JP2014528472A - 枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有するレチノイン酸受容体の活性化を通じた抗老化用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、枸杞子及び松葉の混合抽出物を有効成分として含有する抗老化用組成物に関する。より詳しくは、天然原料である枸杞子及び松葉の混合抽出物を含有することにより、レチノイン酸有用体の活性化を通じた皮膚抗老化またはシワ改善効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。

Description

本発明は、枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有する抗老化用組成物に関する。より詳しくは、枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有するレチノイン酸受容体の活性化を通じた抗老化用組成物に関する。

人は年齢が高くなるにつれて老化現象が深刻化する。特に、皮膚の場合には、その変化が目立つが、このような皮膚変化の主な現象はシワが増加し、皮膚が厚くなり、弾力がなくなり、乾燥して荒くなり、斑点ができることなどで、長い期間にわたって日光にさらされたことによるものと解釈されている。日光によるこのような影響を光老化といい、日光による表皮と真皮組織の変化に起因する。皮膚の光老化は、トレチノイン（オールトランス型レチノイン酸）、レチノール及びその誘導体、ＡＨＡｓなどを含有するクリームを皮膚に塗る場合に改善されることができると報告されている。しかし、トレチノインは、脂溶性であるため吸収力が低く、生体内で不安定であり、皮膚に刺激的であり、潜伏期間の間に皮膚乾燥、傷、皮膚剥離などの副作用を招く可能性があり、医薬及び化粧品の主原料として使用するには多くの困難がある（ＵＳＰ ４，６７７，１２０）。また、ビタミンＡのレチノールの場合は、光、酸素、熱、脂質過酸化物によって不安定になるという短所があって使用し難く、これに伴ってＢＨＴ、ジ−α−トコフェロール、ＢＨＡ、アスコルビン酸、リノール酸トコフェロールなどの抗酸化剤を使用して安定性に役立つか、外部との遮断のためにリポソームやカプセルのような工法を用いて安定化させるなどの別途費用を投資しなければならないという問題がある（ＵＳＰ ６，２２１，９２７、ＵＳＰ ５，７４４，１４８）。

したがって、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）を活性化させて皮膚老化を予防または改善するとともに、皮膚に対する副作用及び安定性を有する原料についての研究が活発に進められている。本発明は、このような研究の結果として、天然原料である枸杞子と松葉の混合抽出物を皮膚外用剤組成物として使用することにより、優れた皮膚老化防止の効果があることを見出した。現在まで枸杞子と松葉の混合抽出物に対する上記のような効能については研究が行われたことがない。

枸杞子は、クコ（Ｌｙｃｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｍｉｌｌｅｒ）の実で、性状は片方がとがっていた方錐状であり、果皮は赤色または暗い赤色である。外側面はしわしわした形状であり、内側には黄色を帯びた白色の種が入っている。種は平たい楕円形であり、直径は約２ｍｍである。臭いが殆どなく、味は若干甘くて収斂性である。主要薬理効能としては、肝細胞保護作用、血圧強化作用が知られており、この他に免疫機能促進及び調節作用、抗老化作用、抗動脈硬化作用、女性ホルモン類似作用、抗腫瘍作用、造血機能促進作用が知られている。

松葉は、松（Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）の葉と新芽である。新鮮な松葉には、多量のアスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＫ、苦味を出す苦味性物質、フラボノイド、アントシアン、７〜１２％の樹脂（松脂）、５％程度のタニンジル、炭水化物、精油（含量は葉に０．１３〜１．３％、芽の葉（芽）に０．３６％、１年生枝に０．２〜０．９％）などが含有されている。この他に松全体には、アルコール、エステルなど体内の老廃物を排出させて新陳代謝を促進する成分と、フェノール化合物、キニン、テルペンチン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、クロロフィルを主成分とする成分と、グリコゲニン、アピエチン酸もあり、鉄も豊富であり、赤松葉に含有されたアミノ酸は２４種であり、タンパク質で構成されたアミノ酸１９種類も確認された。松葉は、ビタミンＣの原料でありながら、供給源である。松葉は、はるかに濃厚な緑色を抱いていて豊富なカロチンを摂取することができる。松葉の薬理学的価値は、テルペン、フェノール化合物、タンニンなどが有した一般的な効果であるといえ、松葉の栄養学的価値は、各種の栄養素及び無機成分、すなわち、脂肪・タンパク質・炭水化物・ビタミン及び無機質の独特の構成成分であるといえる。松葉には、葉緑素（クロロフィル）、ビタミンＡ、ビタミンＣ、特殊ビタミンＰ、タンパク質、脂肪、リン、鉄、酵素精油など各種ミネラル成分が豊富であって、コレステロールの除去に優れた効能を発揮するものと明らかになり、カルシウム０．００３５５％、カリウム０．０４３％、マレイン酸０．２％、グリシン０．３１９８％、セリン０．３４６７％、ビタミンＰ（ルーチン）０．００３７６％、ビタミンＡ０．００１５％、ビタミンＣ０．１３０１％が含有されている。この他にも高血圧、中風（脳卒中）、糖尿、痴呆及び老化防止、抗がん効果、肝と胃、便秘と貧血、慢性アルコール中毒、及び二日酔い解消、ニコチン除去、皮膚美容と体質改善ダイエット、男性のスタミナ、各種ストレスと過剰の喫煙および飲酒によって頭が重くて目がかすむとき、特に頭をきれいにして勉強する学生や受験生に良い。松葉は、松葉１００ｇ当たり含有成分が水分（４２．９％）、粗タンパク質（０．０７％）、ブドウ糖（３０．６％）、無機質（Ｋ、Ｃａ、Ｆａ、Ｍｇ、Ｐ）、ビタミンなどの天然栄養素をそのまま保存しており、栄養の宝庫である。食品栄養学的な成分及び機能として、葉緑素は造血作用（ヘモグロビン増加）、肉芽組織増生（傷つけられた皮膚の再生）、脳細胞活力、コレステロール減少、組織細胞成長を促進する。

本発明者らは皮膚に副作用がなく且つ安定性を有する天然原料を利用して皮膚に老化防止効果を提供することができる組成物を提供しようと多様な実験を繰り返して行った。その結果、天然原料である枸杞子と松葉の混合抽出物を皮膚外用剤組成物として使用する場合、優れた皮膚老化防止効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有し、抗老化効果に優れた皮膚外用剤組成物を提供することにある。

上記した目的を達成するために、本発明は、枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤組成物を提供する。

本発明に係る組成物は、枸杞子と松葉の抽出物を混合して使用することにより、レチノイン酸受容体を活性化させ、コラゲナーゼ発現を抑制させることにより、シワを改善して抗老化効果を示す。また、これを含有する組成物は、副作用が少なくて安全であり、化粧品または医薬品など多様な分野で活用可能である。

本発明は、枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有する組成物に関する。より詳しくは、本発明は、枸杞子と松葉の混合抽出物を有効成分として含有するレチノイン酸受容体の活性化を通じた抗老化用組成物に関する。

前記枸杞子及び松葉の混合抽出物を製造する方法は、特に制限されず、当業界に知られた通常の方法によって行われる。例えば、枸杞子を洗浄・乾燥して細末化した後、水または有機溶媒を入れて抽出し、その後、濾布で濾過して濾過液を得た。次いで、前記濾過液を熟成させた後、濾紙で濾過し、分液漏斗で抽出して分離した抽出物を減圧濃縮し乾燥して枸杞子抽出物を得ることができる。松葉抽出物も同様の方法で得ることができ、これを混合して混合抽出物を製造する。このとき、枸杞子抽出物と松葉抽出物は同じ割合で混合することが好ましい。

本発明で使用可能な有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート、クロロホルム、またはこれら有機溶媒と水の混合溶媒から選択されてもよく、好ましくは７０％エタノールを使用する。このとき、抽出温度は２５〜３０℃が好ましく、抽出時間は２４〜２６時間が好ましい。前記抽出温度及び抽出時間を外れると、抽出効率が落ちるか又は成分の変化が起こる可能性がある。また、濾過液の熟成温度は４〜１５℃が好ましく、熟成時間は５〜７日が好ましい。前記熟成温度及び熟成時間を外れると、成分に変化が起こる可能性がある。

本発明の組成物に含有された枸杞子及び松葉の混合抽出物の含量は、特に制限されない。具体的に、本発明の枸杞子及び松葉の混合抽出物を構成する枸杞子抽出物は、組成物の総重量に対して４０〜６０重量％の量で含有され、好ましくは４５〜５５重量％であってもよい。このとき、含量が４０重量％未満であれば皮膚抗老化効能が微小であり、６０重量％を超えれば増加した抽出物の量に比べて効果の増加が微小である。また、松葉抽出物は、組成物の総重量に対して４０〜６０重量％の量で含有され、好ましくは４５〜５５重量％であってもよい。このとき、含量が４０重量％未満であれば皮膚抗老化効能が微小であり、６０重量％を超えれば増加した抽出物の量に比べて効果の増加が微小である。

本発明では、枸杞子及び松葉の混合抽出物を有効成分として含有することにより、抗老化効果を提供する。より詳しくは、レチノイン酸受容体を活性化させてコラゲナーゼ発現を抑制させることにより、コラーゲンの生成を促進し、また、人体皮膚の老化によって発生するコラーゲンの減少を緩和させることにより、皮膚老化抑制またはシワ改善効果を提供する。

本発明の組成物は、皮膚外用剤組成物であってもよく、より具体的には、抗老化用組成物またはシワ改善用組成物であってもよい。

本発明に係る皮膚外用剤組成物を化粧料の形態で剤形化する場合には、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、クリーム、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークリーム、またはパックなどの形態で剤形化してもよく、その剤形が特に限定されるものではない。また、本発明に係る組成物は、懸濁液、軟膏、ローションまたはスプレーなどの剤形を有する薬学組成物であってもよい。それぞれの剤形において他の成分は、その他外用剤の種類または使用目的に応じて当業者が困難無く適宜に選定して配合することができる。

以下、下記の実施例及び試験例に基づいて本発明をより具体的に説明する。しかし、これらの実施例及び試験例は本発明を理解するのに役立つためのもので、本発明の範囲がこれらの例に限定されるものではない。

［実施例１］枸杞子抽出物の製造
枸杞子を精製水で洗浄して乾燥させ、次いで、細末化した枸杞子粉２００ｇを７０％エタノール水溶液１リットルに入れて、冷却コンデンサが取り付けられた抽出器で１２時間沸かして抽出した。その後、３００メッシュの濾布で濾過し、前記濾過液を４〜１５℃で７日間放置して熟成させた後、ワットマン濾紙Ｎｏ．２で濾過する。

前記抽出液を３リットル入りの分液漏斗に入れて、ここにエチルアセテート１リットルを加えた後、振ってよく混ぜた。次いで、二層に完全に分離した後、上層（エチルアセテート層）を取り、下層（水層）を再び分液漏斗でさらに２回抽出する。

分離した上層を全部合わせた後、冷却コンデンサが取り付けられた蒸留装置を用いて５０℃で減圧濃縮し、乾燥して乾燥重量３５．８ｇを得る。

［実施例２］松葉抽出物の製造
松葉を精製水で洗浄して乾燥させ、次いで、細末化した松葉粉２００ｇを７０％エタノール水溶液１リットルに入れて、冷却コンデンサが取り付けられた抽出器で１２時間沸かして抽出した。その後、３００メッシュの濾布で濾過し、前記濾過液を４〜１５℃で７日間放置して熟成させた後、ワットマン濾紙Ｎｏ．２で濾過する。

前記抽出液を３リットル入りの分液漏斗に入れて、ここにエチルアセテート１リットルを加えた後、振ってよく混ぜた。次いで、二層に完全に分離した後、上層（エチルアセテート層）を取り、下層（水層）を再び分液漏斗でさらに２回抽出する。

分離した上層を全部合わせた後、冷却コンデンサが取り付けられた蒸留装置を用いて５０℃で減圧濃縮し、乾燥して乾燥重量２４．９ｇを得る。

［試験例１］シワ改善効果
前記実施例１から得た枸杞子抽出物、実施例２から得た松葉抽出物、そして枸杞子１００ｇを実施例１の方法で抽出した枸杞子抽出物と松葉１００ｇを実施例２の方法で抽出した松葉抽出物とを同量で混合して得た抽出物（実施例３）のコラゲナーゼ発現抑制効能（生成阻害能）を測定した。このとき、コラゲナーゼ発現を抑制すると知られているレチノイン酸を陽性対照群にして、下記のように測定した。

まず、２．５％のウシ胎児血清が含有されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉａ）培地が入っている９６−穴のマイクロタイタープレート（９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）に人間の纖維芽細胞を５，０００細胞／穴（ｗｅｌｌ）になるように入れて、９０％程度育つまでに培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、試験物質で無血清ＤＭＥＭ培地に溶かした前記実施例１、実施例２を１００μｇ／ｍｌ濃度としたものと、実施例１と実施例２とをそれぞれ１００μｇ／ｍｌ濃度ずつ混合した混合抽出物（実施例３）と、レチノイン酸とを、それぞれ１μＭで２４時間の間に処理した後、細胞培養液を採取した。

次いで、採取した細胞培養液からコラゲナーゼ測定器具（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ社）を利用してコラゲナーゼ生成の程度を測定した。

まず、コラゲナーゼ１次抗体が均一に塗布された９６−穴のプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に採取された前記細胞培養液を入れて、３時間の間に抗原−抗体反応を恒温槽で実施した。３時間後に発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−穴のプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に入れて、再び１５分間反応させた。１５分後に発色誘発物質を入れて室温で１５分間発色を誘発させ、再び１Ｍの硫酸を入れて反応（発色）を中止させると、反応液の色は黄色を帯びて反応進行の程度によって黄色の程度が異なって表れた。

黄色を帯びる９６−穴のプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の吸光度を、吸光計を利用して４０５ｎｍで測定し、下記の数学式１によってコラゲナーゼの発現程度を計算し、その結果を下記の表１に示した。これは、非処理群のコラゲナーゼ発現程度を１００にして対比したものである。このとき、試験物質を処理していない群から採取された細胞培養液を対照群にした。

［数学式１］
コラゲナーゼ発現程度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：前記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度

その結果、前記表１に示されたように、前記枸杞子と松葉の混合抽出物である実施例３は、枸杞子抽出物の実施例１と松葉抽出物の実施例２とのコラゲナーゼ発現抑制効能よりも２．１倍高く測定された。したがって、枸杞子抽出物と松葉抽出物を単独として使用する場合よりも、混合して使用することによってコラゲナーゼ発現を効果的に抑制することを確認することができた。

［試験例２］レチノイン酸受容体アルファ、ガンマ（ＲＡＲ−α／γ）転写活性効果
前記実施例１から得た枸杞子抽出物、実施例２から得た松葉抽出物、実施例１及び２を混合して得た枸杞子、松葉混合抽出物（実施例３）のレチノイン酸受容体アルファ、ガンマ（ＲＡＲ−α／γ）転写活性効果について、レチノイン酸受容体を活性化すると知られているレチノイン酸を陽性対照群にして下記のように測定した。

まず、サル腎培養細胞（Ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ）の上皮細胞株であるＣＶ−１細胞を４×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに植えた後、１２〜１６時間培養した。トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を施行する前にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、培養液を取り替えた。そして、レポータープラスミド（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）、受容体プラスミド（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ）、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）と運搬体ＤＮＡ（ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ）のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）を合わせて、総０．５μｇに作製した後、ＣＶ−１細胞の各ウェル（ｗｅｌｌ）に加えた。次いで、前記実施例１、実施例２をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ濃度としたものと、実施例１及び実施例２をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ濃度ずつ混合した混合抽出物（実施例３）と、レチノイン酸とを、それぞれ１μＭで２０時間処理した。その後、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えた後、細胞溶解液を製造し、次いで、９６−ウェル発光測定機（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）用の細胞培養板（Ｃｏｓｔａｒ）に移した後、ルシフェラーゼの活性を供給者の推奨によって、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）^TMキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通じて測定した。

ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性測定は、前記細胞溶解液２０ｕｌずつを９６−ウェル分析用板（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５３９１１）に移した後、各ウェルに１００ｕｌずつのＯＮＰＧ（Ｏｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌβ−ｇａｌａｃｔｉ−ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）溶液を添加し、３７℃の培養器で２時間の間に定置した。

その後、各ウェルに５０μｌずつの１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃）溶液を添加し、４１５ｎｍで吸光度を測定した。前記方法で測定したベータガラクトシダーゼの活性によって細胞溶解液で形質転換の効率を補正することで、ルシフェラーゼの相対的活性を測定して各実施例の活性能を比較し、結果を下記の表２に示した。

その結果、前記表２に示されたように、前記枸杞子及び松葉の混合抽出物である実施例３は、枸杞子抽出物の実施例１と松葉抽出物の実施例２とのそれぞれのレチノイン酸受容体アルファ、ガンマ（ＲＡＲ−α／γ）転写活性効果よりも２．６倍、２．４５倍高いレチノイン酸受容体アルファ、ガンマ（ＲＡＲ−α／γ）転写活性効果を示すことを確認することができた。

本発明による組成物は、下記の剤形例のように製造されるが、これに限定されるものではない。

［剤形例１］栄養化粧水
下記の表３に記載された組成によって通常の方法で栄養化粧水を製造することができる。

［剤形例２］栄養ローション
下記の表４に記載された組成によって通常の方法で栄養ローションを製造することができる。

［剤形例３］栄養クリーム
下記の表５に記載された組成によって通常の方法で栄養クリームを製造することができる。

［剤形例４］マッサージクリーム
下記の表６に記載された組成によって通常の方法でマッサージクリームを製造することができる。

［剤形例５］パック
下記の表７に記載された組成によって通常の方法でパックを製造することができる。

［剤形例６］軟膏
下記の表８に記載された組成によって通常の方法で軟膏を製造することができる。

本発明に係る組成物は、枸杞子と松葉の抽出物を混合して使用することにより、レチノイン酸受容体を活性化させ、コラゲナーゼ発現を抑制させることにより、シワを改善して抗老化効果を示す。また、これを含有する組成物は、副作用が少なくて安全であり、化粧品または医薬品など多様な分野で活用可能である。

Claims (10)

1. 枸杞子及び松葉の混合抽出物を有効成分として含有する抗老化用化粧料組成物。
2. 前記混合抽出物のうち枸杞子抽出物は、組成物の総重量に対して４０〜６０重量％で含有される請求項１に記載の抗老化用化粧料組成物。
3. 前記混合抽出物のうち松葉抽出物は、組成物の総重量に対して４０〜６０重量％で含有される請求項１に記載の抗老化用化粧料組成物。
4. 前記組成物は、レチノイン酸受容体を活性化させることを特徴とする請求項１に記載の抗老化用化粧料組成物。
5. 前記組成物は、コラゲナーゼ発現抑制を通じたシワ改善用であることを特徴とする請求項１に記載の抗老化用化粧料組成物。
6. 前記組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、クリーム、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークリーム及びパックからなる群より選ばれたいずれか一つの剤形を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗老化用化粧料組成物。
7. 枸杞子及び松葉の混合抽出物を有効成分として含有する抗老化用薬学組成物。
8. 前記組成物は、レチノイン酸受容体を活性化させることを特徴とする請求項７に記載の抗老化用薬学組成物。
9. 前記組成物は、コラゲナーゼ発現抑制を通じたシワ改善用であることを特徴とする請求項７に記載の抗老化用薬学組成物。
10. 前記組成物は、懸濁液、軟膏、ローション及びスプレーからなる群より選ばれたいずれか一つの剤形を有する請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗老化用薬学組成物。