JP2014534183A - インゲノールを単離する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、単一の工程でジテルペノイドエステル及びインゲノールエステルの混合物からインゲノール（Ｃ２０Ｈ２８Ｏ５）を単離する新規な方法に関する。この方法によって単離されたインゲノールは、インゲノール−３−アンゲラートやインゲノール−３−チグリエートなどの、生物学的に活性なインゲノール誘導体の合成のための前駆体として使用することができる。

Description

本発明は、生物学、薬学、医学の分野に属する。より具体的には、本発明は、ジテルペノイドエステルおよびインゲノールエステルの混合物から、特には前記混合物が植物に由来する、具体的にはトウダイグサ属の種子、より具体的にはホルトソウ種の種子に由来するときに、インゲノールを単離する方法に関する。
インゲノールは、化学合成によって得ることができる化合物であるが、トウダイグサ科の植物、特には下剤活性を有する品種にも、本来存在している［Evans FJ and Kinghorn ADJ. Linn. Soc. Bot. (London) 1977;74:23-35; Evans FJ and Taylor SE. In Progress in the Chemistry of Organic Natural Products; Herz W, Grisebach H, Kirby GW, Eds.; Springer: New York,1983;44:1-99］。具体的にはインゲノール（Ｃ２０Ｈ２８Ｏ５）（ＣＡＳ登録番号３０２２０−４６−３）（式１）は、一般にトウダイグサとして知られるホルトソウ種の植物の種子から単離されてきた。トウダイグサ種子油は、世界中の様々な国で販売され、それは塗料、ワニス、化粧品、潤滑剤、プラスチック、バイオディーゼルなど、多くの製品の組成物中に使用されているので、化学工業のために重要な原料である。
Figure 2014534183
本明細書を通じて、ＭｅはＣＨ３を表す。
近年、その重要な生物学的活性のために、インゲノール化合物及びその誘導体に大きな関心が寄せられている。或る種のインゲノール、特に３’位でエステル化された誘導体は、天然であるか部分的合成によって得られるかにかかわらず、強い抗がんおよび抗ウイルス活性を示す［Ogbourne SM et al. Cancer Res 2004;64:2833-9; Benhadji KA et al. Br J Cancer. 2008;99(11):1808-15; Kedei N et al. Cancer Res. 2004;64(9):3243-55; Warrilow D et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 2006;22(9):854-64; Fujiwara M et al., Antimicrob Agents Chemother. 1996;40(1):271-3］。部分的合成は、インゲノールを含有する植物からのインゲノールの単離、および、目的とする様々な誘導体をもたらす基のそれぞれの場合に、適切な化学反応によるその分子構造における置換として理解される。生物学的活性を示し臨床診療で使用することができる３’位でエステル化された前記誘導体は、好ましくはインゲノール−３−チグリエート（ingenol-3-tigliate）（式ＩＩ）およびインゲノール−３−アンゲラート（式ＩＩＩ）である。
Figure 2014534183
インゲノールは、植物中及び植物抽出物中で、ジテルペノイドエステルとの混合物中のエステルの形態で存在する。しかしながら、インゲノールを単離するための商業的な供給源は、トウダイグサ種子だけであって、インゲノールからは臨床診療において使用されている生物学的に活性なインゲノール誘導体を、様々な化学的方法によって得ることができる。当該種子は、脂肪（４０〜４７％）とタンパク質（１５％）［Duke, J.D. Handbook of Energy Crops http://www.hort.purdue.edu/newcrop)］に加えて、インゲノールモノエステル（Ｌ４、Ｌ５およびＬ６）を少量ながら比較的一定量含むＬ１〜Ｌ９ユーフォルビアファクター（Euphorbia Factors）として知られる一連のジテルペノイドエステル［Adolf W and Hecker EZ. Krebsforsch.1975,84,325-344］を含有する複雑なマトリックスを持ち、インゲノールを含有する画分は他のタイプのジテルペノイドを含む画分に比べて少ない。インゲノールエステルは非常に有毒であり、非常に刺激性の油を構成し、そして、遊離形態に単離されたインゲノールは単独では害にならないものの、前記エステルからのインゲノールの単離は、技術的に複雑であり、また、インゲノールエステル画分の前述の毒性のために、単離操作に従事する運転員の健康へのリスクもある。
ホルトソウの種子からインゲノールを単離する方法が、１９９１年に公開された［Bagavathi R. et al., Naturforsch.1991;46b:1425-1433］。当該方法は、メタノール、石油エーテル、クロロホルム等の溶媒による一連の抽出によってインゲノールエステルを含有する画分を分離することと、その後のシリカゲル中での選択的吸着とからなっていた。インゲノールエステルを含有する画分は、次いで、加水分解され、得られたインゲノールは、最終的にはカラムクロマトグラフィー技術を用いて精製された。インゲノールの当該単離方法は、多くの工程もしくは段階のゆえに多大な時間と作業とを必要とし、従ってその収率は低く、それにより、薬として潜在的に使用可能な新たな半合成誘導体の開発を複雑にしている。
インゲノールを単離するための背景技術において前述した方法の効率および収率が低いという問題を解決するために、アペンディーノら［Appendino G et al.,J Nat Prod.1999; 62(1):76-9］は、インゲノールを抽出および単離するための、より短くて毒性の低い手順を開発した。これは、インゲノールエステルと大環状ジテルペノイド化合物とを含むホルトソウの種子から抽出された刺激性の油と接触する時間が、以前に記載された時間よりも短かったという理由による。当該方法においては、ホルトソウ種子油からのインゲノールの単離は、三つの基本工程で行われた。簡潔に言えば、（１）粗ジテルペノイド画分を分離し、（２）Ｌ１〜Ｌ９ユーフォルビアファクターを加水分解し、および（３）大環状ジテルペノイドエステル（ラチロール（latirol）、エポキシラチロール、７−ヒドロキシラチロール、イソラチロール、ジョルキノール等）の加水分解から得られるポリオールからインゲノールを分離する。両分離には、類似する極性を持つ天然化合物の複雑な混合物から低濃度のインゲノールを精製することが含まれる。これが意味するところは、インノールが含まれる試料の複雑さのため、および前記試料を生成する化合物の極性の類似性のために、前記混合物中に存在する他の物質、主に、加水分解されていないインゲノールエステルもしくは他の大環状ジテルペノイドのエステルによってインゲノールが汚染されているので、不純物を含みうるインゲノールが得られるということである。
本発明によって解決される技術的課題は、ジテルペノイドエステルとインゲノールエステルの混合物からインゲノールを単離する従来技術に記載された方法の代替方法である。これらの混合物は任意の起源を有することができ、すなわち、それらは天然（植物由来）であるか、または化学合成プロセスで生成することができる。本発明は、好ましくは、トウダイグサ属の植物から、より具体的にはホルトソウの種子からインゲノールを分離することである。
インゲノールを単離するための従来技術に存在する課題を解決するために、本発明は、前記単離に必要な工程数を簡素化し、それを単一の工程（任意選択で精製工程を伴う）まで減らし、不純物がより少ない（純度＞９９％）インゲノールを得ることによって、好ましくはホルトソウの種子を処理する際に生産される、ジテルペノイドエステルおよびインゲノールエステルの混合物から、従来知られていた収率よりも高い収率でインゲノールを単離する方法を記述している。
本発明に記載された方法は、ジテルペンエステルとインゲノールエステルとの混合物中に存在するインゲノールを加水分解することと、前記混合物から前記インゲノールを分離することを、単一の工程で組み合わせるものである。そのために、ジテルペノイドエステルとインゲノールエステルとの混合物が、有機溶媒、好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と、酸性化された水、好ましくは酸性化された塩水（水＋塩）と、の溶液で処理される。本発明に記載された方法は、インゲノールエステル画分のような毒性又は刺激性の中間体の単離を防止し、インゲノール精製ための方法および時間を簡素化し、さらに、当該化合物の製造歩留まりを、従来技術において今まで知られているものよりもはるかに高くするものである。さらに不純物濃度がより低いインゲノールが得られ、したがって、このように単離されたインゲノールは、より高い収率および薬として使用可能な純度を有し、その誘導体を得るための方法における出発化合物として好適である。
本発明に記載の方法によって得られたインゲノールは、例えばインゲノール−３−チグリエート（式ＩＩ）およびインゲノール−３−アンゲラート（式ＩＩＩ）などの、生物学的に活性な前記インゲノールのエステル化誘導体を得るために使用することができる。前記生物学的に活性な誘導体を得る方法は、前記目的のための従来技術で知られた技術に従って上述の生物学的に活性な化合物を得るために、インゲノール−５，２０−アセトニド（式ＩＶ）を合成する中間工程と、それに続くそのエステル化を含んでいる（図解１）。
〔図解１〕 本発明に記載の方法に従って得られたインゲノールから従来技術で知られた方法により生物学的に活性なインゲノール誘導体を得る方法。
Figure 2014534183
本発明に記載の方法によってインゲノールから得られた生物学的に活性な誘導体は、９９％を超える純度を示した。本発明に記載の方法によって得られたインゲノールからインゲノール−３−アンゲラートを取得する特定の場合については、その製造歩留りが原料１ｋｇ当たりの歩留まりを著しく向上させ、当該製品を得る従来技術（Hohmann, J. et al., Planta Med.2000,66:291-294）に記載された方法と比べて、はるかに効率的かつ工業的に大規模化可能である。その結果、従来技術で知られているトウダイグサ属チャボタイゲキからのインゲノール−３−アンゲラートの製造歩留まりは、植物１ｋｇ当たり１．１ｍｇであるのに対し、本発明の方法では、トウダイグサ属ホルトソウの種子粉末からのインゲノールの抽出と、それに続くインゲノール−３−アンゲラート誘導体の部分的化学合成プロセスを組み合わせることによって、ホルトソウの種子粉末の１ｋｇあたり最大１９０ｍｇを得ることができる。
本発明の目的は、（インゲノールエステルを含む）ジテルペノイドエステルを含む混合物からインゲノールを単離する方法に関し、この方法は、前記インゲノールの加水分解段階と単離／抽出段階とを単一工程において組み合わせるものであり、任意選択で、単離されたインゲノールを精製する追加の段階をさらに含むものである。インゲノールに関する単離と抽出という用語は、本発明を通して同意義である解釈される。
そのために、本発明の方法は、ジテルペノイドエステルとインゲノールエステルとの混合物を、酸性化された水と有機溶媒との溶液を用いる組み合わされた処理の単一工程に供し、好ましくは、有機溶媒に対する酸性化された水の比は１：１である。
好ましい有機溶媒はＴＨＦであり、酸性化された水はまた、好ましくは無機塩を含み、より好ましくは、酸性化された水は、ＮａＣｌを含む酸性化塩水である。酸性化された水もしくは塩水中に存在するＮａＣｌの濃度は、飽和すなわち約３５重量／体積％までである。本発明の目的のために、酸性塩水という用語は、一つもしくは複数の無機塩、特にはＮａＣｌが、ある具体的な濃度で存在する、酸性化された水を指している。
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用される酸性化された水と有機溶媒との溶液は、濃度２ＮのＨ２ＳＯ４と、３５重量／体積（ｗ／ｖ）％の「Ｈ２Ｏ＋ＮａＣｌ」とが、１：１の比で組み合わされたものである。
任意選択で、本発明の方法は、単離インゲノールを精製する追加の段階をさらに含んでいる。インゲノールの当該精製段階は、好ましくは、重力式カラムクロマトグラフィーによって行われる。
本発明の方法を実施する好ましい様式において、インゲノールを加水分解し且つ単離／抽出する単一の工程は、植物材料から出発して以下の段階を含むプロセスの中で行われる。
ａ）植物材料、好ましくは１００ｇの粉砕および均質化された種子を、好ましくは濃度０．２０Ｎでナトリウムメチラートを含有するメタノール溶液中で、好ましくは室温で４時間、機械的撹拌に付す。
ｂ）前記反応を、氷酢酸または過塩素酸の濃度０．０３Ｍの溶液で中和する。
ｃ）前記溶液を、好ましくはセライト（celite）を通して、濾過または吸引する。
ｄ）前の段階で得られたペレットを７０％メタノールで洗浄する。
ｅ）好ましくはロータベーパー（rotavapor）中で、該ペレットを濃縮する。
ｆ）前記ペレットから、石油エーテルを用いて、インゲノールエステルを含有する画分を抽出する。
ｇ）単一の工程で、酸性化された水およびＴＨＦを用いた、組み合わされた処理によって、前記段階ｆ）で得られた画分に含まれる残りの化合物からインゲノールを単離する。
ｈ）任意選択で、前の段階で単離されたインゲノールを精製する。
本発明の好ましい実施形態において、植物材料は、ホルトソウの種子である。
機械的攪拌は、好ましくは、電気モータによって駆動されるロータによって行われる。本発明の好ましい実施形態では、種子は、前もって粉砕、より好ましくは種子粉末に粉砕した後に、この機械的撹拌に付される。
使用される出発植物材料からインゲノールを単離する方法の別の好ましい実施形態では、酸性化された水の溶液は、好ましくは濃度２ＮのＨ２ＳＯ４と３５重量／体積％の「Ｈ２Ｏ＋ＮａＣｌ」との１：１の比率の組み合わせからなる。
使用される出発植物材料からインゲノールを単離する方法の別の好ましい実施形態では、インゲノールを精製する段階は、好ましくは石油エーテル−酢酸エチルの移動相と、固定相としてシリカゲルカラムを用いる、重力式カラムクロマトグラフィーによって行われる。
繰り返し述べたように、本発明の方法により製造されるインゲノールは、生物学的に活性なその誘導体を得るための、好ましくはインゲノール−３−チグリエート（式ＩＩ）およびインゲノール−３−アンゲラート（式ＩＩＩ）を得るための、前駆体として使用することができ、これらは様々な病態の治療のための臨床診療で使用することができる。前記誘導体ならびに本発明の方法に従って単離されたインゲノール自体は、９９％を超える純度で得られる。
そのために、本発明の好ましい実施形態において、任意選択で精製された単離インゲノールは、それが任意の起源のインゲノールエステルおよびジテルペノイドエステルの混合物から得られようと、あるいは、前記混合物が植物材料源（好ましくはホルトソウの種子）から生成されていようと、そのインゲノールが、インゲノール−３−チグリエート（式ＩＩ）、インゲノール−３−アンゲラート（式ＩＩＩ）またはそれらの混合物から選ばれる３位における誘導体を製造するための、追加の部分的化学合成プロセスに付される。好ましくは、３位におけるインゲノール誘導体を得るための追加の部分的化学合成プロセス（任意選択で精製された単離インゲノールがこのプロセスに付される）は、共通の中間体化合物としてインゲノール−５、２０−アセトニドを有する（式ＩＶ）。
以下の例の目的は、その範囲を限定することなく本発明を説明することである。
〔例１ ホルトソウの種子（トウダイグサ）からインゲノール（式１）を単離する方法〕
ホルトソウの種子粉末（１ｋｇ）を、０．２０Ｎナトリウムメチラートのメタノール溶液２リットル中で、機械的に４時間攪拌した。その後、前記溶液を氷酢酸（または過塩素酸）で中和し、セライト床を通して濾過および／または吸引した。前記濾過で得られたペーストをメタノール（毎回１００ミリリットル）で数回洗浄し、濾過された材料を真空技術を用いて体積１．５リットルに濃縮し、続いて石油エーテルで抽出した。
前記抽出で得られたメタノール相をロータリーエバポレーターで蒸発させ、得られた残渣を、室温で、酸性塩水の溶液（２ＮのＨ２ＳＯ４＋塩水、１：１、０．５リットル）およびＴＨＦ（０．２リットル）に供した。得られた上側相を８０℃で蒸発させ、残渣を、石油エーテル−ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）勾配を用いた重量式シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０ｍｌ）によって、９９％を超える純度でインゲノール（式１）０．７５０ｇを得るまで、精製した。
〔例２ インゲノール−５，２０−アセトニド（式ＩＶ）の製造〕
ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（５０ｍｇ）を、アセトン（５ｍｌ）中に溶解したインゲノール（１００ｍｇ、０．２９ミリモル）溶液に添加した。その溶液を室温で１２時間撹拌し、次いで蒸発に付した。残渣を、インゲノール−５，２０−アセトニド（式ＩＶ）が６２ｍｇ（５５％の収率）に達するまで、重量式カラムクロマトグラフィーにより精製した。物理的および分光データについては、「Bangavathi R. et al. On the Chemistry of Ingenol IV. Z. Naturforsch.1991,46b,1425-1433」を参照されたい。
〔例３ インゲノールチグリエート（式ＩＩ）の製造〕
トルエン（４ｍｌ）中のインゲノール−５，２０−アセトニド（１００ｍｇ、０．２６ミリモル）、チグリン酸（３９ｍｇ、０．３９ミリモル、１．５モル当量）およびＤＭＡＰ（４８ｍｇ、０．３９ミリモル、１．５モル当量）の溶液を室温で２時間撹拌し、次いでセライト床を通して濾過し、蒸発させた。得られた材料をシリカゲル（約５ｇ）で濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲル重力式カラムクロマトグラフィー（５ｇ、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝８５：１５）によって、９９％を超える純度で８０ｍｇを超える量のインゲノール−３−チグリエートを得るまで、精製した。物理的および分光データについては、「Hohmann J et al. Planta Medica 2000,66,291-294」を参照されたい。
〔例４ インゲノールアンゲラート（式ＩＩＩ）の製造〕
トルエン（４ｍｌ）中のインゲノール−５，２０−アセトニド（１００ｍｇ、０．２６ミリモル）、アンゲリカ酸（３９ｍｇ、０．３９ミリモル、１．５モル当量）およびＤＭＡＰ（４８ｍｇ、０．３９ミリモル、１．５モル当量）の溶液を室温で２時間撹拌し、次いでセライト床を通して濾過し、蒸発させた。得られた材料をシリカゲル（約５ｇ）で濾過し、蒸発させた。残渣を、シリカゲル重力式カラムクロマトグラフィー（５ｇ、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝８５：１５）によって、９９％を超える純度で８０ｍｇを超える量のインゲノール−３−アンゲラートを得るまで、精製した。物理的および分光データについては、「Hohmann J et al. Planta Medica 2000,66,291-294」を参照されたい。
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Claims (20)

  1. ジテルペノイドエステルとインゲノールエステルの混合物からインゲノールを単離する方法であって、単一の工程において、インゲノールエステルを加水分解する段階と前記混合物からインゲノールを分離／抽出する段階とを組み合わせる方法。
  2. 前記ジテルペノイドエステルとインゲノールエステルの混合物を、酸性化された水と有機溶媒との溶液による組み合わされた処理の単一の工程に付す、請求項１に記載の方法。
  3. 前記酸性化された水と有機溶媒との比が１：１である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記有機溶媒がテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記酸性化された水が無機塩を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記酸性化された水がＮａＣｌを含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記酸性化された水と有機溶媒の溶液が、２ＮのＨ２ＳＯ４と、３５重量／体積％でＮａＣｌが加えられたＨ２Ｏとの、１：１の比率での組み合わせからなることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記単離インゲノールを精製する追加の段階をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記単離インゲノールを精製する段階が重力式カラムクロマトグラフィーによって行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 任意選択で精製された単離インゲノールが、インゲノール−３−チグリエート、インゲノール−３−アンゲラートまたはそれらの混合物から選ばれる３位における誘導体を製造するための部分的化学合成の追加の工程に供される、請求項８または９に記載の方法。
  11. 任意選択で精製された単離インゲノールが供される、３位におけるインゲノール誘導体を得るための部分的化学合成の追加の工程が、共通の中間体化合物としてインゲノール−５，２０−アセトニドを有する、請求項１０に記載の方法。
  12. 以下の段階を含む、植物材料からインゲノールを単離する方法：
    ａ）植物材料を、ナトリウムメチラートのメタノール溶液中で、機械的撹拌に付し、
    ｂ）前記反応を、氷酢酸または過塩素酸の溶液で中和し、
    ｃ）前記溶液を、濾過または吸引し、
    ｄ）前の段階で得られたペレットをメタノールで洗浄し、
    ｅ）真空技術によって該ペレットを濃縮し、
    ｆ）該ペレットから、石油エーテルで、インゲノールエステルを含有する画分を抽出し、
    ｇ）酸性化された水とＴＨＦで処理することにより、前記段階ｆ）で得られた画分に含まれる残りの化合物からインゲノールを単離し、
    ｈ）任意選択で、単離されたインゲノールを精製する。
  13. 前記植物材料がホルトソウの種子であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記メタノール中のナトリウムメチラートの濃度が０．２０Ｎであり、種子を機械的攪拌に付す時間が４時間である、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記段階ｃ）の濾過または吸引がセライト上で行われることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記酸性化された水の溶液が、好ましくは２ＮのＨ２ＳＯ４と、３５重量／体積％でＮａＣｌが加えられたＨ２Ｏとの、１：１の比での組み合わせからなることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記インゲノールを精製する段階が重力式カラムクロマトグラフィーによって行われることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 石油エーテル−酢酸エチルの移動相とともに、シリカゲルカラムが固定相として使用されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  19. 任意選択で精製された単離インゲノールが、インゲノール−３−チグリエート、インゲノール−３−アンゲラートまたはこれらの混合物から選ばれる３位における誘導体を製造するための、部分的化学合成の追加の工程に供される、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 任意選択で精製された単離インゲノールが供される、３位におけるインゲノール誘導体を得るための部分的化学合成の追加の工程が、共通の中間体化合物としてインゲノール−５，２０−アセトニドを有する、請求項１９に記載の方法。
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