JP2014527064A - ユビキチン特異的プロテアーゼ７の選択的かつ可逆的な阻害剤 - Google Patents

ユビキチン特異的プロテアーゼ７の選択的かつ可逆的な阻害剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、式(I')のキナゾリン-4-オン化合物、これらの調製方法、およびこれらの使用に関する。これらの化合物は、癌、神経変性疾患、炎症性障害、およびウイルス感染などを治療するための、ユビキチン特異的プロテアーゼ、特にUSP7の選択的かつ可逆的な阻害剤として有用である。

Description

本発明は、ユビキチン特異的プロテアーゼの新たな選択的かつ可逆的な阻害剤の発見、これらの調製方法、およびこれらの治療的使用に関する。
ユビキチン特異的プロテアーゼ(USP)は、脱ユビキチン化酵素(DUB)ファミリーに属する、システインプロテアーゼである。
ユビキチン-プロテアソーム系の制御が解除されると、癌(Hoellerら、Nat Rev Cancer、2006年、6巻(10)、776〜788頁)、神経変性障害(Rubinsztein、Nature、2006年、443巻(7113)、780〜786頁)、およびウイルス疾患(GaoおよびLuo Can、J Physiol Pharmacol、2006年、84巻(1)、5〜14頁)を含めた多くのヒトの疾患の病因に影響がおよぶ。多発性骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫を治療するためのプロテアソーム阻害薬であるVelcade(登録商標)(ボルテゾミブ)が市場で成功したことで、この系は癌を治療するための有効な標的として確立している(Adams、Nat Rev Cancer、2004年、4巻(5)、349〜360頁)。プロテアソーム自体の標的化に対する有望な代替は、上流のユビキチンのコンジュゲーション/脱コンジュゲーション機構を妨害して、より特異的な、毒性の低い抗癌薬を産生することである。
モノユビキチン化およびポリユビキチン化は、ユビキチンのC末端のイソペプチド結合を特異的に切断する脱ユビキチン化酵素によって戻され得る。ユビキチン特異的プロテアーゼ、およびユビキチンC末端加水分解酵素(UCH)は、DUBファミリーのなかで最も特性が明らかにされたメンバーである(Komanderら、Nat. Rev. Mol. Cell Biol.、2009年、10巻(8)、550〜63頁; Nijmanら、Cell、2005年、123巻(5)、773〜786頁)。UCHは小型タンパク質の基質を優先的に切断し、ユビキチンのプロセシングおよび再利用に主に関与すると考えられているが、UCHの具体的な機能は理解不十分のままである。USPはDUBの最大のサブファミリーを構成し、メンバーは60を超える。これらは、ユビキチンを特異的なタンパク質基質から取り除き、したがってこれらのプロテアソームへの標的化、またはこれらの細胞内局在および細胞内活性化を調節するのを妨げる(DavietおよびColland、Biochimie、2008年、90巻(2)、270〜83頁)。USPはプロテアーゼ活性およびヒト疾患のいくつかへの関与に基づき、ユビキチン調節機構を薬理学的に妨害するための潜在的な標的として出現している(Colland、Biochem Soc Trans、2010年、38巻、137〜43頁)。
USP7(ユビキチン特異的プロテアーゼ7)/HAUSP(ヘルペス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ)は、USPファミリーの135kDaタンパク質である。USP7は、ウイルスの溶解性サイクルの開始を刺激する単純ヘルペスウイルスの最初期遺伝子であるICP0(Vmw110)(Everettら、J Virol、73巻、1999年、417〜426頁)、およびEBNA1 (エプスタインバー核抗原-1)(Holowatyら、J Biol Chem、2003年、278巻、29987〜29994頁および47753〜47761頁)などのウイルスタンパク質と相互作用することが示されている。p53、およびp53の主要なE3リガーゼであるMdm2などのヒトタンパク質も、USP7のパートナーおよび基質として同定されている(Cumminsら、Nature、2004年、486、CumminsおよびVogelstein、Cell Cycle、2004年、3巻、689〜692頁; Liら、Mol Cell、2004年、13巻、879〜886頁; Liら、Nature、2002年、416巻、648〜653頁)。より一般的には、USP7は、Mdm2およびp53を含めた種々の標的を脱ユビキチン化することができ、これら後者の標的の正味の脱ユビキチン化が、p53の機能的なレベルを最終的に決定する。最近の報告と一致して、USP7のサイレンシングも、Mdm2の分解を促進することによって、定常状態のp53レベルを増大することが示されている。USP7のp53に対する結合が、USP7の同じ領域に対する結合をp53と競合することによって、胸部腫瘍形成に潜在的に関与するタンパク質であるTSPYL5によって調節されることが最近示された(Eppingら、Nat Cell Biol.、2011年、13巻(1)、102〜8頁)。さらに最近、USP7の上方制御および下方制御の両方とも、構成的に高レベルのp53をもたらすことによって、in vitroで大腸癌細胞の増殖を阻害し、in vivoで腫瘍の成長を阻害することが示されている(Beckerら、Cell Cycle、2008年、7巻(9)、1205〜13頁)。
USP7はまた、Bmi1/Mel18の安定化により、p16INK4a腫瘍抑制因子のレベルを変更する(Maertensら、Embo J.、2010年、29巻、2553〜2565頁)。DNMT1 DNAメチラーゼ、およびクラスピン(Claspin)アダプターなど、ゲノムの完全性/調節に関与するさらなるタンパク質も、USP7によって安定化される(Duら、Science Signaling、2010年、3巻(146):ra80; Faustrupら、J. Cell Biol.、2009年、184巻(1):13〜9頁)。重要なことは、発生および癌に関与する遺伝子をサイレンシングするのに必要とされるエピジェネティックなメチル化の維持に関与するタンパク質であるUSP7およびDNMT1が豊富であると、ヒトの大腸癌に相関することである(Duら、Science Signaling、2010年、3巻(146):ra80)。USP7は、ヒト細胞において、周知の腫瘍抑制遺伝子であるPTENを脱ユビキチン化することも示されており、PTENはその核外輸送、ゆえにその不活性化を誘発する(Songら、Nature、2008年、455巻(7214)、813〜7頁)。より重要なことに、USP7の過剰発現は前立腺癌において初めて報告され、USP7の過剰発現は腫瘍の攻撃性に直接関連していた(Songら、Nature、2008年、455巻(7214)、813〜7頁)。
USP7はまた、ヒト細胞においてFOXO4を脱ユビキチン化し、USP7はその核外輸送、ゆえにその不活性化を誘発することが示されており、結果的に、発癌性のPI3K/PKBシグナル伝達経路が活性化された(van der Horstら、Nat Cell Biol.、2006年、8巻、1064〜1073頁)。最後に、USP7は、DNA損傷および酸化ストレスなど、種々のタイプのストレスに対するp53媒介性の細胞反応において重要な役割を果たしている(Marchenkoら、Embo J.、2007年、26巻、923〜934頁、Meulmeesterら、Mol Cell、2005年、18巻、565〜576頁、van der Horstら、Nat Cell Biol.、2006年、8巻、1064〜1073頁)。
ポリペプチド部分であるP1-Gly-P3-Ser(式中、P1はグルタミン酸残基または非極性側鎖を有するアミノ酸であり、P3はグリシン残基または非極性側鎖を有するアミノ酸である)を含むUSP7タンパク質結合性の合成阻害薬が報告されている(WO2006072048)。
USP7のサイレンシングに関連する表現型、ならびにUSP7と必須のウイルスタンパク質と発癌経路(例えば、p53/Mdm2およびP13K/PKB経路)との間に知られているつながりがあることは、小分子の阻害剤でUSP7を標的化することは癌およびウイルス疾患の治療において有益であり得ることを強力に示唆している(Sipplら、Future Oncology、2011年、7巻、619〜32頁)。USP7に対する阻害剤が、最近報告された(Collandら、Molecular Cancer Therapeutics、2009年、8巻、2286〜95頁、ならびにEP 1 749 822およびPCT/EP2011/050523.2)。
WO2006072048 EP 1 749 822 PCT/EP2011/050523.2 WO2005054249
Hoellerら、Nat Rev Cancer、2006年、6巻(10)、776〜788頁 Rubinsztein、Nature、2006年、443巻(7113)、780〜786頁 GaoおよびLuo Can、J Physiol Pharmacol、2006年、84巻(1)、5〜14頁 Adams、Nat Rev Cancer、2004年、4巻(5)、349〜360頁 Komanderら、Nat. Rev. Mol. Cell Biol.、2009年、10巻(8)、550〜63頁 Nijmanら、Cell、2005年、123巻(5)、773〜786頁 DavietおよびColland、Biochimie、2008年、90巻(2)、270〜83頁 Colland、Biochem Soc Trans、2010年、38巻、137〜43頁 Everettら、J Virol、73巻、1999年、417〜426頁 Holowatyら、J Biol Chem、2003年、278巻、29987〜29994頁および47753〜47761頁 Cumminsら、Nature、2004年、486 CumminsおよびVogelstein、Cell Cycle、2004年、3巻、689〜692頁 Liら、Mol Cell、2004年、13巻、879〜886頁 Liら、Nature、2002年、416巻、648〜653頁 Eppingら、Nat Cell Biol.、2011年、13巻(1)、102〜8頁 Beckerら、Cell Cycle、2008年、7巻(9)、1205〜13頁 Maertensら、Embo J.、2010年、29巻、2553〜2565頁 Duら、Science Signaling、2010年、3巻(146):ra80 Faustrupら、J. Cell Biol.、2009年、184巻(1):13〜9頁 Songら、Nature、2008年、455巻(7214)、813〜7頁 van der Horstら、Nat Cell Biol.、2006年、8巻、1064〜1073頁 Marchenkoら、Embo J.、2007年、26巻、923〜934頁 Meulmeesterら、Mol Cell、2005年、18巻、565〜576頁 Sipplら、Future Oncology、2011年、7巻、619〜32頁 Collandら、Molecular Cancer Therapeutics、2009年、8巻、2286〜95頁 The Handbook of ChemistryおよびPhysics、76版、CRC Press、Inc.、1995〜1996年、2-25から2-26頁 Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、Mack Publishing Company、Easton、PA、2000年 R.C. Larock、Comprehensive Organic Transformations、Wiley-VCH Publishers、1999年 T.W. GreeneおよびP. G. M. Wuts、 in Protective Groups in Organic Chemistry、第4版(2007年)、John Wiley & Sons Inc.、1999年 J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry、Plenum Press、1973年 Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版; Gennaro、A. R.編集; Lippincott WilliamsおよびWilkins: Philadelphia、PA、2000年 J. Amer. Chem. Soc.、1965年、87巻、1353〜1364頁 Organometallics、2002年、21巻、2842頁 Chem. Biol.、2003年、10巻、837〜846頁 Borodovskyら、Chem Biol、2002年、9巻、1149〜1159頁 Hemelaarら、Mol Cell Biol、2004年、24巻、84〜95頁 Ovaaら、Proc Natl Acad Sci U S A、2004年、101巻、2253〜2258頁 Everett RDら、EMBO J.、(1997年) 16巻、1519〜1530頁 Vivat Hannahら、Future Med Chem.、2010年、2巻(1):35〜50頁
しかしながら、現在まで、特異的かつ可逆的なUSP7小分子の阻害剤は報告されていないと思われる。
第1の目的によると、本発明は式(I)
[式中、
R1は、各々同一または異なり、ハロゲン、R、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、NO2、(C1〜C6)アルキレン-OR、(C1〜C6)アルキレン-NRR'、(C1〜C6)アルキレン-CO2R、(C1〜C6)アルキレン-C(O)NRR'、-O-(C1〜C6)アルキレン-CO2R、-O-(C1〜C6)アルキレン-C(O)NRR'、CO2-(C1〜C6)アルキレン-OR、CO2-(C1〜C6)アルキレン-NRR'、C(O)NH-(C1〜C6)アルキレン-OR、C(O)NH-(C1〜C6)アルキレン-NRR'、OCF3、SO2R、SO3H、SO2NRR'、NHSO2R、R10C≡CR11、(R10)(R11)C=C(R11)2、(C1〜C6)アルキレン-C(O)R、NHC(O)R、または少なくとも1つのヘテロ原子、好ましくは、O、N、またはSから選択されるヘテロ原子、好ましくはOによって中断されている(C1〜C6)アルキルからなる群から選択され、
L1は、=O、CN、C(O)R、C(O)OR、もしくはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレン、または直鎖もしくは分枝鎖CH2(C1〜C6)アルキレンであり、後者の(C1〜C6)アルキレンは、ハロゲン、OR、NRR'、またはCF3の1つまたは複数によって場合により置換されており、
Xは、CR2R7、NR2、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環であり、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環は、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'の1つまたは複数のまたは複数によって場合により置換されており、
R2は、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、R5=直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキレンと一緒に連結して、-X-(CR3R4)n-N-(それらはこれに結合している)と一緒に、複素環、好ましくはOR、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、または=Oの1つまたは複数によって場合により置換されている5員から7員を有する複素環を形成し、
R5は、H、および直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキレンから選択され、
R3、R4は、各々同一または異なり、H、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、または=Oからなる群において選択され、
qは、0、1、2、3、または4であり、
nは、0、1、2、または3であり、
R7は、OR、H、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、CN、OR9、NRR'、またはSRであり、
iは、0または1のいずれかであり、
Aは、
直鎖もしくは分枝鎖-[C1〜C6(アルキル)]0〜1-C(O)-
直鎖もしくは分枝鎖-[C1〜C6(アルキル)]0〜1-C(O)NH-
直鎖もしくは分枝鎖-[C1〜C6(アルキル)]0〜1SO2-、または
直鎖もしくは分枝鎖-[C1〜C6(アルキル)]0〜1SO2N-からなる群から選択され、
L2は、O、NR、またはSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子によって場合により中断されており、および/またはR、OR、NRR'、(C1〜C6)アルキル-OR、(C1〜C6)アルキル-NRR'、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR'、CN、C(=NH)NHORによって場合により置換されている、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレン-O、または直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、
R6は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、複素環、Hからなる群から選択され、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環は、単環式または多環式であり、かつ直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、OR、=O、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、直鎖もしくは分枝鎖(C2〜C6)アルケニレン、またはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されており、
R9は、-C(O)R、-C(O)NHR、-C(O)OR、-C(O)CH2-NRR'、-C(O)-CH2-CH2-CO2R、-C(O)-CH2-SO3H、-C(O)-(C5H4N)、-PO3H2、またはこれらのイオン化型からなる群から選択され、
R10は、独立に、同一または異なり、結合、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキルから選択され、
R11は、独立に、同一または異なり、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、またはアリールから選択され、アルキルまたはアリールはOH、NH2、C(O)OH、またはC(O)NH2によって場合により置換されており、
各RおよびR'は、同一または異なり、独立に、H、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、シクロアルキル、アリール、芳香族または非芳香族複素環、直鎖もしくは分枝鎖-(C1〜C6)アルキル-アリール、または直鎖もしくは分枝鎖-(C1〜C6)アルキル-複素環から選択され、ここで複素環は、芳香族または非芳香族であり;OH、CO2H、C(O)NH2、NH2によって場合により置換され、または置換されていない]
の化合物もしくはこれらの薬学的に許容される塩、またはこれらの光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、もしくは互変異性体に関する。
本発明の式(I)は、あらゆる以下の実施形態、またはあらゆるこれらの組合せに関する。
図1は、HEK293プロテオームを用いた、実験例2および実験例5に対する(12.5-25-50-100-200μM)競合的なHAUbVSゲルを示す図である。 図2は、HEK293プロテオームを用いた、USP7およびさらなる脱ユビキチン化酵素(USP8、USP5、USP10、CYLD、UCH-L3)に対する、実験例2および実験例5の活性を比べる競合的なHAUbVSゲルを示す図である。 図3は、USP7および実験例2での時間依存性実験を示す図である。 図4は、実験例2および実験例3の存在下、USP7でのゲル濾過実験後に得られた可逆性の結果を示す図である。 図5は、実験例2および実験例3の存在下、USP7の迅速かつ大規模な希釈後に得られた可逆性の結果を示す図である。 図6は、自然条件下ESI-MSによって評価した、USP7および実験例1および実験例2を含む複合体のキャラクタリゼーションを表す図である。
好ましくは、式(I)の化合物において、R1は、各々同一または異なり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、NO2、(C1〜C6)アルキレン-OR、(C1〜C6)アルキレン-NRR'、(C1〜C6)アルキレン-CO2R、(C1〜C6)アルキレン-C(O)NRR'、-O-(C1〜C6)アルキレン-CO2R、-O-(C1〜C6)アルキレン-C(O)NRR'、CO2-(C1〜C6)アルキレン-OR、CO2-(C1〜C6)アルキレン-NRR'、C(O)NH-(C1〜C6)アルキレン-OR、C(O)NH-(C1〜C6)アルキレン-NRR'、またはNHC(O)Rからなる群から選択される。
好ましくは、式(I)の化合物において、L1は、=O、CN、C(O)R、C(O)OR、もしくはC(O)NRR'、の1つまたは複数によって場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレン、または直鎖もしくは分枝鎖CH2(C1〜C6)アルキレンであり、後者の(C1〜C6)アルキレンは、ハロゲン、OR、NRR'、またはCF3の1つまたは複数によって場合により置換されている。
好ましくは、式(I)の化合物において、R2は、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、R5=直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレンと一緒に連結して、-X-(CR3R4)n-N-(それらはこれに結合している)と一緒に、OR、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、または=Oの1つまたは複数によって場合により置換されている5員または6員の複素環を形成する。
好ましくは、式(I)の化合物において、R7は、OR、OR9、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、またはCNである。より好ましくは、R7は、OR、OR9である。より好ましくは、R7は、OHまたはOR9、好ましくはOHである。
R6は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、複素環、Hからなる群から選択され、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環は、単環式または多環式であり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、またはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されている。
好ましくは、式(I)の化合物において、Aは、
-C(O)-、
-C(O)NH-、
-SO2-、または
-SO2N-からなる群から選択される。
好ましくは、式(I)の化合物において、L2は、O、NR、もしくはSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子によって場合により中断されており、および/またはR、OR、NRR'、(C1〜C6)アルキル-OR、(C1〜C6)アルキル-NRR'、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR'、CN、C(=NH)NHORによって場合により置換されている、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレンである。
好ましくは、L2はO-(C1〜C6)アルキレンを表さないことを理解されたい。
好ましくは、式(I)の化合物において、
-NR5は、C(O)、C(O)N、SO2、もしくはSO2N基の少なくとも1つに直接結合しており、および/または、
-i=0、nは1、2、もしくは3であり、NR5に連結しているCR3R4はC(O)であり;またはi=1、Aは、-C(O)-、C(O)NH、SO2、もしくはSO2Nであり、および/または
-i=0、nは1、2、もしくは3であり、NR5に連結しているCR3R4はC(O)であり;またはi=1、Aは、-C(O)-、C(O)NH、SO2、もしくはSO2Nであり、XはCR2R7もしくはNR2であり、R2およびR5は、同一もしくは異なり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、-X-(CR3R4)n-N-(それらはこれに結合している)と一緒に、OR、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されている5員から7員の複素環を形成し、R3、R4は、各々同一または異なり、H、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'からなる群において選択され、および/または
-i=1であり、Aは、-C(O)-であり、Xは、CR2R7またはNR2であり、R2およびR5は、同一または異なり、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、-X-(CR3R4)n-N-(それらはこれに結合している)と一緒に、OR、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されている5員から7員の複素環を形成し、R3、R4は、各々同一または異なり、H、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'からなる群において選択され、および/または
-R1は、各々同一または異なり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、またはNHC(O)Rからなる群から選択され、および/または
-R1は、各々同一または異なり、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)、ハロゲン、OH、または直鎖もしくは分枝鎖-O-(C1〜C6)アルキルからなる群から選択され、および/または
-R1は、各々同一または異なり、ハロゲン、または直鎖もしくは分枝鎖-O-(C1〜C6)アルキルからなる群から選択され、および/または
-qは、0、1、または2であり、および/または
-XはCR2R7またはNR2であり、R2およびR5は、同一または異なり、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、-X-(CR3R4)n-N-(それらはこれに結合している)と一緒に、OR、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されている5員から7員の複素環を形成する。好ましくは、-XR2-(CR3R4)n-NR5-によって形成される複素環は非芳香族複素環であり、および/または
-R3、R4は、各々同一または異なり、H、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、=O、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'からなる群において選択され、および/または
-R3、R4は、各々同一または異なり、H、-O-(C1〜C6)アルキル、OH、および=Oからなる群において選択される。好ましくは、R3、R4は、各々同一または異なり、HおよびOHからなる群において選択され、および/または
-Xは、CR2R7、またはアリールであり、R7はOR、OR9、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、ハロゲン、C(O)OH、NRR'、C(O)NH2、またはSRである。好ましくは、XはCR2R7またはアリールであり、R7はOR、OR9、NRR'、またはSRである。より好ましくは、R7はOHまたはOR9、好ましくはOHである。R9は上記に規定した通りであり、および/または
-Xはアリール、好ましくはフェニルであり、および/または
-L1は、1つまたは複数の=Oによって場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキレン)であり、または直鎖もしくは分枝鎖CH2-C1〜C6(アルキレン)であり、後者のアルキレンは、1つまたは複数の-OHによって場合により置換されており、および/または
-L2は、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキレン)-O、またはOもしくはSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子によって場合により中断されており、および/またはR、OR、NRR'、(C1〜C6)アルキル-OR、(C1〜C6)アルキル-NRR'、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR'、CN、C(=NH)NHORの1つもしくは複数によって場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキレン)である。より好ましくは、L2は、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキレン)、または直鎖もしくは分枝鎖-[C1〜C6(アルキレン)]-O-であり、および/または
-R6は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはHからなる群から選択され、アリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルは、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖O-(C1〜C6)アルキルによって場合により置換されており、および/または
-R6は、フェニル、チオフェニル、シクロペンチル、およびHからなる群から選択され、フェニルは、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖O-(C1〜C6)アルキルによって場合により置換されている。
一実施形態において、式(I)の化合物において、XはCR2R7またはNR2であり、R2およびR5は、-X-(CR3R4)n-N-(それらはこれに結合している)と一緒に、1つまたは複数のOHによって場合により置換されている5員から7員の複素環を形成する。好ましくは、この特定の実施形態において、nは、0、1、もしくは2であり、および/またはXはCR2R7であり、R7は、OR、OR9、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、ハロゲン、C(O)OH、C(O)NH2、NRR'、もしくはSRであり、および/またはL1は(CH2)kであり、kは1もしくは2であり、好ましくはkは1、-C(O)-、-CH2-CH(OH)-、もしくは-CH2-C(O)-である。好ましくは、R7は、OR、OR9、NRR'、またはSRである。より好ましくは、R7はOHまたはOR9であり、好ましくはOHである。R9は上記に規定した通りである。
別の一実施形態において、式(I)の化合物において、Xは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環であり、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環は、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されており、好ましくは、Xはアリールであり、R5はH、または直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)、好ましくはHである。好ましくは、この特定の実施形態において、nは0であり、および/またはXはアリールであり、および/またはL1は-CH2-CH(OH)-である。
特定の一実施形態によると、本発明の化合物は以下の式(Ia)
[式中、
R1、q、L1、L2、R6、およびR7は、式(I)において規定した通りであり、
X'はCR7またはNであり、
nは0、1、または2であり、
pは1、2、または3であり、
R3、R4およびR8は、各々同一もしくは異なり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OH、-O-(C1〜C6)アルキル、NRR'、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'からなる群において選択される]
であってよい。
好ましくは、式(Ia)の化合物において、R3、R4、およびR8は、各々同一もしくは異なり、HもしくはOHからなる群において選択され、かつ/またはpは1もしくは2であるのが好ましい。
好ましくは、式(Ia)の化合物において、
は、
であり、
tは、0、1、または2、好ましくは、
[式中、R7は、OR、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、CN、OR9、NRR'、またはSR、より好ましくはOR、OR9、NRR'、またはSRであり、好ましくはOHまたはOR9であり、pは1または2であり、R8はHまたはOHからなる群において選択される]
である。
特定の一実施形態によると、本発明の化合物は以下の式(Ia)
[式中、
R1、q、L1、L2、R6、およびR7は、式(1)において規定した通りであり、
X'は、CR7またはNであり、
nは、0、1、または2であり、
pは、1、2、または3であり、
R3、R4、R8、およびR8'は、各々同一または異なり、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OH、-O-(C1〜C6)アルキル、NRR'、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'からなる群において選択される]
であってよい。
好ましくは、式(Ia)の化合物において、R3、R4、R8、およびR8'は、各々同一もしくは異なり、HもしくはOHからなる群において選択され、および/またはpは1もしくは2である。
好ましくは、式(Ia)の化合物において、
は、
であり、
tは、0、1、または2、好ましくは
[式中、R7は、OR、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、CN、OR9、NRR'、またはSRであり、より好ましくはOR、OR9、NRR'、またはSRであり、好ましくはOHまたはOR9であり、pは1または2であり、R8は、HまたはOHからなる群において選択される]
である。
特定の一実施形態によると、本発明の化合物は、以下の式(Ib)
[式中、
R1、q、L2、およびR6は、式(I)の化合物に対して規定した通りであり、
Xは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環であり、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環は、1つまたは複数の、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)、ハロゲン、OH、直鎖もしくは分枝鎖-O-(C1〜C6)アルキル、NRR'、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'によって場合により置換されており、
R5は、H、または直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキルであり、
L1は、1つまたは複数のOHによって置換されている直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキルである]
であってよい。
式(Ib)の化合物において、Xがフェニルであるのが好ましい。
式(Ib)の化合物において、R5がHであるのが好ましい。
特定の一実施形態によると、本発明の化合物は以下の式(I')
[式中、
R1、q、L1、A、L2、R、R'、およびR6は式(I)において規定した通りであり、
X'はCR7であり、
R7は、OR、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、CN、OR9、NRR'、またはSRであり、より好ましくはOR、OR9、NRR'、またはSRであり、
R9は、式(I)において規定した通りであり、
nは、0、1、または2であり、
pは、1、2、または3であり、
R3、R4、R8、およびR8'は、各々同一または異なり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OH、-O-(C1〜C6)アルキル、NRR'、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'からなる群において選択される]
であってよい。
好ましくは、式(I)の化合物において、Aは、
-C(O)-、
-C(O)NH-、
-SO2-、または
-SO2N-からなる群から選択される。
好ましくは、式(I')の化合物において、R3、R4、R8、およびR8'は、各々同一もしくは異なり、HもしくはOHからなる群において選択され、および/またはpは1または2である。
好ましくは、式(I')の化合物において、R7は、OR、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、CN、より好ましくはOHである。
好ましくは、式(I')の化合物において、R7は、OR、OR9、NRR'、またはSRであり、より好ましくは、R7は、OR、OR9であり、好ましくは、OHまたはOR9、例えばOHである。
好ましくは、式(I)の化合物において、p+n=4であり、より好ましくは、pは2であり、nは2である。
好ましくは、式(I)の化合物において、
は、
である。
好ましくは、式(I')の化合物において、L1はCH2である。
好ましくは、式(I')の化合物において、pは2であり、nは2であり、R7は、OR、OR9、NRR'、またはSRであり、より好ましくは、R7は、OR、OR9であり、好ましくはOHまたはOR9であり、例えばOHである。
好ましくは、式(I')において、pは2であり、nは2であり、L1はCH2である。
好ましくは、式(I')の化合物において、L1はCH2であり、R7はOR、OR9、NRR'、またはSRであり、より好ましくは、R7は、OR、OR9であり、好ましくは、OH、またはOR9であり、例えばOHである。
好ましくは、式(I')の化合物において、pは2であり、nは2であり、L1はCH2であり、R7は、OR、OR9、NRR'、またはSRであり、より好ましくは、R7は、OR、OR9であり、好ましくはOHまたはOR9であり、例えばOHである。
特定の一実施形態によると、式(I')の化合物において、AはC=Oであり、したがって化合物は以下の式(Ia')
[式中、R1、q、L1、n、p、X'、R3、R4、R8、R8'、L2、R6、およびR7は、式(I')において規定した通りである]
である。
好ましくは、式(Ia')の化合物において、
は、
である。
特定の一実施形態によると、本発明は、上記に規定した式(I)の化合物に関し、以下の化合物を例外とする:
-qは0であり、L1はCH2であり、X-(CR3R4)n-NR5はピペリジンを形成し、XはCR2R7であり、R7はOHであり、iは1であり、AはC=OでありL2はC2H4であり、R6は、
であり、
-qは1であり、R1は7位ではClであり、L1はCH2であり、X-(CR3R4)n-NR5はピペリジンを形成し、XはCR2R7であり、R7はOHであり、iは1であり、AはC=Oであり、L2R6はCH(CH2CH3)2である。
特定の一実施形態によると、式(I)の化合物は、
3-({4-ヒドロキシ-1-[3-(2-メトキシフェニル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
7-クロロ-3-{[1-(2-エチルブタノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-({1-[2-(3-フルオロフェノキシ)アセチル]-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-{[4-ヒドロキシ-1-(2-メチルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-6,7-ジメトキシ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-{[4-ヒドロキシ-1-(2-メチルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
7-クロロ-3-{[1-(3-シクロペンチルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-{[1-(3-シクロペンチルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
7-クロロ-3-{[4-ヒドロキシ-1-(3-フェニルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-{[4-ヒドロキシ-1-(3-フェニルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
7-クロロ-3-({4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-({4-ヒドロキシ-1-[3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-{[1-(2-ベンジルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
3-{[1-(2-ベンジルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-7-クロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン、
もしくはこれらの薬学的に許容される塩、またはこれらの光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、もしくは互変異性体から選択される。
本明細書上記または本発明以降において用いられる:
「アルキル」は、鎖中に炭素原子1個から6個を有する直鎖または分枝であり得る脂肪族炭化水素基を意味する。「分枝」は、メチル、エチル、またはプロピルなどの1つまたは複数の低級アルキル基がアルキル直鎖に結合していることを意味する。例示のアルキル基には、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、3-ペンチルが含まれる。
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、水素原子1個を除去することによって形成される炭素原子3個から10個の非芳香族単環式または多環式の炭化水素環を意味する。「C5〜C7シクロアルキル」などの呼称は、炭素原子5個から7個までを含むシクロアルキル基を意味する。例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチルなど、およびこれらの縮合によって、またはフェニル基との縮合によって形成される系が含まれる。
「アルケン」またはアルケニルは、炭素-炭素二重結合を含み、鎖中に炭素原子2個から6個を有する直鎖または分枝であってよい、脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は、鎖中に炭素原子2個から6個、より好ましくは鎖中に炭素原子約2個から4個を有する。例示のアルケニル基には、エテニル、プロペニル、n-ブテニル、i-ブテニル、3-メチルブタ-2-エニル、n-ペンテニルが含まれる。
「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味し、好ましくは、フッ素および塩素原子を意味する。
「アリール」は、置換されている、またはされていない、炭素原子6個から14個、好ましくは6個から10個の、芳香族単環式または多環式炭化水素環系を意味する。例示のアリール基には、フェニルまたはナフチルが含まれる。
本明細書で用いられる用語「複素環」または「複素環の」は、飽和の、部分的に不飽和の、または不飽和の、非芳香族の安定な3員から14員の、好ましくは、5員から10員の、単環式、二環式、または多環式の環を意味し、環の少なくとも1つのメンバーは、置換されている、またはされていない、ヘテロ原子である。典型的に、ヘテロ原子には、それらに限定されないが、酸素、窒素、イオウ、セレン、およびリンの原子が含まれる。好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素、およびイオウである。
適切な複素環は、その開示が参照によって本明細書に援用される、The Handbook of ChemistryおよびPhysics、76版、CRC Press、Inc.、1995〜1996年、2-25から2-26頁にも開示されている。芳香族複素環の例にはチオフェニルがある。
好ましい非芳香族複素環には、それらに限定されないが、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロ-ピラニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ピラニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピラゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ジヒドロ-ピラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリニジニル、ジヒドロチオピラニル、アゼパニル、および各々置換されており、またはされていない、フェニル基との縮合に起因する縮合系が含まれる。
本明細書で用いられる用語「ヘテロアリール」または芳香族複素環は、5員から14員の、好ましくは5員から10員の芳香族複素環、単環式、二環式、または多環式の環を意味する。例として、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、1,2,4-チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル-N-オキシド、およびフェニル基との縮合に起因する縮合系が含まれる。
「アルキル」、「シクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「複素環」などはまた、水素原子2個を除去することによって形成される、対応する「アルキレン」、「シクロアルキレン」、「アリーレン」、「ヘテロアリーレン」、「ヘテロシクレン」などを意味する。アルキルおよびアルキレンは、本明細書において互換的に用いられる。
本明細書で用いられる用語「患者」は、本明細書に記載する1つまたは複数の疾患および状態に罹患している、または罹患する可能性のある、繁殖、集団、もしくは保存目的に役立つ動物などの動物、または好ましくはヒトもしくはヒトの子供のいずれかを意味する。
本明細書で用いられる「治療有効量」は、本明細書に記載する疾患および状態の症状を予防し、低減し、排除し、処置し、またはコントロールする上で有効である本発明の化合物の量を意味する。用語「コントロールする」は、本明細書に記載する疾患および状態の進行が遅延、中断、抑止、または停止し得る全てのプロセスを意味するものと意図されるが、全ての疾患および状態の症状を完全に排除することを必ずしも意味するものではなく、予防的治療も含むものと意図される。
本明細書で用いられる表現「薬学的に許容される」は、健全な医薬の判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または合理的な損益比に見合った他の問題の合併症なく、ヒトおよび動物の組織との接触に適する化合物、材料、添加剤、組成物、または剤形を意味する。
本明細書で用いられる「薬学的に許容される塩」は、開示する化合物の誘導体を意味し、それの酸または塩基の塩を作ることによって親化合物は改変される。薬学的に許容される塩には、形成された親化合物の、例えば、非毒性の無機酸または有機酸からの、慣例的な非毒性の塩または四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような慣例的な非毒性の塩には、それの一塩、二塩、または三塩を含めた、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機の酸に由来するもの、および、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルコロニック(glucoronic)酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸などの有機酸から調製される塩が含まれる。さらなる付加塩には、例えば、トロメタミン、メグルミン、エポラミンなどのアンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、またはマグネシウムなどの金属塩が含まれる。
本発明の薬学的に許容される塩は、慣例的な化学的方法によって、塩基性部分または酸性部分を含んでいる親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基の形態を、水中、または有機溶媒中、または二者の混合液中、化学量論量の好適な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、その開示が参照によって本明細書に援用される、Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、Mack Publishing Company、Easton、PA、2000年に見られる。
幾何異性体および立体異性体を有する一般式(I)の化合物も本発明の一部である。
さらなる一目的によると、本発明は、式(I)の化合物の調製方法にも関する。
本発明の化合物および方法は、当業者には周知の数々の方法で調製することができる。化合物は、例えば、以下に記載する方法の、または当業者には理解されるその変形の、応用または適用によって合成することができる。好適な改変および置換は、当業者には容易に明らかであり、よく知られており、または科学文献より容易に入手できる。
特に、このような方法は、R.C. Larock、Comprehensive Organic Transformations、Wiley-VCH Publishers、1999年において見出すことができる。
本発明の化合物は、1つまたは複数の非対称的に置換されている炭素原子を含むことができ、光学活性体またはラセミ体において単離することができることが理解されよう。このように、特定の立体化学または異性体が特に指摘されなければ、ある構造のキラル体、ジアステレオマー、ラセミ体、異性体全てが意図される。当技術分野において、このような光学活性体を調製し、単離する方法は周知である。例えば、立体異性体の混合物は、それらに限定されないが、ラセミ体の分割、通常の、逆相の、およびキラルのクロマトグラフィー、優先的な塩の形成、再結晶などの標準的な技術によって、またはキラルの出発材料から、もしくは標的のキラル中心の計画的な合成によってのいずれかのキラル合成によって、分離することができる。
本発明の化合物は、種々の合成経路によって調製することができる。試薬および出発材料は市販されており、または当業者には周知の技術によって容易に合成される。全ての置換基は、別段の指摘がなければ、先に規定した通りである。
本明細書以下に記載する反応において、ヒドロキシル基、アミノ基、イミノ基、チオ基、またはカルボキシ基などの反応性の官能基が、最終生成物において、反応における不必要な関与を避けることが望まれる場合、これらを保護する必要があり得る。慣例的な保護基を標準的技法にしたがって用いることができ、例えば、T.W. GreeneおよびP. G. M. Wuts、 in Protective Groups in Organic Chemistry、第4版(2007年)、John Wiley & Sons Inc.、1999年; J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry、Plenum Press、1973年を参照されたい。
いくつかの反応は、塩基の存在下で行われ得る。この反応において用いられる塩基の性質に対して特定の制限はなく、分子の他の部分に対して有害作用がなければ、このタイプの反応において慣例的に用いられるあらゆる塩基を、ここで等しく用いることができる。適切な塩基の例には、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、アルカリ金属水素化物、例えば、水素化ナトリウムおよび水素化カリウム、アルキルリチウム化合物、例えば、メチルリチウムおよびブチルリチウム、ならびにアルカリ金属アルコキシド、例えば、ナトリウムメトキシド、およびナトリウムエトキシドが含まれる。
通常、反応は、適切な溶媒中で行われる。関与する反応または試薬に対して有害作用がなければ、種々の溶媒を用いることができる。適切な溶媒の例には、炭化水素(芳香族、脂肪族、または環状脂肪族の炭化水素であってよい)、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、およびキシレン;アミド、例えば、ジメチルホルムアミド;アルコール、例えば、エタノールおよびメタノール、ならびにエーテル、例えば、ジエチルエーテルおよびテトラヒドロフランが含まれる。
反応は、広範囲の温度にわたっておこり得る。一般的に、0℃から150℃まで(より好ましくは、およそ室温から100℃まで)の温度で反応を行うのが好都合であることが見出されている。反応に必要とされる時間も、多くの要因、とりわけ反応温度および試薬の性質に応じて、やはり広範囲であり得る。しかし、上記に概略した好ましい条件下で反応が行われるのであれば、3時間から20時間までの時間が通常、十分である。
このように調製された化合物は、慣例的な手段によって、反応混合物から回収され得る。例えば、反応混合物から溶媒を留去することによって、または、必要であれば、反応混合物から溶媒を留去した後、残渣を水中に注ぎ、その後水不混和性の有機溶媒で抽出し、抽出物から溶媒を留去することによって、化合物を回収することができる。さらに、生成物を、所望により、再結晶、再沈殿、または種々のクロマトグラフィー技術、とりわけカラムクロマトグラフィーまたは分取薄層クロマトグラフィーなどの、種々の周知技術によってさらに精製することができる。
本発明の式(I)の化合物の調製方法は、本発明のさらなる一目的である。
第一の態様によると、式(I)の本発明の化合物は、二級もしくは三級アミン、カルボキサミド、尿素、スルホンアミド、またはチオ尿素、
を形成させるために、式(II)の化合物と式(III)の化合物
[式中、R1、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、A、q、n、およびiは、式(I)に対して上記に規定した通りであり、Yは脱離基である]
とを反応させることによって得ることができる。
脱離基は、化合物(II)および(III)の反応性官能基が、式(I)における-NR5-(A)i-基をもたらすような基である。脱離基Yは、ハロゲン、OH、R-S(O)2O-基などの活性化OHから選択されるのが好ましく、Rは、アリール、または直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)である。R-S(O)2O-は、Ts-またはMs-基であるのが好ましく、Tsは
であり、Msは
である。
より具体的には、化合物(I)において-NR5-(A)i-からなる基が:
二級または三級アミンである場合:Yは、ハロゲン、OH、活性化OH、例えばR-S(O)2O-基から選択される脱離基であり、Rは、アリール、または直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)である。好ましくは、R-S(O)2O-は、Ts-またはMs-基であり、Tsは、
であり、Msは、
であり、i=0である。一般的に、これらの反応はアルキル化、光延反応であり、当技術分野では周知の方法にしたがって行われ、あるいは
カルボキサミドである場合:YおよびAは酸塩化物またはカルボン酸を形成する。一般的に、YがOHである場合、iは1であり、AはC(O)であり、ペプチドカップリング(peptidic coupling)反応条件が用いられる。一般的に、YがOHであり、iが1であり、AがC(O)である場合、この反応は、塩基(例えば、Et3N)ありまたはなしで、ジクロロメタンまたはジメチルホルムアミドなどの非プロトン性溶媒中、EDCl(1-エチル-3-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩)およびHOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)などのカップリング試薬の存在下で行われ、あるいは、
尿素である場合:YおよびAはイソシアネートを形成し、あるいは、
スルホンアミドである場合: YおよびAはスルホニルクロリドを形成し、あるいは、
チオ尿素である場合:YおよびAはチオイソシアネートを形成する。
好ましくは、式(II)の化合物は式(IIa)の化合物
[式中、R1、q、L1、X'、R8、R8'、p、R3、R4、およびnは、式(I')および(Ia')に対して規定した通りである]
である。
第二の態様によると、式(I)の本発明の化合物は、式(IV)の化合物と式(V)の化合物
[式中、R1、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、q、n、およびiは上記で規定したものであり、Yは脱離基である]
とを反応させることによって得ることができる。
Yが、エポキシ、ハロゲン、上記で規定した活性化OHから選択されるのが好ましい。
より好ましくは、式(V)の化合物は、式(Va)
[式中、X、R8、R8'、p、R3、R4、n、A、L2、およびR6は、式(I')および(Ia')に対して規定した通りである]
の化合物である。
この反応は一般的に、塩基、好ましくは無機の塩基の存在下、および溶媒中、好ましくは極性の非プロトン性溶媒中で行われる。
式(III)および(IV)の化合物は市販されており、または当業者であれば有機化学の一般的な知識に基づいて調製することができる。
式(II)および(V)の化合物は、下記の一般的手順に記載する通りに得られる。
第三の態様によると、式(I)の本発明の化合物は、式(Ic)の対応する化合物を反応させることによって得ることができ:
式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、L1、L2、q、n、およびiは、式(I)に対して規定した通りであり、XaはXの前駆基である。式(Ic)の化合物は、それぞれ式(IIc)および(IIIc)または(IVc)および(Vc)の対応する化合物から、上記の式(I)の化合物との類似性によって得ることができる。
用語「前駆体」は、本明細書において基または官能基の存在および/または非存在によって、指摘される化合物または所望の化合物と異なる化合物を意味するために用いられる。このような基または官能基は、当業者に知られている通常の官能基化反応によって、導入され、変換され、および/または取り除くことができる。
官能基化反応は、公知の方法を応用または適用することによって行うことができる。
好ましくは、前駆基は、Xaから出発してXを得るための1つまたは複数のステップによって、例えば、還元、アミド化、酸化、加水分解、エステル化などによって、可能になるような基である。
上記の反応は、当業者であれば、本明細書以下の例において説明する方法を応用または適用することによって行うことができる。
さらに、本発明の方法は、式(I)、(I')、(Ia)、(Ib)、または(I'a)の化合物を単離するさらなるステップも含むことができる。これは、当業者であれば、上記に記載した回収方法など、あらゆる公知の慣例的な手段によって行うことができる。
一般的に、出発生成物は、主にAldrichもしくはAcros、または他の典型的な化学薬品業者から市販されており、あるいはあらゆる公知の方法または例に記載する方法を応用または適用することによって得ることができる。
さらなる目的によると、本発明はまた、上記に規定した式(I)、(I')、(Ia)、(Ib)、または(I'a)の化合物を、薬学的に許容される添加剤と一緒に含む医薬組成物に関する。
式(I)、(I')、(Ia)、(Ib)、または(I'a)の好ましい実施形態は、本発明の化合物に関して、および好ましい特徴または実施形態のいずれか一つにしたがって上記に規定した通りである。
なおさらなる一目的によると、本発明は、システインプロテアーゼを阻害するための本発明の式(I)の化合物に関する。
式(I)、(I')、(Ia)、(Ib)、または(I'a)の化合物により、システインプロテアーゼの選択的かつ可逆的な阻害が可能になるのが有利である。
本発明の化合物および医薬組成物は、システインプロテアーゼ、特に、USPなどの特異的な脱ユビキチン化酵素を、より詳細にはそれを必要とする患者におけるUSP-7を阻害するのに有用である。
本発明の化合物および医薬組成物は、癌および転移、より詳細には、前立腺癌および/もしくは大腸癌、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病、免疫学的障害、骨および関節の疾患、骨粗鬆症、関節炎炎症性障害、心血管疾患、ウイルス感染および疾患、ならびに/またはウイルス感染性および/もしくは潜在性、細菌感染および疾患を、治療および/または予防するのに特に有用である。
本発明の化合物および医薬組成物は、老年痴呆、特にアルツハイマー病に対して作用するβ-アミロイドプラークのない患者に対して用いることができる。
特に、前記ウイルス感染および疾患は、単純ヘルペス1または2ウイルス感染、A型肝炎、C型肝炎、SARSコロナウイルス感染および疾患、エプスタインバーウイルス、ライノウイルス感染および疾患、アデノウイルス感染および疾患、急性灰白髄炎から選択される。
一態様によると、前記化合物は、1つまたは複数のウイルスのシステインプロテアーゼを阻害する。
細菌のシステインプロテアーゼは、ストレプトパイン、クロストリパイン、ブドウ球菌のシステインプロテアーゼ、ギンギパインから選択することができる。
本発明はまた、上記に規定した式(I)の化合物を、抗癌薬、神経学的薬剤、血栓溶解薬、抗酸化薬、抗感染症薬、降圧薬、利尿薬、血栓溶解薬、免疫抑制薬、心血管薬、免疫調節薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、抗細菌薬から選択される1つまたは複数の活性薬剤と一緒に含む組合せに関する。
本発明はまた、本発明の化合物を、薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、それを必要とする患者に投与することを含む、対応する治療の方法に関する。
本発明によると、用語「患者」または「それを必要とする患者」は、病因において活性なシステインプロテアーゼを伴う病的状態に罹患している、または罹患する可能性のある動物またはヒトを意図するものである。患者がヒトであるのが好ましい。
本明細書に記載する疾患および状態の治療を必要とする対象の同定は、当業者の能力および知識の範囲内に十分ある。当技術分野における熟練した獣医または医師であれば、臨床検査、身体検査、病歴/家族歴、または生物学的検査および診断検査の使用によって、このような治療を必要とする対象を容易に同定することができる。
「治療有効量」は、病因に関与する活性なシステインプロテアーゼの阻害を必要とする病的状態を予防または治療するうえで有効な、本発明による化合物/薬物の量を意味する。
治療有効量は、慣例的な技術を用いることにより、かつ同じような状況の下に得られた結果を観察することにより、当業者として、担当の診断医が容易に決定することができる。治療有効量を決定する上で、担当の診断医によって、それらに限定されないが、対象の種、対象のサイズ、年齢、および全体的な健康、関与する具体的な疾患、関与の度合いまたは疾患の重症度、個々の対象の反応、投与する特定の化合物、投与様式、投与する調製物のバイオアベイラビリティ特性、選択された投与量レジメン、併用の薬物療法の使用、ならびに他の関連する状況を含めた、数々の要因が考えられる。
所望の生物学的効果を達成するのに必要とされる、式(I)、(I')、(Ia)、(Ib)、または(I'a)の化合物の量は、使用する化合物の化学的特性(例えば、疎水性)、化合物の作用強度、疾患のタイプ、患者が属する種、患者の疾患状態、投与経路、選択された経路による化合物のバイオアベイラビリティ、必要とされる投与量を指示する全ての要因、投与される送達およびレジメンを含めた数々の要因に応じて変化する。
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、動物またはヒトに適宜投与した場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生成しない分子実体および組成物を意味する。
本明細書で用いられる「薬学的に許容される添加剤」は、あらゆる担体、希釈剤、補助剤、またはビヒクル、例えば、保存剤または抗酸化剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。このような媒体および薬剤を、薬学的な有効物質のために使用することは、当技術分野において周知である。いかなる慣例的な媒体または薬剤が有効成分と不適合である場合以外は、治療用組成物においてこの媒体または薬剤を用いることが企図される。補足的な有効成分も、適切な治療上の組合せとして組成物中に組み入れることができる。
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「治療する」または「治療」は、このような語が適用される障害もしくは状態を、またはこのような障害もしくは状態の1つもしくは複数の症状を、逆転し、軽減し、進行を阻害し、もしくは予防することを意味する。
一般用語において、本発明の化合物は、非経口投与用に、化合物を0.1w/v%から10w/v%含む生理的なバッファー水溶液において提供することができる。典型的な投与量範囲は、1日あたり1μg/kg体重から0.1g/kg体重までであり、好ましい投与量範囲は、1日あたり0.01mg/kg体重から100mg/kg体重まで、またはヒトの子供において等しい投与量である。投与する薬物の好ましい投与量は、疾患または障害のタイプおよび進行度、特定の患者の全体的な健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の製剤、投与経路(静脈内、筋肉内、またはその他)、選択した送達経路による化合物の薬物動態学的性質、ならびに投与の速度(ボーラスまたは持続的注入)および投与計画(所与の期間における繰返し数)などの変数に依存する可能性がある。
本発明の化合物は、単位投与剤形において投与することも可能であり、表現「単位投与量」は、患者に投与することができる単一の投与量、および容易に取り扱い、包装することができる単一の投与量を意味し、本明細書以下に記載する通り、活性化合物それ自体、または薬学的に許容される組成物としてのいずれかを含む、物理的および化学的に安定な単位投与量として残存するものである。したがって、典型的な1日量の合計は、0.01mg/kg体重から100mg/kg体重までの範囲である。一般的なガイダンスとして、ヒトに対する単位投与量は、1日あたり1mgから3000mgまでの範囲である。好ましくは、単位投与量の範囲は、1日に1回から6回投与して1mgから500mgまでであり、さらにより好ましくは、1日1回10mgから500mgまでである。本明細書に提供する化合物を、1つまたは複数の薬学的に許容される添加剤と混合することによって医薬組成物中に調合することができる。このような単位投与量の組成物は、経口投与によって使用するために、特に錠剤、単純なカプセル剤、もしくはソフトゲルカプセル剤の形態で、または鼻腔内に、特に散剤、点鼻薬、もしくはエアロゾルの形態で、または経皮的に、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、もしくは噴霧剤で、または経皮パッチによって局所的に使用するために、調製されてよい。
組成物は、単位投与剤形において投与すると好都合であり得、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版; Gennaro、A. R.編集; Lippincott WilliamsおよびWilkins: Philadelphia、PA、2000年に記載されているなど、薬学の技術分野において周知のあらゆる方法によって調製することができる。
好ましい製剤は、本発明の化合物が経口投与または非経口投与用に調合されている医薬組成物を含む。
経口投与に対して、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤などは、1つもしくは複数のあらゆる以下の成分、または同様の性質の化合物を含むことができる:結合剤、例えば微結晶性セルロース、もしくはトラガカントゴム;希釈剤、例えば、デンプンもしくはラクトース;崩壊剤、例えば、デンプンおよびセルロース誘導体;滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム;流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素;甘味剤、例えば、ショ糖もしくはサッカリン;または香味料、例えば、ペパーミント、またはサリチル酸メチル。カプセル剤は、硬カプセル剤または軟カプセル剤の形態であってよく、軟カプセル剤は一般的に可塑剤と場合によりブレンドされたゼラチンブレンドから作られ、またはデンプンカプセルの形態であってよい。さらに、投与単位形態は、糖、シェラック、または腸溶性薬剤のコーティングなど、投与量単位の物理的形態を修飾する種々の他の材料を含むことができる。他の経口剤形のシロップ剤またはエリキシル剤は、甘味剤、保存剤、色素、着色剤、および香味剤を含むことができる。さらに、活性化合物は、急速溶解の、放出制御の、または徐放の調製物および製剤中に組み入れることができ、このような徐放製剤は二峰性であるのが好ましい。好ましい錠剤は、あらゆる組合せの、ラクトース、コーンスターチ、ケイ酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、またはタルクを含む。
非経口投与用の液体調製物は、無菌の水性または非水性の液剤、懸濁剤、および乳剤を含む。液体組成物は、結合剤、バッファー、保存剤、キレート化剤、甘味剤、香味剤、および着色剤なども含むことができる。非水性溶媒には、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルが含まれる。水性の担体には、アルコールと水の混合物、緩衝化媒体、および食塩水が含まれる。特に、生体適合性の、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド/グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体が、活性化合物の放出を制御するのに有用な添加剤であり得る。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルのデキストロースをベースとする電解質補給剤などを含むことができる。これら活性化合物に潜在的に有用な他の非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。
代替の投与様式は吸入用の製剤を含み、吸入用の製剤は、ドライパウダー剤、エアロゾル剤、または滴剤などの手段を含む。これらは、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸などを含む水溶液剤、または点鼻薬の形態で投与するための油性液剤、または鼻腔内に適用するためのゲル剤としてであってよい。頬側投与用の製剤は、ロゼンジ剤(lozenge)またはパステル剤(pastille)を含み、ショ糖またはアラビアゴムなどの香味ベース、およびグリココール酸などの他の添加剤も含むことができる。直腸投与に適する製剤は、固体ベースの担体と一緒に単位投与量坐剤として提示するのが好ましく、サリチレートを含むことができる。皮膚に局所適用するための製剤は、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、パスタ剤、ゲル剤、噴霧剤、エアロゾル剤、または油剤の形態をとるのが好ましい。用いることができる担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、またはこれらの組合せが含まれる。経皮投与に適する製剤は、個々のパッチ剤として提示することができ、親油性エマルジョン、またはポリマーもしくは接着剤中に溶解および/もしくは分散されている、緩衝化した水溶液であってもよい。
本発明をさらに説明するが、生理的条件下の活性DUBのパネルにわたるUSP7脱ユビキチン化活性の選択的阻害に対する非限定的な説明としての、以下の実施例および図における記載に限定されない。
本発明の代表的な化合物を以下の表に概略する:
本発明の代表的な化合物は、以下の手順にしたがって合成することができる。
一般的な分析手順
NMRスペクトルを、CDCl3またはDMSO-d6(ジメチルスルホキシド)を溶媒として、BrukerまたはVarianスペクトロメーター上、1Hに対して300MHzまたは400MHz、13Cに対して75MHzまたは100MHzで記録した。TMS(トリメチルシラン)または重水素化した溶媒の内部シグナルを基準にして、化学シフトをppmで示す。
LC-MS分析を用いて、標的化合物を分析および精製した。Waters Micromass、Bruker Esquire 3000 (ESI-IT)、またはAgilent Iontrap XCT-Plus質量分析計、およびWaters Alliance 2790またはUVおよび/もしくはDAD検出器付Agilent 1100 Series LCシステムを用いてLC-MS分析を行った。カラム: Waters XTerra MS C18、30×2.1mm (3.5μm)、Atlantis T3 C18、3μm、50mm×2.1mmまたはInertsil C8、250mm、4.6mm、5μm。流速: 0.8〜1.2ml/分、勾配: a)水10% MeOH (メタノール)、ギ酸アンモニウム10mMから100%MeOHまたはb) 95%水-アセトニトリル、0.1% HCOOHから95%アセトニトリル)。UV検出:190nmから400nm。化合物は全て純度>95%であった。
代表的手順1
実験例1〜14の調製
式(c)の化合物は、J. Amer. Chem. Soc.、1965年、87巻、1353〜1364頁、およびWO2005054249に記載されているCorey-Chaycovsky反応によって、化合物(b)から、または誘導体(b')の二重結合のエポキシ化のいずれかによって得られる。化合物(b)は市販されており、または化合物(a)から当技術分野において周知の保護反応後に得られる。保護基(PG)は、例えば、ベンジル(Bn)、ベンゾイル(Bz)、ter-ブチルオキシカルボニルまたはカルボベンジルオキシ(Cbz)である。
キナゾリノン(IV)でのオキシラン(c)開環は、ジメチルホルムアミド、アセトン中などで50℃から100℃の間に加熱した場合、NaH、KF、K2CO3、Cs2CO3などの塩基の存在下で行われる。
ピペリジン窒素の脱保護を公知の方法にしたがって行って化合物(II)を得る。
ペプチドカップリング反応を、化合物(II)と酸誘導体HO-C(O)-CH2(Z1)-CH2-D(化合物III)との間で、当技術分野では周知の方法にしたがって行う。いくつかの例を挙げると、EDCl(1-エチル-3-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩)、HOBt(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、およびジクロロメタン(CHCl2)中Et3Nなどの条件が好ましい。酸塩化物誘導体と反応させる場合には、アミド結合の形成も可能である。
化合物(IV)は市販されており、または文献の手順にしたがって調製される。
以下の化合物が、代表的手順1を実施することによって得られる:
-qが0であり、nが1であり、Z1がHであり、D1がフェニルである(実験例1、実験パートに記載)
-qが1であり、nが1であり、R1がClであり、Z1がHであり、D1がフェニルである(実験例2)
-qが0であり、nが1であり、Z1がHであり、D1がシクロペンチルである(実験例3)
-qが1であり、nが1であり、R1がClであり、Z1がHであり、D1がシクロペンチルである(実験例4)
-qが0であり、nが1であり、Z1がCH3であり、D1がチオフェニルである(実験例5)
-qが0であり、nが1であり、Z1がCH3であり、D1がH2である(実験例6)
-qが2であり、R1がOMeであり、nが1であり、Z1がCH3であり、D1がH2である(実験例7)
-qが1であり、R1がClであり、nが1であり、Z1がCH2CH3であり、D1がCH3である(実験例9)
-qが0であり、nが1であり、Z1がHであり、D1が2-Ome-フェニルである(実験例10)
-qが1であり、R1がClであり、nが1であり、Z1がCH3であり、D1がチオフェニルである(実験例11)
-qが0であり、nが1であり、Z1がHであり、D1がチオフェニルである(実験例12)
-qが0であり、nが1であり、Z1がCH3であり、D1がフェニルである(実験例13)
-qが1であり、R1がClであり、nが1であり、Z1がCH3であり、D1がフェニルである(実験例14)
上記に開示した方法を適用または応用することによって調製した、いくつかの化合物の選択されたデータを、以下に示す:
(実験)
(実験例1)
3-{[4-ヒドロキシ-1-(3-フェニルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
ステップ1: tert-ブチル1-オキサ-6-アザスピロ[2.5]オクタン-6-カルボキシレートの調製
1-Boc-4-ピペリドン(6.1g、30.6mmol、1eq)のテトラヒドロフラン(200mL)中溶液を撹拌しているものに、ヨウ化トリメチルスルホキソニウム(6.8g、30.6mmol、1eq)およびカリウムtert-ブトキシド(4.0g、30.6mmol、1eq)を加えた。混合物を18時間還流し、真空中で濃縮した。粗製生成物をAcOEt(100mL)中に溶解し、水(100mL)で洗浄した。層を分離し、水層をAcOEtで抽出した。有機抽出物を合わせ、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。固体を、シリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル9/1)、白色固体の化合物tert-ブチル1-オキサ-6-アザスピロ[2.5]オクタン-6-カルボキシレート(3.3g、52%)を得た。
ステップ2:tert-ブチル4-ヒドロキシ-4-[(4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-3-イル)メチル]ピペリジン-1-カルボキシレートの調製
4-ヒドロキシキナゾリン(1.65g、11.3mmol、1.1eq)のDMF(20mL)中溶液に、ステップ1からの化合物(2.35g、1eq)および炭酸セシウム(10.34g、3eq)を加えた。混合物を80℃で終夜加熱した。混合物をNH4Clの飽和溶液で洗浄し、水層をAcOEtで抽出した。有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって精製して(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル3/7)、無色油状のtert-ブチル4-ヒドロキシ-4-[(4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-3-イル)メチル]ピペリジン-1-カルボキシレート(1.6g、40%)を得た。
MS (ES+、m/z): 360.2 [M+H]+、719.6 [2M+H]+
ステップ3:3-[(4-ヒドロキシピペリジン-4-イル)メチル]-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オンのトリフルオロ酢酸塩の調製
ステップ2の化合物(1.0g、2.8mmol)をTFA(トリフルオロ酢酸)(80mL)中に溶解し、反応混合物を室温で終夜撹拌した。得られた混合物を真空中で濃縮した。3-[(4-ヒドロキシピペリジン-4-イル)メチル]-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オンの粗製トリフルオロ酢酸塩を、精製せずに次のステップで用いた。
MS (ES+, m/z): 260.1 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.53 (ブロードなm, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.27 (ブロードなm, 1H), 8.17 (dd, 1H), 7.85 (dd, 1H), 7.70 (dd, 1H), 7.57 (dd, 1H), 4.07 (s, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.02 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.50 (m, 2H)
ステップ4:3-{[4-ヒドロキシ-1-(3-フェニルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
ステップ3からのTFA塩(0.8mmol、1eq)のCH2Cl2(10mL)中溶液に、DIEA(N,Nジイソプロピルエチルアミン)(0.4mL、2.4mmol、3eq)、ヒドロケイ皮酸(150mg、0.96mmol、1.2eq)、EDCI(306mg、1.6mmol、2eq)、およびHOBt(216mg、1.6mmol、2eq)を連続的に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル2/8から0/10まで、次いで酢酸エチル/MeOH 9/1)、白色固体の実験例1を得た(256mg、82%)。
MS (ES+, m/z): 392.2 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.25 (s, 1H), 8.17 (dd, 1H), 7.84 (dd, 1H), 7.69 (dd, 1H), 7.55 (dd, 1H), 7.21 (m, 5H), 4.96 (s, 1H), 4.04 (m, 3H), 3.64 (m, 1H), 3.21 (m, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.80 (m, 2H), 2.62 (m, 2H), 1.41 (m, 4H)
(実験例5)
3-({4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
実験例1のステップ3からのTFA塩(0.42mmol、1eq)のCH2Cl2(10mL)中溶液に、DIEA(0.37mL、2.12mmol、5eq)、2-メチル-3-(2-チエニル)プロパン酸(71mg、0.42mmol、1eq、Organometallics、2002年、21巻、2842頁)、EDCI(161mg、0.84mmol、2eq)、およびHOBt(114mg、0.84mmol、2eq)を連続的に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌し、次いで、真空中で濃縮した。粗製生成物を、シリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって精製した(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル2/8から0/10、次いで酢酸エチル/MeOH 9/1)。カラムクロマトグラフィーによる第2の精製を同じ条件を用いて行って、溶媒を蒸発させ、高真空下で乾燥させた後、白色固体の実験例5(117mg、68%)を得た。
MS (ES+, m/z): 412.2 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.24 (s, 1H), 8.17 (m, 1H), 7.84 (m, 1H), 7.70 (m, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.27 (m, 1H), 6.88 (m, 1H), 6.82 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.68 (m, 1H), 3.20 (m, 5H), 1.34 (m, 4H), 1.02 (m, 3H).
(実験例11)
7-クロロ-3-({4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
ステップ1: tert-ブチル4-[(7-クロロ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-3-イル)メチル]-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレートの調製
7-クロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン(0.40g、2.2mmol、1eq)のDMF(5mL)中溶液に、実験例1のステップ1からの化合物(0.47g、1eq)および炭酸セシウム(2.17g、3eq)を加えた。反応混合物を80℃で終夜加熱し、次いで室温に放冷した。混合物を飽和NH4Cl溶液で洗浄し、次いでAcOEtで抽出した。有機抽出物を合わせ、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって精製した(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル3/7)。第2の精製をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって行い(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル6/4から0/10)、無色油状のtert-ブチル4-[(7-クロロ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-3-イル)メチル]-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート(0.6g、68%)を得た。
ステップ2: 7-クロロ-3-[(4-ヒドロキシピペリジン-4-イル)メチル]-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オンのトリフルオロ酢酸塩の調製
上記ステップ1からの化合物(0.6g、1.5mmol)をTFA(5mL)中に溶解し、反応混合物を室温で終夜撹拌した。得られた混合物を真空中で濃縮した。7-クロロ-3-[(4-ヒドロキシピペリジン-4-イル)メチル]-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オンの粗製トリフルオロ酢酸塩を精製せずに次のステップで用いた。
ステップ3: 7-クロロ-3-({4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
上記ステップ2からのTFA塩(0.51mmol、1eq)のCH2Cl2(18mL)中溶液に、DIEA(0.45mL、2.5mmol、5eq)、2-メチル-3-(2-チエニル)プロパン酸(86mg、0.51mmol、1eq、Organometallics、2002年、21巻、2842頁)、EDCI(196mg、1.02mmol、2eq)、およびHOBt(138mg、1.02mmol、2eq)を連続的に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル2/8から0/10まで、次いで酢酸エチル/MeOH 9/1)。シリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによる第2の精製を行って、残留する試薬を除去した。生成物をEtOH/H2O 1/1中に可溶化し、溶液を凍結乾燥して、白色メレンゲ状(meringe)の実験例11(85mg、2ステップにわたって40%)を得た。
MS (ES+, m/z): 446.2 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.27 (m, 1H), 8.17 (m, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.25 (m, 1H), 6.90 (m, 1H), 6.82 (m, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.09 (m, 3H), 3.68 (m, 1H), 3.20 (m, 5H), 1.50 (m, 4H), 1.03 (m, 3H)
(実験例12)
3-({4-ヒドロキシ-1-[3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
実験例1のステップ3からのTFA塩(0.42mmol、1eq)のCH2Cl2(10mL)中溶液に、DIEA(0.37mL、2.1mmol、5eq)、3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸(80mg、0.51mmol、1.2eq)、EDCI(161mg、0.84mmol、2eq)、およびHOBt(114mg、0.84mmol、2eq)を連続的に加えた。反応混合物を室温で4日間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル2/8から0/10まで、次いで酢酸エチル/MeOH 9/1)。生成物をEtOH/H2O中に溶解し、溶液を凍結乾燥して、白色メレンゲ状の実験例12を得た(125mg、75%)。
MS (ES+, m/z): 398.2 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.24 (s, 1H), 8.16 (dd, J= 8Hz, 1H), 7.84 (dd, J=8Hz, J=8Hz, 1H), 7.68 (d, J=8Hz, 1H), 7.55 (dd, J=8Hz, J=8Hz, 1H), 7.27 (m, 1H), 6.90 (m, 3H), 4.98 (s, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.99 (m, 2H), 3.64 (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 3.00 (m, 2H), 2.92 (m, 1H), 2.66 (m, 2H), 1.45 (m, 4H).
(実験例13)
3-{[1-(2-ベンジルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
実験例1のステップ3からのTFA塩(2.37mmol、1eq)のCH2Cl2(30mL)中溶液に、DIEA(1.24mL、7.11mmol、7eq)、2-メチル-3-フェニルプロパン酸(466mg、2.84mmol、1.2eq)、EDCI(909mg、4.74mmol、2eq)、およびHOBt(640mg、4.74mmol、2eq)を連続的に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル2/8から0/10まで、次いで酢酸エチル/MeOH 9/1)、白色固体の実験例13を得た(640mg、2ステップにわたって66%)。
MS (ES+, m/z): 406.3 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.20 (m, 2H), 7.84 (m, 1H), 7.68 (m, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.20 (m, 5H), 4.90 (m, 1H), 3.85 (m, 4H), 3.11 (m, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.52 (m, 1H), 1.48 (m, 4H), 1.00 (m, 3H).
(実験例14)
3-{[1-(2-ベンジルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-7-クロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
実験例11のステップ2からのTFA塩(0.34mmol、1eq)のCH2Cl2 (10mL)中溶液に、DIEA (0.18mL、1.02mmol、3eq)、2-メチル-3-フェニルプロパン酸(67mg、0.41mmol、1.2eq)、EDCI(130mg、0.68mmol、2eq)、およびHOBt(104mg、0.68mmol、2eq)を連続的に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌し、次いで、真空中で濃縮した。粗製生成物をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して(溶離液:シクロヘキサン/酢酸エチル2/8から0/10まで、次いで酢酸エチル/MeOH 9/1)、白色固体の実験例14を得た(56mg、2ステップにわたって37%).
MS (ES+, m/z): 440.3 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6)δ: 8.29 (d, J=8Hz, 1H), 7.20 (t, J=8Hz, 1H), 7.79 (ブロードな s, 1H), 7.64-7.61 (m, 1H), 7.32-7.26 (m, 2H), 7.22-7.16 (m, 3H), 4.94 (d, J=6Hz, 1H), 4.15-3.79 (m, 3H), 3.68 (t, J=14Hz, 1H), 3.24-3.09 (m, 2H), 2.89-2.82 (m, 2H), 1.59-1.21 (m, 4H), 1.03 (d, J=6Hz, 3H), 0.78-0.75 (m, 1H)
代表的なシステインプロテアーゼ
USP7タンパク質の生成および精製
USP7をコードするcDNAを、胎盤のmRNAからPCR増幅によって得た。USP7のcDNAをPCRによってバキュロウイルス発現ベクター(pFastBac-HT; Invitrogen)中にサブクローニングした。全長の野生型ヒトUSP7およびその触媒変異体(catalytic mutant)(システイン223がアラニンによって置換されている、C223A)を、InvitrogenのBac-to-Bacバキュロウイルス系を用いて、製造元の指示にしたがって、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)の細胞(Sf9、Invitrogen)において、N末端がHis-タグ付けされている融合物として生成した。pFastBac-HT-B-USP7を用いてDH10bac細胞(Invitrogen)を形質転換し、X-gal/IPTG寒天プレート上で青色/白色選択を行った。バクミドのDNAを、アルカリ溶解法の手順によって調製した。バクミドミニプレップ(miniprep)の完全性、およびその配向性を、ジェネリックおよび特異的プライマーを用いて、PCRによって確認した。Sf9昆虫細胞を、27℃のInsectXpress培地(Cambrex)中で培養し、GeneShuttle 40(Q-BIOgen)を用いて、対応するバクミドをトランスフェクトした。トランスフェクト72時間後に、上清中のウイルスを回収した。トランスフェクトしたSf9細胞からの上清500μlを含む150cm2細胞培養フラスコ中50ml InsectXpress培地中、昆虫細胞(Sf9またはHigh Five細胞; invitrogen)を感染させることによってウイルスを増幅した。第2ラウンドの増幅後、感染した細胞を迅速なSDS溶解によって回収し、100℃で5分間煮沸し、短時間超音波処理し、14,000gで20分間遠心分離した。感染したSf9細胞における発現レベルを、非感染細胞における発現レベルと比較した。次いで、4℃で30分間、穏やかに揺り動かしながら、融合タンパク質をTALONビーズ(BD Biosciences、TALON金属アフィニティー樹脂)に結合させた。ビーズを広範囲に洗浄し(50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.0、500mM NaCl、10mMイミダゾール、0.5% Triton X-100、および10%グリセロール)、結合したタンパク質を、250mM イミダゾール (Sigma)を補った洗浄バッファー中で溶出した。溶出した分画を、4〜12% NuPAGEゲル(Novex、Invitrogen)上で分解した。精製したタンパク質を高濃度含む分画(純度>95%)を透析し(20mM トリス HCl pH7.6、200mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、および10%グリセロール)、アリコートにし、液体窒素中瞬間凍結した後、-80℃で貯蔵した。
USP7活性アッセイ
USP7をUSPバッファー(50mM トリス HCl、0.5mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、5mM DTT、0.01% Triton X-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH7.6)中で希釈した。化合物ストック(10mM)をDMSO中-20℃で貯蔵した。化合物を、200μMから91nMまでの種々の濃度で試験した。
Black 384ウエルプレート(小体積マイクロプレート; Greiner;最終反応体積10μl)中で2回ずつ、反応を行った。USP7に対する基質濃度は300nM Ub-AMCであった(Chem. Biol.、2003年、10巻、837〜846頁) (Boston Biochem)。特異性アッセイにおける酵素(USP7)の濃度は100pMであった。初速度下で固定の基質濃度で特異性アッセイを行うために、濃度を決定した。化合物を、25℃で30分間、酵素とプレインキュベートした。アッセイバッファー中希釈した酵素を含むプレート(+/-化合物)に基質を加えることによって、反応を開始させた。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。Pherastar Fluorescent Reader (BMG)上で読み取った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いて、パーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめた(変数勾配)。
USP5活性アッセイ
USP5を、USPバッファー(50mM トリス HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton X-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH7.6)中で希釈した。化合物ストック(100mM)を、DMSO中-20℃で貯蔵した。化合物を、200μMから91nMまでの種々の濃度で試験した。
Black 384ウエルプレート(小体積マイクロプレート; Greiner; 10μl最終反応体積)中で2回ずつ、反応を行った。USP5に対する基質濃度は300nM Ub-AMCであった(Boston Biochem)。特異性アッセイにおける酵素(USP5)の濃度は300pMであった。初速度下で固定の基質濃度で特異性アッセイを行うために、濃度を決定した。化合物を、25℃で30分間、酵素とプレインキュベートした。アッセイバッファー中希釈した酵素を含むプレート(+/-化合物)に基質を加えることによって、反応を開始させた。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。Pherastar Fluorescent Reader (BMG)上で読み取った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いて、パーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめた(変数勾配)。
USP8のクローニングおよび精製
USP8をコードするcDNAを、胎盤のmRNAからPCR増幅によって得た。USP8のcDNAをPCRによってバキュロウイルス発現ベクター(pFastBac-HT; Invitrogen)中にサブクローニングした。変異型USP8をコードするcDNAを、変異原性PCRによって産生した。対応するタンパク質は、残基786のシステインからアラニンへの置換をコードしている。オープンリーディングフレーム全体を配列決定することによって、配列を確認した。USP8をコードするバクミドを、DH10bac転位にしたがって産生した。対応するバクミドを、昆虫細胞(Sf9)にトランスフェクトした。ウイルスを培養上清物から回収し、2回増幅した。昆虫細胞(Sf9またはHigh Five; Invitrogen)を、72時間感染させた。細胞可溶化物を全部収集し、溶解バッファー(トリス HCl 50mM pH7.6、0.75% NP40、500mM NaCl、10%グリセロール、1mM DTT、10mMイミダゾール、Protease Inhibitor Cocktail、AEBSF 20μg.ml-1、Aprotinin 10μg.ml-1)中に溶解した。タンパク質を、金属アフィニティー樹脂(Talon Metal affinity resin; BD Biosciences)上でアフィニティー精製した。結合した材料を、洗浄バッファー(50mMリン酸ナトリウムpH7.0、300mM NaCl、10mMイミダゾール、0.5% Triton X-100、10%グリセロール)中で広範囲に洗浄し、250mMイミダゾール含有洗浄バッファー中で樹脂から溶出させた。タンパク質を、透析バッファー(トリス HCl pH 7.6 20mM、NaCl 200mM、DTT 1 mM、EDTA 1mM、10%グリセロール)中で透析した。タンパク質精製を、4〜12%NuPAGE(Invitrogen)上で分析した。
USP8活性アッセイ
USP8をUSPバッファー(50mM Tris HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton X-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH8.8)中で希釈した。化合物ストック(100mM)をDMSO中-20℃で貯蔵した。化合物を、200μMから91nMまでの種々の濃度で試験した。
Black 384ウエルプレート(小体積マイクロプレート; Greiner; 10μl最終反応体積)中で2回ずつ、反応を行った。USP8に対する基質濃度は300nM Ub-AMCであった(Boston Biochem)。特異性アッセイにおける酵素(USP8)の濃度は1.36nMであった。初速度下で固定の基質濃度で特異性アッセイを行うために、濃度を決定した。化合物を、25℃で30分間、酵素とプレインキュベートした。アッセイバッファー中希釈した酵素を含むプレート(+/-化合物)に基質を加えることによって、反応を開始させた。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。Pherastar Fluorescent Reader (BMG)上で読み取った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いて、パーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめた(変数勾配)。
UCH-L1活性アッセイ
UCH-L1をUSPバッファー(50mM トリス HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT(ジチオスレイトール)、0.01% Triton X-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH7.6)中で希釈した。化合物ストック(100mM)をDMSO中-20℃で貯蔵した。化合物を、200μMから91nMまでの種々の濃度で試験した。
Black 384ウエルプレート(小体積マイクロプレート; Greiner; 10μl最終反応体積)中で2回ずつ、反応を行った。UCH-L1に対する基質濃度は300nM Ub-AMCであった(Boston Biochem)。特異性アッセイにおける酵素(UCH-L1)の濃度は2.5nMであった。初速度下で固定の基質濃度で特異性アッセイを行うために、濃度を決定した。化合物を、25℃で30分間、酵素とプレインキュベートした。アッセイバッファー中希釈した酵素を含むプレート(+/-化合物)に基質を加えることによって、反応を開始させた。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。Pherastar Fluorescent Reader (BMG)上で読み取った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いて、パーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめた(変数勾配)。
UCH-L3活性アッセイ
UCH-L3をUSPバッファー(50mM トリス HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton X-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH7.6)中で希釈した。化合物ストック(100mM)をDMSO中-20℃で貯蔵した。化合物を、200μMから91nMまでの種々の濃度で試験した。
Black 384ウエルプレート(小体積マイクロプレート; Greiner; 10μl最終反応体積)中で2回ずつ、反応を行った。UCH-L3に対する基質濃度は300nM Ub-AMCであった(Boston Biochem)。特異性アッセイにおける酵素(UCH-L3)の濃度は13pMであった。初速度下で、一定の基質濃度で特異性アッセイを行うために、濃度を決定した。化合物を、25℃で30分間、酵素とプレインキュベートした。アッセイバッファー中希釈した酵素を含むプレート(+/-化合物)に基質を加えることによって、反応を開始させた。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。Pherastar Fluorescent Reader (BMG)上で読み取った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いて、パーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめた(変数勾配)。
カスパーゼ3活性アッセイ
カスパーゼ3をカスパーゼ3バッファー(100mM Hepes pH7.5、10%ショ糖、0.1% CHAPS)中で希釈した。化合物ストック(100mM)をDMSO中-20℃で貯蔵した。化合物を、200μMから91nMまでの種々の濃度で試験した。
Black 384ウエルプレート(小体積マイクロプレート; Greiner;10μl最終反応体積)中で2回ずつ、反応を行った。カスパーゼ3特異性アッセイに対する基質濃度は250nMであった(Ac-DEVD-AMC; Promega)。特異性アッセイにおける酵素(カスパーゼ3)の濃度は1.6nMであった。初速度下で、一定の基質濃度で特異性アッセイを行うために、濃度を決定した。化合物を、25℃で30分間、酵素とプレインキュベートした。アッセイバッファー中希釈した酵素を含むプレート(+/-化合物)に基質を加えることによって、反応を開始させた。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。Pherastar Fluorescent Reader (BMG)上で読み取った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いて、パーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめた(変数勾配)。
細胞生存性および増殖方法
HCT116細胞生存性および増殖アッセイ
HCT116大腸癌細胞をATCC(アメリカ培養細胞系統保存機関)から得、10% FBS、3mMグルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むMc Coyの5A培地中に維持した。細胞を、5% CO2を含む湿潤雰囲気中、37℃でインキュベートした。
細胞生存性を、96ウエル培養プレート(CellTiter 96(登録商標) Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay、Promega)中、製造元の指示にしたがって、MTS技術を用いてアッセイした。MTS(3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシ-メトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラ-ゾリウム)は、代謝的に活性な細胞中で、可溶性の、細胞浸透性のホルマザンに還元される、MTT由来のテトラゾリウムである。ホルマザンの量は、492nmの吸光度によって検出され、生存する、代謝的に活性な細胞の数に比例する。
HCT116細胞を、1ウエルあたり103個播種した。24時間後、培地を交換し、細胞を、100μMから50nMまでの濃度の各化合物で3つずつ処理した。化合物を100%DMSO中で希釈し、希釈された化合物の細胞に対する最終濃度を0.5%に維持した。
細胞を、化合物と一緒に72時間インキュベートし、次いで、細胞の生存性を、MTSを2時間加えることによってアッセイした。492nmの吸光度を、96ウエル培養プレートから直接測定した。各化合物に対するGI50(50%増殖阻害)濃度を、S字形変数勾配の適合(Prism 4.0、Graphpad Softwares)を用いて計算した。値は、独立した3つの実験の平均値を表す。
細胞可溶化物中で活性な脱ユビキチン化酵素のパネルから化合物の選択性を評価するための方法
ユビキチンのC末端を改変したビニルスルホン誘導体であるUbVSは、細胞中で活性なDUBを直接可視化するのに明らかに有用であった。このツールは、脱ユビキチン化酵素のシステイン活性部位に共有結合し、新規なユビキチン/ユビキチン様プロテアーゼを発見し、特性を明らかにし、正常な、ウイルス感染した、および悪性細胞中の活性な脱ユビキチン化酵素をプロファイリングするのに応用して上首尾であった(Borodovskyら、Chem Biol、2002年、9巻、1149〜1159頁、Hemelaarら、Mol Cell Biol、2004年、24巻、84〜95頁、Ovaaら、Proc Natl Acad Sci U S A、2004年、101巻、2253〜2258頁)。
この研究において、HA-Ub-VSプローブ(ヘマグルチニンタグ-ユビキチン-ビニルスルホン)を用いて、天然のプロテオームからの脱ユビキチン化酵素全ての活性を直接可視化した。このツールを用いて、生理的条件において活性な脱ユビキチン化酵素全てに比べた、本発明者らの小分子化合物のUSP7に対する活性/特異性を評価した。
HEK293細胞を収集し、氷上で、トリス pH7.4 50mM、NaCl 150mM、MgCl2 5mM、EDTA 0.5mM、DTT 2mM、ATP(アデノシン三リン酸) 2mM、NP40(ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール0.5%、およびグリセロール10%を含む非変性バッファーで溶解させた。試料を4℃で1時間インキュベートし、清澄にした。次いで、タンパク質を、Bradford法(Bio-Rad Protein Assay)によって定量した。天然の細胞可溶化物からのタンパク質50μgを、実験例1および2の化合物(12.5μMから200μMまで)と、または対照として非特異的なDUB阻害剤と、室温で2時間処理した。ユビキチン標識化反応を、標識化バッファー(トリス pH7.6 50mM、MgCl2 5mM、EDTA 0.5mM、DTT 2mM、ATP 2mM、ショ糖250mM)中HA-Ub-VS(8μg/ml)を加えることによって開始させ、室温で15分間インキュベートした。次に試料を100℃で10分間インキュベートし、短時間超音波処理した。これをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分解し、ニトロセルロース膜に移し、USP7、HA、UCH-L3、CYLD、USP8、USP5、USP10、およびStat3に対する抗体でプローブした。セイヨウワサビのペルオキシダーゼ(HRP)-コンジュゲートした抗マウス抗体(Jackson Laboratories、115-035-003)、またはHRP-コンジュゲートした抗ウサギ抗体(Cell Signaling、7074)を二次抗体として用いた。シグナルを、試薬製造元の指示にしたがって、化学発光(ECL; Amersham)の増強によって検出した。
結果
1.USPモジュレーターを評価するためのUSP7およびUSP8基質としてのUb52の使用
本発明による組成物用に、USP7およびUSP8に対するin vitroのアッセイを以下の手順にしたがって行った。
ユビキチン-リボソームのタンパク質融合物の調製
ユビキチンとリボソームのタンパク質であるL40(ub52またはuba52またはユビキチン-L40)との間に融合タンパク質をコードするcDNAを、私有のヒト胎盤ライブラリーを用いて、ヒトRNAから増幅した。cDNAを、コードするタンパク質のカルボキシル末端にさらなるフラッグタグを含む、細菌の発現ベクター(pGEX-2T、GE Healthcare)中にサブクローニングした。以下のプライマー:5'-cgtggatccatgcagatctttgtgaagaccctc-3'(配列番号:1)を、ユビキチン-L40のpGEX-2TへのGSTタグでのインフレームのサブクローニングに、5'-gcgaattctttatcgtcatcgtctttgtagtctttgaccttcttcttgggacg-3'(配列番号:2)をBamHIおよびEcoRIの制限部位へのサブクローニングに用いた。
組換えタンパク質を生成および精製するために、プラスミドpGEX-2T-Ub52-flagをE. coli BL21 (Stratagene)に形質転換し、アンピシリン100mg/mlを補ったLB培地(LB ampi)中37℃で終夜増殖させ、次いで、LB ampi中1/100希釈した。細胞をA600=0.6〜0.8に到達するまで37℃でインキュベートした。0.1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した後、培養物を30℃で180分インキュベートした。
細胞を、4℃、7000×gで15分間、遠心分離することによって収集した。細菌のペレットを、NETN(トリス HCl pH8.0、EDTA 1mM、NP40 0.5%、プロテアーゼ阻害剤カクテル、PMSF 1mM)中で溶解し、短時間超音波処理した。不溶性の材料を、14000×gで30分間、遠心分離することによって除去した。GST-Ub52-flagタンパク質を、Everett RDら、EMBO J.、(1997年) 16巻、1519〜1530頁にしたがって精製した。簡潔に述べると、可溶性分画を、NETNバッファー+0.5%ミルク中、4℃で120分間プレインキュベートしたグルタチオンビーズ上でインキュベートした。フロースルーを回収した。ビーズを広範囲に洗浄し、最後の洗浄は、トリス HCl pH7.6 20mM、NaCl 100mM、MgCl2 12mM中で行った。溶出を、50mM トリス HCl pH8.0、NaCl 120mM中、20mM還元グルタチオンを用いて行った。全ての分画を4〜12% NuPAGE上で分解し、その後、0.1M DTT処理し、変性させ、クーマシーブリリアントブルーで染色した。溶離液をトリス HCl pH7.6 20mM、NaCl 50mM、DTT 0.5mM中4℃で終夜、透析した。
均一の時間分解蛍光(HTRF(登録商標))測定法を用いた融合タンパク質(GST-Ub52-Flag)のアッセイ
GST-Ub52-Flagの使用は、均一の媒体中の移動によって放射される蛍光の時間分解測定に基づくものである。
用いた試薬は以下の通りであった:
-抗-Flag-K(CIS bio international)と呼ばれる、抗フラッグ抗体-ユーロピウムクリプテートコンジュゲート、0.8M KF、0.1%ウシ血清アルブミン、トリス HCl 25mM pH7.6中0.2μM溶液
-抗-GST抗体-XL665コンジュゲート(CIS bio international)、0.8M KF、0.1%ウシ血清アルブミン、トリス HCl 25mM pH7.6中2.6μM溶液
-50mM トリス HCl pH7.6、EDTA 0.5mM、ウシ血清アルブミン0.05%、DTT 5mM中、上記に記載したストック溶液から調製した、14.75μMのGST-Ub52-Flag溶液および37.3μMのMBP_Ub52
アッセイはマルチウエルアッセイプレート上で行う。プレートを、4℃で終夜インキュベート後、PHERAstar fluorimeter (BMG)上で分析する(励起337nm、発光620nmおよび665nm)。
脱ユビキチン化型の酵素活性の、ユビキチン-リボソームタンパク質融合物でのアッセイ
用いた試薬は以下の通りであった:
-50mM トリス HCl pH7.6、ウシ血清アルブミン0.05%、DTT 5mM中、USP7 200pM、およびUSP8 400pMの溶液
-0.8M KF、0.1%ウシ血清アルブミン、トリス HCl 25mM pH7.6.中、0.2μM抗-Flag-K (CIS bio international)溶液
- 0.8M KF、0.1%ウシ血清アルブミン、トリス HCl 25mM pH7.6中、2.6μM抗-GST抗体-XL665コンジュゲート(CIS bio international)溶液
-14.75μMのGST-Ub52-flag溶液および37.7μMのMBP_Ub52を、50mM トリス HCl pH7.6、EDTA 0.5mM、ウシ血清アルブミン0.05%、DTT 5mM中、上記に記載したストック溶液から希釈することによって調製する。
GST-Ub52-flag溶液を、USP7溶液(最終200pM) 5μlまたはUSP8溶液(最終400pM) 5μlと混合することによって、酵素反応を行う。この混合物を、マルチウエルアッセイプレート上室温で1時間インキュベートする。抗-Flag-K溶液(0.2μM)5μlプラス抗-GST-XL665抗体(2.6μM)5μlの混合物10μlを、マルチウエルアッセイプレートの各ウエルに加える。プレートを、4℃で終夜インキュベート後、PHERAstar蛍光光度計(BMG)上で読む。
シグナルの低下は、酵素活性、すなわちGST-Ub52-Flag基質の切断の増大に相関する。したがって、用いたフォーマットは、ユビキチン特異的プロテアーゼなどの脱ユビキチン化型の酵素をアッセイする方法に完全に適するが、この酵素活性のモジュレーターを決定するためにも完全に適する。
脱ユビキチン化型の酵素活性のモジュレーターの決定
脱ユビキチン化型の酵素活性をアッセイするのに上記で言及したのと同じ手順を行うが、化合物1から14の存在下または非存在下で、種々の反応混合物を同じ酵素濃度でインキュベートする。データ(平均値±標準偏差)を対照(化合物なし)の%として分析し、GraphPad (Prism)を用いてパーセント値対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルにあてはめ(変数勾配)、IC50 (μM)を決定し、以下の表に表した。
2.UbAMC基質を用いたUSP7脱ユビキチン化活性の選択的阻害
結果を以下の表に要約する(μM):
3.細胞生存性/増殖の阻害
結果を以下の表に要約する(μM):
4.生理的条件における1パネルの活性DUBにわたるUSP7脱ユビキチン化活性の選択的阻害:
組換え酵素からin vitroで観察される特異性を確認するために、本発明者らは、脱ユビキチン化酵素のシステイン活性部位に共有結合する、HAUbVS活性ベースのプローブ(ABP)を用いて競合アッセイを行った(Borodovskyら、Chem Biol、2002年、9巻、1149〜1159頁、Hemelaarら、Mol Cell Biol、2004年、24巻、84〜95頁、Ovaaら、Proc Natl Acad Sci U S A、2004年、101巻、2253〜2258頁)。組換え酵素と比較して、このアッセイには、抗-HA抗体を用いることにより、ウエスタンブロット分析によって天然のプロテオームと直接並行して多くの脱ユビキチン化酵素に対する阻害剤の効果を評価する利点がある。このアッセイでは、阻害剤を細胞可溶化物全体に加え、残りの活性な脱ユビキチン化酵素をHAUbBSで標識化することによって阻害を決定する。この標識化の後に抗-HA抗体で免疫ブロットすると、HEK293細胞可溶化物からの全ての活性な脱ユビキチン化酵素の同定が可能になる(図1、レーン2)。この標識化は活性型のDUBに特異的であり、非特異的なDUB阻害剤によって非選択的に阻害される(図1、レーン14)。種々の投与量の実験例25の非存在下および存在下、溶解したHEK293細胞をHAUbVSで処理した場合、免疫ブロットのパターンに変化は認められなかったが、HA-Ub-VS-USP7に対応するサイズの1本のバンドが、ほとんど完全に排除された(図1)。USP7活性に対するこの効果は、処理した試料と非処理の試料との間に観察された移動度のシフトによって指摘される通り、抗-USP7抗体で確認された(図2)。
本発明者らは、次に、いくつかの脱ユビキチン化酵素を個々にモニタリングすることによって、USP7阻害剤の、HAUbVS標識化効率に対する効果を評価した。この目的で、HEK293細胞可溶化物からのUSP7、USP8、USP5、USP10、CYLD、およびUCH-L3に対するHAUbVSの標識化効率を、特異的な抗体を用いて最初に調べた。HAUbVS処理した試料と非処理の試料との間に観察された移動度のシフトによって示される通り、この標識化は、効率は異なるが、全ての試験したDUBで確認された(図2、レーン1およびレーン2)。これらDUBの潜在的な阻害を、実験例2および5、ならびに対照として非特異的なDUB阻害剤の存在下で評価した。本発明者らは、予想通り、非特異的なDUB阻害剤は、試験したDUB全てを阻害することを見出した(図2、レーン14)。興味深いことに、実験例2および5は、USP7の標識化を効率的に阻止したが、USP8、USP5、USP10、CYLD、またはUCH-L3の標識化は阻止しなかったことを本発明者らは見い出し、生理的条件下における、1パネルにわたる活性なDUBの、そのUSP7特異性を示した(図2)。これらのデータをまとめると、実験例2および5は、試験した全ての脱ユビキチン化酵素といかなる交差反応もせずに、生理的条件下、用量依存的に、天然のプロテオームのUSP7を直接標的とすることを示している。
5.USP7特異的な化合物は可逆的な阻害剤である
本発明者らのUSP7特異的化合物がUSP7を阻害する機序をさらに理解するために、いくつかの実験を行った。本発明者らはまず、種々の時点(30分、1時間、2時間、4時間、6時間)、実験例2(100μM)をUSP7(100pM)とプレインキュベートすることによって、実験例2の阻害機序の特性を明らかにした。次いで、脱ユビキチン化活性を、上記に記載した通り、Ub-AMC基質で評価し、DMSOで処理した試料の活性と比較した。興味深いことに、実験例2によるUSP7の阻害(約75%)は、プレインキュベート時間とは無関係であることが見出された(図3)。これらのデータは、実験例2はUSP7の時間依存的な阻害剤ではないことを明確に示している。
次に、ゲル濾過後の酵素活性の回復を測定することによって、阻害の可逆性を決定した。本発明者らは、実験例2および3(100μM)、または不可逆的USP7阻害剤として用いた対照の化合物(25μM)の存在下、USP7(100pM)を室温で4時間インキュベートした。本発明者らは、各試料のいくらかを、G50ゲル濾過系(Sephadex、G50 superfine、Sigma Aldricht)を通過させた。G50溶出物の脱ユビキチン化活性を、上記に記載した通りUb-AMC基質で評価し、G50濾過にかけなかった試料の活性と比較した。反応を、PHERAstar (BMG Labtech)を用いてモニタリングした。濾過の非存在下では、USP7活性は実験例2および3によって、ならびに不可逆的な化合物として用いた対照の阻害剤によって阻害された(図4A、-G50)。本発明者らは、これらの化合物単独を含む試料を用いて、全ての化合物は、G50カラムを通して濾過すると、カラム上に完全に保持されたことを確認した(図4B)。USP7ならびに実験例2および3を含む試料を、G50カラムを通して濾過すると、USP7活性の完全な修復がもたらされ、不可逆的な対照化合物によるUSP7の阻害は、濾過によって逆転することができなかった(図4A、+G50)。不可逆的な複合体は洗浄後も依然として阻害されていると予期されることから、本発明者らの知見は、実験例2および3はUSP7の可逆的な阻害剤であることを実証している。
これらの知見を確かめるために、本発明者らは、酵素-化合物複合体を迅速かつ大幅に希釈した後、酵素活性の回復を測定した。本発明者らは、活性アッセイに必要とされる濃度の100倍(10nM)の濃度のUSP7をインキュベートし、阻害剤の濃度はIC50の10倍に等しかった(図5A)。合理的な平衡化時間(1時間)後、この混合物を、UbAMC(300nM)を含む反応バッファー中100倍希釈して、反応を開始させた(図5A)。USP7ならびに実験例2および3を含む試料を希釈することにより、USP7活性はほとんど完全に回復し、不可逆的な対照化合物によるUSP7の阻害は希釈によって逆転され得なかった(図5B)。実験例2および3をUSP7から解離することで、迅速かつ大幅な希釈後におよそ90%を超える酵素活性の回復がもたらされたことは、実験例2および3が迅速な可逆的阻害剤であることを明確に実証している。
USP7ならびに実験例1、2、3、および5に関与する複合体の特性を明らかにするために、本発明者らは、以前に記載されている通り、自然条件下(7mM酢酸アンモニウム、pH7.5)、ESI-MSによる直接的な結合を評価した(Vivat Hannahら、Future Med Chem.、2010年、2巻(1):35〜50頁)。本発明者らはまず、3-5-10モル当量の実験例1、2、3、および5の存在下でタンパク質をインキュベートすることによって相互作用を確認した。これらの化合物は全て、図6における実験例1および2で説明する通り、3モル当量または5モル当量過剰で試験した場合、種々の程度でUSP7と複合体を形成し、USP7に対して1:1結合の化学量論を示した。USP7の存在下および非存在下で、化合物の質量に違いは観察されなかった。弱い非共有結合性の複合体を解離するために、USP7/阻害剤複合体を、H2O/CH3CN/HCOOH 50/50/1中で希釈し、エネルギー性機器の(energetic instrumental)条件下(Vc=120V、Pi=4mbar)で分析した。これら条件下で、USP7と実験例1、2、3、および5との間に結合は観察されず、USP7と実験例1、2、3、および5とは非共有結合性の複合体を形成することが示唆された。
これらのデータは全て、これらUSP7特異的な阻害剤は、可逆的にUSP7に結合することを明確に示すものである。

Claims (22)

  1. 式(I')
    [式中、
    R1は、各々同一または異なり、ハロゲン、R、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、NO2、(C1〜C6)アルキレン-OR、(C1〜C6)アルキレン-NRR'、(C1〜C6)アルキレン-CO2R、(C1〜C6)アルキレン-C(O)NRR'、-O-(C1〜C6)アルキレン-CO2R、-O-(C1〜C6)アルキレン-C(O)NRR'、CO2-(C1〜C6)アルキレン-OR、CO2-(C1〜C6)アルキレン-NRR'、C(O)NH-(C1〜C6)アルキレン-OR、C(O)NH-(C1〜C6)アルキレン-NRR'、OCF3、SO2R、SO3H、SO2NRR'、NHSO2R、R10C≡CR11、(R10)(R11)C=C(R11)2、(C1〜C6)アルキレン-C(O)R、NHC(O)R、または少なくとも1つのヘテロ原子、好ましくは、O、N、またはSから選択されるヘテロ原子、好ましくはOによって中断されている(C1〜C6)アルキルからなる群から選択され、
    L1は、=O、CN、C(O)R、C(O)OR、もしくはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレン、または直鎖もしくは分枝鎖CH2(C1〜C6)アルキレンであり、後者の(C1〜C6)アルキレンは、ハロゲン、OR、NRR'、またはCF3の1つまたは複数によって場合により置換されており、
    qは、0、1、2、3、または4であり、
    X'は、CR7であり、
    R7は、OR、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル-OR、C(O)OR、C(O)NRR'、CN、OR9、NRR'、またはSRであり、
    nは、0、1、または2であり、
    pは、1、2、または3であり、
    R3、R4、R8'、およびR8は、各々同一または異なり、H、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OH、-O-(C1〜C6)アルキル、NRR'、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、またはC(O)NRR'からなる群において選択され、
    Aは、
    -C(O)-、
    -C(O)NH-、
    SO2-、または
    SO2N-からなる群から選択され、
    L2は、O、NRもしくはSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子によって場合により中断されており、および/またはR、OR、NRR'、(C1〜C6)アルキル-OR、(C1〜C6)アルキル-NRR'、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR'、CN、C(=NH)NHORによって場合により置換されている、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレン-O、または直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキレンであり、
    R6は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、複素環、Hからなる群から選択され、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、または複素環は、単環式または多環式であり、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、NRR'、CN、CF3、OR、=O、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、直鎖もしくは分枝鎖(C2〜C6)アルケニレン、またはC(O)NRR'の1つまたは複数によって場合により置換されており、
    各RおよびR'は、同一または異なり、独立に、H、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキル、シクロアルキル、アリール、芳香族または非芳香族複素環、直鎖または分枝鎖-(C1〜C6)アルキル-アリール、または直鎖もしくは分枝鎖-(C1〜C6)アルキル-複素環から選択され、ここで複素環は芳香族または非芳香族であり;OH、CO2H、C(O)NH2、NH2によって場合により置換され、または置換されておらず、
    R9は、-C(O)R、-C(O)NHR、-C(O)OR、-C(O)CH2-NRR'、-C(O)-CH2-CH2-CO2R、-C(O)-CH2-SO3H、-C(O)-(C5H4N)、-PO3H2、またはこれらのイオン化型からなる群から選択され、
    R10は、独立に、結合、直鎖または分枝鎖(C1〜C6)アルキルから選択され、
    R11は、独立に、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、またはアリールから選択され、アルキルまたはアリールはOH、NH2、C(O)OHまたはC(O)NHによって場合により置換されている]
    の化合物もしくはこれらの薬学的に許容される塩、またはこれらの光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、もしくは互変異性体。
  2. AがC=Oである、請求項1に記載の化合物。
  3. R7が、OR、OR9、NRR'、またはSRである、請求項1または2に記載の化合物。
  4. R7がOHまたはOR9である、請求項1または2に記載の化合物。
  5. R7がOHである、請求項1または2に記載の化合物。
  6. R1が、各々同一または異なり、直鎖もしくは分枝鎖(C1〜C6)アルキル、ハロゲン、OR、NRR'、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'、またはNHC(O)Rからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. R1が、各々同一または異なり、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキル)、ハロゲン、OH、または直鎖もしくは分枝鎖-O-(C1〜C6)アルキルからなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
  8. R3、R4、R8、R8'が、各々同一または異なり、H、-O-(C1〜C6)アルキル、OHからなる群において選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
  9. L2が、直鎖もしくは分枝鎖C1〜C6(アルキレン)、または直鎖もしくは分枝鎖-[C1〜C6(アルキレン)]-O-である、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. R6が、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはHからなる群から選択され、アリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルは、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖O-(C1〜C6)アルキルによって場合により置換されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
  11. p+n=4である、請求項1から10のいずれか一項に記載の化合物。
  12. pが2であり、nが2である、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物。
  13. L1がCH2である、請求項1から12のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 3-({4-ヒドロキシ-1-[3-(2-メトキシフェニル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    7-クロロ-3-{[1-(2-エチルブタノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-({1-[2-(3-フルオロフェノキシ)アセチル]-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-{[4-ヒドロキシ-1-(2-メチルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-6,7-ジメトキシ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-{[4-ヒドロキシ-1-(2-メチルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    7-クロロ-3-{[1-(3-シクロペンチルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-{[1-(3-シクロペンチルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    7-クロロ-3-{[4-ヒドロキシ-1-(3-フェニルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-{[4-ヒドロキシ-1-(3-フェニルプロパノイル)ピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    7-クロロ-3-({4-ヒドロキシ-1-[2-メチル-3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-({4-ヒドロキシ-1-[3-(チオフェン-2-イル)プロパノイル]ピペリジン-4-イル}メチル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-{[1-(2-ベンジルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    3-{[1-(2-ベンジルプロパノイル)-4-ヒドロキシピペリジン-4-イル]メチル}-7-クロロ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン
    もしくはこれらの薬学的に許容される塩、またはこれらの光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、もしくは互変異性体
    からなる群において選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 式(II)の化合物と式(III)の化合物
    [式中、R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X'、A、q、n、およびiは、請求項1から13のいずれか一項において規定した通りであり、Yは脱離基である]
    との反応を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。
  16. 式(IV)の化合物と式(V)の化合物
    [式中、R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、q、n、およびiは、請求項1から13のいずれか一項において規定した通りであり、Yは、エポキシ、ハロゲン、活性化OHから選択される脱離基である]
    との反応を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。
  17. 請求項1から14のいずれか一項に記載の式(I)の化合物を、薬学的に許容される添加剤と一緒に含む医薬組成物。
  18. 脱ユビキチン化酵素を阻害するための、請求項1から14のいずれか一項において規定した式(I)の化合物の使用。
  19. USP7(ユビキチン特異的プロテアーゼ7)/HAUSP(ヘルペス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ)を阻害するための、請求項18に記載した使用のための使用。
  20. 癌および転移、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病、免疫学的障害、糖尿病、骨および関節の疾患、骨粗鬆症、関節炎炎症性障害、心血管疾患、ウイルス感染および疾患、ならびに/またはウイルス感染性および/または潜在性、細菌感染および疾患を、治療および/または予防のために使用するための、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物。
  21. 前記ウイルス感染および疾患が、単純ヘルペス1または2ウイルス感染、A型肝炎、C型肝炎、SARSコロナウイルス感染および疾患、エプスタインバーウイルス、ライノウイルス感染および疾患、アデノウイルス感染および疾患、急性灰白髄炎から選択される、請求項20に記載の使用のための化合物。
  22. 請求項1から14のいずれか一項に規定した式(I)の化合物を、抗癌薬、神経学的薬剤、血栓溶解薬、抗酸化薬、抗糖尿病薬、抗感染症薬、降圧薬、利尿薬、血栓溶解薬、免疫抑制薬、心血管薬、免疫調節薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、抗細菌薬から選択される1つまたは複数の活性薬剤と一緒に含む組合せ。
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