JP2014511673A - 糖化プロセスにおける粘度を低下させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年3月17日に出願された米国特許仮出願第61/453,923号に基づく利益を主張するものであり、当該出願の全容を本明細書に援用するものである。
本発明は、バイオマスを加水分解するうえで有用な組成物、その組成物を使用してバイオマス材料を加水分解する方法、及びバイオマスの糖化混合物の粘度を低下させるための方法に関する。
本開示は、GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(例えば、単離、合成又は組換えポリペプチド)を提供する。例えば、本開示は、異なる種に由来するGH61エンドグルカナーゼ、又はその変異体、異なる種に由来するエンドグルカナーゼIV(又はエンドグルカナーゼ4)ポリペプチド(本明細書では、「Eg4」又は「EG4」とも記載され、これらは本明細書では互換可能に用いられる)、又はその変異体、及び、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)のEg4、又はその変異体を提供する。一部の態様では、ポリペプチドは単離される。
グリコシドヒドロラーゼファミリー61(「GH61」)酵素は、真核生物において特定されている。ハイポクレア・ジェコリーナ(Hypocrea jecorina)に由来するCel61Aにおいて弱いエンドグルカナーゼ活性が観察されており(Karlssonら、Eur J Biochem,2001,268(24):6498〜6507)、そのためCel61AはGH61/エンドグルカナーゼ活性を有するとされる。GH61ポリペプチドは、セルラーゼによるリグノセルロース基質の酵素的加水分解を増強する(Harrisら、2010,Biochemistry,49(15)3305〜16)。キチン分解に関与する同種のポリペプチドに関する研究によって、GH61ポリペプチドは、電子供与体基質を必要とし、2価の金属イオンが関与する酸化的加水分解の機構を利用している可能性が予想されている(Vaaje−Kolstad,2010,Science,330(6001),219〜22)。これは、リグノセルロース基質の分解に対するGH61ポリペプチドの相乗効果が2価のイオンに依存するという観察と一致している(Harrisら、2010,Biochemistry,49(15)3305〜16)。多くの存在するGH61ポリペプチドの構造が、多数の保存されたアミノ酸残基が結合した2価の原子を有している(Karkehabadi,2008,J.Mol.Biol.,383(1)144〜54;Harrisら、2010,Biochemistry,49(15)3305〜16)。GH61ポリペプチドは、保存された残基によって形成された平らな表面を金属結合部位に有しており、これが基質の結合に関与している可能性があることが報告されている(Karkehabadi,2008,J.Mol.Biol.,383(1),144〜54)。
(1)非極性のもの:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)電荷のない極性のもの:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性(負の電荷を有する)のもの:Asp、Glu;
(4)塩基性(正の電荷を有するもの):Lys、Arg;
(5)残基が鎖の向きに影響するもの:Gly、Pro;及び
(6)芳香族性のもの:Trp、Tyr、Phe、Hisである。
FP=1−(Fl試料−Flセロビオースを含む緩衝液)/(Fl酵素なし−Flセロビオースを含む緩衝液)
式中、FP=生成率(fraction product)であり、FI=蛍光単位である。
GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物を提供する。本発明はまた、GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼ(例えばエンドグルカナーゼIVなどのGH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを濃縮化した全セルラーゼ(例えばT.リーゼイ(T. reesei)Eg4ポリペプチド濃縮化全セルラーゼ))を含む非天然組成物も提供する。GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書で提供されるGH61/エンドグルカナーゼ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。一部の態様では、GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、T.リーゼイ(T. reesei)Eg4又はその変異体である。T.リーゼイ(T. reesei)Eg4の変異体は、上記に示される変異体のいずれであってもよい。
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドには、内部のβ−1,4結合の切断を触媒するポリペプチドが含まれる。エンドグルカナーゼ(「EG」)は、EC 3.2.1.4.として分類されるセルラーゼ酵素群のことを指す。EG酵素は、セルロースの内部のβ−1,4グルコシド結合を加水分解する。EGは、セルロース、セルロース誘導体(例えばカルボキシメチルセルロース)、リケニンの1,4−β−D−グルコシド結合、穀類のβ−D−グルカン又はキシログルカンなどのβ−1,3グルカン混合物、及びセルロース成分を含有する他の植物性材料のβ−1,4結合の内部加水分解を触媒する。EG活性は、Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257〜268の方法に従って、カルボキシメチルセルロース(CMC)加水分解を用いて測定することができる。一部の態様では、エンドグルカナーゼを有する少なくとも1種類のポリペプチドには、T.リーゼイ(T. reesei)EG1(GenBankアクセッション番号HM641862.1)及び/又はT.リーゼイ(T. reesei)EG2ポリペプチド(GenBankアクセッション番号ABA64553.1)が含まれる。
セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドには、セルロース、セロテトリオース、又はβ−1,4−結合したグルコースを含むあらゆるポリマー内の1,4−β−D−グルコシド結合の加水分解を触媒し、鎖の末端からセロビオースを放出させる、1,4−D−グルカンセロビオヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.91)活性を有するポリペプチドが含まれる。本発明の目的では、セロビオヒドロラーゼ活性は、Leverら、1972,Anal.Biochem 47:273〜279のPHBAH法によって測定されるように、セルロースからの水溶性の還元糖の放出によって測定することができる。セロビオヒドロラーゼのエキソグルカナーゼ型の攻撃と、エンドグルカナーゼ型の攻撃との区別は、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースなどの置換セルロースからの還元糖の放出を同様に測定することによって行うことができる(Ghose,1987,Pure & Appl.Chem.59:257〜268)。真のセロビオヒドロラーゼは、置換セルロースに対して非置換のセルロースに極めて高い活性比を有している(Baileyら、1993,Biotechnol.Appl.Biochem.17:65〜76)。
グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、セロビオースの加水分解を触媒してβ−D−グルコースを放出させるβ−D−グルコシドグルコヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.21)活性を有するポリペプチドが含まれる。本発明の目的では、β−グルコシダーゼ活性は、例えばHPLCなどの当該技術分野では周知の方法によって測定することができる。グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、これらに限定されるものではないが、セロビオースの加水分解を触媒してβ−D−グルコースを放出させるGHファミリー1、3、9又は48のメンバーを含む特定のGHファミリーのメンバーが含まれる。グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、組換え手法によって多くの微生物から得られるか又は販売元から購入されるβ−グルコシダーゼなどのβグルコシダーゼが含まれる。微生物に由来するβ−グルコシダーゼの例としては、これらに限定されるものではないが、細菌及び真菌類に由来するものが挙げられる。例えば、β−グルコシダーゼは好適には糸状菌から得られる。一部の態様では、グルコシダーゼ活性(例えばβ−グルコシダーゼ活性)を有する少なくとも1種類のポリペプチドは、T.リーゼイ(T. reesei)のBgl1ポリペプチドである。
キシラナーゼ活性は、比色アゾ−バーチウッドキシランアッセイ(S−AXBL、メガザイム・インターナショナル・アイルランド社(Megazyme International Ireland Ltd.)(アイルランド))を使用して測定することができる。
キシロシダーゼ(例えばβ−キシロシダーゼ)活性は、発色性基質である4−ニトロフェニルβ−D−キシロピラノシド(pNPX、シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)N2132)を使用して測定することができる。
本開示の酵素ブレンド/組成物などの、本明細書で提供される組成物のいずれも、全セルラーゼを含みうる。
全セルラーゼ調製物は、好適には、American Type Culture Collectionより、T.リーゼイ(T. reesei)ATCC 56765として入手可能なT.リーゼイ(T. reesei)RutC30全セルラーゼ調製物でありうる。例えば、全セルラーゼ調製物は、好適には、American Type Culture Collectionより、P.フニクロサム(P. funiculosum)ATCC番号:10446として入手可能なP.フニクロサム(P. funiculosum)の全セルラーゼであってもよい。
本明細書において提供されるGH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物(又はGH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼを含む非天然組成物)は、本明細書に述べられるような異なる成分を含みうるものであり、各成分は組成物中に異なる量で存在する。
本開示の酵素組成物は、好適には、1以上のアクセサリータンパク質を更に含みうる。アクセサリータンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、マンナナーゼ(例えばエンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、及びβ−マンノシダーゼ)、ガラクタナーゼ(例えば、エンド型及びエキソ型ガラクタナーゼ)、アラビナーゼ(例えばエンド型アラビナーゼ及びエキソ型アラビナーゼ)、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ(例えば、フェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、クマリン酸エステラーゼ又はペクチンメチルエステラーゼ)、リパーゼ、他のグリコシドヒドロラーゼ、キシログルカナーゼ、CIP1、CIP2、スウォレニン、エクスパンシン、及びセルロース破壊タンパク質が挙げられる。例えば、セルロース破壊タンパク質はセルロース結合モジュールである。
本開示は、本開示の酵素、酵素ブレンド/組成物を使用したバイオマス糖化のための方法及びプロセスを提供する。詳細には、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチド又は組成物のいずれか1つを用いて、バイオマス材料を加水分解するための方法及びプロセスを提供する。更に、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチド又は組成物のいずれか1つを用いて、バイオマス混合物(例えば、糖化プロセスにおいてバイオマス基質及び酵素を含むバイオマス混合物)の粘度を低下させるための方法を提供する。一部の態様では、GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物とバイオマス材料とを接触させることを含む、バイオマス材料を加水分解する方法が提供される。一部の態様では、ポリペプチドは、バイオマス材料を加水分解するうえで充分な量である。
糖化に先立って、バイオマス材料を1以上の前処理工程に供することにより、キシラン、ヘミセルロース、セルロース、及び/又はリグニン材料と酵素との接触性を高めるか又は酵素の作用を受けやすくし、これにより本開示の酵素及び/又は酵素ブレンド/組成物による加水分解をより受けやすくすることが好ましい。
本開示は、バイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、バイオマス混合物を、バイオマス混合物の粘度を低下させるうえで充分な量のグリコシルヒドロラーゼファミリー61(「GH61」)エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物(例えば非天然組成物)と接触させることを含む、方法を提供する。一部の態様では、バイオマス混合物は、バイオマス材料と、発酵性糖と、全セルラーゼと、セルラーゼ活性を有するポリペプチド及び/又はヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物とを含む。一部の態様では、粘度は、GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(例えば、T.リーゼイ(T. reesei)Eg4ポリペプチド又はその変異体)の非存在下でのバイオマス混合物の粘度と比較して、少なくとも約5%(例えば、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、又は90%のいずれか)低下させられる。本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、バイオマス材料は、ヘミセルロース、セルロース、又はこれらの混合物を含む。一部の態様では、バイオマス物質は、グルカン、キシラン、及び/又はリグニンを含む。
本開示のセルラーゼ及び/又はヘミセルラーゼ組成物は、工業的及び/又は商業的な状況で更に使用することができる。したがって、本発明の非天然セルラーゼ及び/又はヘミセルラーゼ組成物を製造、販売、又は商業化する方法もまた、想到されるものである。
以下のアッセイ/方法を、下記に述べる実施例において一般的に使用した。下記に示すプロトコールからのすべての変更点は、具体的な実施例に示す。
国際特許出願公開第WO06110901A号に述べられる方法及び処理範囲に従って(特に断らないかぎり)、酵素加水分解に先立ってトウモロコシの穂軸、トウモロコシの茎葉、及びスイッチグラスの前処理を行った。前処理に関するこれらの参照文献は、米国特許出願公開第20070031918−A1号、同第20070031919−A1号、同第20070031953−A1号、及び/又は同第20070037259−A1号の開示内容にも含まれている。
蒸気膨張サトウキビバガス(SEB)を、サン・オプタ社(SunOpta)より入手した(Glasser,WGら、Biomass and Bioenergy 1998,14(3):219〜235;Jollez,Pら、Advances in thermochemical biomass conversion,1994,2:1659〜1669)。
「バイオマス中の構造性炭水化物及びリグニンの測定(Determination of structural carbohydrates and lignin in the biomass)」、(National Renewable Energy Laboratory,Golden,CO 2008 http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf)に述べられる2工程の酸加水分解法を用いてバイオマス基質の組成物を測定した。この方法を用いて、酵素加水分解の結果を、基質の開始時のグルカン及びキシラン含量からの理論的収率に対する変換率(%)として本明細書に報告した。
BCAタンパク質アッセイは、分光光度計によってタンパク質濃度を測定する比色分析アッセイである。BCAタンパク質アッセイキット(ピアース・ケミカル社(Pierce Chemical)、製品番号23227)を製造者の指示に従って使用した。50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5)を使用して、酵素希釈液を試験チューブ中で調製した。希釈した酵素溶液(0.1mL)を、1mLの15%トリクロロ酢酸(TCA)が入った2mLのエッペンドルフ遠心チューブに加えた。チューブをボルテックスにかけ、氷浴中に10分間置いた。次いで、各試料を14,000rpmで6分間遠心した。上清を捨て、ペレットを1mLの0.1N NaOHに再懸濁し、ペレットが溶解するまでチューブをボルテックスした。BSA標準溶液を2mg/mLのストック溶液から調製した。BCA作用溶液を、0.5mLの試薬Bを25mLの試薬Aと混合することにより調製した。0.1mLの酵素再懸濁試料を3本のエッペンドルフ遠心チューブに加えた。2mLのPierce BCA作用溶液を、各試料及びBSA標準エッペンドルフチューブに加えた。すべてのチューブを37℃の水浴中で30分間インキュベートした。次いで各試料を室温にまで冷却し(15分間)、分光光度計で562nmの吸光度を測定した。
y=mx+b
グルコース測定用のABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチレンチアゾリン−6)−スルホン酸)アッセイは、O2の存在下では、グルコース酸化酵素が、化学量論的な量の過酸化水素(H2O2)を生成しながらグルコースの酸化を触媒するという原理に基づいたものである。この反応の後に、H2O2の濃度と線形の相関を示す、ABTSの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)により触媒される酸化を行う。酸化型ABTSの生成は、405nmのODにおいて定量される緑色の呈色によって示される。ABTS粉末(シグマ社(Sigma)、#A1888−5g、2.74mg/mL)、0.1U/mLのHRP(100U/mL、シグマ社(Sigma)、#P8375)、及び1U/mLのグルコースオキシダーゼ(OxyGO(登録商標)HP L5000、5000U/mL、ダニスコ・ユー・エス・エー社ジェネンコア部門(Genencor Division, Danisco USA))の混合物を、50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)中で調製し、暗所で保管した(基質)。グルコース標準溶液(0、2、4、6、8、10nmol)を50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)中で調製し、10μLの各標準溶液を96穴平底MTP中に3重で加えた。10μLの連続希釈した試料もMTPに加えた。100μLのABTS基質溶液を各ウェルに加え、プレートを分光光度プレートリーダー上に置いて、ABTSの酸化を405nmで5分間、速度論的に読み取った。
透明な不溶性物質が得られるまで遠心し、0.22μmのナイロンフィルター(Spin−X遠心チューブフィルター、コーニング社(Corning Incorporated)、ニューヨーク州コーニング)に通して濾過し、蒸留水で適当な濃度の可溶性糖にまで希釈することによって、バイオマス糖化からの試料を調製した。モノマー糖は、6×50mmのSH−1011Pガードカラムを備えたShodex Sugar SH−G SH1011、8×300mm(www.shodex.net)で測定した。溶媒は、0.01NのH2SO4を0.6mL/分で流した。カラム温度は50℃とし、屈折率により検出を行った。また、Waters 2410屈折率検出器を備えたBiorad Aminex HPX−87Hカラムを使用して、糖の分析を行った。分析時間は20分間であり、注入体積は20μLの希釈試料であり、移動相は、0.2μmで濾過し、脱気した0.01N硫酸であり、流速は0.6mL/分であり、カラム温度は60℃であった。グルコース、キシロース、及びアラビノースの外部標準を各試料群とともに流した。
トウモロコシ穂軸のT.リーゼイ(T. reesei)Xyn3による加水分解によるオリゴマーを、グルカン及びキシラン1g当たり8mgのT.リーゼイ(T. reesei)Xyn3と、乾燥重量で250gの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸とを、50mM、pH 5.0の酢酸ナトリウム緩衝液(1N硫酸によりpHを調整したもの)中でインキュベートすることにより調製した。反応は、48℃で72時間、180rpmで回転振盪を行って進行させた。上清を9,000×Gで遠心した後、0.22μmのNalgeneフィルターに通して濾過して可溶性糖を回収した。その後の酵素アッセイを行うため、T.リーゼイ(T. reesei)Xyn3オリゴマーを含む上清の100μLのアリコートを、1μg/μLのT.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A、1μg/μLのT.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A/EG4#27、又はコントロールとしての水とともに、エッペンドルフチューブ中、48℃で2.5時間インキュベートした。次に上清を氷冷したMilliQ水で4倍に希釈し、濾過して、オリゴマーからの糖の放出についてHPLCにより分析した。
本明細書における一般的な実施例では、特定の実施例により具体的に述べられないかぎりは、トウモロコシ穂軸の糖化は、以下の手順に従ってマイクロタイタープレートのフォーマットで行った。例えば希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸のようなバイオマス基質を、水で薄め、硫酸でpHを調整してpH 5の7%セルローススラリーとした後、これを更なる処理を行わずにアッセイにおいて直接使用した。酵素試料を、基質(例えばトウモロコシ穂軸)中のセルロース1g当たりの全タンパク質のmg数(例えば上記の実施例1Aにおいて述べた方法を用い、従来の組成分析法によって決定される)に基づいてロードした。次いで各酵素を50mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)に希釈して、所望のローディング濃度を得た。40μLの酵素溶液を、70mgの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に、7%セルロース/ウェルとなるように加えた(4.5%セルロース/ウェルの最終濃度に相当)。各アッセイプレートにアルミニウムのプレートシーラーを被せ、室温で混合し、50℃、200rpmで3日間(「3d」)インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、各ウェルに100μLの100mMグリシン緩衝液(pH10.0)を加えることにより糖化反応を停止させた。プレートを3,000rpmで5分間遠心した。次いで10μLの上清を、96穴HPLCプレート中で200μLのMilliQ水に加え、HPLCにより可溶性糖を測定した。
T.リーゼイ(T. reesei)β−グルコシダーゼ遺伝子bgl1、T.リーゼイ(T. reesei)エンドキシラナーゼ遺伝子xyn3、F.バーティシリオイデス(F. verticillioides)β−キシロシダーゼ遺伝子fv3A、F.バーティシリオイデス(F. verticillioides)β−キシロシダーゼ遺伝子fv43D、及びF.バーティシリオイデス(F. verticillioides)α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子fv51Aの5つの遺伝子を同時発現するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の組み込み発現株を構築した。
天然β−グルコシダーゼ遺伝子bgl1のN末端部分を、ディーエヌエー2.0社(DNA 2.0)(メンローパーク、米国)によりコドン最適化した。この合成された部分は、コーディング領域の最初の447個の塩基からなるものであった。このフラグメントを、プライマーとしてSK943及びSK941を用いてPCR増幅した。天然bgl1遺伝子の残りの領域は、プライマーとしてSK940及びSK942を用いて、T.リーゼイ(T. reesei)株RL−P37(Sheir−Neiss,Gら、Appl.Microbiol.Biotechnol.1984,20:46〜53)から抽出したゲノムDNA試料からPCR増幅した。bgl1遺伝子のこれら2つのPCRフラグメントを、プライマーとしてSK943及びSK942を用いて融合PCR反応で互いに融合した。
順方向プライマーSK943:(5’−CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT−3’)(配列番号121)
逆方向プライマーSK941:(5’−CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG−3’)(配列番号122)
順方向プライマー(SK940):(5’−CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG−3’)(配列番号123)
逆方向プライマー(SK942):(5’−CCTACGCTACCGACAGAGTG−3’)(配列番号124)
順方向プライマーSK771:(5’−GTCTAGACTGGAAACGCAAC−3’)(配列番号125)
逆方向プライマーSK745:(5’−GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC−3’)(配列番号126)
天然T.リーゼイ(T. reesei)エンドキシラナーゼ遺伝子xyn3を、xyn3F−2及びxyn3R−2をプライマーとして用いて、T.リーゼイ(T. reesei)から抽出したゲノムDNA試料からPCR増幅した。
順方向プライマーxyn3F−2:(5’−CACCATGAAAGCAAACGTCATCTTGTGCCTCCTGG−3’)(配列番号127)
逆方向プライマー(xyn3R−2):(5’−CTATTGTAAGATGCCAACAATGCTGTTATATGCCGGCTTGGGG−3’)(配列番号128)
順方向プライマーSK745:(5’−GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC−3’)(配列番号129)
逆方向プライマーSK822:(5’−CACGAAGAGCGGCGATTC−3’)(配列番号130)
F.バーティシリオイデス(F. verticillioides)β−キシロシダーゼfv3A遺伝子を、プライマーとしてMH124及びMH125を用いてF.バーティシリオイデス(F. verticillioides)のゲノムDNAから増幅した。
順方向プライマーMH124:(5’−CAC CCA TGC TGC TCA ATC TTC AG−3’)(配列番号131)
逆方向プライマーMH125:(5’−TTA CGC AGA CTT GGG GTC TTG AG−3’)(配列番号132)
順方向プライマーSK1334:(5’−GCTTGAGTGTATCGTGTAAG−3’)(配列番号133)
順方向プライマーSK1335:(5’−GCAACGGCAAAGCCCCACTTC−3’)(配列番号134)
逆方向プライマーSK1299:(5’−GTAGCGGCCGCCTCATCTCATCTCATCCATCC−3’)(配列番号135)
F.バーティシリオイデス(F. verticillioides)β−キシロシダーゼFv43D発現カセットを構築するため、fv43D遺伝子産物を、プライマーとしてSK1322及びSK1297を用いてF.バーティシリオイデス(F. verticillioides)のゲノムDNA試料から増幅した。エンドグルカナーゼ遺伝子egl1のプロモーターの領域を、プライマーとしてSK1236及びSK1321を用い、株RL−P37から抽出したT.リーゼイ(T. reesei)のゲノムDNA試料からPCRによって増幅した。次に、これら2つのPCR増幅したDNAフラグメントを、プライマーとしてSK1236及びSK1297を用いて融合PCR反応で互いに融合した。得られた融合PCRフラグメントをpCR−Blunt II−TOPOベクター(インビトロジェン社(Invitrogen))にクローニングして、プラスミドTOPO Blunt/Pegl1−Fv43D(図8H)を得て、このプラスミドを用いて大腸菌One Shot(登録商標)TOP10化学コンピテント細胞(インビトロジェン社(Invitrogen))を形質転換した。複数の大腸菌クローンからプラスミドDNAを抽出し、制限酵素で消化して確認した。
順方向プライマーSK1322:(5’−CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC−3’)(配列番号136)
逆方向プライマーSK1297:(5’−GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG−3’)(配列番号137)
順方向プライマーSK1236:(5’−CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG−3’)(配列番号138)
逆方向プライマーSK1321:(5’−GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG−3’)(配列番号139)
F.バーティシリオイデス(F. verticillioides)のα−アラビノフラノシダーゼ遺伝子fv51Aの発現カセットを構築するため、fv51A遺伝子産物を、プライマーとしてSK1159及びSK1289を用いてF.バーティシリオイデス(F. verticillioides)のゲノムDNA試料から増幅した。エンドグルカナーゼ遺伝子egl1のプロモーターの領域を、プライマーとしてSK1236及びSK1262を用い、株RL−P37から抽出したT.リーゼイ(T. reesei)のゲノムDNA試料からPCRによって増幅した。次に、これら2つのPCR増幅したDNAフラグメントを、プライマーとしてSK1236及びSK1289を用いて融合PCR反応で互いに融合した。得られた融合PCRフラグメントをpCR−Blunt II−TOPOベクター(インビトロジェン社(Invitrogen))にクローニングしてプラスミドTOPO Blunt/Pegl1−Fv51A(図8I)を得て、このプラスミドを用いて大腸菌One Shot(登録商標)TOP10化学コンピテント細胞(インビトロジェン社(Invitrogen))を形質転換した。
順方向プライマーSK1159:(5’−CACCATGGTTCGCTTCAGTTCAATCCTAG−3’)(配列番号140)
逆方向プライマーSK1289:(5’−GTGGCTAGAAGATATCCAACAC−3’)(配列番号141)
順方向プライマーSK1236:(5’−CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG−3’)(配列番号142)
逆方向プライマーSK1262:(5’−GAACTGAAGCGAACCATGGTGTGGGACAACAAGAAGGAC−3’)(配列番号143)
順方向プライマーSK1298:(5’−GTAGTTATGCGCATGCTAGAC−3’)(配列番号144)
逆方向プライマーSK1289:(5’−GTGGCTAGAAGATATCCAACAC−3’)(配列番号145)
RL−P37より誘導し(Sheir−Neiss,Gら、Appl.Microbiol.Biotechnol.1984,20:46〜53)、高いセルラーゼの産生量について選択したトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)突然変異株に、PEG媒介形質転換法(Penttila,Mら、Gene 1987,61(2):155〜64)を用いて、β−グルコシダーゼ発現カセット(cbh1プロモーター、T.リーゼイ(T. reesei)β−グルコシダーゼ1遺伝子、cbh1ターミネーター、及びamdSマーカー)及びエンドキシラナーゼ発現カセット(cbh1プロモーター、T.リーゼイ(T. reesei)xyn3、及びcbh1ターミネーター)を同時形質転換した。多数の形質転換体が単離され、これらをβ−グルコシダーゼ及びエンドキシラナーゼの産生について調べた。T.リーゼイ(T. reesei)株#229と呼ばれる形質転換体を、他の発現カセットとともに形質転換に使用した。
T.リーゼイ(T. reesei)株#229に、エレクトロポレーション(例えば国際特許出願公開第WO 08153712号を参照)を用いて、β−キシロシダーゼfv3A発現カセット(cbh1プロモーター、fv3A遺伝子、cbh1ターミネーター、及びalsRマーカー)、β−キシロシダーゼfv43D発現カセット(egl1プロモーター、fv43D遺伝子、天然fv43Dターミネーター)、及びfv51Aα−アラビノフラノシダーゼ発現カセット(egl1プロモーター、fv51A遺伝子、fv51A天然ターミネーター)を同時形質転換した。形質転換体を、クロリムロンエチル(80ppm)を含むフォーゲル(Vogels)寒天平板培地上で選択した。フォーゲル寒天は、1L当たりにつき以下のように調製した。
T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3Aの発酵により以下のタンパク質、すなわち、T.リーゼイ(T. reesei)Xyn3、T.リーゼイ(T. reesei)Bgl1、Fv3A、Fv51A、及びFv43Dが、本明細書に述べられ、図9に示されるようにして測定した比で生成する。
液体クロマトグラフィー(LC)及び質量分析(MS)を行って、発酵ブロス中に含まれる酵素を分離、同定、及び定量した。酵素試料を、S.プリカタス(S. plicatus)(例えばNEB P0702L)から組換えにより発現されたendoHグリコシダーゼで最初に処理した。endoHは、1μgの試料の全タンパク質当たり0.01〜0.03μgのendoHタンパク質となる比で使用し、37℃、pH 4.5〜6.0で3時間インキュベートすることにより、HPLC分析に先立ってN結合型グリコシル化を酵素的に除去した。次いで、Agilent 1100 HPLCシステムをHICフェニルカラム及び35分間にわたる高〜低塩勾配とともに使用して、約50μgのタンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うために注入した。この勾配は、高塩濃度緩衝液A(20mMリン酸カリウムを含む4M硫酸アンモニウム、pH 6.75)及び低塩濃度緩衝液B(20mMリン酸カリウム、pH 6.75)を用いて得た。ピークは222nmの紫外線により検出し、分画を回収し、質量分析により同定を行った。タンパク質の濃度は、試料の全積分面積に対する各ピークの面積の比率(%)として報告した。
精製タンパク質(及び1種類の非精製タンパク質)をストック溶液から連続希釈し、T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3Aの発酵ブロスに加えることにより、前処理したバイオマスの糖化に対する効果を調べた。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、マイクロタイタープレート(MTP)の各ウェルに20%固形分(w/w)(1ウェル当たり約5mgのセルロース)(pH 5)となるようにロードした。H3Aタンパク質(発酵ブロスの形態)を、20mgタンパク質/セルロース1gとなるように各ウェルに加えた。希釈したタンパク質のそれぞれ(図10)の10、5、2及び1μLの量を、個々のウェルに加え、各ウェルへの液体の添加量が全体で10μLとなるように水を加えた。参照ウェルには、10μLの水又は更なるH3A発酵ブロスの希釈液を加えた。MTPをホイルでシールし、Innovaインキュベーターシェーカー中で200RPMで振盪しながら50℃で3日間インキュベートした。各試料を、100μLの100mMグリシン、pH 10で反応停止した。反応停止させた試料をプラスチックシールで覆い、3000RPMで5分間、4℃で遠心した。反応停止させた反応液のアリコート(5μL)を100μLの水で希釈し、反応液中に生成したグルコースの濃度をHPLCを用いて測定した。グルコースのデータを、20mg/gのH3Aに加えたタンパク質濃度の関数としてプロットした(タンパク質の添加濃度は、異なる開始濃度及び添加体積のために異なりうる)。結果を図11A〜11Dに示す。
A.T.リーゼイ(T. reesei)株H3A/EG4#27の構築及びスクリーニング
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)に由来するT.リーゼイ(T. reesei)egl1(「Cel 7B」とも称される)プロモーター、T.リーゼイ(T. reesei)eg4(「TrEG4」又は「Cel 61A」とも称される)オープンリーディングフレーム、及びcbh1(Cel 7A)ターミネーター配列を含む発現カセット(図12A)、並びにアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)に由来するsucA選択マーカー(Boddyら、Curr.Genet.1993,24:60〜66を参照)を、pCR Blunt II TOPO(インビトロジェン社(Invitrogen))にクローニングした(図12B)。
SK1298:5’−GTAGTTATGCGCATGCTAGAC−3’(配列番号146)
214:5’−CCGGCTCAGTATCAACCACTAAGCACAT−3’(配列番号147)
好ましい用量を決定するため、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸(25%固形分、8.7%セルロース、7.3%キシラン)の加水分解を、T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A/EG4 #27、又は精製したEG4を反応混合物に加えたH3A株から得られた発酵ブロスを用いてpH 5.3で行った。T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A/EG4 #27又はH3Aの全体のロード量は、グルカン(G)及びキシラン(X)1g当たり14mgのタンパク質とした。
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対する、株H3AにおけるT.リーゼイ(T. reesei)Eg4の過剰発現の効果を、株H3A/EG4 # 27及びH3Aから得られた発酵ブロスを用いて試験した。3gのスケールのトウモロコシ穂軸の糖化を、以下のようにして20mLガラスバイアル中で行った。酵素調製物、1N硫酸、及び50mM(pH 5.0)酢酸ナトリウム緩衝液(0.01%アジ化ナトリウム及び5mM MnCl2を含む)を加え、酵素のロード量が1gのグルカン+キシラン当たり1.7〜21.0mgの全タンパク質の範囲で変化する、全体で3gの反応液として最終的なスラリーを得た(乾燥固形分22%、pH 5.0)。糖化バイアルはすべて、48℃で180rpmの回転速度でインキュベートした。72時間後、12mLの濾過したMilliQ水を各バイアルに加えて糖化反応液全体を5倍に希釈した。各試料を14,000×gで5分間遠心してから0.22μmナイロンフィルター(Spin−X遠心チューブフィルター、コーニング社(Corning Incorporated)、ニューヨーク州コーニング)に通して濾過し、濾過したMilliQ水で更に4倍に希釈して最終的に20倍の希釈液とした。20μLの注入液をHPLCにより分析して、放出された糖を測定した。
放出される糖の濃度に対する精製されたT.リーゼイ(T. reesei)Eg4の効果について、1.05gの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、0.53mgのXyn3/g(グルカン+キシラン)の存在下又は非存在下で使用して試験した。各実験は、実施例6で述べたようにして行った。結果を図23に示す。これらのデータは、精製されたT.リーゼイ(T. reesei)Eg4は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどの他のセルラーゼの作用がなくとも、グルコースモノマーの放出を生じることを示している。
この実験では、14mgのタンパク質/g(グルカン+キシラン)の用量で用いた、T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A又はH3A/EG4#27より得た発酵ブロスを、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、洗浄した希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、アンモニア繊維膨張トウモロコシ茎葉(AFEX CS)、蒸気膨張サトウキビバガス(SEB)、並びにクラフト前処理した紙パルプFPP27(脱リグニン化した針葉樹工業用未漂白パルプ−κ 13.5、グルカン81.9%、キシラン8.0%、クラーソンリグニン1.9%)、FPP−31(脱リグニン化した広葉樹未漂白パルプ−κ 10.1、グルカン75.1%、キシラン19.1%、クラーソンリグニン2.2%)及びFPP−37(空気乾燥した針葉樹未漂白パルプ−κ 82、グルカン71.4%、キシラン8.7%、クラーソンリグニン11.3%)を含む異なる基質に対する糖化効率について試験した。
酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対するEg4の効果について試験を行った。希硫酸で前処理したトウモロコシ茎葉(Schell,DJら、Appl.Biochem.Biotechnol.2003,105(1〜3):69〜85)を、NRELより入手し、20%固形分に調整し、ソーダ灰溶液を加えてpH 5.0に調整した。前処理した基質の糖化を、20%全固形分を用いてマイクロタイタープレート中で行った。発酵ブロス中の全タンパク質は、ビウレットアッセイ(上記実施例1を参照)により測定した。T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A/EG4 #27及びH3Aより得た発酵ブロスの基質への添加量を増やし、50℃、5日間、200RPMの振盪でのインキュベーション後の糖化効率を測定した。グルコースの生成量(mg/g)をHPLCにより測定した。結果を図26に示す。
T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3A及びH3A/EG4#27の糖化効率を、希アンモニアで前処理したトウモロコシ葉、茎、又は穂軸で比較した。前処理は、国際特許出願公開第WO06110901A号に述べられるようにして行った。5gの全質量(7%固形分)を、20mLバイアル中、pH 5.3(6N H2SO4によりpHを調整した)で、14mgのタンパク質/g(グルカン+キシラン)を使用して加水分解した。糖化反応は50℃で行い、試料は4日目に放出されたグルコース及びキシロースについてHPLCにより分析した。結果を図27に示す。
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いて、3gのスケールの糖化反応を行った。充分な前処理を行った穂軸調製物を、20mLガラスバイアル中に0.75g乾燥固形分となるように計量して入れた。酵素調製物、1N硫酸及び50mM(pH 5.0)酢酸ナトリウム緩衝液(0.01%アジ化ナトリウムを含むもの)を加えて、全体で3gの反応液として最終的なスラリーを得た(25%乾燥固形分、pH 5.0)。T.リーゼイ(T. reesei)組み込み株H3Aから得た細胞外タンパク質(発酵ブロス)を14mgのタンパク質/g(グルカン+キシラン)となるように加え、更に5%の14mgのタンパク質ロードを、Eg4を過剰発現するT.リーゼイ(T. reesei)株(Δcbh1 Δcbh2 Δeg1 Δeg2)(国際特許出願公開第WO 05/001036号を参照)より得た未精製の培養上清として加えるか、又は加えなかった。糖化反応液は、50℃で72時間インキュベートした。インキュベーションの後、反応内容物を3倍に希釈し、濾過し、グルコース及びキシロース濃度についてHPLCにより分析した。結果を図28に示す。Eg4を過剰発現するT.リーゼイ(T. reesei)株より得た細胞外タンパク質の形態のEg4タンパク質をH3Aに加えることにより、モノマーグルコースの放出量が大幅に増加し、モノマーキシロースの放出量はわずかに増加した。
タンパク質の用量を増やした場合のアンモニアで前処理したスイッチグラスに対する株H3A/EG4#27の糖化効率(国際特許出願公開第WO06110901A号)を、株H3A(18.5%固形分)の糖化効率と比較した。前処理したスイッチグラス調製物を、0.925gの乾燥固形分となるように20mLガラスバイアル中に計量して入れた。1N硫酸及び50mM(pH 5.3)酢酸ナトリウム緩衝液(0.01%アジ化ナトリウムを含むもの)を加えて、全体で5gの反応液として最終的なスラリーを得た。試験したH3Aの酵素の用量は、14、20、及び30mg/g(グルカン+キシラン)であり、H3A−EG4#27の用量は、5、8、11、14、20、及び30mg/g(グルカン+キシラン)であった。反応液を50℃で3日間インキュベートした。インキュベーションの後、反応内容物を3倍に希釈し、濾過し、グルコース及びキシロース濃度についてHPLCにより分析した。グルカン及びキシランの変換率を、スイッチグラス基質の組成に基づいて計算した。結果(図29)は、H3A−EG4#27の効率は、同じ酵素用量のH3Aよりもグルカンの変換においてより効果的であることを示している。
A.トウモロコシ穂軸の糖化
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、20%固形分、7%セルロースに調整し、マイクロタイタープレートの1ウェル当たり65mgを分注した。T.リーゼイ(T. reesei)CBH1を5mgのタンパク質/g(グルカン)(最終濃度)で、関連酵素(CBH1又はEg4)を0、1、2、3、4及び5mg/g(グルカン)の最終濃度で含む35μLの50mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)緩衝液を加えることにより、糖化反応を開始した。Eg4コントロールには同じ用量のEG4のみを加えたため、これらのウェルでは全体のタンパク質の添加量はより少なかった。各マイクロタイタープレートを、アルミニウムプレートシール(イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社(E&K scientific))でシールし、600rpm、24℃で2分間混合した。次いでプレートを、50℃、200rpmで72時間、Innovaインキュベーター内に置いた。
カルボキシメチルセルロース(CMC、シグマ社(Sigma)C4888)を、50mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)で1%に希釈した。EG4、EG1及びCBH1の3種類のT.リーゼイ(T. reesei)の精製酵素のそれぞれを、20、10、5、2.5、1.25及び0mg/gの最終濃度で100μLの1% CMCに96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社(NUNC)#269787)中で別々に加えることにより、加水分解反応を開始した。酢酸ナトリウム(pH 5.0、50mM)を、各ウェルに150μLの最終体積となるように加えた。このCMC加水分解反応液を、アルミニウムプレートシール(イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社(E&K scientific))でシールし、600rpm、24℃で2分間混合した。次いでプレートを、50℃、200rpmで30分間、Innovaインキュベーター内に置いた。
DNS溶液:
40g 3.5−ジニトロサリチル酸(シグマ社(Sigma)、D0550)
8gフェノール
2g亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)
800g Na−K酒石酸塩(ロッシェル塩)
上記のものすべてを2Lの2% NaOHに加える。
一晩攪拌し、アルミニウム箔で覆う。
蒸留した脱イオン水を4Lの最終体積となるように加える。
これをよく混ぜる。
暗ビン中で冷蔵保管する。
セロビオースを、50mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)で5g/Lに希釈した。EG4及びBGL1の2種類の酵素のそれぞれを、20、10、5、2.5及び0mg/gの最終濃度で100μLの5g/Lセロビオース溶液に別々に加えることにより、加水分解反応を開始した。酢酸ナトリウム(pH 5.0)を120μLの最終体積にまで各ウェルに加えた。反応プレートをアルミニウムプレートシール(イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社(E&K scientific))でシールし、600rpm、24℃で2分間混合した。次いでプレートを、50℃、200rpmで2時間、Innovaインキュベーター内に置いた。
精製したEg4と精製した各セルラーゼ(T.リーゼイ(T. reesei)EG1、EG2、CBH1、CBH2、及びBgl1)との組み合わせの、放出される糖の濃度に対する効果について、1gのグルカン+キシラン当たり0.53mgのT.リーゼイ(T. reesei)Xyn3の存在下で、1.05gの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用して試験した。1.06gの反応液を、0.111gの乾燥穂軸固形分(10.5%固形分)が入った5mLバイアル中で調製した。酵素調製物(図33)、1N硫酸、及び50mM(pH 5.0)酢酸ナトリウム緩衝液(0.01%アジ化ナトリウム及び5mM MnCl2を含んだもの)を加えて、最終的な反応重量とした。反応バイアルを、48℃で180rpmの回転速度でインキュベートした。72時間後、濾過したMilliQ水を加えて各糖化反応を5倍に希釈した。各試料を14,000×gで5分間遠心してから0.22μmナイロンフィルター(Spin−X遠心チューブフィルター、コーニング社(Corning Incorporated)、ニューヨーク州コーニング)に通して濾過し、濾過したMilliQ水で更に4倍に希釈して最終的に20倍の希釈液とした。20μLの注入液をHPLCにより分析して、放出された糖(グルコース、セロビオース、及びキシロース)を測定した。
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化反応液を、96穴MTP(ブイ・ダブリュ・アール社(VWR))中で以下のようにして酵素混合物をトウモロコシ穂軸(65mg/ウェル(20%固形分、7%セルロース))に加えることによって調製した。80μLの50mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)、1mgのBgl1/g(グルカン)、及び0.5mgのXyn3/g(グルカンバックグランド)もすべてのウェルに加えた。
市販のセルラーゼ酵素調製物であるSpezyme(登録商標)CP、Accellerase(登録商標)1500、及びAccellerase(登録商標)DUET(ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア部門(Genencor Division, Danisco US))の全タンパク質濃度を、改変ビウレットアッセイ(本明細書に述べられる)によって測定した。
本実験で使用したバイオマスは、以下の組成(表2)を有するInbiconで酸性化し蒸気膨張で前処理した麦わらである。すなわち、
本実験で使用したバイオマスは、NRELより入手した希釈酸で前処理したトウモロコシ茎葉(未洗浄PCS)である。
本実験で使用したバイオマスは、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸である。
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、乾燥固形分25%及び乾燥固形分30%の2つの固形分ローディング条件で酵素組成物と混合した。具体的には、前処理したバイオマスを、50℃、pH 5.0で、T.リーゼイ(T. reesei)H3A(図9)又はH3A/Eg4 #27株のいずれかの発酵ブロスからの14mg(タンパク質)/g(セルロース)と混合した。粘度の低下は、ブルックフィールド粘度計(ブルックフィールド・エンジニアリング社(Brookfield Engineering, Inc))を使用して測定した。結果を図44に示す。
本実験では、糖化プロセスにおいて、OPTIMASH(商標)BG、OPTIMASH(商標)TBG、OPTIMASH(商標)VRなどの異なる粘度低下酵素、又はAccellerase(登録商標)BGなどのβ−グルコシダーゼを、Accellerase(登録商標)DUETの存在下で使用し、グルコース産生及び粘度低下におけるこれらの粘度低下酵素の効果を判定した。H3A/EG4組み込み株#27から産生された酵素組成物も含まれた。Accellerase(登録商標)1500、Accellerase(登録商標)DUET、Accellerase(登録商標)BG、OPTIMASH(商標)BG、OPTIMASH(商標)TBG、及びOPTIMASH(商標)VRは、ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア(Danisco US Inc., Genencor)より販売される製品である。
Inbiconで前処理した麦わら(25%乾燥物質)を異なる酵素と反応チャンバ内でインキュベートすることによって、糖化プロセスを行った。実験条件を表7に示す。各チャンバ内の全質量は10kgとした。麦わらの初期のpHは約3.50であり、Na2CO3を加えることによりpH 5.0に調整した。Accellerase(登録商標)1500、Accellerase(登録商標)DUET、Accellerase(登録商標)BG、Optimash(商標)BG、及びPrimafast(登録商標)LUNAは、ジェネンコア社(Genecor)より販売される製品である。
図39Aに示したように、精製したT.リーゼイ(T. reesei)CBH1(最終濃度5mg/g)、精製したT.リーゼイ(T. reesei)Eg4(最終濃度10mg/g)、アスコルビン酸(50mMストック、最終濃度8.8g/L)、及びマンガン溶液(最終濃度10mM)の組み合わせを互いに混合することにより、結晶性セルロース(50mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)に加えた10%アビセル(Avicel)の溶液50μL)の反応を開始させた。50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)を、各試料に300μLの最終体積となるように加えた。
Claims (43)
- バイオマス糖化混合物であって、
a.バイオマス材料と、
b.エンドグルカナーゼ活性を有するグリコシルヒドロラーゼファミリー61の酵素を含む酵素組成物であって、前記酵素組成物が、
i.配列番号1〜29及び148のいずれか1つと少なくとも65%の配列同一性を有するか、
ii.配列番号27の残基22〜344と少なくとも65%の配列同一性を有するか、
iii.配列番号84〜91からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列モチーフを有するか、
iv.(1)配列番号84及び88、(2)配列番号85及び88、(3)配列番号86、(4)配列番号87、(5)配列番号84、88及び89、(6)配列番号84、88及び91、(10)配列番号85、88及び91、(11)配列番号84、88、89及び91、(12)配列番号84、88、90及び91、(13)配列番号85、88、89及び91、並びに(14)配列番号85、88、90及び91からなる群から選択される1以上の配列モチーフを有するか、
v.配列番号30と少なくとも65%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列又はその相補体によりコードされるか、又は、
vi.配列番号30又はその相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされる、酵素組成物と、を含み、
前記バイオマス糖化混合物が、グリコシルヒドロラーゼファミリー61の酵素を含まないバイオマス糖化混合物よりも低い粘度を有し、かつ/又は、グリコシルヒドロラーゼファミリー61の酵素を含まないか若しくはより低い濃度で含む混合物中の糖化度と比較して、前記混合物中の糖化度を高めることが可能である、バイオマス糖化混合物。 - 前記糖化度が、前記バイオマスの糖化を生じるだけの充分な時間にわたって前記混合物がインキュベートされた後に、発酵性糖の収率によって測定される、請求項1に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記グリコシルヒドロラーゼファミリー61の酵素が、糸状菌に由来する、請求項1又は2に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(Cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティクラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシナム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイド(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・サルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロサム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイド(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)、ブジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブローサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サブバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルストゥス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、マイセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ニューロスポラ・インターメディア(Neurospora intermedia)、ペニシリウム・パープロゲナム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネスセンス(Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリタム(Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニクロサム(Penicillium funiculosum)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジエート(Phlebia radiate)、プレウロタス・エリンギ(Pleurotus eryngii)、タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ(Trametes villosa)、トラメテス・ベルシコロル(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)、ゲオスミチア・エメルソニイ(Geosmithia emersonii)、又はG.ステアロサーモフィルス(G. stearothermophilus)からなる群から選択されるものである、請求項3に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも1種類のポリペプチド、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも1種類のポリペプチドを更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも1種類のポリペプチドが、T.リーゼイ(T. reesei)CBH1、Af7A(配列番号150)、Af7B(配列番号151)、Cg7A(配列番号152)、Cg7B(配列番号153)、Tt7A(配列番号154)、Tt7B(配列番号155)、T.リーゼイ(T. reesei)CBH2、Tt6A(配列番号156)、St6A(配列番号157)、St6B(配列番号158)、又はこれらと少なくとも90%の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチドである、請求項5に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも1種類のポリペプチドが、
a.Fv3C(配列番号100)、Pa3D(配列番号94)、Fv3G(配列番号96)、Fv3D(配列番号98)、Tr3A(配列番号102)、Tr3B(配列番号104)、Te3A(配列番号106)、An3A(配列番号108)、Fo3A(配列番号110)、Gz3A(配列番号112)、Nh3A(配列番号114)、Vd3A(配列番号116)、Pa3G(配列番号118)、Tn3B(配列番号119)、若しくはこれらと少なくとも90%の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
b.(1)配列番号99、93、95、97、101、103、105、107、109、111、113、115、若しくは117と少なくとも90%の配列同一性を有するか、(2)配列番号99、93、95、97、101、103、105、107、109、111、113、115、若しくは117、又はこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである、請求項5又は6に記載のバイオマス糖化混合物。 - 前記酵素組成物が、(1)キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、(2)β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、及び(3)L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの1以上又はすべてを更に含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドが、
a.T.リーゼイ(T. reesei)Xyn3(配列番号76)、T.リーゼイ(T. reesei)Xyn2(配列番号77)、AfuXyn2(配列番号58)、及びAfuXyn5(配列番号60)、若しくはこれらと少なくとも90%の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
b.(1)配列番号75、57、若しくは59と少なくとも90%の配列同一性を有するか、又は(2)配列番号75、57、若しくは59、又はこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、請求項8に記載のバイオマス糖化混合物。 - 前記β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも1種類のポリヌクレオチドが、
a.Fv3A(配列番号36)、Fv43A(配列番号44)、Pf43A(配列番号38)、Fv43D(配列番号62)、Fv39A(配列番号42)、Fv43E(配列番号40)、Fo43A(配列番号52)、Fv43B(配列番号46)、Pa51A(配列番号48)、Gz43A(配列番号50)、T.リーゼイ(T. reesei)Bxl1(配列番号78)、若しくはこれらと少なくとも90%の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
b.(1)配列番号35、43、37、61、41、39、51、45、47、49、若しくは159と少なくとも90%の配列同一性を有するか、(2)配列番号35、43、37、61、41、39、51、45、47、49、159、若しくはこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、請求項8に記載のバイオマス糖化混合物。 - 前記L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも1種類のポリヌクレオチドが、
a.Af43A(配列番号54)、Fv43B(配列番号46)、Pf51A(配列番号56)、Pa51A(配列番号48)、Fv51A(配列番号66)、若しくはこれらと少なくとも90%の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
b.(1)配列番号53、45、55、47、若しくは65と少なくとも90%の配列同一性を有するか、(2)配列番号53、45、55、47、若しくは65、又はこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、請求項8に記載のバイオマス糖化混合物。 - 前記酵素組成物が、(1)前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約0.1重量%〜約50重量%、約1重量%〜約20重量%、約5重量%〜約15重量%の、前記GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は(2)前記バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物1g当たり約0.2mg〜約30mg、約0.2mg〜約20mg、約0.5mg〜約10mg、若しくは約1mg〜約5mgの、前記GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、(1)前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約0.1重量%〜約80重量%、約5重量%〜約70重量%、約10重量%〜約60重量%、約20重量%〜約50重量%、若しくは約25重量%〜約50重量%、又は(2)前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物1g当たり約0.2mg〜約30mg、約0.2mg〜約20mg、約0.5mg〜約10mg、若しくは約0.5mg〜約5mgの量のセロビオヒドロラーゼ(cellulobiohydrolase)を含み、更に(1)前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約0.1重量%〜約50重量%、約1重量%〜約30重量%、約2重量%〜約20重量%、約5重量%〜約20重量%、若しくは約8重量%〜約15重量%、又は(2)前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物1g当たり約0.2mg〜約30mg、約0.2mg〜約20mg、約0.5mg〜約10mg、若しくは約0.5mg〜約5mgの量のβ−グルコシダーゼを含む、請求項5〜12のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、(1)前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約0.1重量%〜約50重量%、約1重量%〜約40重量%、約4重量%〜約30重量%、約5重量%〜約20重量%、若しくは約8重量%〜約15重量%の、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、又は(2)前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物1g当たり約0.2mg〜約30mg、約0.2mg〜約20mg、約0.5mg〜約10mg、若しくは約0.5mg〜約5mgの、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項8〜13のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、(1)前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約0.1重量%〜約50重量%、約1重量%〜約40重量%、約2重量%〜約30重量%、約4重量%〜約20重量%、若しくは約5重量%〜約15重量%の、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は(2)前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物1g当たり約0.2mg〜約30mg、約0.2mg〜約20mg、約0.5mg〜約10mg、若しくは約0.5mg〜約5mgの、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項8〜14のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、(1)前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約0.1重量%〜約50重量%、約0.1重量%〜約50重量%、約1重量%〜約40重量%、約2重量%〜約30重量%、約4重量%〜約20重量%、若しくは約5重量%〜約15重量%の、前記L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は(2)前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物1g当たり約0.2mg〜約30mg、約0.2mg〜約20mg、約0.5mg〜約10mg、若しくは約0.5mg〜約5mgの、前記L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項8〜15のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、全セルラーゼ組成物である、請求項1〜16のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記全セルラーゼ組成物が、GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞に由来する、請求項17に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記GH61ファミリー酵素活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞とは異種のものである、請求項18に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記全セルラーゼ組成物が、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に発現する宿主細胞に由来する、請求項17〜19のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、及び/又は前記β−グルコシダーゼを有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞とは異種のものである、請求項20に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記全セルラーゼ組成物が、(1)β−キシロシダーゼ活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、(2)キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(3)L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリヌクレオチドペプチドの1以上又はすべてを発現する宿主細胞に由来する、請求項17〜21のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、又は前記L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞とは異種のものである、請求項22に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記酵素組成物が、全ブロス配合物である、請求項17〜23のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- (1)前記GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、(2)前記セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、(3)前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、(4)前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、(5)前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び(6)前記L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の1以上又はすべてが、前記宿主細胞の遺伝物質に組み込まれる、請求項1〜24のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記宿主細胞が、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、又は真菌宿主細胞である、請求項18〜25のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記宿主細胞が、糸状菌宿主細胞である、請求項26に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記糸状菌宿主細胞が、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティクラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシナム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイド(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・サルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロサム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイド(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)、ブジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブローサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サブバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルストゥス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、マイセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ニューロスポラ・インターメディア(Neurospora intermedia)、ペニシリウム・パープロゲナム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネスセンス(Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリタム(Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニクロサム(Penicillium funiculosum)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジエート(Phlebia radiate)、プレウロタス・エリンギ(Pleurotus eryngii)、タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ(Trametes villosa)、トラメテス・ベルシコロル(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)の細胞から選択されるものである、請求項27に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記糖化混合物が、前記GH61/エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む前記酵素組成物を最初にブレンドした後、前記酵素組成物を前記バイオマスと混合することにより調製される、請求項1〜28のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記バイオマス材料が、ヘミセルロース、セルロース、又はヘミセルロースとセルロースとの混合物を含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記バイオマス材料が、グルカン、キシラン、及び/又はリグニンを含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記バイオマス材料が、種子、穀粒、塊茎、植物性廃棄物、食品加工又は工業プロセスの副生成物、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、草類、ソルガストラム・ニュータンス(Sorghastrum nutans)、スイッチグラス、多年生イネ科植物、木材、ウッドチップ、加工廃材、おがくず、紙、古紙、パルプ、及び再生紙、ジャガイモ、大豆、大麦、ライ麦、オート麦、小麦、ビーツ、サトウキビバガス、及び麦わらから選択される、請求項1〜30のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記バイオマス材料が、酸又は塩基による前処理に供される、請求項1〜32のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記前処理されたバイオマスが、前記酵素組成物と混合される前に約4.0〜6.5のpHに調整される、請求項33に記載のバイオマス糖化混合物。
- 前記バイオマス材料が、前記混合物の全重量に対する固体状態のバイオマス材料の量として、約5重量%〜約60重量%、約10重量%〜約50重量%、約15重量%〜約40重量%、約15重量%〜約30重量%、又は約20重量%〜約30重量%の量で前記混合物中に存在する、請求項1〜34のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
- バイオマス材料を加水分解するための方法であって、請求項1〜35のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物を、該バイオマス糖化混合物中の前記バイオマス材料を加水分解するのに適した条件下で、充分な長さの時間にわたってインキュベートすることを含む、方法。
- 前記バイオマス糖化混合物中の前記バイオマス材料を加水分解するのに適した条件が、(1)約3.5〜約7.0のpH、(2)約2時間以上の時間の長さ、及び/又は(3)約25℃〜約75℃の温度を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記充分な長さの時間が、約8時間〜約72時間の長さの時間を含む、請求項36又は37に記載の方法。
- 2時間以上の任意の所定の時間において、前記バイオマス糖化混合物により産生される発酵性糖の量が、同じ量及び種類のバイオマス材料、並びに同じ酵素成分の組成を有するが、GH61/エンドグルカナーゼを含まないコントロールバイオマス糖化混合物によって産生される発酵性糖の量と比較して少なくとも約5%増加する、請求項36〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマス糖化により産生される発酵性糖の量が、前記コントロールバイオマス糖化混合物により産生される発酵性糖と比較して少なくとも約10%増加する、請求項39に記載の方法。
- 前記バイオマス材料が、固体状態で約10重量%〜約50重量%の量で存在する、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマス糖化混合物の粘度が、同じ量及び種類のバイオマス材料、並びに同じ酵素成分の組成を有するが、GH61/エンドグルカナーゼを含まない前記コントロールバイオマス糖化混合物の粘度と比較して、少なくとも約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、又はそれ以上低下する、請求項41に記載の方法。
- バイオマス材料を、商業的酵素供給モデル又はオンサイトバイオ精錬モデルにおいて発酵性糖に変換するための、請求項1〜35のいずれか一項に記載の組成物の使用方法。
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JP2017236222A Pending JP2018075020A (ja) | 2011-03-17 | 2017-12-08 | 糖化プロセスにおける粘度を低下させる方法 |
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---|---|---|---|---|
US7056721B2 (en) * | 2001-12-18 | 2006-06-06 | Genencor International, Inc. | EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same |
MX2012003091A (es) | 2009-09-23 | 2012-04-30 | Danisco Us Inc | Enzimas de glicosil hidrolasa novedosas y usos de las mismas. |
DK2602317T3 (da) | 2009-11-20 | 2017-11-13 | Danisco Us Inc | Beta-glucosidasevarianter med forbedrede egenskaber |
CN102686736B (zh) | 2009-12-23 | 2017-05-31 | 丹尼斯科美国公司 | 提高同步糖化发酵反应效率的方法 |
US9493802B2 (en) | 2010-08-20 | 2016-11-15 | Codexis, Inc. | Use of glycohydrolase 61 protein variants with improved thermostability for processing cellulose |
MX2013010512A (es) | 2011-03-17 | 2013-10-07 | Danisco Inc | Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion. |
BR112014004171A2 (pt) * | 2011-08-22 | 2018-11-06 | Codexis Inc | variantes da proteína glicósideo hidrolase gh61 e cofatores que aumentam a atividade de gh61 |
JP2013169154A (ja) * | 2012-02-17 | 2013-09-02 | Toyota Motor Corp | セルロース系バイオマス分解増強活性ポリペプチド |
CN104245926B (zh) | 2012-04-27 | 2021-05-07 | 诺维信股份有限公司 | Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸 |
EP2914719A1 (en) * | 2012-10-31 | 2015-09-09 | Danisco US Inc. | Compositions and methods of use |
CA2892054A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Ling Hua | Compositions and methods of use |
ES2738514T3 (es) | 2013-01-11 | 2020-01-23 | Dsm Ip Assets Bv | Procedimiento para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico |
HRP20220917T1 (hr) | 2013-02-04 | 2022-10-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Polipeptid koji razgrađuje ugljikohidrate i njegova upotreba |
EP2964760B1 (en) | 2013-03-08 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
WO2014140171A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel cell wall deconstruction enzymes of thielavia australiensis and uses thereof |
CA2910239A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
US10167460B2 (en) | 2013-07-29 | 2019-01-01 | Danisco Us Inc | Variant enzymes |
JP6325214B2 (ja) * | 2013-08-29 | 2018-05-16 | アサヒグループホールディングス株式会社 | セルラーゼの製造方法及び液体培地 |
AU2014315208A1 (en) | 2013-09-04 | 2016-01-28 | Novozymes A/S | Processes for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material |
WO2015081139A1 (en) | 2013-11-26 | 2015-06-04 | Novozymes A/S | Enzyme compositions and uses thereof |
FR3014903B1 (fr) * | 2013-12-17 | 2017-12-01 | Ifp Energies Now | Procede d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes genetiquement modifies (mgm) et non mgm |
DK3092312T3 (en) | 2014-01-07 | 2019-03-04 | Novozymes As | INSURANCE OF MAN-MADE CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS |
DK3152315T3 (en) | 2014-06-06 | 2018-11-26 | Novozymes As | ENZYME COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF |
WO2016030480A1 (en) | 2014-08-28 | 2016-03-03 | Renescience A/S | Solubilization of msw with blend enzymes |
BR112017004251A2 (pt) * | 2014-09-05 | 2017-12-12 | Novozymes As | variantes de módulos de ligação a carboidrato e polinucleotídeos que os codificam |
US10066244B2 (en) | 2014-09-23 | 2018-09-04 | Novozymes A/S | Process for producing ethanol and fermenting organisms |
KR101719778B1 (ko) * | 2015-01-13 | 2017-04-03 | 대한민국 | 신규 페니실리움 솔리텀 m2439 균주 및 이의 용도 |
US10557127B2 (en) | 2015-02-24 | 2020-02-11 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
BR112017018461A2 (pt) | 2015-03-12 | 2018-04-17 | Novozymes As | processos para hidrólise multiestágio, para produção de um produto de fermentação, e, para aumento de rendimento de açúcar de hidrólise. |
WO2016145350A1 (en) | 2015-03-12 | 2016-09-15 | Novozymes A/S | Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass |
BR112017019331A2 (pt) | 2015-03-12 | 2018-06-05 | Beta Renewables Spa | processos para sacarificação de múltiplos estágios de um material lignocelulósico e para melhorar um rendimento de glicose ou xilose de sacarificação de um material lignocelulósico em um reator de tanque continuamente agitado |
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MX2017016625A (es) | 2015-07-07 | 2018-05-15 | Danisco Us Inc | Induccion de la expresion genica usando una mezcla de azucar de alta concentracion. |
WO2017019491A1 (en) | 2015-07-24 | 2017-02-02 | Novozymes Inc. | Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same |
EP3325616A1 (en) | 2015-07-24 | 2018-05-30 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same |
CN108350044B (zh) | 2015-09-22 | 2022-05-24 | 诺维信公司 | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸 |
WO2017076421A1 (en) | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Renescience A/S | Solubilization of msw with blend enzymes |
WO2018053058A1 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Danisco Us Inc. | Lignocellulosic biomass fermentation-based processes |
JP7285780B2 (ja) | 2016-10-04 | 2023-06-02 | ダニスコ・ユーエス・インク | 誘導基質の非存在下における糸状菌細胞内でのタンパク質の産生 |
CN110381746B (zh) | 2016-12-21 | 2023-12-01 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 使用热稳定丝氨酸蛋白酶的方法 |
CN107328883A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-11-07 | 南京凯通粮食生化研究设计有限公司 | 一种鼠李糖生产企业快速准确测定鼠李糖含量的方法 |
WO2019074828A1 (en) | 2017-10-09 | 2019-04-18 | Danisco Us Inc | CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE |
EP3781697A1 (en) | 2018-04-20 | 2021-02-24 | Renescience A/S | Method for determining chemical compounds in waste |
CN110713998B (zh) * | 2019-11-29 | 2021-11-02 | 江南大学 | 一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法及其应用 |
WO2022096406A1 (en) | 2020-11-04 | 2022-05-12 | Renescience A/S | Method for enzymatic and/or microbial processing of waste comprising recirculation of process water |
EP4015640A1 (en) * | 2020-12-16 | 2022-06-22 | Clariant Produkte (Deutschland) GmbH | Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low viscosity |
EP4015642A1 (en) * | 2020-12-16 | 2022-06-22 | Clariant Produkte (Deutschland) GmbH | Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low biomass formation and high protein yield |
EP4015641A1 (en) * | 2020-12-16 | 2022-06-22 | Clariant Produkte (Deutschland) GmbH | Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low biomass formation and high protein yield |
CN112522117B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-06-28 | 中国科学院成都生物研究所 | 一株粪壳菌及其应用 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005074647A2 (en) * | 2004-01-30 | 2005-08-18 | Novozymes Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
JP2007523646A (ja) * | 2004-02-06 | 2007-08-23 | ノボザイムス,インコーポレイティド | セルロース分解増強活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド |
US20090019608A1 (en) * | 2007-05-31 | 2009-01-15 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
JP2009509546A (ja) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ノボザイムス,インコーポレイティド | セルロース材料の分解又は転換を増強するための方法 |
WO2009085859A2 (en) * | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
US20100124769A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-20 | Novozymes, Inc. | Methods and compositions for degrading cellulosic material |
US20100159535A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Novozymes, Inc. | Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material |
WO2010118257A2 (en) * | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Danisco Us Inc. | Endoglucanase for reducing the viscosity of a plant material slurry |
US20100263092A1 (en) * | 2008-12-04 | 2010-10-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
US20100281582A1 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2010138754A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
JP2011507525A (ja) * | 2007-12-19 | 2011-03-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | セルロース分解増強活性を有するポリペプチドとこれをコードするポリヌクレオチド |
Family Cites Families (123)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1358599A (en) | 1970-12-22 | 1974-07-03 | Monacelli Umberto | Gun for firing tacks |
US5366558A (en) | 1979-03-23 | 1994-11-22 | Brink David L | Method of treating biomass material |
DK187280A (da) | 1980-04-30 | 1981-10-31 | Novo Industri As | Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode |
GB2095275B (en) | 1981-03-05 | 1985-08-07 | Kao Corp | Enzyme detergent composition |
GB2094826B (en) | 1981-03-05 | 1985-06-12 | Kao Corp | Cellulase enzyme detergent composition |
US4797361A (en) | 1983-10-24 | 1989-01-10 | Lehigh University | Microorganism and process |
US5648263A (en) | 1988-03-24 | 1997-07-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric |
JP2728531B2 (ja) | 1988-03-24 | 1998-03-18 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | セルラーゼ調製品 |
CA1333777C (en) | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
US5536655A (en) | 1989-09-26 | 1996-07-16 | Midwest Research Institute | Gene coding for the E1 endoglucanase |
DK494089D0 (ja) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | Novo Nordisk As | |
DK16490D0 (da) | 1990-01-19 | 1990-01-19 | Novo Nordisk As | Enzym |
DK115890D0 (da) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | Novo Nordisk As | Enzym |
WO1991017243A1 (en) | 1990-05-09 | 1991-11-14 | Novo Nordisk A/S | A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme |
DE69133100T3 (de) | 1990-12-10 | 2015-09-03 | Danisco Us Inc. | Verbesserte saccharifizierung von zellulose durch klonierung und vervielfältigung des beta-glukosidase genes aus trichoderma reesei |
US6103464A (en) | 1990-12-10 | 2000-08-15 | Genencor International, Inc. | Method of detecting DNA encoding a β-glucosidase from a filamentous fungus |
EP0507369B1 (en) | 1991-03-18 | 1998-05-20 | Gist-Brocades N.V. | Cloning and expression of acetyl xylan esterases from fungal origin |
US5405769A (en) | 1993-04-08 | 1995-04-11 | National Research Council Of Canada | Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase |
DK81293D0 (da) | 1993-07-06 | 1993-07-06 | Novo Nordisk As | Enzym |
DK83993D0 (ja) | 1993-07-13 | 1993-07-13 | Novo Nordisk As | |
US5437992A (en) | 1994-04-28 | 1995-08-01 | Genencor International, Inc. | Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp |
US6099844A (en) | 1994-08-22 | 2000-08-08 | Triarco Industries, Inc. | Increasing yield of extractable substances from botanicals with an enzyme composition |
US5705369A (en) | 1994-12-27 | 1998-01-06 | Midwest Research Institute | Prehydrolysis of lignocellulose |
NZ303162A (en) | 1995-03-17 | 2000-01-28 | Novo Nordisk As | Enzyme preparations comprising an enzyme exhibiting endoglucanase activity appropriate for laundry compositions for textiles |
WO1997000964A1 (en) | 1995-06-23 | 1997-01-09 | Danisco Ingredients A/S (Danisco A/S) | Novel beta-xylosidase, nucleotide sequence encoding it, and use thereof |
CN1152025A (zh) * | 1995-12-13 | 1997-06-18 | 高广仁 | 啤酒生产中添加纤维素酶的糖化工艺 |
US7883872B2 (en) | 1996-10-10 | 2011-02-08 | Dyadic International (Usa), Inc. | Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose |
US5811381A (en) | 1996-10-10 | 1998-09-22 | Mark A. Emalfarb | Cellulase compositions and methods of use |
CA2295849C (en) | 1997-07-11 | 2011-02-08 | Genencor International, Inc. | Trichoderma reesei swollenin protein and encoding dna sequence |
US20020084046A1 (en) | 1998-09-29 | 2002-07-04 | Jay Chiehlung Hsu | Enzymatic paper and process of making thereof |
CA2345356C (en) | 1998-10-06 | 2012-10-02 | Mark Aaron Emalfarb | Transformation system in the field of filamentous fungal hosts |
US6409841B1 (en) | 1999-11-02 | 2002-06-25 | Waste Energy Integrated Systems, Llc. | Process for the production of organic products from diverse biomass sources |
US6248535B1 (en) | 1999-12-20 | 2001-06-19 | University Of Southern California | Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens |
NZ520022A (en) | 1999-12-30 | 2005-01-28 | Genencor Int | Protein and DNA sequences for XYL-IV from Trichoderma reesei |
US6423145B1 (en) | 2000-08-09 | 2002-07-23 | Midwest Research Institute | Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics |
DE10043662A1 (de) | 2000-08-30 | 2001-02-22 | Saechsisches Inst Fuer Angewan | Verfahren zur enzymatischen Aktivierung von lignocellulosen Faserstoffen zur Herstellung von Werkstoffen |
JP2004527261A (ja) | 2001-05-18 | 2004-09-09 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | セロビアーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド |
US6982159B2 (en) | 2001-09-21 | 2006-01-03 | Genencor International, Inc. | Trichoderma β-glucosidase |
US7005289B2 (en) | 2001-12-18 | 2006-02-28 | Genencor International, Inc. | BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same |
US7045331B2 (en) | 2001-12-18 | 2006-05-16 | Genencor International, Inc. | EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same |
US7049125B2 (en) | 2001-12-18 | 2006-05-23 | Genencor International, Inc. | EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same |
US7056721B2 (en) | 2001-12-18 | 2006-06-06 | Genencor International, Inc. | EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same |
US7045332B2 (en) | 2001-12-18 | 2006-05-16 | Genencor International, Inc. | BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same |
US20040005674A1 (en) | 2002-04-30 | 2004-01-08 | Athenix Corporation | Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose |
DK2322607T3 (en) | 2002-08-16 | 2015-12-14 | Danisco Us Inc | NOVEL HYPROCREA JECORINA CBH1 cellulase WITH INCREASED THERMAL STABILITY COMPREHENSIVE SUBSTITUTION OR DELETION FOR POSITION S113 |
US7371558B2 (en) | 2002-10-04 | 2008-05-13 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the biological production of 1,3-propanediol with high yield |
AU2003291395A1 (en) | 2002-11-07 | 2004-06-03 | Genencor International, Inc. | Bgl6 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same |
US7407788B2 (en) | 2002-11-21 | 2008-08-05 | Danisco A/S, Genencor Division | BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same |
AU2003219956A1 (en) | 2003-02-27 | 2004-09-28 | Midwest Research Institute | Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from penicillium funiculosum |
US20040231060A1 (en) | 2003-03-07 | 2004-11-25 | Athenix Corporation | Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes |
EP1606392A4 (en) | 2003-03-21 | 2007-10-17 | Genencor Int | NEW CBH1 HOMOLOGO AND CBH1 CELLULASE VARIANTS |
SI1627050T1 (sl) | 2003-04-01 | 2014-01-31 | Danisco Us Inc. | Varianta humicola grisea cbh1.1 |
EP1862626B1 (en) | 2003-05-29 | 2011-09-14 | Genencor International, Inc. | Novel trichoderma genes |
US20050048619A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Novozymes Biotech, Inc. | Variants of glycoside hydrolases |
CN101415823B (zh) * | 2003-09-15 | 2012-10-17 | 金克克国际有限公司 | 修饰酶、生产修饰酶的方法及其用途 |
CN1902310B (zh) | 2003-10-28 | 2011-09-21 | 诺维信股份有限公司 | 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸 |
EP1700917B1 (en) | 2003-12-03 | 2016-04-13 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Endoglucanase stce and cellulase preparation containing the same |
US8097445B2 (en) | 2004-03-25 | 2012-01-17 | Danisco Us Inc. | Exo-endo cellulase fusion protein |
EP2354222A1 (en) | 2004-03-25 | 2011-08-10 | Genencor International, Inc. | Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same |
SI3219806T1 (sl) | 2004-03-25 | 2020-08-31 | Novoyzmes, Inc. | Postopki za degradiranje ali pretvorbo polisaharidov rastlinske celične stene |
CA2567485C (en) | 2004-05-27 | 2015-01-06 | Genencor International, Inc. | Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions |
WO2005118769A1 (en) | 2004-06-03 | 2005-12-15 | Novozymes A/S | Mashing process and enzyme composition useful therein |
US20060075522A1 (en) | 2004-07-31 | 2006-04-06 | Jaclyn Cleveland | Genes and uses for plant improvement |
ES2554467T3 (es) | 2004-12-30 | 2015-12-21 | Danisco Us Inc. | Variantes de celulasas CBH2 de Hypocrea jecorina |
ATE492633T1 (de) | 2005-01-06 | 2011-01-15 | Novozymes Inc | Polypeptide mit cellobiohydrolaseaktivität und dafür kodierende polynukleotide |
US7781191B2 (en) | 2005-04-12 | 2010-08-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain a target chemical |
CN101160409B (zh) | 2005-04-12 | 2013-04-24 | 纳幕尔杜邦公司 | 获得可发酵糖的生物质处理方法 |
EP1877568B9 (en) | 2005-04-26 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Hydrolysis of arabinoxylan |
FI120045B (fi) * | 2005-12-22 | 2009-06-15 | Roal Oy | Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit |
US7256032B2 (en) | 2005-12-22 | 2007-08-14 | Ab Enzymes Oy | Enzymes |
NZ571087A (en) * | 2006-02-10 | 2012-04-27 | Verenium Corp | Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
WO2008008793A2 (en) | 2006-07-10 | 2008-01-17 | Dyadic International Inc. | Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material |
US8017373B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-09-13 | Iogen Energy Corporation | Process for enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulosic feedstocks |
US8138321B2 (en) | 2006-09-22 | 2012-03-20 | Danisco Us Inc. | Acetolactate synthase (ALS) selectable marker from Trichoderma reesei |
US7993884B2 (en) | 2006-10-10 | 2011-08-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Beta-xylosidase for conversion of plant cell wall carbohydrates to simple sugars |
WO2008147396A2 (en) | 2006-11-13 | 2008-12-04 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Method for improving yield of cellulose conversion processes |
WO2008140749A2 (en) | 2007-05-10 | 2008-11-20 | Novozymes, Inc. | Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material |
EP2152892B1 (en) | 2007-05-21 | 2013-05-01 | Danisco US, Inc., Genencor Division | Method for introducing nucleic acids into fungal cells |
CN103436509A (zh) | 2007-05-31 | 2013-12-11 | 诺维信股份有限公司 | 提高多肽的纤维素分解增强活性的方法 |
US9969993B2 (en) | 2007-05-31 | 2018-05-15 | Novozymes, Inc. | Filamentous fungal host cells and methods of recombinantly producing proteins |
EA018049B1 (ru) | 2007-06-08 | 2013-05-30 | ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН | Система экспрессии гетерологичных и гомологичных целлюлаз |
WO2009003167A1 (en) | 2007-06-27 | 2008-12-31 | Novozymes A/S | Methods for producing fermentation products |
EP2380988A3 (en) | 2007-07-10 | 2012-04-11 | Mosanto Technology LLC | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
US8551751B2 (en) | 2007-09-07 | 2013-10-08 | Dyadic International, Inc. | BX11 enzymes having xylosidase activity |
US7819976B2 (en) | 2007-08-22 | 2010-10-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Biomass treatment method |
JP5300092B2 (ja) | 2007-09-07 | 2013-09-25 | ダニスコ・ユーエス・インク | ベータ‐グルコシダーゼ強化糸状菌全セルラーゼ組成物及び使用方法 |
BRPI0817811A2 (pt) | 2007-10-03 | 2014-10-14 | Verenium Corp | Xilanases, ácidos nucleicos que codificam as mesmas e métodos para fabricação e uso das mesmas. |
CN101821397A (zh) | 2007-10-12 | 2010-09-01 | 丹尼斯科美国公司 | 从发酵微生物中提高有机物产生的方法和组合物 |
WO2009074685A1 (en) * | 2007-12-12 | 2009-06-18 | Novozymes A/S | Enzymatic degradation of biomass substrates comprising mannan |
AU2008334945C1 (en) | 2007-12-13 | 2013-09-05 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for producing isoprene |
US10676751B2 (en) | 2008-02-29 | 2020-06-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Production and use of plant degrading materials |
KR101768225B1 (ko) | 2008-03-07 | 2017-08-14 | 다니스코 유에스 인크. | 트리코데르마에서의 카탈라아제 발현 |
JP5690713B2 (ja) | 2008-03-21 | 2015-03-25 | ダニスコ・ユーエス・インク | バイオマスの加水分解促進用ヘミセルラーゼ強化組成物 |
US20110165635A1 (en) | 2008-04-21 | 2011-07-07 | Chromatin, Inc. | Methods and materials for processing a feedstock |
MX2010011722A (es) | 2008-04-29 | 2010-11-30 | Danisco Inc | Composiciones de swolenina y metodos para incrementar la eficiencia de una celulasa. |
WO2009149202A2 (en) | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity to non-cellulosic materials |
MX2011008495A (es) | 2009-02-20 | 2011-09-21 | Danisco Us Inc | Formulaciones de caldo de fermentacion. |
CA2750920A1 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Iogen Energy Corporation | Novel lignin-resistant cellulase enzymes |
KR20120062643A (ko) | 2009-06-03 | 2012-06-14 | 다니스코 유에스 인크. | 향상된 발현, 활성 및/또는 안정성을 갖는 셀룰라아제 변이체, 및 이의 용도 |
EP2443235A4 (en) | 2009-06-16 | 2013-07-31 | Codexis Inc | ß-glucosidase VARIANTS |
MX2012003091A (es) | 2009-09-23 | 2012-04-30 | Danisco Us Inc | Enzimas de glicosil hidrolasa novedosas y usos de las mismas. |
CN101671698A (zh) * | 2009-10-12 | 2010-03-17 | 天津科技大学 | 用木聚糖酶提高淀粉质原料酒精发酵速度和出酒率的方法 |
DK2602317T3 (da) | 2009-11-20 | 2017-11-13 | Danisco Us Inc | Beta-glucosidasevarianter med forbedrede egenskaber |
CN102686736B (zh) | 2009-12-23 | 2017-05-31 | 丹尼斯科美国公司 | 提高同步糖化发酵反应效率的方法 |
US8647850B2 (en) * | 2009-12-23 | 2014-02-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Process for simultaneous saccharification and fermentation for production of ethanol |
US8906235B2 (en) | 2010-04-28 | 2014-12-09 | E I Du Pont De Nemours And Company | Process for liquid/solid separation of lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth |
US8721794B2 (en) | 2010-04-28 | 2014-05-13 | E I Du Pont De Nemours And Company | Production of high solids syrup from lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth |
CN105441414A (zh) | 2010-06-01 | 2016-03-30 | 加州理工学院 | 稳定的功能嵌合纤维二糖水解酶i类酶 |
EP2397491A1 (en) | 2010-06-21 | 2011-12-21 | Technische Universität Wien | LeaA from Trichoderma reesei |
US8629325B2 (en) | 2010-08-30 | 2014-01-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
US8476048B2 (en) * | 2010-12-17 | 2013-07-02 | E I Du Pont De Nemours And Company | Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium |
MX2013010512A (es) | 2011-03-17 | 2013-10-07 | Danisco Inc | Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion. |
US20140073017A1 (en) | 2011-03-17 | 2014-03-13 | Danisco Us Inc. | Cellulase compositions and methods of using the same for improved conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars |
CN103502444A (zh) | 2011-03-17 | 2014-01-08 | 丹尼斯科美国公司 | 糖基水解酶及其在生物质水解方面的用途 |
BR112013027242A2 (pt) | 2011-05-10 | 2016-11-29 | Danisco Us Inc | anidrases carbônicas termoestáveis e métodos de uso das mesmas |
BR112014004171A2 (pt) | 2011-08-22 | 2018-11-06 | Codexis Inc | variantes da proteína glicósideo hidrolase gh61 e cofatores que aumentam a atividade de gh61 |
CA2858373A1 (en) | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Danisco Us Inc. | Enzyme cocktails prepared from mixed cultures |
KR20150079676A (ko) | 2012-10-31 | 2015-07-08 | 다니스코 유에스 인크. | 마그나포르테 그리세아로부터의 베타-글루코시다제 |
EP2914719A1 (en) | 2012-10-31 | 2015-09-09 | Danisco US Inc. | Compositions and methods of use |
BR112015013647A2 (pt) | 2012-12-12 | 2017-11-14 | Danisco Us Inc | variante isolada de uma enzima celobio-hidrolase (cbh) parental, polinucleotídeo isolado, vetor, célula hospedeira, composição detergente, aditivo alimentar, método para hidrolisar um substrato celulósico, sobrenadante de cultura celular, métodos de produção de um polipeptídeo cbh variante e sobrenadante de cultura celular |
ES2727390T3 (es) | 2013-05-20 | 2019-10-15 | Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa | Expresión de enzimas beta-xilosidasas recombinantes |
US10167460B2 (en) | 2013-07-29 | 2019-01-01 | Danisco Us Inc | Variant enzymes |
CN105829530A (zh) | 2013-12-04 | 2016-08-03 | 丹尼斯科美国公司 | 包含β-葡萄糖苷酶多肽的组合物及其使用方法 |
-
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-
2018
- 2018-12-10 US US16/214,195 patent/US20190249160A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005074647A2 (en) * | 2004-01-30 | 2005-08-18 | Novozymes Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
JP2007523646A (ja) * | 2004-02-06 | 2007-08-23 | ノボザイムス,インコーポレイティド | セルロース分解増強活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド |
JP2009509546A (ja) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ノボザイムス,インコーポレイティド | セルロース材料の分解又は転換を増強するための方法 |
US20090019608A1 (en) * | 2007-05-31 | 2009-01-15 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
WO2009085859A2 (en) * | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
JP2011507525A (ja) * | 2007-12-19 | 2011-03-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | セルロース分解増強活性を有するポリペプチドとこれをコードするポリヌクレオチド |
US20100124769A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-20 | Novozymes, Inc. | Methods and compositions for degrading cellulosic material |
US20100263092A1 (en) * | 2008-12-04 | 2010-10-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
US20100159535A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Novozymes, Inc. | Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material |
WO2010118257A2 (en) * | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Danisco Us Inc. | Endoglucanase for reducing the viscosity of a plant material slurry |
US20100281582A1 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2010138754A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KARLSSON, JOHAN ET AL.: "Homologous expression and characterization of Cel61A (EG IV) of Trichoderma reesei", EUR. J. BIOCHEM., vol. Vol. 268, JPN6016008007, 2001, pages pp. 6498-6507 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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