JP2014516580A

JP2014516580A - Ｃｓｐ−ｂ５’−ｓａｒ因子を含む動物細胞発現ベクター、及びそれを利用した組換えタンパク質の製造方法

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Publication number: JP2014516580A
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Inventors: コ・ヨウク; リ・サンヨン; キム・スヨン; ムン・スンキ
Original assignee: チョン・クン・ダン・ホールディングス・コーポレーション
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2014-07-17
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Abstract

本発明は、（ａ）ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲと、（ｂ）動物細胞で作動するプロモーターと、（ｃ）ポリアデニル化配列と、を含む動物細胞用発現ベクター、そして、それを用いて組換えタンパク質を製造する方法に関するものである。本発明のベクターは、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲを含むベクターであって、動物細胞に導入した外来遺伝子の位置による遺伝子発現抑制現象を克服する効果を有し、目的タンパク質の発現率を大きく向上させる。本発明のベクターは、医薬品用組換えタンパク質または抗体を動物細胞で効果的に発現させる。本発明のベクター及びそれを利用した組換えタンパク質の製造方法は、医薬品の産業的量産に非常に有用に使われる。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＣＳＰ−Ｂ（ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＳｅｒｉｎｅＰｒｏｔｅａｓｅ−Ｂ、細胞毒性セリンプロテアーゼ−Ｂ）の５’−ＳＡＲ（５’−ｓｃａｆｆｏｌｄｏｒｍａｔｒｉｘａｔｔａｃｈｍｅｎｔｒｅｇｉｏｎ、５’−足場又はマトリックス付着領域）因子を含む動物細胞発現ベクター、及び該ベクターを用いて組換えタンパク質を製造する方法に関する。

ＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）細胞のような動物細胞に組換えタンパク質をコードする外来遺伝子を導入すれば、臨床的治療のためのタンパク質医薬品を生産することができる。

赤血球増殖因子であるＮＥＳＰ（ＮｏｖｅｌＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）は、ダルベポエチンα（Ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎａｌｆａ）とも呼ばれ、天然型エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）に２つのＮ−連結糖鎖部位が生成されるように、遺伝子操作されたタンパク質医薬品である（ＥｇｒｉｅａｎｄＢｒｏｗｎｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４Ｓｕｐｐｌ．１：３−１０（２００１））。ＮＥＳＰは、造血母細胞を刺激し、赤血球系への分化を促進して赤血球の生成を増加させる。ＮＥＳＰの血清半減期は、既存の組換えエリスロポエチンよりも３倍も長いために、慢性心不全患者の貧血治療で少ない投与頻度で同等の治療効果を期待することができる。

抗悪性腫瘍剤であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、遺伝子組換え技術を用いて製造されたヒト化単クローン抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ）であって、細胞表面にあるヒト表皮増殖因子受容体２（ＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒ２、ＨＥＲ２）に選択的に作用する。原発性乳癌の２５−３０％でＨＥＲ２の過発現が確認されており、トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過発現されたヒトの腫瘍細胞増殖を抑制する。

外来遺伝子は、動物細胞染色体の如何なる位置に挿入されるかによって、その発現率が変わりうるが、周辺の調節因子あるいはクロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）の構造によって、外来遺伝子の発現が影響を受けるためである（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８７，２９−４２（２００１））。

周りのクロマチンが、外来遺伝子の発現に影響を与えないようにするクロマチン因子を使えば、このような位置による遺伝子発現抑制現象（ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ）を克服し、組換えタンパク質を高発現する動物細胞クローンを分離することができる機会を高めて、医薬品生産細胞株を製造する時間を短縮することができる。位置による遺伝子発現抑制現象を克服することができるクロマチン因子を使って、安定的細胞株（ｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅ）を作ろうとする試みがなされており、そのような因子には、ＢＥ（ＢｏｕｎｄａｒｙＥｌｅｍｅｎｔ）、ＳＡＲ／ＭＡＲ（ＳｃａｆｆｏｌｄｏｒＭａｔｒｉｘＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＲｅｇｉｏｎ）、及びＬＣＲ（ＬｏｃｕｓＣｏｎｔｒｏｌＲｅｇｉｏｎ）などがある。

ＳＡＲは、ＭＡＲとも呼ばれる３００−３０００ｂｐ長さのＤＮＡであり、染色体上のクロマチンが細胞核マトリックス（ｎｕｃｌｅａｒｍａｔｒｉｘ）のタンパク質と結合させ、遺伝子の発現を調節すると知られており（Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｅｄ．），ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．Ｃｈａｐｔｅｒ１０（２００３））、形質転換細胞株で外来遺伝子の発現を向上させることができる（Ｐｏｌｊａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２２，４３８６−４３９４（１９９４）；ＫａｌｏｓａｎｄＦｏｕｒｎｉｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１５，１９８−２０７（２００５））。

Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌらは、ニワトリリゾチーム（ｃｈｉｃｋｅｎｌｙｓｏｚｙｍｅ）５’−ＭＡＲをルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）発現ベクターに導入し、このベクターでＣＨＯ細胞を形質転換して安定的細胞（ｓｔａｂｌｅｃｅｌｌ）を作った（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８７，２９−４２（２００１））。ＭＡＲを含まないベクターに形質転換した安定的細胞と比較した時、リゾチーム５’−ＭＡＲを含んだベクターに形質転換した安定的細胞は、さらに高いルシフェラーゼ発現率を表わした。また、リゾチーム５’−ＭＡＲを１コピー含んだベクターの場合よりもＭＡＲを２コピー含んだベクターの場合、さらに高いルシフェラーゼ発現率を表わした。このような結果は、動物細胞発現ベクターにＭＡＲを導入して目的タンパク質の発現率を高めうるということを示す。

特許文献１では、動物細胞発現ベクターにヒトβグロビン（ｈｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ）ＭＡＲを含ませて、動物細胞に外来遺伝子を導入する時に発生する遺伝子発現抑制現象を克服した。この特許には、ヒトβグロビンＭＡＲ以外に、ＧｅｎＢａｎｋＭ８３１３７に登録されているヒトインターフェロンβ（ｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）ＭＡＲとＧｅｎＢａｎｋＭ６２７１６に登録されているヒトＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲとが使われ、この３種のＳＡＲ／ＭＡＲが目的タンパク質であるβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の発現率を向上させることを記述した。また、この特許には、βグロビンＭＡＲがインターフェロンβＭＡＲまたはＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲよりも効果に優れているという研究結果が公知されている。

特許文献２では、動物細胞発現ベクターにヒトインターフェロンβＭＡＲを導入して、外来遺伝子の発現を増加させ、効率的に組換えタンパク質を発現させた。また、特許文献３では、動物細胞発現ベクターにヒトβグロビンＭＡＲを２コピー含ませて、βグロビンＭＡＲが１コピーである場合よりもさらに優れているように目的タンパク質の発現率を向上させることを記述した。この特許には、ＭＡＲ因子１コピーと２コピーとの比較研究結果が記述されており、ＭＡＲ因子２コピーと３コピーとの比較研究内容が記載されていない。

ＨａｎｓｏｎとＬｅｙは、約７０ｋｂのヒト染色体１４ｑ１１．２造血セリンプロテアーゼ遺伝子群（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒ）からＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲと３’−ＳＡＲとを探し出して塩基配列を明らかにし、これらＳＡＲが細胞の核で由来するスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と結合することを生体外実験（ｉｎｖｉｔｒｏ）で確認した（ＨａｎｓｏｎａｎｄＬｅｙ，Ｂｌｏｏｄ，７９，６１０−６１８（１９９２））。

ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲと３’−ＳＡＲとの塩基配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋＭ６２７１７とＭ６２７１６とに登録されており、その長さは、それぞれ２４２９ｂｐと１２３３ｂｐであって、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲが３’−ＳＡＲに比べて、２倍程度さらに長い。ＧｅｎＢａｎｋＡＬ１３６０１８には、ヒト染色体１４ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）の塩基配列が登録されており、この配列上でＣＳＰ−Ｂタンパク質を暗号化する遺伝子の翻訳開始コドン（ｃｏｄｏｎ）とその上位（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にある５’−ＳＡＲとの間の長さは、１１９５ｂｐであり、ＣＳＰ−Ｂタンパク質を暗号化する遺伝子の翻訳終結コドンとその下位（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にある３’−ＳＡＲとの間の長さは、４５４３ｂｐである。

本明細書の全般に亘って多数の引用文献及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

大韓民国特許出願番号第２０００−００４３９９６号大韓民国特許出願番号第２００１−００７９２２７号大韓民国特許出願番号第２００７−０１０８４５１号

本発明者らは、動物細胞で組換えタンパク質を効率的に生産することができるベクターを開発するために努力した。その結果、ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲ（ＳｃａｆｆｏｌｄｏｒＭａｔｒｉｘＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＲｅｇｉｏｎ）をベクターに含ませて（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）使う場合に、非常に優れる生産効率で組換えタンパク質を生産できるということを知見し、本発明を完成した。

したがって、本発明は、動物細胞用発現ベクターを提供することである。

本発明の他の目的は、前述した発現ベクターによって形質転換された動物細胞を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組換えタンパク質の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

本発明の一様態によれば、本発明は、次を含む動物細胞用発現ベクターを提供する：
（ａ）細胞毒性セリンプロテアーゼ−Ｂ（ＣＳＰ−Ｂ）の５’−足場又はマトリックス付着領域（５’−ＳＡＲ）と、（ｂ）動物細胞で作動する（ｏｐｅｒａｂｌｅ）プロモーターと、（ｃ）ポリアデニル化配列。

本発明者らは、動物細胞で組換えタンパク質を効率的に生産することができるベクターを開発するために努力した。その結果、ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲをベクターに含ませて使う場合に、非常に優れる生産効率で組換えタンパク質を生産できるということを知見した。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明のベクターは、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲを含むベクターであって、動物細胞に導入した外来遺伝子の位置による遺伝子発現抑制現象を克服する効果を有し、目的タンパク質の発現率を大きく向上させる。
（ｂ）本発明のベクターは、医薬品用組換えタンパク質（例えば、ＥＰＯ）または抗体（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）を動物細胞で効果的に発現させる。
（ｃ）本発明のベクター及びそれを利用した組換えタンパク質の製造方法は、医薬品の産業的量産に非常に有用に使われる。

βガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ｌａｃＺは、βガラクトシダーゼ遺伝子、ＢＧＨｐＡは、牛成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化配列、及びＴＫｐＡは、チミジンキナーゼ遺伝子のポリアデニル化配列である。ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を１コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を１コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を１コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ因子を２コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ因子を２コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ因子を２コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ因子を２コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を３コピー含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの構造についての概略図である。ＮＥＳＰ発現ベクターの構造についての概略図である。ＮＥＳＰ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を含むＮＥＳＰ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を含むＮＥＳＰ発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を１コピー導入したベクターに形質転換した細胞の相対的βガラクトシダーゼ活性を示すグラフである。ＳＡＲ因子を１、２、及び３コピー導入したベクターに形質転換した細胞の相対的βガラクトシダーゼ活性を示すグラフである。ＳＡＲ因子を導入したベクターに形質転換した細胞の相対的ＮＥＳＰ（赤血球刺激因子）発現率を示すグラフである。ＳＡＲ因子を導入していないｐＣＬＳ０７Ａ１ベクターに形質転換した細胞からランダム選択した２４つクローンのＮＥＳＰ発現率を示すグラフである。ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を導入したｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１ベクターに形質転換した細胞からランダム選択した２４つクローンのＮＥＳＰ発現率を示すグラフである。抗ＨＥＲ２抗体発現ベクターの構造についての概略図である。抗ＨＥＲ２抗体発現ベクターの構造についての概略図である。ＳＡＲ因子を２コピー導入したベクターに形質転換した細胞の相対的抗ＨＥＲ２抗体発現率を示すグラフである。ＳＡＲ因子を導入していないｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターに形質転換した細胞からランダム選択した１９つクローンの抗ＨＥＲ２抗体発現率を示すグラフである。ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を２コピー導入したｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターに形質転換した細胞からランダム選択した１９つクローンの抗ＨＥＲ２抗体発現率を示すグラフである。

本発明の動物細胞用発現ベクターは、ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲと、動物細胞で作動するプロモーターと、ポリアデニル化配列と、を含む。

本発明の最大の特徴は、ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲが含まれたベクターを利用することである。本発明で利用されるＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲは、望ましくは、ＧｅｎＢａｎｋＭ６２７１７に登録されているヌクレオチド配列を含み、配列リスト第１配列にその例示的なヌクレオチド配列が記載されている。

ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲは、発現ベクターで組換えタンパク質の生産効率を大きく増加させる。

ＣＳＰ−Ｂの５’−ＳＡＲは、発現させようとするタンパク質をコードするヌクレオチド配列のアップストリームまたはダウンストリームに位置し、望ましくは、ダウンストリームに位置する。

下記の実施例で立証されたように、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲは、従来のＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ及びβグロビンＭＡＲ因子よりも動物細胞で目的タンパク質の発現率を向上させる。例えば、ＣＨＯ動物細胞で目的タンパク質であるβガラクトシダーゼを発現させるベクターに、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ、及びβグロビンＭＡＲ因子を１コピーずつ導入した場合、ＳＡＲ因子を導入していない場合よりもβガラクトシダーゼ活性が、それぞれ１０．０倍、２．２倍、及び８．７倍高く測定された（図７）。すなわち、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子は、他の因子よりも相対的に優れる目的タンパク質の発現率を表わす。

また、目的タンパク質をＮＥＳＰとしてＳＡＲ因子の効果を確認した時、類似した結果が導出された。ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲとＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子とをベクターに導入し、ＣＨＯ細胞を形質転換した場合、ＳＡＲ因子を導入していない場合よりもＮＥＳＰの発現率が、それぞれ１１．２倍、及び３．２倍高く測定された（表３及び図９）。ベクターにＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を導入した時、その形質転換細胞でＮＥＳＰを発現する陽性クローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅ）の形成頻度が増加し、ランダムに選択したクローンのＮＥＳＰ発現率も増加した（表４、表５、図１０及び図１１）。

目的タンパク質を抗ＨＥＲ２抗体としてＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子の効果を確認した。ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子２コピーをベクターに導入し、ＣＨＯ細胞を形質転換した場合、ＳＡＲ因子を導入していない場合よりも抗ＨＥＲ２抗体の発現率が相対的に高く測定された（表６及び図１３）。ベクターにＳＡＲ因子を導入した時、ランダムに選択したクローンの抗ＨＥＲ２抗体発現率が高く表われた（図１４及び図１５）。

本発明の望ましい具現例によれば、５’−ＳＡＲは、発現ベクターに複数個のコピーで存在し、この場合、１コピーで存在する場合よりも組換えタンパク質の生産効率を増加させる。より望ましくは、５’−ＳＡＲは、発現ベクターに２コピーで存在する。下記の実施例で立証されたように、５’−ＳＡＲは、発現ベクターに３コピーで存在する場合よりも２コピーで存在する場合に、組換えタンパク質の生産効率がより優れている。

下記の実施例で立証されたように、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子をベクターに１、２、及び３コピー導入して、コピー数による効果を確認した結果、このＳＡＲ因子を連続して２コピー導入した時、βガラクトシダーゼ活性が最も高く測定された（図８）。すなわち、ベクター内のＳＡＲ因子のコピー数が、目的タンパク質の発現率に影響を与え、２コピーのＳＡＲが最も望ましいと見られる。

５’−ＳＡＲが、発現ベクターに複数個のコピーで存在する場合、前記複数個のコピーは、連続的または離隔して位置しうる。望ましくは、前記複数個のコピーは、連続して存在し、より望ましくは、発現させようとするタンパク質をコードするヌクレオチド配列のダウンストリームに連続して存在する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記動物細胞で作動するプロモーターは、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０（ＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓ４０）プロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、ＨＳＶ（ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓ）のｔｋプロモーター、ＲＳＶ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ１α（ＥｌｏｎｇａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ）プロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２（ｉｎｔｅｒｌｕｅｋｉｎ−２）遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＭａｃｒｏｐｈａｇｅＣｏｌｏｎｙ−ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ）遺伝子のプロモーターであり、より望ましくは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、またはβ−アクチンプロモーターであり、最も望ましくは、ＣＭＶプロモーターである。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明のベクターは、発現しようとするタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、望ましくは、ホルモン、サイトカイン、抗体、ペプチドアプタマー、アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ、米国特許第５，８３１，０１２号）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．ｅｔａｌ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３（１２）：１５５６（２００５））、またはクニッツドメイン（Ｋｕｎｉｔｚｄｏｍａｉｎ、ＡｒｎｏｕｘＢｅｔａｌ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８（Ｐｔ７）：１２５２４（２００２））、及びＮｉｘｏｎ、ＡＥ、Ｃｕｒｒｅｎｔｏｐｉｎｉｏｎｉｎｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ９（２）：２６１８（２００６））である。より望ましくは、本発明のベクターを用いて発現しようとするタンパク質は、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＥＰＯ類似体、または抗ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ２）抗体である。最も望ましくは、ＥＰＯ、ＥＰＯ類似体としてＮＥＳＰ（Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、Ｐ９０Ｔ）または抗ＨＥＲ２抗体である。

前記ＥＰＯ類似体は、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列で１つまたはそれ以上が変異されたものを含む。ＥＰＯ類似体は、アミノ酸残基の付加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を通じて変異を生成（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）することで製作し、これを通じて糖鎖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）位置（ｓｉｔｅ）を増加させるか、その位置を変えることができる。ＥＰＯ類似体は、ヒトＥＰＯよりも多数の炭水化物鎖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｃｈａｉｎ）を有し、少なくとも１つ以上の追加された糖鎖化位置を含む。また、ＥＰＯ類似体は、追加された糖鎖化位置によって天然（ｎａｔｕｒａｌｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ヒトＥＰＯよりも高いシアル酸（ｓｉａｌｉｃａｃｉｄ）レベルを表わすが、それによって、生物学的活性に重要なタンパク質２次または３次構造が変わらない。ＥＰＯ類似体は、Ｎ−糖鎖化（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）またはＯ−糖鎖化（Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に対する追加的な位置を１、２、または３箇所有しうる。例えば、６９番目のロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）がアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）に置換されれば、これが、Ｎ−糖鎖化の４番目の位置としての役割をする。

本発明のベクターで発現しようとするＥＰＯ類似体の例は、ＥＰＯ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＭ１１３１９の配列）で３０、５１、５７、６９、８８、８９、１３６、及び１３８番の位置から選択される少なくとも１つの位置に追加的な糖鎖化位置が導入されたものである。最も望ましくは、ＥＰＯ類似体は、Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、及びＰ９０Ｔ変異を含むＮＥＳＰである。

本発明の望ましい具現例によれば、前記ポリアデニル化配列は、牛成長ホルモンターミネーター、ＨＳＶ由来ＴＫ（ＴｈｙｍｉｄｉｎｅＫｉｎａｓｅ）、またはＳＶ４０由来ポリアデニル化配列を含む。

本発明のベクターで望ましいコンストラクトは、５’から３’の順序で、動物細胞で作動するプロモーター−発現タンパク質遺伝子−ポリアデニル化配列−ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲであり、より望ましいコンストラクトは、動物細胞で作動するプロモーター−発現タンパク質遺伝子−ポリアデニル化配列−ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ−ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲである。

本発明のベクターは、選択マーカーをさらに含みうる。前記選択マーカーの例は、真核細胞に作用する抗生剤に対する耐性遺伝子を含み、望ましくは、ネオマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、及びカナマイシンに対する耐性遺伝子である。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明のベクターは、動物細胞で目的タンパク質の発現に利用される。前記動物細胞は、哺乳類、齧歯類、鳥類、または昆虫細胞であり、より望ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ（ＢａｂｙＨａｍｓｔｅｒＫｉｄｎｅｙ、ベビーハムスター腎臓）細胞、ＣＯＳ細胞、またはＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−ＤａｒｂｙＣａｎｉｎｅＫｉｄｎｅｙ）細胞を含み、さらに望ましくは、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＭＤＣＫ細胞であり、最も望ましくは、ＣＨＯ細胞である。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明のベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）コーディング配列を含む。前記配列は、ベクターの増幅に有用である。

本発明の他の様態によれば、本発明は、前述した本発明の発現ベクターによって形質転換された動物細胞を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前述した本発明の形質転換された動物細胞を培養する段階を含む組換えタンパク質の製造方法を提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組換えタンパク質の製造方法は、（ｉ）本発明の形質転換された動物細胞を培養する段階と、（ｉｉ）前記培養過程で生産された組換えタンパク質を収得する段階と、を含む。

本発明で使ったＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子は、従来技術で動物細胞発現ベクターに導入して、医薬品用組換えタンパク質の生産性を向上させようとする試みに使われなかった因子である。下記の実施例から、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲをベクターに導入すれば、動物細胞で目的タンパク質の発現率を向上させるということが分かる。組換えタンパク質の生産のために、既存に使わなかった新たなＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲをベクターに導入して、目的タンパク質の発現効率をより高めうる方法を開発するならば、タンパク質医薬品の産業的生産性を増大させることができる。

従来技術で、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲを動物細胞発現ベクターに導入して、医薬品用組換えタンパク質の生産性を向上させようとする試みは報告されていない。また、ＳＡＲをベクターに、１コピー、２コピー、あるいは３コピー導入して、このベクターで動物細胞を形質転換した時、何コピーのＳＡＲを含むベクターを使ってこそ組換えタンパク質の生産性を最も高めるのかについても研究されていない。また、ＳＡＲ因子の位置による目的遺伝子の発現率増大の効果についての詳細な先行研究結果が公開されていない。

本発明の発現ベクターを細胞に導入して、形質転換された動物細胞を製造する場合、多様な方法でベクターを細胞に導入させることができる。例えば、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０））、カルシウムフォスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１：８４１（１９８２））、リポソーム媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））などによってベクターを動物細胞内に注入することができる。

形質転換された動物細胞の培養は、当業界に公知の多様な方法を、プロトコルを用いて実施することができる。本発明で利用される培地は、動物細胞の培養に通常利用される如何なる培地も可能であり、例えば、Ｅａｇｌｅｓ’ｓＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ、Ｅａｇｌｅ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ（Ｓｔａｎｎｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．ＮｅｗＢｉｏｌ．２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０（Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２（Ｈａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２との混合物（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ（ＭｃＣｏｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１００：１１５（１９５９））、及びＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．ｅｔａｌ．，ＩｎＶｉｔｒｏ１４：１１（１９７８））などが利用される。動物細胞培養及び培地についての説明は、Ｒ．ＩａｎＦｒｅｓｈｎｅｙ，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ，ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋに詳細に記載されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

実施例１：ＳＡＲ／ＭＡＲ因子の準備
ヒトＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ及び３’−ＳＡＲ因子の準備
ＧｅｎＢａｎｋＭ６２７１７及びＡＬ１３６０１８に登録されたヒトＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲＤＮＡをＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）で増幅するために、ヒト天然殺傷細胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ細胞、ＮＫ細胞、及びＡＴＣＣＣＲＬ−２４０７）のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを準備した。ＤＮＡ分離キット（ＤｎｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６９５０４）を使ってＮＫ細胞からゲノムＤＮＡを準備し、これを５’−ＳＡＲＤＮＡＰＣＲの鋳型として使った。

ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｓ５Ｓ３００Ｆプライマー（ａｔｔｃｔｔｃａｇｃａｃｃｔｃｃｔｔａａｔｔｔｔｔｃｔｃｃｃ；配列リスト第５配列）及びＣｓ５Ｓ３００Ｒプライマー（ｃｃａｇｇｃａｇｃｃａａａｇａｔｃａｇｔａｇｔｔｇｔｇｔｔｇ；配列リスト第６配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３５回繰り返してＰＣＲを行った。

次いで、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３６００）にクローニングして、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを製造した。

ＧｅｎＢａｎｋＭ６２７１６及びＡＬ１３６０１８に登録されたヒトＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲＤＮＡを準備するために、ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として２ｋＣｓｐＳＦプライマー（ｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃａｔｔｇｇａａａａｇｇａａａａｃａｃ；配列リスト第７配列）及び２ｋＣｓｐＳＲプライマー（ｔｃｃｇｃｔｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｃｃａｃｃ；配列リスト第８配列）を使ってＰＣＲを行った。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型としてＣｓｐＳＦプライマー（ｇｇａｔｃｃｃａｔｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔａｃｔａａｔ；配列リスト第９配列）及びＣｓｐＳＲプライマー（ｇａａｔｔｃａａａｃａａｃｔｃａａｔａｇｃａａｇａａａｃ；配列リスト第１０配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で５分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。２次ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングして、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ３Ｓ．１．２ｋベクターを製造した。

ヒトβグロビンＭＡＲ因子の準備
ＧｅｎＢａｎｋＬ２２７５４とＮＷ＿００１８３８０２１とに登録されたヒトβグロビンＭＡＲＤＮＡをＰＣＲで増幅するために、ヒトＧ２細胞のゲノムＤＮＡを準備した。ＤＮＡ分離キットを使ってＧ２細胞からゲノムＤＮＡを準備し、これを５’ ＭＡＲＤＮＡＰＣＲの鋳型として使った。Ｇ２細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＢｇ５ＭＦ−１００Ｆ−ＮｈｅＩプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃｔｔｇｔａｔｔｃｔｇｔｔｔｃｇｔｇａｇｇｃａａｇｇｔｔｔ；配列リスト第１１配列）及びＢｇ５ＭＲ−１００Ｒ−ＸｈｏＩプライマー（ａａｔｔｃｔｃｇａｇｔｔｃｃｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｇｇｃｔｃａａａｔｇｔｃｃｔ；配列リスト第１２配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で３分２０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ８３００−０１）にクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．３−Ｂｇ５Ｍベクターを製造した。

実施例２：βガラクトシダーゼ発現ベクターの製造
ｐＣ０６ベクターの製造
サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プロモーター、多数制限酵素クローニング部位（ＭｕｌｔｉｐｌｅＣｌｏｎｉｎｇＳｉｔｅｓ、ＭＣＳ）、及び牛成長ホルモン（ＢｏｖｉｎｅＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ、ＢＧＨ）ポリアデニル化配列（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｐＡ）を順次に含むｐＣ０６ベクターを製造するために、次のような実験を行った。まず、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９５−２０）を鋳型としてＶ６＿Ｆプライマー（ａａｇｃｔｔｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃａｔｃｇａｔｇｇｃｃｇｇｃｃｇｇｔａｃｃｃｔｃｇａｇｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃ；配列リスト第１３配列）及びＶ６＿Ｒプライマー（ｇｃｔａｇｃｔａｇａｇｃｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃｃｇ；配列リスト第１４配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＣ０６ベクターを製造した。

ｐＣ０４’ベクターの製造
ＳＶ４０プロモーター、コザック配列（Ｋｏｚａｋｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｇｃｃａｔｃ）、ｄｈｆｒ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子、及びＴＫ（ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ）ｐＡを順次に含むｐＣ０４’ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐｃＤＮＡ３．３ベクターを鋳型としてＰｓｖＡｐａＤｒａＦプライマー（ａａａａｔｔｇｇｇｃｃｃｃａｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｔｇｇａａｔｇｔｇｔｇｔｃａｇｔｔａｇｇｇｔ；配列リスト第１５配列）及びＰｓｖＫｚＤＨＲプライマー（ｔｇｇｔｃｇａａｃｃａｔｇａｔｇｇｃｇｃｇａａａｃｇａｔｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｔ；配列リスト第１６配列）を使ってＰＣＲを行い、ｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２７４４−０１７）を鋳型としてＤＨＫｚＰｓｖＦプライマー（ｇｇａｔｃｇｔｔｔｃｇｃｇｃｃａｔｃａｔｇｇｔｔｃｇａｃｃａｔｔｇａａｃｔｇｃａｔｃｇ；配列リスト第１７配列）及びＴＫＮｈｅＮｄｅＲプライマー（ｔｇｔｇｔｇｃａｔａｔｇｇｃｔａｇｃｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａｇ；配列リスト第１８配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、この２種のＰＣＲ産物を、重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを通じて連結し、ｐＧＥＭ−ＴベクターのＡｐａＩ及びＮｄｅＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣ０４’ベクターを製造した。

ｐＣ０４ベクターの製造
ｐＣ０４’ベクターが含むＳＶ４０プロモーターで７２ｂｐ（ｇｇｔｇｔｇｇａａａｇｔｃｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃａｇｇｃａｇａａｇｔａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃａｔｃｔｃａａｔｔａｇｔｃａｇｃａａｃｃａ；配列リスト第１９配列）のエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）１つを除去（ＳＶ４０ｄＥ１プロモーター）したｐＣ０４ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＣ０４’ベクターをＳｐｈＩ制限酵素で切断し、次いで、大きなＤＮＡ切片を自己ライゲーション（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）させてｐＣ０４ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０７ベクターの製造
ｐＣ０６ベクターのＢＧＨｐＡとＳＶ４０プロモーターとの間に、ＳＶ４０ｄＥ１プロモーター、コザック配列、ｄｈｆｒ遺伝子、及びＴＫｐＡが挿入されたｐＣＬＳ０７ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＣ０４ベクターを鋳型としてＰｓｖＡｐａＤｒａＦプライマー及びＴＫＮｈｅＮｄｅＲプライマーを使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分２０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物とｐＣ０６ベクターとをＤｒａＩＩＩ及びＮｈｅＩ制限酵素でそれぞれ切断し、ここで得た２つの大きなＤＮＡ切片をライゲーションさせてｐＣＬＳ０７ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０８ベクターの製造
ｐＣＬＳ０７ベクターのＮｈｅＩ制限酵素部位にＭＣＳを挿入して、ｐＣＬＳ０８ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングされているエリスロポエチン遺伝子を鋳型としてＮｈＡｓＥ１Ｆプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃａｔａｔａｇｃｇａｔｃｇｃｇｃａｇｇａｃａｇｃｔｔｃｃｇａｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇｇ；配列リスト第２０配列）及びＢｂＰｓＳｂＮｈＥ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃａｔａｔａｃｃｔｇｃａｇｇｔａｔａｔｇｇｇｃｃｃａｔａｔａｇｃｔｇａｇｇｔｔｇａａｔｇａｇａａｔａｔｃａｃｔｇｔｃｃｃａｇａｃａｃ；配列リスト第２１配列）を使ってＰＣＲを行って、ＭＣＳを製造した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１５秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０７ベクターのＮｈｅＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０８ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０８Ｇ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ０８ベクターのＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素部位との間に、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子を挿入して、ｐＣＬＳ０８Ｇ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＢ０９４）を鋳型としてｇａｌＨｉｎＦプライマー（ａａｔｔａａｇｃｔｔｃｔｃｇｃｇｃａａｃｃｔａｔｔｔｔｃｃｃｃｔｃｇａａｃ；配列リスト第２２配列）及びｇａｌＸｈｏＲプライマー（ａａｔｔｃｔｃｇａｇｃｃｇａｇｔｔｔｇｔｃａｇａａａｇｃａｇａｃｃａａａｃ；配列リスト第２３配列）を使ってＰＣＲを行って、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で３分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０８ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０８Ｇ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ０８Ｇ１ベクターの２つのＮｈｅＩ制限酵素部位の間にあるＭＣＳを他のＭＣＳに変えて、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングされているエリスロポエチン遺伝子を鋳型としてＮｈＳｂＥ１Ｆプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃａｔａｔａｃｃｔｇｃａｇｇｔｔｇａａｔｇａｇａａｔａｔｃａｃｔｇｔｃｃｃａｇａｃａ；配列リスト第２４配列）とＮｈＡｓＳｆＰｓＥ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃａｔａｔａｇｃｇａｔｃｇｃｔａｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｔｇｇｃｃａｔａｔａｇｇｇｃｃｃａｇｇａｃａｇｃｔｔｃｃｇａｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇｇｃ；配列リスト第２５配列）とを使ってＰＣＲを行って、新たなＭＣＳを製造した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１５秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、ｐＣＬＳ０８Ｇ１ベクターの２つのＮｈｅＩ制限酵素部位の間にある既存のＭＣＳを除去し、ここにＰＣＲで新たに作ったＭＣＳをクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターを製造した。ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのマップ（ｍａｐ）は、図１に示した。

実施例３：ＳＡＲ／ＭＡＲを含むβガラクトシダーゼ発現ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのＳｂｆＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ３Ｓ．１．２ｋベクターを鋳型としてｃｓ３ｓＳｂｆ１Ｆプライマー（ａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｇａｔｃｃｃａｔｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔａｃｔａａｔ；配列リスト第２６配列）及びｃｓ３ｓＰｓｐ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃａａａｃａａｃｔｃａａｔａｇｃａａｇａａａｃ；配列リスト第２７配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのＳｂｆＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのＳｂｆＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを鋳型としてｃｓ５ｓＳｂｆ１Ｆプライマー（ａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｇｇａａｔｔｃｃｔａａａｃａｇａｇｃａａｔｔａｇｇｔａａｇ；配列リスト第２８配列）及びｃｓ５ｓＰｓｐ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃｃａｇｔｇｔａａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｔｇｔ；配列リスト第２９配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのＳｂｆＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのＳｂｆＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位の間にβグロビンＭＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐｃＤＮＡ３．３−Ｂｇ５Ｍベクターを鋳型としてｇｌｍＳｂｆ１Ｆプライマー（ａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｇｔｔｇｔａｔｔｃｔｇｔｔｔｃｇｔｇａｇｇｃａａｇｇｔｔｔ；配列リスト第３０配列）及びｇｌｍＰｓｐ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｇｇｃｔｃａａａｔｇｔｃｃｔ；配列リスト第３１配列）を使ってＰＣＲを行って、βグロビンＭＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で３分２０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターのＳｂｆＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ２ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターのＰｓｐＯＭＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ２ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ３Ｓ．１．２ｋベクターを鋳型としてｃｓ３ｓＰｓｐ２Ｆプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇｇａｔｃｃｃａｔｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔａｃｔａａｔ；配列リスト第３２配列）及びｃｓ３ｓＳｆｉ２Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｃｃａｔｇａｔｇｇｃｃｇａａｔｔｃａａａｃａａｃｔｃａａｔａｇｃａａｇａａａｃ；配列リスト第３３配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターのＰｓｐＯＭＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ２ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターのＰｓｐＯＭＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを鋳型としてｃｓ５ｓＰｓｐ２Ｆプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃｃｔａａａｃａｇａｇｃａａｔｔａｇｇｔａａｇ；配列リスト第３４配列）及びｃｓ５ｓＳｆｉ２Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｃｃａｔｇａｔｇｇｃｃｇａａｔｔｃｃａｇｔｇｔａａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｔｇｔ；配列リスト第３５配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターのＰｓｐＯＭＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔｆベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターのＰｓｐＯＭＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔｆベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを鋳型としてｃｓ５ｓＰｓｐ２Ｆプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃｃｔａａａｃａｇａｇｃａａｔｔａｇｇｔａａｇ；配列リスト第３４配列）及びｃｓ５ｓＳｆｉ２Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｃｃａｔｇａｔｇｇｃｃｇａａｔｔｃｃａｇｔｇｔａａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｔｇｔ；配列リスト第３５配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１ベクターのＰｓｐＯＭＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔｆベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ３ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２ベクターのＣＭＶプロモーター及びｂｌａプロモーターの間にあるＢｇｌＩＩ制限酵素部位にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ３ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを鋳型としてｃｓ５ｓＢｇｌ３Ｆプライマー（ａａｔｔａｇａｔｃｔｇａａｔｔｃｃｔａａａｃａｇａｇｃａａｔｔａｇｇｔａａｇ；配列リスト第３６配列）及びｃｓ５ｓＢｇｌ３Ｒプライマー（ａａｔｔａｇａｔｃｔｇａａｔｔｃｃａｇｔｇｔａａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｔｇｔ；配列リスト第３７配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２ベクターのＢｇｌＩＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ３ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ４ベクターの製造
ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターのＣＭＶプロモーター及びｂｌａプロモーターの間にあるＢｇｌＩＩ制限酵素部位にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を挿入して、ＳＡＲが目的遺伝子であるｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子の両側に位置するｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ４ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを鋳型としてｃｓ５ｓＢｇｌ３Ｆプライマー（ａａｔｔａｇａｔｃｔｇａａｔｔｃｃｔａａａｃａｇａｇｃａａｔｔａｇｇｔａａｇ；配列リスト第３６配列）及びｃｓ５ｓＢｇｌ３Ｒプライマー（ａａｔｔａｇａｔｃｔｇａａｔｔｃｃａｇｔｇｔａａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｔｇｔ；配列リスト第３７配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターのＢｇｌＩＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ４ベクターを製造した。

実施例４：ＳＡＲ／ＭＡＲ導入ベクターを使ったβガラクトシダーゼ発現
ｐＣＬＳ０９Ｇ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１、またはｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターを使った形質転換
ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ、及びβグロビンＭＡＲ因子をベクターに１コピーずつ導入し、次のようにその効果を調べるために、次のような方法でＣＨＯＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２６０９）を形質転換した。

付着培養形態のＤＧ４４細胞を６ウェルプレートにウェル当たり４×１０^５細胞で分注した。２４時間後、細胞がプレート底に完全に付着されたことを確認した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３１９８５−０７０）を滅菌されたチューブ３つにそれぞれ５００μｌずつ分注した後、あらかじめ準備したｐＣＬＳ０９Ｇ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１、及びｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターを２μｇずつ混合し、弱くピペッティングした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を滅菌されたチューブ３つにそれぞれ５００μｌずつ分注した。ここに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１６６８−０２７）を１０μｌずつ取って混合し、弱くピペッティングした後、常温で５分間放置した。ＤＮＡと試薬溶液とを混合して常温で２０分間放置し、この混合液を各ＤＮＡ当たり準備した６ウェルプレートのウェルに入れてよく混合した。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１、またはｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターに形質転換した細胞プール（ｐｏｏｌ）のβガラクトシダーゼ活性の確認

ｐＣＬＳ０９Ｇ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｔ１、またはｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターでＤＧ４４細胞を形質転換し、２４時間後、１０％ＦＢＳと５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）とが含まれた培地で交換した。３−４日に１回ずつ培地を交換し、３週間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養して安定的細胞のプールを製造した。
βガラクトシダーゼ分析キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２００３８３）を使って形質転換した安定的細胞に対するβガラクトシダーゼ活性を確認し、ベクターによるβガラクトシダーゼ活性とｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターを基準とした相対的（ｒｅｌａｔｉｖｅ）βガラクトシダーゼ活性とを求めた。表１及び図７に示したように、ＳＡＲ／ＭＡＲ因子が導入されていないｐＣＬＳ０９Ｇ１ベクターに比べて、ＳＡＲ／ＭＡＲ因子を導入したベクターは、いずれもβガラクトシダーゼ活性が増加した。また、βグロビンＭＡＲ因子を導入したｐＣＬＳ０９Ｇ１ｇ１ベクターに比べて、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を導入したｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１ベクターの場合、さらに高いβガラクトシダーゼ活性の増加を示した。したがって、目的タンパク質の発現率の増加のために、ベクターにＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲを導入することが望ましい。

ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ３、またはｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ４ベクターに形質転換した細胞プールのβガラクトシダーゼ活性の確認
ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子が目的タンパク質の発現率を増加させるということを確認し、ベクターに導入するＳＡＲ因子のコピー数によって、目的タンパク質の発現率の増加が如何に変わるのか調べるために、次のような実験を行った。ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ１、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２、ｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ３、またはｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ４ベクターでＤＧ４４細胞を形質転換し、ジェネティシン培地で選別して細胞プールを得た。形質転換した安定的細胞に対するβガラクトシダーゼ活性を確認し、ベクターによるβガラクトシダーゼ活性を求めた。表２と図８とに示したように、ＳＡＲ因子を１コピーまたは３コピー導入したベクターに比べて、ＳＡＲ因子を２コピー導入したベクターがさらに高いβガラクトシダーゼ活性を示した。すなわち、ＳＡＲ因子による目的タンパク質の発現率の増加は、ＳＡＲ因子のコピー数によって変わり、ＳＡＲ因子をベクターに２コピー導入することによって、目的タンパク質の発現率を最大に増加させるということを確認した。

実施例５：ＮＥＳＰ発現ベクターの製造
エリスロポエチン遺伝子の準備
ＧｅｎＢａｎｋＭ１１３１９（ｈｕｍａｎｆｅｔａｌｌｉｖｅｒｇｅｎｏｍｉｃｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｇｅｎｅ）及びＧｅｎＢａｎｋＮＭ０００７９９（ｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｍＲＮＡ）に登録されている５８２ｂｐのエリスロポエチン遺伝子をクローニングするために、次のような実験を進行した。まず、ＨｕｍａｎｌｉｖｅｒＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ（ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０７−１）を鋳型としてＩＥ１ＡＴＧＦプライマー（ａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔ；配列リスト第３８配列）及びＩＥ１ＴＧＡＲプライマー（ｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｔ；配列リスト第３９配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で４０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。

ＮＥＳＰ遺伝子の製造
大韓民国特許出願番号第１９９５−０７０１４５３号の請求項３に明示されたエリスロポエチン類似体ＮＥＳＰ（Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、Ｐ９０Ｔ）の遺伝子を製造するために、次のような実験を進行した。まず、Ａ３０Ｎ及びＨ３２Ｔ類似体の遺伝子を製造するために、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングされているエリスロポエチン遺伝子を鋳型としてＭ１３Ｒプライマー（ｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ；配列リスト第４０配列）及びＩＡ１ｇ１Ｒプライマー（ｃｔｃａｔｔｃａａｇｃｔｇｃａｔｇｔｔｔｃａｔｔａｃａｇｃｃｃｇｔｃｇｔｇａｔ；配列リスト第４１配列）を使ってＰＣＲを行い、Ｍ１３Ｆプライマー（ｃａｇｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａ；配列リスト第４２配列）及びＩＡ１ｇ１Ｆプライマー（ａｔｃａｃｇａｃｇｇｇｃｔｇｔａａｔｇａａａｃａｔｇｃａｇｃｔｔｇａａｔｇａｇ；配列リスト第４３配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で４０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、この２種のＰＣＲ産物を重複ＰＣＲを通じて連結し、ｐＧＥＭ−ＴベクターのＮｄｅＩ及びＳｐｈＩ制限酵素部位にクローニングした。

Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ類似体の遺伝子をＡ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、及びＰ９０Ｔ類似体の遺伝子に突然変異化させ、翻訳開始コドン前にコザック配列（ｇｃｃａｃｃ）を貼り付けるために、ｐＧＥＭ−ＴベクターにクローニングされているＡ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ類似体の遺伝子を鋳型としてＭ１３Ｒプライマー及びＩＡ１Ｇ２Ｒプライマー（ｃａｃａｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｔｇｔｃｔｃａｔｔｃａｃｃｔｇｇｇａａｇａｇｔｔｇａｃ；配列リスト第４４配列）を使ってＰＣＲを行い、Ｍ１３Ｆプライマー及びＩＡ１Ｇ２Ｆプライマー（ｇｔｃａａｃｔｃｔｔｃｃｃａｇｇｔｇａａｔｇａｇａｃａｃｔｇｃａｇｃｔｇｃａｔｇｔｇ；配列リスト第４５配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で４０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、この２種のＰＣＲ産物を鋳型としてＩＥ１ＫｚＡＴＧＨｉｎＦプライマー（ａａｔｔａａｇｃｔｔｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔ；配列リスト第４６配列）とＩＥ１ＴＧＡＸｈｏＲプライマー（ａａｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｔ；配列リスト第４７配列）とを使って重複ＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で５０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。

ｐＣＬＳ０７Ａ１ベクターの製造
前記ＮＥＳＰ遺伝子のＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０７ベクターのＭＣＳのうち、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０７Ａ１ベクターを製造した。

実施例６：ＳＡＲを含むＮＥＳＰ発現ベクターの製造
ｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターの製造
ＮＥＳＰを動物細胞で発現することができるｐＣＬＳ０７Ａ１ベクターのＮｈｅＩ制限酵素部位にＳＡＲまたはＭＡＲ因子を導入するためのＭＣＳを挿入して、ｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターを鋳型としてＮｈＡｓｆ１Ｆプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃａｔａｔａｇｇｃｇｃｇｃｃａａｃｔｔｇａｔｔａｇｇｇｔｇａｔｇｇｔｔｃａｃｇｔａｇ；配列リスト第４８配列）及びＮｈＣｌＰａＰｓｆ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｃｔａｇｃａｔａｔａａｔｃｇａｔｔａｔａｔｔｔａａｔｔａａａｔａｔａｇｇｇｃｃｃｔｔｇａｇｔｇｔｔｇｔｔｃｃａｇｔｔｔｇｇａａｃａａｇａ；配列リスト第４９配列）を使ってＰＣＲを行った後、ＭＣＳを得た。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１５秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ０７Ａ１ベクターのＮｈｅＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ１０Ａ１ｔ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターのＡｓｃＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｔ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ３Ｓ．１．２ｋベクターを鋳型としてｃｓ３ｓＡｓｃ１Ｆプライマー（ａａｔｔｇｇｃｇｃｇｃｃｇｇａｔｃｃｃａｔｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔａｃｔａａｔ；配列リスト第５０配列）及びｃｓ３ｓＰｓｐ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃａａａｃａａｃｔｃａａｔａｇｃａａｇａａａｃ；配列リスト第５１配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ３’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターのＡｓｃＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｔ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターのＡｓｃＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位の間にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を挿入して、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＧＥＭＴ−ＣＳ５Ｓ．３．０ｋベクターを鋳型としてｃｓ５ｓＡｓｃ１Ｆプライマー（ａａｔｔｇｇｃｇｃｇｃｃｇａａｔｔｃｃｔａａａｃａｇａｇｃａａｔｔａｇｇｔａａｇ；配列リスト第５２配列）及びｃｓ５ｓＰｓｐ１Ｒプライマー（ａａｔｔｇｇｇｃｃｃｇａａｔｔｃｃａｇｔｇｔａａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｔｇｔ；配列リスト第５３配列）を使ってＰＣＲを行って、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で２分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＣＬＳ１０Ａ１ベクターのＡｓｃＩ及びＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１ベクターを製造した。

実施例７：ＳＡＲ導入ベクターを使ったＮＥＳＰ発現
ｐＣＬＳ０７Ａ１、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１、またはｐＣＬＳ１０Ａ１ｔ１ベクターに形質転換したＤＧ４４細胞プールのＮＥＳＰ発現率の確認
βガラクトシダーゼ活性実験を通じて確認したＳＡＲ因子の効果が他の組換えタンパク質の発現にも適用されるかを調べるために、目的タンパク質であるＮＥＳＰとＳＡＲ因子とを含むｐＣＬＳ０７Ａ１、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１、またはｐＣＬＳ１０Ａ１ｔ１ベクターをＤＧ４４細胞に形質転換し、ジェネティシン含む培地で選別した後、細胞プールを得て、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）方法でＮＥＳＰの発現率を確認した。表３及び図９に示したように、ＳＡＲ因子が導入された場合、発現量が増加することを確認し、特に、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子をＮＥＳＰ遺伝子の下位に導入した場合、導入していない場合よりもＮＥＳＰの発現率が１１．２倍増加することを確認した。

ＮＥＳＰを発現する陽性クローンの形成頻度の確認
外来遺伝子の位置による遺伝子発現抑制現象を克服することができるＳＡＲ因子の効果を確認するために、ｐＣＬＳ０７Ａ１、ｐＣＬＳ１０Ａ１ｔ１、またはｐＣＬＳ１０Ａ１ｆ１ベクターをＤＧ４４細胞に形質転換した後、９６ウェルプレートを使って単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｙ）を作った。顕微鏡観察を通じて各ベクターのコロニー形成頻度を確認し、培養液を採取して発現率を測定して、各ベクターごとにＮＥＳＰを発現する陽性クローン形成頻度を求めた。表４及び表５に示したように、ＳＡＲ因子未導入時に、８２％のコロニー形成頻度が表われ、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子導入時に、９０％、３’−ＳＡＲ因子導入時に、５０％のウェルでコロニーが形成された。また、陽性クローンの頻度は、ＳＡＲ因子未導入時に、及び３’−ＳＡＲ因子導入時に、約４０％程度に表われ、５’−ＳＡＲ因子導入時に、５９％に増加した。すなわち、５’−ＳＡＲ因子導入時に、外来遺伝子の位置による遺伝子発現抑制現象が克服されて、目的遺伝子であるＮＥＳＰを発現するクローンがさらに多く形成されることを確認することができた。

単一クローンのＮＥＳＰ発現率の確認
ＮＥＳＰの発現が確認された９６ウェルプレート上の陽性クローンのうち、任意にベクター当たり２４つを選んで２４ウェルプレートに継代した後、培養液を採取して発現率を測定した。図１０と図１１とに示したように、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を導入したベクターの場合、任意に選択した２４つの陽性クローンのうち、１０μｇ／ｍｌ以上の発現率を表わす高発現クローンが１３つ表われ、ＳＡＲ因子未導入ベクターの場合、５つ表われた。すなわち、ベクターに５’−ＳＡＲ因子を導入時に、高発現クローンの出現頻度数が増加することを確認した。

実施例８：抗ＨＥＲ２抗体発現ベクターの製造
ｐＣ０１ベクターの製造
ネオマイシン抵抗遺伝子、アンピシリン抵抗遺伝子、ＣＭＶプロモーター、ＭＣＳ、及びＢＧＨｐＡを順次に含むｐＣ０１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターを鋳型としてＶ１＿Ｆプライマー（ａａｇｃｔｔｃｃｔｃａｇｃａｔｃｇａｔｇｇｃｃｇｇｃｃｇｇａｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔ；配列リスト第５４配列）及びＶ１＿Ｒプライマー（ｔａｇａｇｃｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃｃｇｃｃｔｃａｇ；配列リスト第５５配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯベクターにクローニングして、ｐＣ０１ベクターを製造した。

ｐＣ０２ベクターの製造
ＣＭＶプロモーター、ｐＣ０１ベクターのＭＣＳと他のＭＣＳ及びＢＧＨｐＡを順次に含むｐＣ０２ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターを鋳型としてＶ２＿Ｆプライマー（ｇａａｔｔｃｔｇｔａｃａｇｇｔａｃｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｔｃｇａｇｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔ；配列リスト第５６配列）及びＶ２＿Ｒプライマー（ｔａｇａｇｃｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃｃｇｃｃｔｃａｇ；配列リスト第５７配列）を使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯベクターにクローニングして、ｐＣ０２ベクターを製造した。

ｐＣ０３ベクターの製造
ｐＣ０１ベクターに含まれたネオマイシン抵抗遺伝子、アンピシリン抵抗遺伝子、ＣＭＶプロモーター、最初のＭＣＳ、ＢＧＨｐＡ、ｐＣ０２ベクターに含まれたＣＭＶプロモーター、二番目のＭＣＳ及びＢＧＨｐＡを順次に含むｐＣ０３ベクターを製造するために、次のような実験を行った。まず、ｐＣ０１ベクターをＤｒａＩＩＩ及びＡｇｅＩ制限酵素で切断し、大きなＤＮＡ切片を得た。次いで、ｐＣ０２ベクターを鋳型としてＰｃｍｖＡｇｅＦプライマー（ａａｔｃｔｇａｃｃｇｇｔｇｔｔａｇｇｃｇｔｔｔｔｇｃｇｃｔｇｃｔｔｃｇｃｇ；配列リスト第５８配列）及びＢＧＨＮｈｅＤｒａＲプライマー（ｔｔａｃｔａｃａｃｔａｃｇｔｇｇａｔｃｇａｇｃｔａｇｃｔａｇａｇｃｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃｃｇ；配列リスト第５９配列）を使ってＰＣＲを行い、このＰＣＲ産物をＤｒａＩＩＩ及びＡｇｅＩ制限酵素で切断した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。最後に、ｐＣ０１ベクターをＤｒａＩＩＩ及びＡｇｅＩ制限酵素で切断したＤＮＡ切片と、このＰＣＲ産物をライゲーションさせてｐＣ０３ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０５ベクターの製造
１４０ｐＣ０３ベクターのＢＧＨｐＡとＳＶ４０プロモーターとの間に、ＳＶ４０ｄＥ１プロモーター、コザック配列、ｄｈｆｒ遺伝子、及びＴＫｐＡが挿入されたｐＣＬＳ０５ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、ｐＣ０４ベクターを鋳型としてＰｓｖＡｐａＤｒａＦプライマー及びＴＫＮｈｅＮｄｅＲプライマーを使ってＰＣＲを行った。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物とｐＣ０３ベクターとをＤｒａＩＩＩ及びＮｈｅＩ制限酵素でそれぞれ切断し、ここで得た２つの大きなＤＮＡ切片をライゲーションさせてｐＣＬＳ０５ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０５Ｈ１ベクターの製造
ｐＣＬＳ０５ベクターのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間に抗ＨＥＲ２抗体重鎖（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ）遺伝子を挿入して、ｐＣＬＳ０５Ｈ１ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。まず、合成した抗ＨＥＲ２抗体遺伝子を鋳型としてＨ１ｓｓＦプライマー（ｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｇｇｔｃｃａａｃｔｇｇｔｃｇａａａｇｃｇｇｔｇｇａ；配列リスト第６０配列）とＨ１ＴＧＡＸｈｏＲプライマー（ａａｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇａｇｇｃｔｃｔｔ；配列リスト第６１配列）とを使ってＰＣＲを行って、シグナル配列（ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）の一部がある重鎖遺伝子を増幅し、このＰＣＲ産物を鋳型としてＨ１ｓｓＥｃｏＦプライマー（ａａｔｔｇａａｔｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇｔａｔｃａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇｇ；配列リスト第６２配列）とＨ１ＴＧＡＸｈｏＲプライマー（配列リスト第６１配列）とを使ってＰＣＲを行って、コザック配列とシグナル配列とがある重鎖遺伝子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分３０秒の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で切断してコザック配列とシグナル配列とがある重鎖遺伝子を得た後、ｐＣＬＳ０５ベクターのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０５Ｈ１ベクターを製造した。

ｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターの製造
ｐＣＬＳ０５Ｈ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位の間に抗ＨＥＲ２抗体軽鎖（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ）遺伝子を挿入して、ｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターを製造するために、次のような実験を行った。まず、合成した抗ＨＥＲ２抗体遺伝子を鋳型としてＨ２ｓｓＦプライマー（ｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｔａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｔｃｃｃｔｃｔ；配列リスト第６３配列）とＨ２ＴＧＡＢａｍＲプライマー（ａａｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔｃｔｔｔｇｔ；配列リスト第６４配列）とを使ってＰＣＲを行って、シグナル配列の一部がある軽鎖遺伝子を増幅し、このＰＣＲ産物を鋳型としてＨ２ｓｓＨｉｎＦプライマー（ａａｔｔａａｇｃｔｔｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇｔａｔｃａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇｇ；配列リスト第６５配列）とＨ２ＴＧＡＢａｍＲプライマー（配列リスト第６４配列）とを使ってＰＣＲを行って、コザック配列とシグナル配列とがある軽鎖遺伝子を増幅した。９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で１分の条件で３０回繰り返してＰＣＲを行った。次いで、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切断してコザック配列とシグナル配列とがある軽鎖遺伝子を得た後、ｐＣＬＳ０５Ｈ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位にクローニングして、ｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターを製造した。ｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターのマップは、図１２Ａに示した。

実施例９：ＳＡＲを含む抗ＨＥＲ２抗体発現ベクターの製造
ｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターの製造
抗ＨＥＲ２抗体を動物細胞で発現することができるｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターのＭＣＴ遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子との間にＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を２コピー導入して、ｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターを製造するために、次のような実験を進行した。ｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクター及びｐＣＬＳ０９Ｇ１ｆ２ベクターをＸｈｏＩ及びＢｓｓＨＩＩ制限酵素でそれぞれ切断し、ここで得た２つの大きなＤＮＡ切片をライゲーションさせてｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターを製造した。ｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターのマップは、図１２Ｂに示した。

実施例１０：ＳＡＲ導入ベクターを使った抗ＨＥＲ２抗体発現
ｐＣＬＳ０５Ｈ２またはｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターに形質転換したＤＧ４４細胞プールの抗ＨＥＲ２抗体発現率の確認

目的タンパク質である抗ＨＥＲ２抗体の遺伝子を含むｐＣＬＳ０５Ｈ２ベクターと抗体遺伝子及びＳＡＲ因子を含むｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターとをそれぞれＤＧ４４細胞に形質転換し、ジェネティシン含む培地で選別した後、細胞プールを得てＥＬＩＳＡ方法で抗ＨＥＲ２抗体の発現率を確認した。表６及び図１３に示したように、ＳＡＲ因子を２コピー導入した場合、導入していない場合よりも抗ＨＥＲ２抗体の発現率が３０倍高いことを確認した。ＳＡＲ因子を含むｐＣＬＳ０５Ｈ２ｆ２ベクターを使った時、ジェネティシンに抵抗性を表わし、生き残った細胞の個数が相対的に多かった。

単一クローンの抗ＨＥＲ２抗体発現率の確認
抗ＨＥＲ２抗体の発現が確認された９６ウェルプレート上の陽性クローンを任意に選んで２４ウェルプレートに継代した後、培養液を採取して発現率を測定した。図１４と図１５とに示したように、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を２コピー導入したベクターの場合、任意に選択した１９つの陽性クローンのうち、５μｇ／ｍｌ以上の発現率を表わす高発現クローンが１０個表われ、ＳＡＲ因子未導入ベクターの場合、６つ表われた。すなわち、ベクターに５’−ＳＡＲ因子を導入時に、相対的に組換えタンパク質を高発現するクローンの出現頻度数が増加することを確認した。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

本発明は、ＣＳＰ−Ｂ５’−ＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクター、及びそれを利用した組換えタンパク質の製造方法に関連する分野に適用されうる。

Claims

次を含む動物細胞用発現ベクター：
（ａ）細胞毒性セリンプロテアーゼ−Ｂ（ＣＳＰ−Ｂ）の５’−足場又はマトリックス付着領域（５’−ＳＡＲ）と、
（ｂ）動物細胞で作動するプロモーターと、
（ｃ）ポリアデニル化配列。
前記ベクターは、発現しようとするタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記５’−ＳＡＲは、２コピー（ｃｏｐｉｅｓ）で存在することを特徴とする請求項１に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記動物細胞で作動するプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｔｋプロモーター、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、エロンゲーションファクター−１α（ＥＦ１α）プロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子のプロモーター、ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子のプロモーター、ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、またはヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記ポリアデニル化配列は、牛成長ホルモンポリアデニル化配列、ＨＳＶ由来チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリアデニル化配列、またはＳＶ４０由来ポリアデニル化配列であることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、またはメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞であることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、ペプチドアプタマー、アドネクチン、アフィボディ、アビマー、またはクニッツドメインであることを特徴とする請求項２に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ類似体、または抗ヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体であることを特徴とする請求項７に記載の動物細胞用発現ベクター。
前記請求項１ないし請求項８のうち何れか一項に記載の発現ベクターによって形質転換された動物細胞。
前記請求項９の形質転換された動物細胞を培養する段階を含む組換えタンパク質の製造方法。