーム侵入部位(vIRES)の外で駆動される2シストロン性である。構築物は全て第3世代自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクターであり、導入遺伝子の長期発現を確保するための幾つかのエレメントを組み込んでいる。MND(MND、骨髄増殖肉腫ウイルスLTRネガティブコントロール領域欠失)プロモーターは導入遺伝子の高発現を可能とするが、LTRは、繰り返し継代後の長期発現を可能とする。上記のベクターは、(IFN)-β-足場付着領域(SAR)エレメントも含む。このSARエレメントは、メチル化を抑制し導入遺伝子を発現抑制から保護することによってベクターを転写的に活性に保持するのに重要であることが示されている。
本発明は、PIM発現核酸およびPIMポリペプチドの使用を含む組成物および方法を提供する。
である。
である。
本発明は、本発明のPIMを発現させる、またはPIMを誘導もしくはアップレギュレートする組成物および/または核酸(例えば、ベクター、組換えウイルスなど)、トランスフェクト剤、形質導入剤、心臓または血管の細胞および/または細胞株、使用説明書(本発明の方法に関する)、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明の組成物を含むキットおよび本発明の方法を提供する。キット、細胞、ベクターなどは、それ自体、本明細書で提供される。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)血管系細胞または組織のPIM活性を増強する必要のある患者を同定するステップと、該組織中の細胞の機能特性を改変するために該患者の血管系細胞または組織におけるPIMレベルを増強するステップとを含む方法。
(2)患者が心臓損傷を経験しており、PIMレベルの増強が心臓の再生を促進して該損傷を修復する、(1)に記載の方法。
(3)増強ステップが、血管系組織におけるPIMの内因性産生を増強するステップを含む、(1)に記載の方法。
(4)増強ステップが、患者に外因性PIMを投与するステップを含む、(1)に記載の方法。
(5)外因性PIMが、細胞送達部分に結合したPIM酵素を含む、(1)に記載の方法。
(6)細胞送達部分が、PIM酵素に結合された転移ドメインである、(5)に記載の方法。
(7)増強ステップが、PIMレベルの増強をもたらす細胞を患者に投与するステップを含む、(1)に記載の方法。
(8)投与される細胞が、幹細胞または血管系前駆細胞である、(7)に記載の方法。
(9)投与される細胞が、非PIMプロモーター、心臓特異的プロモーター、心臓細胞もしくは幹細胞において活性なプロモーターまたはPIMプロモーターに機能的に連結されたPIMコードポリヌクレオチドを含む、(7)に記載の方法。
(10)プロモーターが、α-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターであるか、またはα-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターを含む、(9)に記載の方法。
(11)増強ステップが、細胞を患者の血管組織に投与するステップと、投与された細胞から増強レベルのPIMを発現させるステップとを含む、(1)に記載の方法。
(12)血管系疾患または損傷の治療のための、PIM酵素送達物質またはPIM酵素増強物質。
(13)細胞送達剤に連結したPIM酵素を含む、(12)に記載の物質。
(14)ヒトまたは動物に導入するための、PIM産生の増強を可能にするように改変された細胞を含む、(12)に記載の物質。
(15)細胞が前駆細胞または幹細胞であり、改変が、非PIMプロモーター、心臓特異的プロモーター、心臓細胞もしくは幹細胞において活性なプロモーターまたはPIMプロモーターの制御下にあるPIMコードポリヌクレオチドを含む、(14)に記載の物質。
(16)プロモーターが、α-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターであるか、またはα-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターを含む、(15)に記載の物質。
(17)内因性PIM発現の誘導因子を含む、(11)に記載の物質。
(18)血管系疾患または損傷を治療するための医薬の製造における、PIM送達物質またはPIM増強物質の使用。
(19)非PIMプロモーター、心臓特異的プロモーター、心臓細胞もしくは幹細胞において活性なプロモーターまたはPIMプロモーターに機能的に連結されたPIMコードポリヌクレオチド配列を含む血管系細胞または血管系細胞に分化し得る細胞を含む組成物。
(20)プロモーターが、α-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターであるか、またはα-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターを含む、(19)に記載の組成物。
(21)細胞が幹細胞もしくは心臓前駆細胞であるか、または細胞が筋細胞もしくは心臓細胞に分化し得る、(19)に記載の組成物。
(22)細胞が間葉系幹細胞である、(19)に記載の組成物。
(23)プロモーターが誘導性プロモーターである、(19)に記載の組成物。
(24)疾患のあるまたは損傷した心臓組織内のPIMレベルを増強するステップを含む、心臓疾患または損傷を治療する方法。
(25)心臓疾患または損傷が、虚血損傷、低酸素損傷、心筋梗塞、外傷性心臓損傷、心臓肥大、過圧損傷、鬱血性心不全、アポトーシス誘導性損傷または疾患、細菌感染、ウイルス感染、および前記のいずれかのリスクの増強をもたらす症状を含む、(24)に記載の方法。
(26)心筋への投与のために製剤化される医薬組成物であって:
(i)(a) Pim-1コード核酸;
(b) 発現構築物または発現ビヒクル中に挿入されたPim-1コード核酸、またはプロモーターに機能的に連結されたネイキッドPim-1コード核酸;
(c) 発現構築物または発現ビヒクルが、ベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体を含むか、またはベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体からなる、(b)の医薬組成物;
(d) 発現構築物または発現ビヒクルが、組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターを含むか、または組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターからなる、(c)の医薬組成物;
(e) 発現構築物または発現ビヒクルが、免疫不全ウイルス由来ベクターを含むか、または免疫不全ウイルス由来ベクターからなる、(d)の医薬組成物;
(f) 免疫不全ウイルス由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターからなる、(e)の医薬組成物;あるいは
(g) ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターからなる、(f)の医薬組成物;
(h) Pim-1コード核酸がプロモーターに機能的に連結されている、(a)〜(g)のいずれかの医薬組成物;
(i) プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、(h)の医薬組成物;あるいは
(j) プロモーターが、心臓細胞(筋細胞)中で構成的または誘導的に活性である、(i)の医薬組成物;および、
(ii) 製薬上許容される賦形剤
を含む、前記医薬組成物。
(27)(26)に記載の医薬化合物を含むリポソーム。
(28)(26)に記載の医薬化合物を含むナノ粒子。
(29)以下のための医薬の製造のための(26)に記載の医薬化合物、(27)に記載のリポソーム、または(28)に記載のナノ粒子の使用:
(a) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPim-1キナーゼ活性を増加させることによる、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、あるいは圧過負荷誘発性肥大または圧過負荷誘発性心不全の後の、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防;
(b) 低酸素症、低酸素血症または無酸素症が、梗塞、外傷、手術、再移植、移植または毒素によって引き起こされる、(a)の使用;
(c) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞脱分化および/または幹細胞マーカーの再発現の誘導;
(d) 細胞、組織または器官においてPim-1を過剰発現または発現させることによる、生着した、または移植された細胞、組織または器官の保持の増強;
(e) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における、bcl-2、bcl-XLの発現および/またはBadタンパク質のリン酸化の増加;
(f) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における、虚血/再灌流損傷の改善、治療または予防;
(g) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄であるか、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄に含まれる、(a)〜(f)のいずれかの使用;
(h) 幹細胞または多能性細胞の再生能を増強し、および/または増殖を誘導するための、幹細胞または多能性細胞におけるPim-1の過剰発現または発現;
(i) 心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるBcl-XLの発現を増加させて、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を誘導し、および/または心筋生存シグナル伝達を増加させるための、心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるPim-1の過剰発現または発現;
(j) 細胞が、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit + 幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(i)のいずれかの使用;あるいは
(k) 使用が、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、または圧過負荷誘発性肥大もしくは圧過負荷誘発性心不全の後の、または肥大心筋、加齢心筋、不全心筋、虚血心筋、再構築心筋、炎症、感染、慢性的ストレス、疾患、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって損傷を受けた心筋による、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防のためである、(a)〜(j)のいずれかの使用。
(30)心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において、PIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導、アップレギュレートまたは挿入する方法であって、以下:
(a) (i)Pim-1コード核酸を提供し、該Pim-1コード核酸を心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入し、(ii)Pim-1キナーゼを発現および/または分泌する細胞を提供し、(iii)Pim-1キナーゼまたはPIM-1発現核酸を、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に投与し、または(iv)心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導またはアップレギュレートする化合物を提供するステップ;
(b) Pim-1コード核酸が、Pim-1コードメッセージ(Pim-1コードmRNA)もしくはPIM-1遺伝子を含むか、またはPim-1コードメッセージ(Pim-1コードmRNA)もしくはPIM-1遺伝子からなる、(a)の方法;
(c) Pim-1コード核酸が、ヒトPim-1コード核酸、もしくはヒトPim-1コードメッセージ(mRNA)、もしくはヒトPIM-1遺伝子、もしくはヒトPIM-1遺伝子座を含むか、またはヒトPim-1コード核酸、もしくはヒトPim-1コードメッセージ(mRNA)、もしくはヒトPIM-1遺伝子、もしくはヒトPIM-1遺伝子座からなる、(a)または(b)の方法;
(d) 細胞が、ヒト細胞、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit + 幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(c)のいずれかの方法;
(e) Pim-1コード核酸を、ex vivoまたはin vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入する、(a)〜(d)のいずれかの方法;
(f) Pim-1コード核酸を、発現構築物または発現ビヒクルに挿入する、(a)〜(e)のいずれかの方法;
(g) 発現構築物または発現ビヒクルが、ベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体を含むか、またはベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体からなる、(f)のいずれかの方法;
(h) 発現構築物または発現ビヒクルが、組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターを含むか、または組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターからなる、(g)のいずれかの方法;
(i) 発現構築物または発現ビヒクルが、免疫不全ウイルス由来ベクターを含むか、または免疫不全ウイルス由来ベクターからなる、(h)のいずれかの方法;
(j) 免疫不全ウイルス由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターからなる、(i)のいずれかの方法;
(k) ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターからなる、(j)のいずれかの方法;
(l) Pim-1コード核酸を、野生型(正常)レベルのPIM-1タンパク質を発現しない細胞に挿入する、(a)〜(k)のいずれかの方法;
(m) Pim-1コード核酸を、野生型(正常)レベルのPIM-1タンパク質コードメッセージ(mRNA)を発現しない細胞に挿入する、(l)の方法;
(n) Pim-1コード核酸を、野生型(正常)PIM-1遺伝子またはゲノムPim-1コード核酸を含まない細胞に挿入する、(m)の方法;
(o) Pim-1コード核酸を、ex vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入し、該心臓または血管の細胞、組織もしくは器官を、それが必要な個体に移植する、(a)〜(n)のいずれかの方法;
(p) Pim-1コード核酸を、ex vivoで心臓細胞、心臓もしくは血管の組織または心臓もしくは血管の器官あるいは筋細胞に挿入し、該細胞を、それを必要とする心臓または血管の細胞、組織もしくは器官あるいは心筋(心臓)に移植する、(a)〜(o)のいずれかの方法;
(q) Pim-1コード核酸を、in vivoでそれを必要とする個体の心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入する、(a)〜(n)のいずれかの方法;
(r) Pim-1コード核酸を、in vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官または心臓細胞もしくは筋細胞または心臓に挿入する、(q)の方法;
(s) 個体が、鬱血性心不全を有するか、または心筋梗塞、もしくは心筋損傷を有していたことがある、(r)の方法;
(t) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄であるか、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄に含まれる、(a)〜(s)のいずれかの方法;
(u) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導またはアップレギュレートする化合物が、生存および/または増殖シグナル伝達に関与するインターロイキン、サイトカインおよび/またはパラクリン因子;AKTセリン/トレオニンキナーゼのアップレギュレーター;インスリン様成長因子-1(IGF-1);インスリン;白血病抑制因子(LIF);顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF);または表皮成長因子(EGF)を含む、(a)の方法;
(v) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官におけるPim-1活性が、該細胞集団に外因性Pim-1キナーゼを投与することによって増加する、(a)〜(u)のいずれかの方法;
(w) Pim-1活性が、細胞集団を、外因性PIM-1遺伝子を発現するトランスフェクト細胞と接触させることによって増加する、(v)の方法;
(x) 細胞集団が幹細胞を含む、(v)の方法;または
(y) Pim-1キナーゼ活性が、(1)に記載の医薬化合物、(2)に記載のリポソーム、もしくは(3)に記載のナノ粒子またはこれらのいずれかの組み合わせを投与することにより、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において増加および/またはアップレギュレートされる、(a)〜(y)のいずれかの方法
を含む、上記方法。
(31)(26)に記載の医薬化合物、(27)に記載のリポソーム、もしくは(28)に記載のナノ粒子、またはこれらの任意の組み合わせをそれを必要とする個体に投与するステップを含む、疾患または症状を治療、予防または改善する方法であって、該疾患または症状の治療、予防および/または改善が、以下:
(a) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPim-1キナーゼ活性を増加またはアップレギュレートさせることによる、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、または圧過負荷誘発性肥大もしくは圧過負荷誘発性心不全の後の、または肥大心筋、加齢心筋、不全心筋、虚血心筋、再構築心筋、炎症、感染、慢性的ストレス、疾患、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって損傷を受けた心筋による、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防;
(b) 細胞アポトーシスおよび/もしくは損傷、または低酸素症、低酸素血症もしくは無酸素症が、梗塞、外傷、手術、再移植、移植もしくは毒素によって、または炎症、感染、慢性的ストレス、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって引き起こされる、(a)の方法;
(c) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において細胞脱分化および/または幹細胞マーカーの再発現を誘導するステップ;
(d) 生着したまたは移植された細胞、組織または器官においてPim-1を過剰発現または発現させることにより、該細胞、組織または器官の保持を増強するステップ;
(e) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において、bcl-2、bcl-XLの発現および/またはBadタンパク質のリン酸化を増加させるステップ;
(f) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における虚血/再灌流損傷の改善、治療または予防;
(g) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄であるか、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄に含まれる、(a)〜(f)のいずれかの方法;
(h) 幹細胞または多能性細胞の再生能を増強し、および/または増殖を誘導するために、幹細胞または多能性細胞においてPim-1を過剰発現または発現させるステップ;あるいは
(i) 心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるBcl-XLの発現を増加させて、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を誘導し、および/または心筋生存シグナル伝達を増加させるために、心臓細胞(筋細胞)または心臓組織においてPim-1を過剰発現または発現させるステップ;
(j) 細胞が、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit + 幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(i)のいずれかの方法
を含む、上記方法。
Claims (31)
- 血管系細胞または組織のPIM活性を増強する必要のある患者を同定するステップと、該組織中の細胞の機能特性を改変するために該患者の血管系細胞または組織におけるPIMレベルを増強するステップとを含む方法。
- 患者が心臓損傷を経験しており、PIMレベルの増強が心臓の再生を促進して該損傷を修復する、請求項1に記載の方法。
- 増強ステップが、血管系組織におけるPIMの内因性産生を増強するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 増強ステップが、患者に外因性PIMを投与するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 外因性PIMが、細胞送達部分に結合したPIM酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞送達部分が、PIM酵素に結合された転移ドメインである、請求項5に記載の方法。
- 増強ステップが、PIMレベルの増強をもたらす細胞を患者に投与するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 投与される細胞が、幹細胞または血管系前駆細胞である、請求項7に記載の方法。
- 投与される細胞が、非PIMプロモーター、心臓特異的プロモーター、心臓細胞もしくは幹細胞において活性なプロモーターまたはPIMプロモーターに機能的に連結されたPIMコードポリヌクレオチドを含む、請求項7に記載の方法。
- プロモーターが、α-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターであるか、またはα-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターを含む、請求項9に記載の方法。
- 増強ステップが、細胞を患者の血管組織に投与するステップと、投与された細胞から増強レベルのPIMを発現させるステップとを含む、請求項1に記載の方法。
- 血管系疾患または損傷の治療のための、PIM酵素送達物質またはPIM酵素増強物質。
- 細胞送達剤に連結したPIM酵素を含む、請求項12に記載の物質。
- ヒトまたは動物に導入するための、PIM産生の増強を可能にするように改変された細胞を含む、請求項12に記載の物質。
- 細胞が前駆細胞または幹細胞であり、改変が、非PIMプロモーター、心臓特異的プロモーター、心臓細胞もしくは幹細胞において活性なプロモーターまたはPIMプロモーターの制御下にあるPIMコードポリヌクレオチドを含む、請求項14に記載の物質。
- プロモーターが、α-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターであるか、またはα-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターを含む、請求項15に記載の物質。
- 内因性PIM発現の誘導因子を含む、請求項11に記載の物質。
- 血管系疾患または損傷を治療するための医薬の製造における、PIM送達物質またはPIM増強物質の使用。
- 非PIMプロモーター、心臓特異的プロモーター、心臓細胞もしくは幹細胞において活性なプロモーターまたはPIMプロモーターに機能的に連結されたPIMコードポリヌクレオチド配列を含む血管系細胞または血管系細胞に分化し得る細胞を含む組成物。
- プロモーターが、α-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターであるか、またはα-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンTプロモーターもしくはMLC-2vプロモーターを含む、請求項19に記載の組成物。
- 細胞が幹細胞もしくは心臓前駆細胞であるか、または細胞が筋細胞もしくは心臓細胞に分化し得る、請求項19に記載の組成物。
- 細胞が間葉系幹細胞である、請求項19に記載の組成物。
- プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項19に記載の組成物。
- 疾患のあるまたは損傷した心臓組織内のPIMレベルを増強するステップを含む、心臓疾患または損傷を治療する方法。
- 心臓疾患または損傷が、虚血損傷、低酸素損傷、心筋梗塞、外傷性心臓損傷、心臓肥大、過圧損傷、鬱血性心不全、アポトーシス誘導性損傷または疾患、細菌感染、ウイルス感染、および前記のいずれかのリスクの増強をもたらす症状を含む、請求項24に記載の方法。
- 心筋への投与のために製剤化される医薬組成物であって:
(i)(a) Pim-1コード核酸;
(b) 発現構築物または発現ビヒクル中に挿入されたPim-1コード核酸、またはプロモーターに機能的に連結されたネイキッドPim-1コード核酸;
(c) 発現構築物または発現ビヒクルが、ベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体を含むか、またはベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体からなる、(b)の医薬組成物;
(d) 発現構築物または発現ビヒクルが、組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターを含むか、または組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターからなる、(c)の医薬組成物;
(e) 発現構築物または発現ビヒクルが、免疫不全ウイルス由来ベクターを含むか、または免疫不全ウイルス由来ベクターからなる、(d)の医薬組成物;
(f) 免疫不全ウイルス由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターからなる、(e)の医薬組成物;あるいは
(g) ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターからなる、(f)の医薬組成物;
(h) Pim-1コード核酸がプロモーターに機能的に連結されている、(a)〜(g)のいずれかの医薬組成物;
(i) プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、(h)の医薬組成物;あるいは
(j) プロモーターが、心臓細胞(筋細胞)中で構成的または誘導的に活性である、(i)の医薬組成物;および、
(ii) 製薬上許容される賦形剤
を含む、前記医薬組成物。 - 請求項26に記載の医薬化合物を含むリポソーム。
- 請求項26に記載の医薬化合物を含むナノ粒子。
- 以下のための医薬の製造のための請求項26に記載の医薬化合物、請求項27に記載のリポソーム、または請求項28に記載のナノ粒子の使用:
(a) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPim-1キナーゼ活性を増加させることによる、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、あるいは圧過負荷誘発性肥大または圧過負荷誘発性心不全の後の、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防;
(b) 低酸素症、低酸素血症または無酸素症が、梗塞、外傷、手術、再移植、移植または毒素によって引き起こされる、(a)の使用;
(c) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞脱分化および/または幹細胞マーカーの再発現の誘導;
(d) 細胞、組織または器官においてPim-1を過剰発現または発現させることによる、生着した、または移植された細胞、組織または器官の保持の増強;
(e) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における、bcl-2、bcl-XLの発現および/またはBadタンパク質のリン酸化の増加;
(f) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における、虚血/再灌流損傷の改善、治療または予防;
(g) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄であるか、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄に含まれる、(a)〜(f)のいずれかの使用;
(h) 幹細胞または多能性細胞の再生能を増強し、および/または増殖を誘導するための、幹細胞または多能性細胞におけるPim-1の過剰発現または発現;
(i) 心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるBcl-XLの発現を増加させて、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を誘導し、および/または心筋生存シグナル伝達を増加させるための、心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるPim-1の過剰発現または発現;
(j) 細胞が、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit+幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(i)のいずれかの使用;あるいは
(k) 使用が、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、または圧過負荷誘発性肥大もしくは圧過負荷誘発性心不全の後の、または肥大心筋、加齢心筋、不全心筋、虚血心筋、再構築心筋、炎症、感染、慢性的ストレス、疾患、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって損傷を受けた心筋による、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防のためである、(a)〜(j)のいずれかの使用。 - 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において、PIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導、アップレギュレートまたは挿入する方法であって、以下:
(a) (i)Pim-1コード核酸を提供し、該Pim-1コード核酸を心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入し、(ii)Pim-1キナーゼを発現および/または分泌する細胞を提供し、(iii)Pim-1キナーゼまたはPIM-1発現核酸を、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に投与し、または(iv)心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導またはアップレギュレートする化合物を提供するステップ;
(b) Pim-1コード核酸が、Pim-1コードメッセージ(Pim-1コードmRNA)もしくはPIM-1遺伝子を含むか、またはPim-1コードメッセージ(Pim-1コードmRNA)もしくはPIM-1遺伝子からなる、(a)の方法;
(c) Pim-1コード核酸が、ヒトPim-1コード核酸、もしくはヒトPim-1コードメッセージ(mRNA)、もしくはヒトPIM-1遺伝子、もしくはヒトPIM-1遺伝子座を含むか、またはヒトPim-1コード核酸、もしくはヒトPim-1コードメッセージ(mRNA)、もしくはヒトPIM-1遺伝子、もしくはヒトPIM-1遺伝子座からなる、(a)または(b)の方法;
(d) 細胞が、ヒト細胞、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit+幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(c)のいずれかの方法;
(e) Pim-1コード核酸を、ex vivoまたはin vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入する、(a)〜(d)のいずれかの方法;
(f) Pim-1コード核酸を、発現構築物または発現ビヒクルに挿入する、(a)〜(e)のいずれかの方法;
(g) 発現構築物または発現ビヒクルが、ベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体を含むか、またはベクター、プラスミド、組換えウイルスもしくは人工染色体からなる、(f)のいずれかの方法;
(h) 発現構築物または発現ビヒクルが、組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターを含むか、または組換えアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、もしくはレンチウイルスベクターからなる、(g)のいずれかの方法;
(i) 発現構築物または発現ビヒクルが、免疫不全ウイルス由来ベクターを含むか、または免疫不全ウイルス由来ベクターからなる、(h)のいずれかの方法;
(j) 免疫不全ウイルス由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターからなる、(i)のいずれかの方法;
(k) ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターを含むか、またはヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)由来ベクターからなる、(j)のいずれかの方法;
(l) Pim-1コード核酸を、野生型(正常)レベルのPIM-1タンパク質を発現しない細胞に挿入する、(a)〜(k)のいずれかの方法;
(m) Pim-1コード核酸を、野生型(正常)レベルのPIM-1タンパク質コードメッセージ(mRNA)を発現しない細胞に挿入する、(l)の方法;
(n) Pim-1コード核酸を、野生型(正常)PIM-1遺伝子またはゲノムPim-1コード核酸を含まない細胞に挿入する、(m)の方法;
(o) Pim-1コード核酸を、ex vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入し、該心臓または血管の細胞、組織もしくは器官を、それが必要な個体に移植する、(a)〜(n)のいずれかの方法;
(p) Pim-1コード核酸を、ex vivoで心臓細胞、心臓もしくは血管の組織または心臓もしくは血管の器官あるいは筋細胞に挿入し、該細胞を、それを必要とする心臓または血管の細胞、組織もしくは器官あるいは心筋(心臓)に移植する、(a)〜(o)のいずれかの方法;
(q) Pim-1コード核酸を、in vivoでそれを必要とする個体の心臓または血管の細胞、組織もしくは器官に挿入する、(a)〜(n)のいずれかの方法;
(r) Pim-1コード核酸を、in vivoで心臓または血管の細胞、組織もしくは器官または心臓細胞もしくは筋細胞または心臓に挿入する、(q)の方法;
(s) 個体が、鬱血性心不全を有するか、または心筋梗塞、もしくは心筋損傷を有していたことがある、(r)の方法;
(t) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄であるか、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄に含まれる、(a)〜(s)のいずれかの方法;
(u) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPIM-1核酸またはPim-1キナーゼ活性を誘導またはアップレギュレートする化合物が、生存および/または増殖シグナル伝達に関与するインターロイキン、サイトカインおよび/またはパラクリン因子;AKTセリン/トレオニンキナーゼのアップレギュレーター;インスリン様成長因子-1(IGF-1);インスリン;白血病抑制因子(LIF);顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF);または表皮成長因子(EGF)を含む、(a)の方法;
(v) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官におけるPim-1活性が、該細胞集団に外因性Pim-1キナーゼを投与することによって増加する、(a)〜(u)のいずれかの方法;
(w) Pim-1活性が、細胞集団を、外因性PIM-1遺伝子を発現するトランスフェクト細胞と接触させることによって増加する、(v)の方法;
(x) 細胞集団が幹細胞を含む、(v)の方法;または
(y) Pim-1キナーゼ活性が、請求項1に記載の医薬化合物、請求項2に記載のリポソーム、もしくは請求項3に記載のナノ粒子またはこれらのいずれかの組み合わせを投与することにより、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において増加および/またはアップレギュレートされる、(a)〜(y)のいずれかの方法
を含む、上記方法。 - 請求項26に記載の医薬化合物、請求項27に記載のリポソーム、もしくは請求項28に記載のナノ粒子、またはこれらの任意の組み合わせをそれを必要とする個体に投与するステップを含む、疾患または症状を治療、予防または改善する方法であって、該疾患または症状の治療、予防および/または改善が、以下:
(a) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官においてPim-1キナーゼ活性を増加またはアップレギュレートさせることによる、細胞、組織および/または器官の低酸素症、低酸素血症または無酸素症の後の、または圧過負荷誘発性肥大もしくは圧過負荷誘発性心不全の後の、または肥大心筋、加齢心筋、不全心筋、虚血心筋、再構築心筋、炎症、感染、慢性的ストレス、疾患、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって損傷を受けた心筋による、心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における細胞アポトーシスおよび/または損傷の改善、治療または予防;
(b) 細胞アポトーシスおよび/もしくは損傷、または低酸素症、低酸素血症もしくは無酸素症が、梗塞、外傷、手術、再移植、移植もしくは毒素によって、または炎症、感染、慢性的ストレス、糖尿病もしくはアルコール依存症、および/または酸化的損傷によって引き起こされる、(a)の方法;
(c) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において細胞脱分化および/または幹細胞マーカーの再発現を誘導するステップ;
(d) 生着したまたは移植された細胞、組織または器官においてPim-1を過剰発現または発現させることにより、該細胞、組織または器官の保持を増強するステップ;
(e) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官において、bcl-2、bcl-XLの発現および/またはBadタンパク質のリン酸化を増加させるステップ;
(f) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官における虚血/再灌流損傷の改善、治療または予防;
(g) 心臓または血管の細胞、組織もしくは器官が、心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄であるか、あるいは心臓細胞(筋細胞)、心臓組織もしくは心臓、または腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、皮膚、粘膜、目、脳、肺、神経、知覚神経、末梢神経、脊髄、血管、内皮、筋肉、平滑筋、骨格筋、心筋または骨もしくは骨髄に含まれる、(a)〜(f)のいずれかの方法;
(h) 幹細胞または多能性細胞の再生能を増強し、および/または増殖を誘導するために、幹細胞または多能性細胞においてPim-1を過剰発現または発現させるステップ;あるいは
(i) 心臓細胞(筋細胞)または心臓組織におけるBcl-XLの発現を増加させて、心臓保護的抗アポトーシスシグナル伝達を誘導し、および/または心筋生存シグナル伝達を増加させるために、心臓細胞(筋細胞)または心臓組織においてPim-1を過剰発現または発現させるステップ;
(j) 細胞が、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、c-kit+幹細胞、ヒト幹細胞、自己または同種幹細胞、胚細胞、組織特異的常在幹細胞、同種または自己細胞、前駆細胞、胎盤および/または臍帯血細胞、Sca-1+細胞、またはCD34+細胞である、(a)〜(i)のいずれかの方法
を含む、上記方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US98875307P | 2007-11-16 | 2007-11-16 | |
US60/988,753 | 2007-11-16 | ||
US9169808P | 2008-08-25 | 2008-08-25 | |
US61/091,698 | 2008-08-25 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010534249A Division JP2011503207A (ja) | 2007-11-16 | 2008-11-14 | 循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015007063A true JP2015007063A (ja) | 2015-01-15 |
JP5795670B2 JP5795670B2 (ja) | 2015-10-14 |
Family
ID=40639186
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010534249A Pending JP2011503207A (ja) | 2007-11-16 | 2008-11-14 | 循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 |
JP2014154915A Expired - Fee Related JP5795670B2 (ja) | 2007-11-16 | 2014-07-30 | 循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010534249A Pending JP2011503207A (ja) | 2007-11-16 | 2008-11-14 | 循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8617534B2 (ja) |
EP (1) | EP2209889B1 (ja) |
JP (2) | JP2011503207A (ja) |
CA (1) | CA2705862C (ja) |
WO (1) | WO2009065080A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2814513B1 (en) * | 2012-02-14 | 2017-12-20 | The Regents of The University of California | Systemic delivery and regulated expression of paracrine genes for cardiovascular diseases and other conditions |
WO2014110574A1 (en) | 2013-01-14 | 2014-07-17 | Incyte Corporation | Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors |
ME03780B (me) | 2013-01-15 | 2021-04-20 | Incyte Holdings Corp | Jedinjenja tiazolkarboksamida i piridinkarboksamida korisna kao inhibitori pim kinaze |
CN105658653A (zh) | 2013-08-23 | 2016-06-08 | 因赛特公司 | 可用作pim激酶抑制剂的呋喃并-和噻吩并-吡啶甲酰胺化合物 |
US9822124B2 (en) | 2014-07-14 | 2017-11-21 | Incyte Corporation | Bicyclic heteroaromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors |
US9580418B2 (en) | 2014-07-14 | 2017-02-28 | Incyte Corporation | Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors |
US9540347B2 (en) | 2015-05-29 | 2017-01-10 | Incyte Corporation | Pyridineamine compounds useful as Pim kinase inhibitors |
AR105967A1 (es) | 2015-09-09 | 2017-11-29 | Incyte Corp | Sales de un inhibidor de pim quinasa |
WO2017059251A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Incyte Corporation | Heterocyclic compounds useful as pim kinase inhibitors |
MX2019015321A (es) | 2017-06-16 | 2020-07-20 | Avery Therapeutics Inc | Composiciones tridimensionales de tejido y métodos de uso. |
US10596161B2 (en) | 2017-12-08 | 2020-03-24 | Incyte Corporation | Low dose combination therapy for treatment of myeloproliferative neoplasms |
CN108913655B (zh) * | 2018-07-16 | 2022-07-15 | 浙江大学 | 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法 |
US20210386827A1 (en) * | 2018-10-15 | 2021-12-16 | Avery Therapeutics, Inc. | Cell-free compositions and methods for restoration or enhancement of tissue function |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004090158A1 (ja) * | 2003-04-03 | 2004-10-21 | Oncorex, Inc. | 医薬品 |
JP2005501802A (ja) * | 2001-01-23 | 2005-01-20 | ボストン サイエンティフィック コーポレイション | 虚血心筋を処置するための限局性心筋注入方法 |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5217879A (en) | 1989-01-12 | 1993-06-08 | Washington University | Infectious Sindbis virus vectors |
US20040132190A1 (en) | 1995-02-28 | 2004-07-08 | The Regents Of The University Of California | Gene therapy for myocardial ischemia |
US5716928A (en) | 1995-06-07 | 1998-02-10 | Avmax, Inc. | Use of essential oils to increase bioavailability of oral pharmaceutical compounds |
US5858401A (en) | 1996-01-22 | 1999-01-12 | Sidmak Laboratories, Inc. | Pharmaceutical composition for cyclosporines |
US6007839A (en) | 1996-02-16 | 1999-12-28 | The Liposome Company, Inc. | Preparation of pharmaceutical compositions containing etherlipid-containing multiple lipid liposomes |
US5869037A (en) * | 1996-06-26 | 1999-02-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Adenoviral-mediated gene transfer to adipocytes |
AU741931B2 (en) * | 1996-09-05 | 2001-12-13 | Collateral Therapeutics, Inc. | Gene therapy for congestive heart failure |
US7198784B2 (en) | 1996-10-17 | 2007-04-03 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Retroviral vectors |
HUP0000421A2 (hu) | 1996-10-17 | 2000-06-28 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Retrovirális vektorok |
US6924123B2 (en) | 1996-10-29 | 2005-08-02 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Lentiviral LTR-deleted vector |
US6630137B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-07 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
NZ500740A (en) | 1997-05-13 | 2001-02-23 | Univ North Carolina | Recombinant lentivirus-based gene transfer vectors comprising 3 vectors from Equine Infectious Anemia Virus (EIAV) |
US6063400A (en) | 1997-07-02 | 2000-05-16 | Sdg, Inc. | Targeted liposomal constructs for diagnostic and therapeutic uses |
ATE298371T1 (de) | 1997-09-24 | 2005-07-15 | Univ California | Nicht-primaten lentivirale vektoren und verpackungssysteme |
EP1042493A1 (en) | 1997-12-22 | 2000-10-11 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Equine infectious anaemia virus (eiav) based retroviral vectors |
US6943153B1 (en) | 1999-03-15 | 2005-09-13 | The Regents Of The University Of California | Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye |
US6867348B1 (en) * | 1999-12-16 | 2005-03-15 | Xenogen Corporation | Methods and compositions for screening for angiogenesis modulating compounds |
US7122181B2 (en) | 2000-12-19 | 2006-10-17 | Research Development Foundation | Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof |
EP2338899A1 (en) * | 2001-01-18 | 2011-06-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptides for activation and inhibition of delta PKC |
US20030003582A1 (en) | 2001-05-08 | 2003-01-02 | Tranzyme, Inc. | Trans-viral vector mediated gene transfer to the retina |
US7732199B2 (en) * | 2001-07-12 | 2010-06-08 | Geron Corporation | Process for making transplantable cardiomyocytes from human embryonic stem cells |
US7671010B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-03-02 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer |
IL161229A0 (en) | 2001-10-02 | 2004-09-27 | Inst Clayton De La Rech | Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications. |
WO2004044142A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Mesenchymal stem cells and methods of use thereof |
EP1642903A4 (en) * | 2003-06-24 | 2007-03-07 | Univ Keio | PEPTIDES WITH APOPTOSIS-INHIBITING EFFECT |
US7135339B2 (en) | 2003-11-20 | 2006-11-14 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses using envelope glycoproteins from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) |
CA2549966A1 (en) | 2003-12-24 | 2005-07-07 | Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. | Drug-containing nanoparticle, process for producing the same and parenterally administered preparation from the nanoparticle |
CN101031287A (zh) | 2004-03-02 | 2007-09-05 | 麻省理工学院 | 纳米细胞药物递送系统 |
WO2006014035A1 (en) | 2004-08-06 | 2006-02-09 | Biospectrum, Inc. | Multiple layered liposome and preparation method thereof |
CN101437938B (zh) * | 2004-11-08 | 2015-05-13 | 约翰霍普金斯大学 | 心脏干细胞 |
CA2609937A1 (en) * | 2005-05-27 | 2006-11-30 | The Hospital For Sick Children | Modulation of the integrin linked kinase signaling pathway to promote cardiac cell proliferation and self-renewal |
CA2616877C (en) | 2005-07-27 | 2014-01-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing liposomes |
US20120128631A1 (en) * | 2009-05-19 | 2012-05-24 | San Diego State University (SDSU) Foundation, dba San Diego State University (SDSU) Research | Compositions and methods for kinase-mediated cytoprotection and enhanced cellular engraftment and persistence |
-
2008
- 2008-11-14 CA CA2705862A patent/CA2705862C/en active Active
- 2008-11-14 WO PCT/US2008/083693 patent/WO2009065080A1/en active Application Filing
- 2008-11-14 US US12/742,871 patent/US8617534B2/en active Active
- 2008-11-14 JP JP2010534249A patent/JP2011503207A/ja active Pending
- 2008-11-14 EP EP08850768.6A patent/EP2209889B1/en active Active
-
2013
- 2013-11-18 US US14/082,760 patent/US20140234265A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-07-30 JP JP2014154915A patent/JP5795670B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-03-23 US US15/078,854 patent/US20160324936A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-08-16 US US16/104,047 patent/US20190060417A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-03-31 US US17/219,749 patent/US20210322522A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005501802A (ja) * | 2001-01-23 | 2005-01-20 | ボストン サイエンティフィック コーポレイション | 虚血心筋を処置するための限局性心筋注入方法 |
WO2004090158A1 (ja) * | 2003-04-03 | 2004-10-21 | Oncorex, Inc. | 医薬品 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014045621; Muraski JA et al.: 'Pim-1 regulates cardiomyocyte survival downstream of Akt' Circulation Vol.114 No.18 Suppl.S, 20061031, pp.294 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210322522A1 (en) | 2021-10-21 |
JP2011503207A (ja) | 2011-01-27 |
CA2705862A1 (en) | 2009-05-22 |
US20140234265A1 (en) | 2014-08-21 |
EP2209889B1 (en) | 2016-07-20 |
US20190060417A1 (en) | 2019-02-28 |
WO2009065080A1 (en) | 2009-05-22 |
US8617534B2 (en) | 2013-12-31 |
EP2209889A1 (en) | 2010-07-28 |
US20100316701A1 (en) | 2010-12-16 |
EP2209889A4 (en) | 2012-09-05 |
US20160324936A1 (en) | 2016-11-10 |
JP5795670B2 (ja) | 2015-10-14 |
CA2705862C (en) | 2018-03-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5795670B2 (ja) | 循環系細胞におけるpim−1活性を操作するための組成物および方法 | |
Dalal et al. | Osteopontin stimulates apoptosis in adult cardiac myocytes via the involvement of CD44 receptors, mitochondrial death pathway, and endoplasmic reticulum stress | |
ES2770073T3 (es) | Uso terapéutico de proteínas morfogenéticas óseas | |
JP2016516423A (ja) | 心筋症を処置するための遺伝子治療ベクター | |
Li et al. | Integrin β1 increases stem cell survival and cardiac function after myocardial infarction | |
Lal et al. | Troponin I-Interacting Protein Kinase–A Novel Cardiac-Specific Kinase, Emerging as a Molecular Target for the Treatment of Cardiac Disease– | |
EP1693451B1 (en) | Method of growing myocardial cells | |
US9550981B2 (en) | Modified tafazzin proteins and methods of making and using the same | |
US20240016769A1 (en) | Method for preparing compound or biological drug enhancing CNPase activity for treating heart diseases | |
JP7193874B2 (ja) | 筋肉Aキナーゼアンカータンパク質(mAKAP)作用の阻害による心臓病の処置 | |
KR102175170B1 (ko) | HBV enhancer 억제인자 ACK1을 포함하는 B형 간염 치료용 조성물 | |
JP4736088B2 (ja) | Cd9遺伝子からなる心疾患を予防又は治療する医薬 | |
US8496928B2 (en) | Method for preventing and treating cardiovascular diseases with BRCA1 | |
EP3689896A1 (en) | Grk2 modulating mirnas | |
WO2015177330A1 (en) | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of heart failure | |
US20070213263A1 (en) | Methods And Compositions Using Adiponectin For Treatment Of Cardiac Disorders And For Stimulation Of Angiogenesis | |
JP6913930B2 (ja) | 扁平上皮癌に対する抗腫瘍剤 | |
Pan et al. | Myofibroblast-specific inhibition of ASPP1 alleviates myocardial fibrosis by enhancing p53 degradation | |
Glembotski et al. | distribute. Destroy after use. | |
Szelid | Cardioselective Nitric Oxide Synthase Gene Transfer to Target Myocardial Ischemia | |
Maharsy | Enhancing Cardiomyocyte Survival in Drug Induced Cardiac Injury |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141028 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150122 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150428 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20150618 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150618 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150721 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150813 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5795670 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |