JP2014526451A - マルビジン−３−ｏ−ベータ−グルコシド及びプロポリス抽出物を含む抗炎症組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、植物抽出物及びプロポリス抽出物を含む抗炎症組成物に関する。

Description

本発明は、特定の含有量のマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドを含む植物抽出物、及びプロポリス抽出物を含む抗炎症組成物に関する。本発明は、より具体的には、炎症性疾患、特に関節炎の治療における、この組成物の使用に関する。

炎症性病態、特に関節炎の現在の管理は、大抵の場合、ステロイド性抗炎症剤（コルチコイド）、又は非ステロイド性抗炎症剤、例えばイブプロフェン、ケトプロフェン、ニフルム酸及びジクロフェナクの使用に基づくものである。

しかしながら、これらの抗炎症剤の使用に関する主要な欠点、特に胃に対するその有害な効果（胃潰瘍又は十二指腸潰瘍）が存在する。

さらに、炎症の症状の除去に関与する基本的治療、例えばスルファサラジン（サラゾピリン（登録商標））が存在する。

しかしながら、これらの治療を用いた場合、多くの欠点、特に、コルチコイド等の分子の長期間の毒性、それに加え、炎症の発生が予防されないこと、が残る。

プロポリス、特に、プロポリスに含有されるコーヒー酸又はそのエステルの抗炎症活性が知られている（非特許文献１）。

しかしながら、プロポリスの含有量が限定的である場合、この活性は、慢性炎症性疾患、例えば関節炎の場合における炎症性応答を抑制するには不十分である。

アントシアン、特にマルビジン及びそのグルコシドの抗炎症活性も知られている（非特許文献２）。

特許文献１は、慢性又は急性の炎症プロセスを伴う病態、特にリウマチ性多発性関節炎（rheumatoid polyarthritis）を予防又は治療するための医薬組成物におけるマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドの使用を記載する。

FR 2 916 141

Borelli et al., Fitoterapia (2002), 73 Suppl 1, 53-63 Wang et al., J.Agric.Food.Chem (2002), 50, 850-857

しかしながら、現在のところ、その性能が慣用される抗炎症剤と近いか又はさらにはそれと同等である、特に関節炎に対する抗炎症活性を有する、無毒の組成物、特に食品組成物又は局所組成物は存在しない。

したがって、本発明の第１の目的は、従来技術の欠点を取り除き、従来技術の課題の全部又は一部に対する解決策を提供する組成物を提案することからなる。

別の目的は、慢性又は急性の炎症プロセスを伴う病態、特に我々の関節炎の治療に対するその性能が、現在利用可能な組成物の性能と近いか又はさらにはそれと同等である抗炎症組成物を提案することである。

別の目的は、食品又は局所使用組成物の形態で提示され得る無毒の抗炎症組成物を提案することである。

本発明の別の目的は、他の抗炎症剤、例えばコルチゾン又はメトトレキサートと組み合わせることによって、それらの使用と関連する毒性のリスクを減少させることができる抗炎症組成物を提案することである。

本発明の目的は、抗炎症組成物であって、
１／４から４／１までの範囲の植物抽出物／プロポリス抽出物（ａ／ｂ）の重量比で、
（ａ）少なくとも５重量％、好ましくは５重量％から２０重量％まで、有利には５重量％から１５重量％までのマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドを含む植物抽出物；及び
（ｂ）コーヒー酸又はそのエステルのうちの１つ、フェルラ酸、ガランギン及びピノセムブリンを含むプロポリス抽出物；
を含む、抗炎症組成物である。

マルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドは、以下の式を有する、マルビジンのグルコシド誘導体である：

本発明によれば、植物抽出物は、ブドウ、ブルーベリー（Vaccinium spp）、ブラックベリー（Rubus fruticosus）又はさらには赤キャベツ（Brassica oleracea var. capitata f. rubra）の抽出物から選択され得る。

本発明によれば、植物抽出物は、有利には、ブドウ果皮（grape cuticle）抽出物から選択される。

本発明によれば、ブドウ果皮抽出物は、少なくとも１つの赤ブドウの絞りかす（marc）のポリフェノール画分の濃縮を含む方法によって取得される又は取得することができる。

ブドウの絞りかすは、マストからブドウを分離した後に、ブドウを圧搾することによって取得される、果皮、種（pips）及び茎（stalk）によって形成される全体を意味する。

本発明によれば、赤ブドウの絞りかすは、有利には、ワイン品種：メルロー（Merlot）、カベルネ（Cabernets）、例えばカベルネ・ソービニョン（Sauvignon）若しくはカベルネ・フラン（Franc）、シラー（Syrah）、ガメ（Gamays）、グルナッシュ（Grenache）、タナ（Tannat）若しくはアリカンテ・ブーシェ（Alicanthe Bouchet）、又はそれらの混合物由来のブドウの房（bunches）の圧搾によって得られる。

本発明によれば、ブドウ果皮抽出物は、有利には、少なくとも１つの赤ブドウの絞りかすの選択、及び前記絞りかすのポリフェノール画分の濃縮を含む方法によって取得される。

ブドウ果皮抽出物を取得するための方法は、具体的には、赤ブドウの絞りかすを選択する第１の工程、及びその後の、二酸化硫黄の水性分散物の存在下での前記絞りかすの拡散を含み得る。

その後、遠心分離を行い、その後、特に蒸発及びその後の真空での濃縮による、ポリフェノール画分の濃縮を行う。

それによって取得される製造物を、噴霧化（atomization）に供してもよく、それによって、少なくとも５重量％のマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシド及び低残留湿度を含む粉末の形態で、ブドウ果皮抽出物を取得することが可能となる。

植物抽出物のマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドの割合は、具体的には、逆相Ｃ１８カラムとトリフルオロ酢酸及びアセトニトリルからなる溶媒勾配とを使用することによる、ＵＶ−可視光ＤＡＤ分光光度計（５３５ｎｍで検出）と連結したＨＰＬＣ方法によって測定される。

ブドウ果皮抽出物の一例として、Anthos-vinとして参照され、GRAP’SUDによって市販される、１０重量％のマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドを含むブドウ果皮の抽出物に言及することができる。

本発明による組成物における植物抽出物の重量による含有率は、０．１％から５０％まで、好ましくは１％から４０％までの範囲である。

プロポリスは、粘稠性を有する樹脂、粘性物質及びバルサム（balsam）物質の集合物であって、これを巣に輸送し並びに自身の唾液分泌及びワックスの添加によってこれを或る程度改良するハチによって、植物の或る特定の部分、特に芽（buds）及び樹皮（barks）上に収集される、粘稠性を有する樹脂、粘性物質及びバルサム物質の集合物を指す。これらの植物は、主として、木、例えばマツ、モミ、トウヒ、ポプラ、ハン、ヤナギ、トチノキ、カバノキ、スモモの木、セイヨウトネリコ（ashes）、オーク又はさらにはニレである。

プロポリス抽出物は、適用することができるプロポリスの一形態を意味する。したがって、それは、変形されていなくても、又は処理されていなくてもよく、又は他には、特に、好適な賦形剤、例えばイナゴマメ、デンプン又はデンプン誘導体、例えばマルトデキストリンの存在下で変形されていてもよい。プロポリスは、特に、粉末として提示されてもよい。このために、プロポリスを、担体として賦形剤、例えばマルトデキストリン又はイナゴマメ粉末が追加される水アルコール溶液と混合してもよい。それによって取得される混合物を、蒸発させ、その後乾燥させる。１８％のプロポリス及び８２％のイナゴマメ粉末を含むプロポリス抽出物が、LUSTRELによって、propolis PPM 18の名称で、さらに市販されている。６０％のプロポリス及び４０％のイナゴマメを含むプロポリス抽出物の別の例が、Plantexによって市販されている。

本発明による組成物におけるプロポリス抽出物の重量による含有率は、２０％から８０％まで、好ましくは３０％から７０％までの範囲である。

本発明によれば、プロポリス抽出物は、０．００１％から０．２％まで、好ましくは０．００５％から０．１５％までの重量による含有率のコーヒー酸又はそのエステルのうちの１つ、０．０００１％から０．００５％まで、好ましくは０．０００５％から０．００３％までの重量による含有率のフェルラ酸、０．０５％から１０％まで、好ましくは０．１％から６％までの重量による含有率のガランギン、及び０．１％から５％まで、好ましくは０．２％から３％までの重量による含有率のピノセムブリンを含む。

コーヒー酸又は（Ｅ）３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン酸は、以下の式を有するヒドロキシカルボン酸である：

フェルラ酸又は３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパ−２−エン酸は、以下の式を有するヒドロキシカルボン酸である：

ガランギン又は３，５，７−トリヒドロキシ−２−フェニルクロメン−４−オンは、以下の式を有するフラボノイド誘導体である：

ピノセムブリン又は（２Ｒ，３Ｒ）−３，５，７−トリヒドロキシ−２−フェニル−クロマン−４−オンは、以下の式を有するフラボノイド誘導体である：

さらに、本発明による組成物は、鎮痛剤、好ましくはカプサイシン、有利には赤唐辛子（Cayenne peppers）から得られるカプサイシン、抗細菌剤、好ましくはクランベリー抽出物、有利にはVaccinium macrocarponクランベリーの抽出物、抗炎症剤、又はそれらの混合物から選択され得る、少なくとも１つの付加的な活性化合物も含み得る。

一実施形態では、本発明による組成物は、カプサイシン又は抗炎症剤又はそれらの混合物も含む。

本発明による組成物におけるカプサイシンの重量による含有率は、０．０１％から０．１％まで、好ましくは０．０２５％から０．０７５％までの範囲である。

クランベリー抽出物の例として、文献（ＷＯ２０１１／０２０９５７）に記載されるもの、特にExocyan CRAN 20Sとして参照されTournay Biotechnologiesによって市販されるものに言及することができる。

本発明による組成物におけるクランベリー抽出物の重量による含有率は、５％から４０％までの範囲である。

さらに、本発明による組成物は、食品成分も含み得る。

有利に、食品成分はピペリンである。

ピペリンは、様々な供給源、例えばマッシュルーム、又は黒コショウ、白コショウ若しくはグレイペッパーから得ることができる。

有利には、ピペリンは、黒コショウ、白コショウ又はグレイペッパー、好ましくは黒コショウから得られる。一例としては、１０％から１５％までのピペリンを含む、Plantexによって市販される、コショウの乾燥抽出物に言及することができる。

具体的にいかなる理論にも拘束されるものではないが、ピペリンは、本発明による組成物中に存在する活性化合物、特にマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシド、コーヒー酸又はそのエステルのうちの１つ、フェルラ酸、ガランギン及び／又はピノセムブリンの吸収及びバイオアバイラビリティを促進することができ、したがって、本発明による組成物の抗炎症有効性の改善を可能とする。

本発明によれば、本発明による組成物におけるピペリンの重量による含有率は、０．０１％から４％まで、好ましくは０．１％から１％までの範囲である。

食品成分は、亜鉛及びその誘導体によって形成される群において選択することもできる。

本発明によれば、亜鉛誘導体は、亜鉛塩、例えばクエン酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛又はグルコン酸亜鉛から選択することができる。

有利には、亜鉛塩は硫酸亜鉛である。

本発明によれば、本発明による組成物における亜鉛又はその誘導体の１つの重量による含有率は、０．０１％から２％まで、好ましくは０．１％から１．５％までの範囲である。

本発明の別の態様は、本発明による組成物の調製であって、
（ｉ）少なくとも５重量％、好ましくは５重量％から２０重量％まで、有利には５重量％から１５重量％までのマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドを含む植物抽出物を調製する工程、
（ｉｉ）（ｉ）由来の抽出物とプロポリス抽出物とを混合する工程
を含む、本発明による組成物の調製に関する。

有利には、本発明は、本発明による組成物の調製であって、
（ｉ）少なくとも１つの赤ブドウの絞りかすを選択すること及び前記絞りかすのポリフェノール画分を濃縮することによって取得されるブドウ果皮抽出物を調製する工程、並びに
（ｉｉ）（ｉ）由来の抽出物とプロポリス抽出物とを混合する工程
を含む、本発明による組成物の調製に関する。

有利には、本発明は、本発明による組成物の調製であって、
（ｉ）少なくとも１つの赤ブドウの絞りかすを選択すること及び前記絞りかすのポリフェノール画分を濃縮することによって取得されるブドウ果皮抽出物を調製する工程であって、前記ブドウ果皮抽出物が、少なくとも５重量％、好ましくは５重量％から２０重量％まで、有利には５重量％から１５重量％までのマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドを含む、ブドウ果皮抽出物を調製する工程、並びに
（ｉｉ）（ｉ）由来の抽出物とプロポリス抽出物とを混合する工程
を含む、本発明による組成物の調製に関する。

ブドウ果皮抽出物及びプロポリス抽出物に対して示される本発明による組成物の種々の特徴又は好ましい態様の全体並びにそれらの含有物に対するものは、本発明による方法にも適用される。

本発明による組成物は、固体形態又は液体形態で提示され得る。

特定の実施形態では、本発明は、
（ａ）植物抽出物を含む第１の組成物、
（ｂ）プロポリス抽出物を含む第２の組成物
を含むキットを提供する。

植物抽出物（ａ）及びプロポリス抽出物（ｂ）に対して示される本発明による組成物の種々の特徴又は好ましい態様の全体並びにそれらの含有物に対するものは、本発明によるキットにも適用される。

本発明の別の態様は、本発明による組成物を含む補助食品（food supplement）に関する。

一実施形態では、補助食品は、急性又は慢性の炎症性疾患を低減、治療及び／又は予防する可能性をもたらす。

急性又は慢性の炎症性疾患は、急性又は慢性の炎症プロセスを伴う任意の病態又は障害を意味する。

炎症を伴う多くのヒトの病態、特に関節炎；リウマチ性多発性関節炎；紅斑性狼瘡、特に全身性紅斑性狼瘡；橋本甲状腺炎、多発性硬化症、特に播種性硬化症（disseminated sclerosis）；糖尿病、特に自己免疫性糖尿病；ブドウ膜炎、皮膚炎；乾癬；蕁麻疹；炎症性ネフローゼ症候群；糸球体腎炎；炎症性結腸疾患；潰瘍性大腸炎；セリアック病；クローン病；シェーグレン症候群；アレルギー；喘息；アレルギー性喘息；鼻炎；湿疹；子宮内膜症；臓器移植、若しくは宿主に対する移植片の反応に関連する疾患；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気管支炎、特に慢性気管支炎；パーキンソン病；アルツハイマー病、又は炎症性皮膚疾患が知られている。

好ましい実施形態では、本発明による補助食品は、関節炎を治療及び／又は予防することが意図される。

補助食品は、賦形剤、又は、例えば植物起源のゲル化剤、好ましくはゼラチンから選択される、不活性な非毒性担体をさらに含み得る。

不活性な賦形剤としては、糖、例えばラクトース又はフルクトース、セルロース、炭酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク（talcum）、コロイド性非晶質シリカに言及することができる。

補助食品は、ポリオール、例えばグリセリン若しくはソルビトール；着色料；甘味料、例えばスクラロース、又は芳香性活性物質、例えばエチルバニリン若しくはメントールによって形成される群から選択される化合物も含み得る。

本発明による補助食品は、粉末、ゼラチンカプセル、カプセル、チューインガム、顆粒、粒状物（granulates）、カシェ、ピル、ロゼンジ、カプレット又は錠剤として提示され得る。調剤（Galenic）適用が、供給された成分の結着性と活性成分の生物活性とが観察される温度及び圧力の条件下で実施される。

本発明による組成物が補助食品として提示される場合、１日有効用量（推奨１日許容量（ＲＤＡ）と称される）の本発明による組成物が、投与される。ＲＤＡは、２４時間の期間にわたって消費される本発明による組成物の用量（dose）を意味する。

ＲＤＡは特に、１００ｍｇと４００ｍｇとの間の植物抽出物及び２５０ｍｇと１，０００ｍｇとの間のプロポリス抽出物を含む、本発明による組成物の量を意味する。

補助食品、例えばゼラチンカプセルとしての補助食品を投与するための投与量は、炎症の性質及び重篤度に依存して、１日当たりゼラチンカプセル２個から８個まで変動してもよく、必要に応じて更新される。

本発明の別の態様は、急性又は慢性の炎症性疾患を治療及び／又は予防するための、特に関節炎を治療及び／又は予防することが意図される、本発明による組成物を含む、局所的使用のための組成物に関する。

局所的使用のための組成物は、油中水型、水中油型、水中油中水型、油中水中油型のエマルション、又は無水製剤の形態で提示され得る。組成物は、クリーム、軟膏又はゲル等の外用のための調剤形態で提示され得る。

本発明によれば、組成物の局所的使用は、炎症を示す皮膚の領域（複数の場合もあり）上にそれを塗ることによって適用される。

本発明の別の態様は、急性又は慢性の炎症性疾患を治療及び／又は予防するための、特に関節炎を治療及び／又は予防することが意図される、本発明による組成物を含む薬剤にも関する。

本発明の別の態様は、急性又は慢性の炎症性疾患を治療及び／又は予防するための本発明による組成物の、哺乳動物、特にヒトにおける経口経路又は局所的適用を介する投与を含む、治療方法にさらに関し、本発明による組成物は例えば、上で規定したような補助食品、局所的使用のための組成物、又は薬剤として提示され得る。

好ましい実施形態では、治療方法は、関節炎を治療及び／又は予防するための本発明による組成物の、経口経路又は局所的適用を介する投与を含む。

この治療は、抗炎症療法的治療、特に抗炎症剤、特にステロイド性抗炎症剤又は非ステロイド性抗炎症剤から選択される抗炎症剤の投与と、併用してもよい。

本発明の別の態様は、したがって、本発明の目的は、治療的又は予防的な抗炎症治療を進めるための、これを完了させるための、及び／又はこれの後に行うための、本発明による組成物の使用でもある。これは、施術者が、それを必要とする患者に対して、治療の過程において、抗炎症剤による治療を行う前に、これを行っている時に、及び／又はこれを行った後に、本発明による補助食品若しくは薬剤を消費すること、又は、本発明による局所的使用のための組成物を適用することを指示することを意味する。

本発明の別の態様は、
− 植物抽出物（ａ）及びプロポリス抽出物（ｂ）を含む第１の組成物、
− 抗炎症剤を含む第２の組成物
を含むキットに関する。

植物抽出物（ａ）及びプロポリス抽出物（ｂ）に対して示される本発明による組成物の種々の特徴又は好ましい態様の全体並びにそれらの含有物及びそれらの比率に対するものは、本発明によるキットにも適用される。

本発明によるキットにおいて使用される抗炎症剤は、ステロイド性抗炎症剤又は非ステロイド性抗炎症剤から選択され得る。

本発明の様々な態様は、以下の実施例を読むことによって、より良好に理解される。これらの実施例は、なんらの限定も伴わず、表示として提示される。

実施例１：ブドウ果皮抽出物の製造
メルロー、カベルネ及びシラーのワインのブドウから赤ブドウの絞りかすを選択した後、二酸化硫黄の水性分散物の存在下で拡散を行う。

７０００Ｇと７５００Ｇとの間の重力及び１０ｓから２０ｓまでの範囲の滞留時間による遠心分離を、その後、それによって取得される製造物に適用する。

この遠心分離の終了時に、製造物中のポリフェノールを蒸発によって濃縮し、それによって取得される製造物は、３０％から３５％までの範囲の乾燥物質含有率によって特徴付けられる。

その後、５０絶対ｍｂａｒまで減圧される真空での濃縮を行い、それによって取得される濃縮物は、３５％以上の乾燥物質含有率によって特徴付けられる。

それによって取得される濃縮物をその後、噴霧化によって脱水する。したがって、濃縮物を、わずかに減圧される高温空気中で噴霧する。

それによって取得される製造物は、１０重量％に等しいマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドの含有率によって特徴付けられ、１０％未満の相対湿度を有する粉末として提示される。

実施例２：プロポリス抽出物の製造
粗プロポリスを回収した後、これを、水アルコール溶液中に投入し、濾過し、真空で濃縮し、その後、殺菌する。その後、これを、担体としてのイナゴマメ粉末と混合し、その後、噴霧化による乾燥工程（噴霧乾燥）を混合物に適用し、その後、前記混合物を検査する。それによって取得されるプロポリス抽出物は、６０％の活性プロポリスを含有する粉末として提示される。

プロポリス抽出物は、０．０５％に等しいコーヒー酸、０．００１％に等しいフェルラ酸、１．６％に等しいガランギン、及び１％に等しいピノセムブリンの、重量による平均含有率によって特徴付けられる。

実施例３：本発明による組成物を含むゼラチンカプセルの形態の補助食品
− ブドウ果皮抽出物^（１） ０．１００ｇ
− プロポリス抽出物^（２） ０．２００ｇ
（１）Grap'Sudによって市販されるAnthos-Vin
（２）Plantexによって市販されるプロポリス

実施例３による組成物は、粉末として提示され、ゼラチンカプセルにおいて調整され、使用の投与量は、１日ゼラチンカプセル２個から４個までであり、必要に応じて更新される。

実施例４及び５：本発明による組成物を含むゼラチンカプセルの形態の補助食品

実施例４による組成物は、粉末として提示され、ゼラチンカプセルにおいて調整される。

使用の投与量は、１日当たりゼラチンカプセル２個から６個までであり、必要に応じて更新される。

実施例５による組成物は、粉末として提示され、ゼラチンカプセルにおいて調整される。

フラッシュ処理（flash treatment）における投与量は、最初の４８時間については１２時間ごとにゼラチンカプセル４個であり、その後、次の４８時間については１２時間ごとにゼラチンカプセル２個であり、必要に応じて、次の４８時間においては１２時間ごとにゼラチンカプセル１個から２個までである。

予防的治療における投与量は、ゼラチンカプセル１個から２個までであり、必要に応じて更新される。

実施例６、７及び８：本発明による組成物を含むゼラチンカプセルの形態の補助食品

実施例６、７及び８による組成物は、粉末として提示され、ゼラチンカプセルにおいて調整される。

予防的治療におけるそれらの使用の投与量は、３０日間、１日ゼラチンカプセル２個であり、必要に応じて更新される。

フラッシュ処理におけるそれらの使用の投与量は、５日間、１２時間ごとにゼラチンカプセル２個である。

実施例９：本発明による組成物を含むゲルとしての局所組成物

組成物は、ブドウ果皮抽出物の水アルコール溶液とプロポリス抽出物の水アルコール溶液とを混合すること、その後、ゲル化剤及び水和剤を添加し、最後に、所望のテクスチャーを得るために水及び保存料によって体積を調節すること（the balance）によって調製される。

適用回数は、１日適用１回から４回であり、必要に応じて更新される。

実施例１０：ブドウ果皮抽出物、プロポリス抽出物、並びに、付加的な活性化合物としてのクランベリー抽出物の血液毒性の研究
この研究の目的は、本発明による組成物中に組み込まれ得る様々な抽出物が、ヒトの細胞に対する毒性作用を有しないことを示すことである。

細胞培養及びサイトカインアッセイを実施した。

評価される３種類の抽出物は以下である：
− １００％エタノール中に３３１ｍｇ／ｍｌまで再懸濁された、ブドウ果皮抽出物（Anthos-vin）
− ７０％エタノール中に５００ｍｇ／ｍｌまで再懸濁された、プロポリス抽出物
− ９０％メタノール中に５０ｍｇ／ｍｌまで再懸濁された、クランベリー抽出物。

ヒト単核細胞を、３名の異なる健康なドナーの末梢血液から単離した。使用した技法は、フィコール勾配における単離であった。フィコールと血漿との間に、単球及びリンパ球からなる細胞の環が確立される。後者を回収し、Malassez Cell上での計数のためにＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中で洗浄する。

血液単核細胞（ＰＢＭＣ、末梢血単核球）を、１０％の無添加（decomplemented）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と、細菌感染を回避するための抗生物質：ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）と、ストレプトアビジン（１００μｇ／ｍｌ）とを添加したＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所）培地中で、血液毒性試験のために、９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりの細胞数１０^５の量で培養する（１０^６／ｍｌ）。

ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）を用いる細胞増殖試験は、増殖する生細胞の数を決定するための比色法である。この試験は、ＭＴＳの、細胞培養培地に可溶性のホルマザン（呈色生成物）への変換を使用する。ホルマザンの吸光度は、分光光度計を用いて４９０ｎｍで直接読み取ることができる。ＭＴＳの可溶性ホルマザンへの還元は、活性型細胞の代謝に関与するデヒドロゲナーゼによって誘導される。

ＰＢＭＣを、無活動条件（未処理（naive）細胞）で、又は増殖条件（０．５μｇ／ｍｌのバクトフィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ（Difco））の存在下で）で、９６ウェルプレートの１ウェル当たりの細胞数１０^５の量で培養する。ＰＨＡは、Ｔリンパ球に対する有糸分裂活性を有し、それらの増殖を誘導する。

抽出物を、抽出物を試験しなかったＰＢＭＣと比較して、２名の異なるドナー由来のＰＢＭＣに対して、Anthos-vinについては８、１７、３３及び６６μｇ／ｍｌ、並びにプロポリス及びクランベリーについては５、２０、５０及び１００μｇ／ｍｌという異なる濃度で、４連で試験した。

３種類の抽出物が、プロポリス抽出物及びクランベリー抽出物については２００μｇ／ｍｌ、並びにブドウ果皮抽出物については６６μｇ／ｍｌに及ぶ濃度で試験されたが、３種類の抽出物のうちのいずれも、培養物中の２つのドナーの造血細胞に対する細胞毒性を示さなかった。

ブドウ果皮抽出物及びプロポリス抽出物を含む組成物においても、又はブドウ果皮抽出物、プロポリス抽出物及びクランベリー抽出物を含む組成物においても、毒性は観察されなかった。

実施例１１：本発明による組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗炎症活性の研究
この研究は、本発明による組成物、ブドウ果皮抽出物（Anthos-vin）及びプロポリス抽出物を含む第１の組成物、並びにブドウ果皮抽出物（Anthos-vin）、プロポリス抽出物及びクランベリー抽出物を含む第２の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗炎症活性を実証する目的を有する。

細胞培養及びサイトカインアッセイを実施した。

以下の組成物を試験した：
本発明による組成物：
− ８μｇ／ｍｌのAnthos-vin及び２５μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物を含む組成物、
− １６μｇ／ｍｌのAnthos-vin及び５０μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物を含む組成物、
− ３３μｇ／ｍｌのAnthos-vin及び１００μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物を含む組成物、
− ８μｇ／ｍｌのAnthos-vin、２５μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物及び２５μｇ／ｍｌのクランベリー抽出物を含む組成物、
− １６μｇ／ｍｌのAnthos-vin、５０μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物及び５０μｇ／ｍｌのクランベリー抽出物を含む組成物、
− ３３μｇ／ｍｌのAnthos-vin、１００μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物及び１００μｇ／ｍｌのクランベリー抽出物を含む組成物。

基準組成物：
− ８μｇ／ｍｌのAnthos-vinを含む組成物、
− １６μｇ／ｍｌのAnthos-vinを含む組成物、
− ３３μｇ／ｍｌのAnthos-vinを含む組成物、
− ２５μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物を含む組成物、
− ５０μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物を含む組成物、
− １００μｇ／ｍｌのプロポリス抽出物を含む組成物、
− ２５μｇ／ｍｌのクランベリー抽出物を含む組成物、
− ５０μｇ／ｍｌのクランベリー抽出物を含む組成物、
− １００μｇ／ｍｌのクランベリー抽出物を含む組成物。

ＰＢＭＣを、３名の異なる健康なドナーの末梢血液から単離した。使用した技法は、フィコール勾配における単離であった。フィコールと血漿との間に、単球及びリンパ球からなる細胞の環が確立される。後者を回収し、Malassez Cell上での計数のためにＰＢＳで洗浄する。

ラットのマクロファージを、ＰＢＳで動物の腹膜を洗浄することによって、後者の遠心分離、及びMalassez Cell上での計数のためのＰＢＳにおける洗浄によって、単離した。

ＰＢＭＣを、１０％の無添加ＦＣＳと、抗生物質：ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）と、ストレプトアビジン（１００μｇ／ｍｌ）とを添加したＲＰＭＩ培地中で、２４ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりの細胞数５．１０^５の量で培養した（１０^６／ｍｌ）。

ラットのマクロファージを、１０％の無添加ＦＣＳと、抗生物質：ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）と、ストレプトアビジン（１００μｇ／ｍｌ）とを添加したＲＰＭＩ培地中で、２４ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりの細胞数５．１０^５の量で培養した（１０^６／ｍｌ）。

ＰＢＭＣ及びラットのマクロファージにおける炎症反応を誘導するために、細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（細菌のリポ多糖、炎症促進性生成物）の存在下で４８時間インキュベートする。

ＮＯのアッセイ：ラット腹膜マクロファージの４８時間の培養の後、上清をサンプリングした。ＮＯは高い化学反応性を有する。水の存在下で、このフリーラジカルは、化学量論的に迅速に酸化され、したがって、下記反応に従って亜硝酸イオン（ＮＯ_２ ⁻）を形成する。
４ＮＯ^０ ＋ Ｏ_２ ＋ Ｈ_２Ｏ → ４ＮＯ_２ ⁻ ＋ ４Ｈ^＋

亜硝酸化合物は、培地中に蓄積し、Griessの方法によって容易に化学的に検出可能である（Kolb et al., 1994）：
− Griess Ａ：１．２Ｎ ＨＣｌ中の１％スルファニルアミド、
− Griess Ｂ：蒸留水中の０．３％ナフチレンジアミン二塩酸。

６０μｌのGriess Ａ及び６０μｌのGriess Ｂに、アッセイ対象の５０μｌの培養上清を添加した。比色反応が、光から離れて、１０分間、発生した。５４０ｎｍで取得された光学密度を、培養培地のみを含有するウェルにおいて取得されたＯＤの減算によって、補正した。

炎症のメディエーターのアッセイ：ＰＢＭＣのＬＰＳによる活性化の４８時間後、２５μｌの細胞上清を、サンプリングして、即座に、FlowCytomix技法によって炎症促進性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインをアッセイするために試験した。

Human FlowCytomixは、培養上清中のインターフェロン−γ、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２ｐ７０並びに腫瘍壊死因子α及びβのフローサイトメトリーによる定量的検出のために蛍光ビーズを用いるイムノアッセイシステムである。

マイクロスフェアを、多重システムによって検出される各サイトカインに特異的に指向性を有する抗体でコーティングした。ビーズは、それらのサイズによって、及びそれらのスペクトル放出によって、識別することができる。各サイトカインに対する各々のコーティングされたビーズの混合物を、試料又は標準範囲とともにインキュベートした。試料中に存在するサイトカインは、蛍光ビーズと結合した抗体と結合する。ビオチンと連結された第２の抗体を、混合物に添加した。この特異的抗体は、第１の抗体によって捕捉されたサイトカインと結合する。

ストレプトアビジン−フィコエリトリンを添加した。これは、ビオチン複合体と結合し、蛍光シグナルを放出する。

プロスタグランジンＥ_２のアッセイ：エイコサノイドのシグナルの伝達経路は、高度に保存されており、多くの生理病理学的プロセスに関与する。プロスタグランジンは、この酸をプロスタグランジンＨ_２（ＰＧＨ_２）に変換する、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）によってアラキドン酸から合成される。後者は、その後、ミクロソーム又はサイトゾルのプロスタグランジンシンターゼによって、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）又は様々な他のプロスタノイドへと変換される。

ＰＧＥ_２は、広範な組織によって、並びに、炎症、関節炎、発熱、組織損傷、子宮内膜症及び多くの癌を含む多くの生理病理学的状態において、生成される。

ＰＧＥ_２を、ＥＬＩＳＡアッセイキット（Tebu-Bio, Le Perray en Yvelines, France）を用いて、培養上清においてアッセイした。

ＰＢＭＣのＬＰＳによる活性化の４８時間後、１００μｌの細胞上清を、サンプリングし、即座に、ＰＧＥ_２をアッセイするために試験する。

表１は、取得された結果を示し、炎症促進性メディエーターのレベルに対する様々な組成物の効果を示す。

これらの結果は、Anthos-vin及びプロポリスを含む本発明による組成物が、Anthos-vin又はプロポリスを単独で含む組成物よりも良好な全体的な抗炎症作用を有することを示す。

これらの結果は、クランベリー単独が、抗炎症作用についてほとんど影響を有しないのに対して、Anthos-vin、プロポリス及びクランベリーを含む本発明による組成物が、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γに対して顕著な作用を有することも示す。

これらの結果を確認するために、（３３μｇのAnthos-vin＋１００μｇのプロポリス抽出物）／ｍｌを含む本発明による組成物を、ヒトにおける炎症性分子をコードする遺伝子の転写に関して、試験した。

細胞培養及びサイトカインアッセイを実施した。

ヒト単核細胞を、ドナーの末梢血液から単離した。使用した技法は、フィコール勾配における単離であった。フィコールと血漿との間に、単球及びリンパ球からなる細胞の環が確立された。後者を、回収し、Malassez Cell上での計数のためにＰＢＳ中で洗浄した。

ＰＢＭＣを、１０％の無添加ＦＣＳと、抗生物質：ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）と、ストレプトアビジン（１００μｇ／ｍｌ）とを添加したＲＰＭＩ培地中で、６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりの細胞数１．１０^７の量で培養した（１０^６／ｍｌ）。

炎症反応を、ＰＢＭＣにおいて誘導した。迅速に、細胞を、ＬＰＳの存在下でインキュベートした。

定量的ＰＣＲが、８４種類の主要遺伝子のプロファイリングの可能性をもたらす。

炎症レベルで、リアルタイムＰＣＲは、主要な炎症促進性／抗炎症性メディエーター（ケモカイン、ケモカインに対する受容体、サイトカイン、サイトカインに対する受容体、及び炎症パターンに関連する遺伝子）を表す８４種類の遺伝子に加えて、シグナル伝達、アポトーシス及び細胞周期に関与する遺伝子の遺伝子発現の測定を可能とする。リアルタイムＰＣＲを使用することによって、炎症反応に関する標的遺伝子パネルの発現を解析することが可能である。

標的遺伝子を以下に列挙する：
伝達群の分子：ＦＯＳ、ＨＳＦ１、ＨＳＰ９０ＡＡ２、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰＢ１、ＪＵＮ、ＩＫＢＫＢ、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ１、ＮＯＸ５、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＴＡＮＫ；
アポトーシス経路に関与する分子：ＢＡＤ、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ９、ＴＰ５３；
接着分子：ＩＣＡＭ１、ＩＴＧＡＸ、ＳＥＬＥ、ＳＥＬＰＬＧ、ＶＣＡＭ１；
細胞周期の分子：ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ１１；
ケモカイン及びサイトカイン：ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＩＦＮＡ２、ＩＦＲ１、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ２２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＭＩＦ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３；
サイトカインの受容体：ＩＬ１ＲＮ；
ＴＮＦのリガンド及び受容体：ＣＤ４０ＬＧ、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＬＴＡ（ＬＴ−ａ）、ＬＴＢ（ＬＴ−ｂ）、ＴＮＦ（ＴＮＦ−ａ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ。

炎症性応答に関与する他の因子：Ｃ３、ＣＡＴ、ＣＲＰ、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＧＰＸ１、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＮＯＳ、ＮＯＳ２Ａ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２。

抽出キット（Qiagen, France）を用いて、細胞の全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを、この材料の全体を検査するために、定性的に及び定量的に解析した。リボソーム２８Ｓ及び１６Ｓ ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ並びにメッセンジャーＲＮＡの存在を検証（定性測定）するために、ＲＮＡ試料を、泳動のために８０Ｖで１％アガロースゲルに注入した。

さらに、このＲＮＡを、タンパク質汚染物質が存在しないことについて定量化及び検査するために、２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでアッセイした。

１μｇのＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲのために使用した。キット（eBioscience, France）を用いて、ＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写し、その後、ＰＣＲによって増幅した。

増幅と同時に、蛍光プローブ（Sybergreen）の使用が、ゲノム塩基の遺伝子のリアルタイム測定を可能とした。結果の全体を、好適なソフトウェアパッケージを用いて解析した。

さらに、リアルタイムＰＣＲ装置の使用が必要とされる（Stratagene MX3000P）。

以下の表２は、処理されていない細胞と比較した場合の、本発明による組成物とともにインキュベートされた細胞における炎症促進性遺伝子の転写の主要な顕著な変更を示す。

結果は、炎症と関連する遺伝子の大部分（ＩＬ−１、Ｃ３、ＩＬ−６及びＩＬ−８）が抑制されることを示す。

さらに、本発明による組成物の存在下において、その両方が抗炎症作用について既知の分子であるＴＧＦβ２及びインターフェロン−αの転写が、増大する。

さらに、結果は、細胞の保護タンパク質（ＨＳＰ、ＤＡＸ、ＢＣＬ−２、ＳＯＤ１）をコードするＲＮＡが増大することも示し、このことは、ヒトの細胞に対する本発明による組成物の毒性がないことを確認する。

実施例１２：本発明による組成物のｉｎ ｖｉｖｏ抗炎症活性の研究
この研究は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究の結果を確認することを目的として実施された。このために、本発明による様々な組成物を、関節炎ラットモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。このモデルは、細菌抗原を注射することによって、若齢ラットにおいて慢性炎症発作を発症させることからなる。このモデルは、ヒトにおけるリウマチ性多発性関節炎の症状と多くの類似性（すなわち、関与する間接の対称性、優先的に影響を受ける末梢関節、滑膜の過形成、炎症細胞の浸潤、周辺部の腐食（marginal erosions）、及び、雌性における疾患のより良好な易罹患性）を有するという利点を有する。ヒトのリウマチ性多発性関節炎とは異なり、血清中に微量のリウマチ因子は検出されない。

ラットの炎症状態は（ヒトと比較して）非常に進行しており、特に経口経路を介して、ヒトに使用される治療的用量よりも１０〜２０倍大きい治療的用量を必要とする（皮質療法（corticotherapy）で実施された試験）ことに留意すべきである。

６週齢の雌性Lewisラットを、熱によって殺し油性溶液中で乳化したマイコバクテリウム・ブチリカム（Mycobacterium butyricum）６０ｍｇの、尾の基部における皮内注射によって免疫化した。

Ｊ＋７で、同条件下での第２の免疫化を実施した。最初の臨床徴候は、Ｊ＋１４で現れる。

ラットは、末梢関節（基本的に、後肢）で関節炎を急速に発症し、関連する関節の準麻痺及び骨組織の破壊性腐食によって表される滑膜腔の強い炎症反応を伴う。多くの病理学的モデルと同様に、動物は、強度の体重減少を経験する。

炎症症状を、予め確立された臨床スコアに従って、評価し、表３に要約する。

マイコバクテリウム・ブチリカムによる第１の免疫化の前の７日間、ラットを、複数の群に分離する：
− 群１：ネガティブコントロール、健康なラット；
− 群２：ポジティブコントロール、実験的関節炎を有し、いかなる治療もおこなわれないラット；
− 群３：症状の発生の１日目から、５用量（２日ごとに１回）の、動物１ｋｇ当たり及び１用量当たり３０ｍｇのAnthos-vin及び１００ｍｇのプロポリス抽出物を含む本発明による組成物の投与を受ける関節炎ラット；
− 群４：症状の１日目から研究の終了（Ｊ＋５０）まで、動物１ｋｇ当たり及び１用量当たり３０ｍｇのAnthos-vin及び１００ｍｇのプロポリス抽出物を含む用量の本発明による組成物の投与を２日ごとに継続的に受ける関節炎ラット；
− 群５：症状の発生の１日目から、５用量（２日ごとに１回）の、動物１ｋｇ当たり及び１用量当たり１５０ｍｇのAnthos-vin及び５００ｍｇのプロポリス抽出物を含む本発明による組成物の投与を受ける関節炎ラット；
− 群６：症状の１日目から研究の終了（Ｊ＋５０）まで、動物１ｋｇ当たり及び１用量当たり１５０ｍｇのAnthos-vin及び５００ｍｇのプロポリス抽出物を含む用量の本発明による組成物の投与を２日ごとに継続的に受ける関節炎ラット。

症状の発生から、群３、４、５及び６のラットは、それらの治療を、２日ごとに、すなわち１０日間（群３及び５）、又は継続的に（群４及び６）、経口的に受ける（強制給餌）。

ラットを、毎日秤量し、それらの臨床スコアを記録する。

研究の結果を、表４及び５に示す。

本発明による組成物のうちの１つで処理されたラットの全体は、非処理ラットと比較して、はるかに小さい臨床スコアを有する。

本発明による組成物は、病理学的徴候の重症度を強く低減する。罹患した下肢の数及び後者の炎症は、かなりの程度低減される。

適度な用量の投与を連続的に受けるラット（群４及び６）が、５用量の投与を受ける他のラット（群３及び５）と比較して、より良好な応答を示すことに留意すべきである。

さらに、群３、４、５及び６のラットにおいて、明らかな毒性は観察されなかった（また、出血も、嘔気も、下痢も、食欲喪失も観察されなかった）。

これらの結果は、試験された本発明による組成物が、病理学的徴候の重大性を非常に顕著に低減する可能性をもたらすことを確認する。

Claims (16)

1. ａ．少なくとも５重量％、好ましくは５重量％から２０重量％まで、有利には５重量％から１５重量％までのマルビジン−３−Ｏ−β−グルコシドを含む植物抽出物；並びに
   ｂ．コーヒー酸又はそのエステルのうちの１つ、フェルラ酸、ガランギン及びピノセムブリンを含むプロポリス抽出物；
   を含む抗炎症組成物であって、
   植物抽出物／プロポリス抽出物（ａ／ｂ）の重量比が、１／４から４／１までの範囲である、抗炎症組成物。
2. 前記植物抽出物が、少なくとも赤ブドウの絞りかすのポリフェノール画分の濃縮を含む方法によって取得される又は取得することができる、ブドウ果皮抽出物である、請求項１に記載の組成物。
3. − ０．１重量％から５０重量％まで、好ましくは１重量％から４０重量％までの植物抽出物、又は
   − ２０重量％から８０重量％まで、好ましくは３０重量％から７０重量％までのプロポリス抽出物、又は
   − ０．１重量％から５０重量％まで、好ましくは１重量％から４０重量％までの植物抽出物、及び２０重量％から８０重量％まで、好ましくは３０重量％から７０重量％までのプロポリス抽出物
   を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記プロポリス抽出物が、
   ０．００１重量％から０．２重量％まで、好ましくは０．００５重量％から０．１５重量％までのコーヒー酸又はそのエステルのうちの１つ；
   ０．０００１重量％から０．００５重量％まで、好ましくは０．０００５重量％から０．００３重量％までのフェルラ酸；
   ０．０５重量％から１０重量％まで、好ましくは０．１重量％から６重量％までのガランギン；
   ０．１重量％から５重量％まで、好ましくは０．２重量％から３重量％までのピノセムブリン
   を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. カプサイシン又は抗炎症剤又はそれらの混合物をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. ０．０１重量％から０．１重量％まで、好ましくは０．０２５重量％から０．０７５重量％までのカプサイシンを含む、請求項５に記載の組成物。
7. 食品成分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記食品成分が、ピペリン又は亜鉛誘導体から選択される、請求項７に記載の組成物。
9. ０．０１重量％から４重量％まで、好ましくは０．１重量％から１重量％までのピペリンを含む、請求項７又は８に記載の組成物。
10. ０．０１重量％から２重量％まで、好ましくは０．１重量％から１．５重量％までの亜鉛誘導体を含む、請求項７又は８に記載の組成物。
11. 固体形態又は液体形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含む補助食品。
13. 急性又は慢性の炎症性疾患を治療又は予防するための、特に関節炎を治療又は予防するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含む、局所的使用のための組成物。
14. 急性又は慢性の炎症性疾患を治療又は予防するための、特に関節炎を治療又は予防するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含む薬剤。
15. − 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の第１の組成物、
    − 抗炎症剤を含む第２の組成物
    を含むキット。
16. （ｉ）少なくとも１つの赤ブドウの絞りかすを選択すること及び前記絞りかすのポリフェノール画分を濃縮することによって取得されるブドウ果皮抽出物を調製する工程、
    （ｉｉ）（ｉ）由来の抽出物とプロポリス抽出物とを混合する工程、
    を含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。