JP2014508138A

JP2014508138A - 細胞移植のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2014508138A
Application number: JP2013549850A
Authority: JP
Inventors: ステファン，グザヴィエ; ソカル，エティエンヌ; ナジミ，ムスタファ; エークハウト，ステファン; ハーマンズ，セドリック
Original assignee: Universite Catholique de Louvain UCL
Current assignee: Universite Catholique de Louvain UCL
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2014-04-03
Anticipated expiration: 2032-01-25
Also published as: EP2667878B1; PL2667878T3; US20170042940A1; EP2667878A1; US20170354723A1; PT2667878E; US20130302291A1; WO2012101181A1; SG192124A1; DK2667878T3; CN103402527A; CN103402527B; US10478459B2; US10039789B2; CA2825252A1; IL227529A0; JP6012629B2; ES2573522T3; CA2825252C

Abstract

本発明は、細胞移植のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、凝固促進性細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質、好ましくは未分画ヘパリンと、少なくとも１つのトロンビン阻害物質、好ましくはビバリルジンとを含む組成物を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、全般的に組織再生、特に細胞移植の分野に関する。本発明は、細胞移植を改良するため、特に細胞移植に伴う凝固促進活性(procoagulant activity)を阻害するための組成物および方法に向けられる。

病気にかかったかまたは損傷を受けたかもしくは機能が損なわれた臓器により引き起こされる様々な状態は、臓器移植により処置できる。特に、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸および胸腺の移植は、妥当な成功率で日常的に行うことができる。臓器移植における主な問題点は、しかし、いまだに、各レシピエント患者について適合するドナーを見出す必要性があることである。なぜなら、ドナーとレシピエントとの間の不適合性は、移植された臓器の拒絶をもたらし得るからである。移植片拒絶は、最も適当なドナー・レシピエントの一致を決定するための血清型決定により、および免疫抑制薬の使用により低減することができるが、これらのアプローチは、いくらかの症例においては医療的緊急性によりあまり適切でないことがある。また、免疫抑制薬を生涯にわたって用いることは、副作用および服薬遵守の点でレシピエントに負担をもたらす。

近年、様々な供給源の細胞を用いる細胞療法が、ヒトにおける再生医療のために用いられるようになっている。細胞の移植は、臓器移植にとって価値のある代替または追加（付属）療法をもたらし得る。さらに、全ての臓器が効率よく移植できるわけではないので、細胞移植は、頻繁に、唯一の利用可能な治癒手段である。有利には、細胞移植において、適合性に関連する合併症は、少なくとも理論的に、あまり問題ではなくなる可能性がある。例えば、移植される細胞は、時折、患者自身から単離または導くことができる(すなわち自家細胞移植)ので、拒絶の危険性が低減される。あるいは、同種異系または異種の移植細胞でさえ、容易に型決定して、細胞バンクまたはレジストリにおいて長期間貯蔵でき、ここから遺伝子的に一致するか少なくとも適合する細胞を、ほとんどのレシピエントについて得ることができる。

患者への細胞の投与を企図する場合、患者と投与細胞との間の組織適合性を最大限にして、そのことにより患者の免疫系による投与細胞の拒絶(移植片対宿主拒絶)の機会を低減するように細胞または細胞培養物を選択することが好ましいことがある。例えば、有利には、細胞は、患者と同一のHLAハプロタイプ(１または好ましくは１より多いHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-DR、HLA-DPおよびHLA-DQ；好ましくは１または好ましくは全てのHLA-A、HLA-BおよびHLA-C)を有するか、または患者にとって一般的なほとんどのHLA抗原対立遺伝子を有し、かつ患者が既に有する抗HLA抗体に対するHLA抗原をほとんど若しくは全く有していない細胞が典型的に選択できる。

細胞移植による組織再生手順は、非常に多様な細胞供給源を用いて、一般的には増殖能を有する細胞を用いて行うことができる。例えば、様々なヒトの先天性代謝性疾患では、肝臓細胞移植が、少なくともいくらかの程度の代謝制御を回復できる。別の例では、膵島細胞の門脈内移植は、１型糖尿病における血糖管理の改善およびインスリン非依存性をもたらす。例えば、非常に多くの細胞系統に分化できる多能性幹細胞、または１もしくはいくつかの細胞系統に拘束され(多分化能)、様々な程度の分化を示す前駆細胞を、細胞移植のための細胞供給源として用いることができる。

いくらかの臨床上の成功にもかかわらず、現在の細胞移植療法は、さらなる改良を必要としている。臨床家および保健機関の間でのある懸念は、細胞の生着およびその他の合併症に対するあるいくらかの移植細胞の凝固促進活性の影響の可能性である。例えば、島細胞移植片の凝固促進活性は、移植片機能損失および門脈内血栓性事象を引き起こすと報告されている(BeuneuらDiabetes, 2004, 第53巻, 1407〜11; MobergらLancet, 2002, 第360巻, 2039〜45)。凝固促進活性は、単離初代肝細胞においても観察されている(StephenneらLiver Transpl., 2007, 第13巻, 599〜606)。

よって、当該技術において、細胞移植の成功および細胞生着能を改善し、特に細胞移植に伴う血栓形成促進性の合併症を低減するための緊急の必要性が持続的に存在する。
FurlaniらMicrovasc Res., 2009, 第77巻, 370〜6は、SCIDマウスの精巣挙筋脈管構造への血管内投与の後のヒト間葉系幹細胞の動態について、生体内顕微鏡観察により研究した。著者らは、動脈内間葉系幹細胞注入が、細胞のサイズが比較的大きいために、遠位脈管構造における閉塞を導き得ることを提案した。

網羅的なインビトロおよび臨床的評価を行って、本発明者らは、単離初代細胞、例えば肝細胞および島細胞について以前に報告された凝固促進活性が、幹細胞および前駆細胞、例えば間葉系幹細胞についても観察されることを学んだ。幹細胞および前駆細胞の凝固促進活性は、これらの細胞の移植について懸念となることがあり、特に望ましくない血流の改変、移植細胞損失、細胞生着能の低減および/または血栓性事象を引き起こすことがある。さらに、この凝固促進活性は、肝細胞移植についての従来の抗凝固剤である未分画ヘパリンによって制御できない。

本発明者らは、よって、移植細胞の凝固促進活性を打ち消すための様式を探索し、凝固促進活性を有する細胞とアンチトロンビン活性化物質およびトロンビン阻害物質との併用または随伴投与が、有害な凝固促進効果を妨げるための特に効果的で安全な組み合わせを提供することを見出した。驚くべきことに、凝固促進活性を有する細胞と、アンチトロンビン活性化物質またはトロンビン阻害物質のいずれか単独との併用投与は、アンチトロンビン活性化物質またはトロンビン阻害物質のそれぞれの生理的に許容できる濃度にて、血栓性事象を適切に妨げないが、アンチトロンビン活性化物質と、トロンビン阻害物質との組み合わせは、細胞療法により誘導される血栓症および血栓症に関連する合併症(例えば局所血栓症および局所炎症の誘導)を有利に妨げることができる。したがって、本発明者らは、移植細胞、特に幹細胞および前駆細胞の凝固促進活性を低減するために有用な、特に有利で、相乗的でさえある組み合わせ療法および臨床プロトコールを見出した。

したがって、ある態様は、凝固促進活性を有する細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせに関する。

別の態様は、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞および肝臓筋線維芽細胞を含むかまたはそれからなる群から選択され、より好ましくは、成体肝臓前駆細胞および肝臓筋線維芽細胞から選択される細胞とを含む組み合わせに関する。

当てはまる場合、上記の組み合わせは、細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質の別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成できる。さらに、上記の組み合わせにおける細胞、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質および/または少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、混和してもよいか、または別々であってもよい。細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを組み合わせることを含む上記の組み合わせを生成する方法も開示される。

本明細書に記載されている細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせに言及する場合、または少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせに言及する場合、またはこのような組み合わせを含むかもしくは採用する任意の主題に言及する場合に本明細書をとおして意図するように、組み合わせの個別の構成成分は、対象者への別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成されるか、または別々、同時または任意の順序で逐次的に対象者に投与できる。一例では、細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質は全て、投与される細胞懸濁物に含まれてもよい。別の例では、細胞と少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質は、投与される細胞懸濁物に含まれるが、少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、上記の細胞懸濁物とは別に保持され、上記の細胞懸濁物と同時または逐次的に対象者に投与してもよい。さらに別の例では、細胞と少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、投与される細胞懸濁物に含まれるが、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質は、上記の細胞懸濁物とは別に保持され、上記の細胞懸濁物と同時または逐次的に対象者に投与してもよい。さらなる例では、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と少なくとも１つのトロンビン阻害物質はともに、細胞懸濁物とは別に保持され、上記の細胞懸濁物と同時または逐次的に、かつ互いに同時または逐次的に対象者に投与してもよい。構成成分の投与が逐次的である場合、投与のタイミングは、構成成分の組み合わせによりもたらされる構成成分の所望の作用を可能にするように選択されることが理解される。

(a)凝固促進活性を有する細胞、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質、少なくとも１つのトロンビン阻害物質を含む組み合わせと、(b)１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物がさらに開示される。
(a)少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞および肝臓筋線維芽細胞を含むかまたはそれからなる群から選択され、より好ましくは、成体肝臓前駆細胞および肝臓筋線維芽細胞から選択される細胞とを含む組み合わせと、(b)１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物がさらに開示される。
医薬組成物は、細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質の別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成できる。上記の医薬組成物における細胞、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質および/または少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、混和してもよいか、または別々であってもよい。細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを、それぞれ別々にまたは混和して、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤と混和することを含む、上記の医薬組成物を生成する方法も開示される。

凝固促進活性を有する細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせを含み、場合によって１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤をさらに含む部品キットまたは製品(article of manufacture)も提供される。
少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞および肝臓筋線維芽細胞を含むかまたはそれからなる群から選択され、より好ましくは、成体肝臓前駆細胞および肝臓筋線維芽細胞から選択される細胞とを含む組み合わせを含み、場合によって１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤をさらに含む部品キットまたは製品も提供される。
部品キットまたは製品は、細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質の別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成できる。上記の部品キットまたは製品における細胞、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質および/または少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、混和してもよいか、または別々であってもよく、特に、例えば別々の容器に含有されるように別々であってもよい。細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、場合によって１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを、部品キットまたは製品に含めることを含む、上記の部品キットまたは製品を生成する方法も開示される。本明細書に記載されている効能のいずれか１つおよびそのそれぞれにおいて用いるための部品キットまたは製品も開示される。

以下の態様のいずれか１つおよびそのそれぞれがさらに開示される：
-医薬品として用いるための、凝固促進活性を有する細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ；
-医薬品として用いるための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞および肝臓筋線維芽細胞を含むかまたはそれからなる群から選択され、より好ましくは、成体肝臓前駆細胞および肝臓筋線維芽細胞から選択される細胞とを含む組み合わせ；
-本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植において用いるための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；

-本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植のための医薬品を製造するための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；
-血栓症または血栓性合併症、特に本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症の処置において用いるための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；
-血栓症または血栓性合併症、特に本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症の処置のための医薬品を製造するための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；
-インビボでの本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の凝固促進活性の阻害において用いるための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；

-インビボでの本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の凝固促進活性の阻害のための医薬品を製造するための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；
-インビトロでの本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞胞の凝固促進活性を阻害するための、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；
-本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の凝固促進活性をインビトロで阻害するための方法であって、上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせを提供することを含む方法；
-本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞を、移植を必要とする対象者に移植する方法であって、上記の対象者に、治療または予防有効量の上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を投与することを含む方法；

-処置を必要とする対象者における血栓症または血栓性合併症、特に本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症を処置する方法であって、上記の対象者に、治療または予防有効量の上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を投与することを含む方法；
-インビボで、阻害を必要とする対象者において、細胞、例えば本明細書に記載されている任意の細胞の凝固促進活性を阻害する方法であって、上記の対象者に、治療または予防有効量の上記の細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を投与することを含む方法。

本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの、上記の効能のいずれか１つおよびそれぞれにおける使用も提供される。

さらなる態様は、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせに関する。当てはまる場合、上記の組み合わせは、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と少なくとも１つのトロンビン阻害物質の別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成できる。さらに、上記の組み合わせにおける少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、混和してもよいか、または別々であってもよい。少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを組み合わせることを含む、上記の組み合わせを生成する方法も開示される。

少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質、少なくとも１つのトロンビン阻害物質を含む組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物がさらに開示される。医薬組成物は、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と少なくとも１つのトロンビン阻害物質の別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成できる。上記の医薬組成物における少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、混和してもよいか、または別々であってもよい。少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを、それぞれ別々にまたは混和して、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤と混和することを含む、上記の医薬組成物を生成する方法も開示される。

少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせを含み、場合によって１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤をさらに含む部品キットまたは製品も提供される。部品キットまたは製品は、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質の別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成できる。上記の部品キットまたは製品における少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と少なくとも１つのトロンビン阻害物質は、混和してもよいか、または別々であってもよく、特に、例えば別々の容器に含有されるように別々であってもよい。少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、場合によって１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを、部品キットまたは製品に含めることを含む、上記の部品キットまたは製品を生成する方法も開示される。本明細書に記載されている効能のいずれか１つおよびそのそれぞれにおいて用いるための部品キットまたは製品も開示される。

次の態様のいずれか１つおよびそのそれぞれも開示される：
-医薬品として用いるための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ；
-凝固促進活性を有する細胞の移植において用いるための(すなわち細胞移植とともに)、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；
-成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞および肝臓筋線維芽細胞を含むかまたはそれからなる群から選択され、より好ましくは、成体肝臓前駆細胞および肝臓筋線維芽細胞から選択される細胞の移植において用いるための(すなわち細胞移植とともに)、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；

-本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植のための医薬品を製造するための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；
-血栓症または血栓性合併症、特に本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症の処置において用いるための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；
-血栓症または血栓性合併症、特に本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症の処置のための医薬品を製造するための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；

-インビボでの細胞、例えば本明細書に記載されている任意の細胞の凝固促進活性の阻害において用いるための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物；
- インビボでの細胞、例えば本明細書に記載されている任意の細胞の凝固促進活性の阻害のための医薬品を製造するための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用。
-インビトロでの細胞、例えば本明細書に記載されている任意の細胞の凝固促進活性を阻害するための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの使用；
-本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の凝固促進活性をインビトロで阻害するための方法であって、上記の細胞に、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせを接触させることを含む方法；

-処置を必要とする対象者における血栓症または血栓性合併症、特に本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症を処置する方法であって、上記の対象者に、治療または予防有効量の少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を投与することを含む方法；
-インビボで、阻害を必要とする対象者において、細胞の凝固促進活性を阻害する方法であって、上記の対象者に、治療または予防有効量の少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または上記の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を投与することを含む方法。

好ましくは、上記の方法のいずれかは、(a)少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質を含有する水溶液中に、本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の細胞懸濁物を含む組成物を調製するステップと、(b)少なくとも１つのトロンビン阻害物質を含有する(すなわち、組成物(a)とは異なるかまたは別の)水溶液を調製するステップと、(c) (a)で規定される組成物と、(b)で規定される溶液とを、同時、別々または逐次的に対象者に投与するステップとを含み得る。よって、上記の態様において好ましくは、(a) 少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質を含有する水溶液中に、本明細書に記載されている任意の細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞の細胞懸濁物を含む組成物が調製され、(b) 少なくとも１つのトロンビン阻害物質を含有する(すなわち、組成物(a)とは異なるかまたは別の)水溶液が調製され、(c) (a)で規定される組成物と、(b)で規定される溶液とが、同時、別々または逐次的に対象者に投与される。

少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせの、上記の効能のいずれか１つおよびそれぞれにおける使用も提供される。

例えば全身、局部、臓器または組織内(例えば肝門脈、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓被膜、腹膜および網膜嚢(omental pouch))で、組成物を対象者に投与するための外科的器具またはデバイスを含み、本明細書に記載されている細胞、例えば特に本明細書で教示する凝固促進性細胞を含む組み合わせまたは医薬組成物をさらに含む機構(arrangement)であって、上記の組み合わせまたは医薬組成物の、例えば全身、局部、臓器または組織内での投与のために適合されている機構も提供される。例えば、適切な外科的器具は、本明細書で教示する組み合わせまたは医薬組成物を含む液体組成物を、例えば全身、局部、臓器または組織内で注入することができる。

本明細書をとおして意図する凝固促進活性を有する細胞は、凝固カスケードを活性化でき、凝固または血餅形成を誘導できる任意の細胞を包含する。凝固促進活性は、任意の既知の凝固試験、例えば限定することなく、トロンボエラストメトリー(thromboelastometry)を用いて簡便に決定できる。
例えば、標準的トロンボエラストメトリー試験において、細胞が、細胞を添加しない陰性対照よりも有意により短い(統計的有意性の適切な検定を当てはめてｐ<0.05)凝固時間(CT)を示す場合に、細胞は、本発明の意味において凝固促進活性を有するということができる。トロンボエラストメトリーは標準的実験室技術であるが、さらなる手引きのために、本明細書で意図する細胞の凝固促進性の性質を試験するための適切なトロンボエラストメトリーは、以下のとおりであり得る。

測定は、ROTEM(登録商標)デルタ分析器(Pentapharm, Munich, Germany)で行う。ROTEM(登録商標)は、血餅形成および血餅溶解の動態および特質をリアルタイムで評価する。凝固時間(CT)は、分析の開始から、血餅形成の開始まで、２mmの振幅に達するまでの時間と定義される。短い休止期間の後に、300μlの全血を、37℃に予め温めたカップにピペットを用いて入れる。懸濁細胞(５×10exp5)を、その後、全血に加える(陰性対照:いずれの懸濁細胞も含まない等容量の懸濁媒体)。Owrenバッファー(例えばClin-Tech Ltd, UKから得ることができるもの)中で希釈した、組織因子(TF)を最終希釈１:17000/0.35 pMで含有する20μlのトリガー試薬(例えばイノビン、Siemens, Marburg, Germany)を、細胞-血液混合物に加え、その後、20μlの0.2M CaCl2を加える。カルシウムを加えた後に、測定を自動的に開始する。1800秒後に凝固が観察されないならば、トロンボエラストメトリーを停止する。

本明細書で意図するように、本明細書で意図する細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞は、任意の起源のものおよび/または任意の分化状態のものであってよい。好ましくは、本明細書で意図する細胞、例えば凝固促進活性を有する細胞は、幹細胞および前駆細胞からなる群から選択される。より好ましくは、本明細書で意図する細胞、例えば凝固促進活性を有する細胞は、間葉系幹細胞である。これもまた好ましくは、本明細書で意図する細胞、例えば凝固促進活性を有する細胞は、成体肝臓由来前駆または幹細胞である。

ある実施形態において、本明細書で意図する細胞、例えば凝固促進活性を有する細胞は、WO 2007/071339に全般的に記載される成体由来ヒト肝臓幹細胞、より具体的には、該文献に記載されるように、アルファ平滑筋アクチン(ASMA)およびアルブミン(ALB)を発現し、サイトケラチン-19 (CK-19)を発現しない成体肝臓を起源とするヒト前駆または幹細胞、さらにより具体的には、該文献に記載されるように、CD90、CD73、CD44、ビメンチン、ASMAおよびALBを発現し、CYP3A4を場合によって発現し、CK-19を発現しない成体肝臓を起源とするヒト前駆または幹細胞、さらにより具体的には、Najimiら, Cell Transplant, 2007, 第16巻, 717〜28に記載される成体由来ヒト肝臓幹細胞 (ADHLSC、さらにより具体的には、WO 2007/071339の出願人により2006年２月20日にブダペスト条約の下でBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMBP)に受託番号LMBP 6452CBの下で寄託された細胞である。

ある実施形態において、本明細書で意図する細胞、例えば凝固促進活性を有する細胞は、WO 2006/126236に全般的に記載される非卵形成体ヒト肝臓由来多能性前駆細胞、より具体的には、該文献に記載されるように、肝細胞マーカーを発現し、成熟肝臓細胞、インスリン生成細胞、骨原性細胞および上皮細胞に分化できる成体組織から単離された非卵形ヒト肝臓多能性前駆株化細胞、またはこれもまた具体的に、肝細胞マーカーを発現し、成熟肝臓細胞、インスリン生成細胞、骨原性細胞および内皮細胞に分化できる成体組織から単離された非卵形ヒト肝臓多能性前駆株化細胞、さらにより具体的には、HerreraらStem Cells, 2006, 第24巻, 2840〜50に記載されるヒト肝臓幹細胞(HLSC)である。

いずれの理論と結び付けられることも望まないが、凝固促進活性を有する細胞による組織因子(血小板組織因子、第III因子、トロンボキナーゼまたはCD142としても知られる)の発現は、上記の細胞の凝固促進活性の少なくとも部分的な原因因子であると考えられる(例えばBeuneuら2004, Mobergら2002およびStephenneら2007、既出を参照されたい)。したがって、ある実施形態において、凝固促進活性を有する細胞は、組織因子を発現する。

本発明者らは、本発明で用いる特に好ましい凝固促進性細胞が、細胞による組織因子 (TF)の発現とは独立して、凝固促進活性成分を含み得ることをさらに見出した。より具体的には、このような凝固促進性細胞は、トロンボエラストメトリーにより第VII因子欠損血漿において測定するか、またはトロンボエラストメトリーにより例えば細胞を抗TF抗体と予備インキュベートすることによりTF活性をブロックした場合の血液または正常血漿において測定すると、それらの凝固促進活性を少なくとも部分的に(例えば部分的にだけまたは全体的に)保持する。理論と結び付けられることを望まないが、第VII因子欠損血漿における細胞の測定可能な凝固促進活性は、残存する少量の第VII因子とも部分的に関連することがある。

本発明者らは、本発明で用いる特に好ましい凝固促進性細胞が、ヘパリン耐性の凝固促進活性成分を含み得ることをさらに見出した。より具体的には、このような凝固促進性細胞は、トロンボエラストメトリーにより、ヘパリン単独の存在下で(すなわちトロンビン活性化剤の非存在下)、例えば特に、特にそれぞれ10 UI/ml、１UI/mlおよび0.34 mg/lの濃度の未分画ヘパリン、エノキサパリンまたはフォンダパリヌクスの存在下で測定すると、それらの凝固促進活性を少なくとも部分的(例えば部分的にだけまたは全体的に)保持する。よって、さらに好ましい実施形態では、本発明で用いる凝固促進性細胞は、細胞による組織因子 (TF)の発現とは独立して凝固促進活性成分を含み、ヘパリン耐性の凝固促進活性成分を含むことができる。

本明細書をとおして意図するアンチトロンビン活性化物質は、アンチトロンビンと、その標的のいずれか１つ以上との結合を増大させることができる任意の物質を包含する。
ある実施形態において、アンチトロンビン活性化物質は、未分画ヘパリンおよび低分子量ヘパリンからなる群、好ましくは未分画ヘパリンから選択される。

本明細書を通して意図するトロンビン阻害物質は、トロンビンと直接結合でき、トロンビンが媒介するフィブリノゲン活性化を阻害または妨げることができる物質である。
ある実施形態において、トロンビン阻害物質は、ビバリルジンおよびヒルジンからなる群、好ましくはビバリルジンから選択される。有利には、ビバリルジンは、約35〜約40分の比較的短い半減期を有するので、対象者が正常な止血状態に迅速に戻ることを可能にする。

本発明の上記のおよび追加の態様、好ましい実施形態および特徴は、以下の項および添付の特許請求の範囲に記載される。本明細書に記載されているそれぞれの態様、実施形態または特徴は、そうでないことが明確に記載されない限り、任意のその他の態様、実施形態または特徴と組み合わせることができる。特に、本明細書に記載されている任意の特徴、特に、好ましいかまたは有利であると示す任意の特徴は、本明細書に記載されている任意のその他の特徴、特に好ましいかまたは有利であると示す任意のその他の特徴と組み合わせることができる。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書に具体的に組み込まれている。

組織因子(ExTem 20μl)を加えるかまたは加えずにカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁した細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間 (CT)。Hep:肝細胞(白)、ALDSC:成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(黒)、Ａ: ヒトアルブミン５%。ALDSC 対肝細胞: Mann-Whitney検定*ｐ<0.05; ALDSC 対肝細胞対対照: Kruskal-Wallis検定***ｐ<0.001。組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%およびヘパリン10 UI/ml (hepar)に懸濁した細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。Hep: 肝細胞(白)、ALDSC:成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(黒)、Ａ:ヒトアルブミン５%。ALDSC 対肝細胞: Mann-Whitney検定**ｐ<0.01; ALDSC 対肝細胞対対照: Kruskal-Wallis検定***ｐ<0.001。組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%およびヘパリン(hepar) (10〜50〜100 UI/ml)に懸濁した細胞の存在下または非存在下でクエン酸塩添加血液を30分間インキュベーションした後に得られた血漿(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。Hep:肝細胞(白)、ALDSC:成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(黒)、Ａ:ヒトアルブミン５%。組織因子(ExTem 20μl)を加えるかまたは加えずにカルシウム再添加した後の、細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。Hep:肝細胞(白)、ALDSC:成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(黒)、Ａ:ヒトアルブミン５%、hir、hir2、hir5:臨床的使用における急速投与濃度(0.4 mg/kg)の１、２、５倍のヒルジン; hepar:細胞懸濁物中のヘパリン10 UI/ml;対照:全血。組織因子(ExTem 20μl)を加えるかまたは加えずにカルシウム再添加した後の、細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。Hep:肝細胞(白)、ALDSC:成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(黒)、Ａ:ヒトアルブミン５%、biv、biv2:臨床的使用における急速投与濃度(0.75 mg/kg)の１、２倍のビバリルジン; hepar:細胞懸濁物中のヘパリン10 UI/ml; 対照:全血。ALDSC 対 ALDSC biva: Mann-Whitney検定**ｐ<0.01; Ａ対 ALDSC biva: Mann-Whitney検定**ｐ<0.01; ALDSC biva 対 ALDSC biva hepar: Mann-Whitney検定**ｐ<0.01; ALDSC hepar 対 ALDSC biva hepar: Mann-Whitney検定***ｐ<0.001; ALDSC 対 ALDSC biva 対 ALDSC biva hepar: Kruskal-Wallis検定***ｐ<0.001。組織因子(ExTem 20μl)を加えずにカルシウム再添加した後の、細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。Hep:肝細胞(白)、ALDSC:成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(黒)、BMMC:骨髄間葉系幹細胞、BMHC:骨髄造血幹細胞、Ａ:アルブミン。ALDSC 対肝細胞: Mann-Whitney検定*ｐ<0.05; Ａ対 ALDSC: Mann-Whitney検定***ｐ<0.001。組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%およびヘパリン10 UI/ml (hepar)に懸濁した骨髄造血幹細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。通常のRT-PCRにより評価した、ALDSCにおける組織因子および組織因子経路阻害物質(TFPI) mRNA発現。Ｘ=ALDSC細胞;Ｈ=肝細胞;Ｐ= PBMC;Ｃ=陰性対照; TF=組織因子(プライマーの第１セット); TF'=組織因子(プライマーの第２セット)、TFPI=組織因子経路阻害物質、GAPDH=グリセルアルデヒド３-リン酸脱水素酵素(技術対照)。リアルタイム-PCRにより評価した、ALDSCの組織因子mRNA (TFおよびas-TF)およびTFPI発現。ALDSC (Ｘ)細胞および肝細胞のうちの、TF遺伝子(Ａ)、選択的スプライシング形as-TF (Ｂ)およびTFPI遺伝子(Ｃ)のmRNAの半定量的発現。CAPAN-2細胞およびHUVECは、それぞれTF、asTFおよびTFPIの陽性対照である。 (Ａ)組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁した細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。カルシウム再添加がなければ、凝固は誘導されない。肝細胞(白)、hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。肝細胞対 hALPC ｐ<0.001;肝細胞対対照ｐ<0.001; hALPC 対対照ｐ<0.01; hALPC 対肝細胞対対照: Kruskal-Wallis検定***ｐ<0.001。(Ｂ) 組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁した細胞の存在下または非存在下でインキュベートした血液から得られた血漿(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。肝細胞(白)、hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。肝細胞対 hALPC ｐ<0.05;肝細胞対対照ｐ<0.01; hALPC 対対照ｐ<0.01; hALPC 対肝細胞対対照: Kruskal-Wallis検定***ｐ<0.001。血液および血漿における細胞(肝細胞およびhALPC)の凝固促進活性(PCA)は、イノビン(Innovin)を加えなかった場合に同等である。組織因子(ExTem 20μl)を加えずにカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁した細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。カルシウム再添加がなければ、凝固は誘導されない。肝細胞(白)、hALPC (黒)。組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、hALPC培養物の上清の存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。カルシウム再添加がなければ、凝固は誘導されない。組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁したhALPC、肝細胞、皮膚線維芽細胞、骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)、骨髄造血幹細胞(BMHSC)、肝臓筋線維芽細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。線維芽細胞対対照ｐ<0.01; BMMSC 対対照ｐ<0.01;肝臓筋線維芽細胞対対照ｐ<0.01。組織因子(ExTem 20μl)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁した細胞の存在下での第VII、Ｖ、ＸおよびII凝固因子欠損血漿(7d Pl、5d Pl、10d Pl、2d Pl) (300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。Nl pl (正常血漿) 対 7d Pl ｐ<0.01; 7d Pl 対対照ｐ<0.01; Nl Pl 対 5d Pl ｐ<0.01; Nl Pl 対 10d Pl ｐ<0.001; Nl Pl 対 2d Pl ｐ<0.001。 (Ａ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%とヘパリン(Hepar)に懸濁したhALPCの存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。対照的に、エノキサパリン(Eno)またはフォンダパリヌクス(Fond)を、アルブミンに懸濁した細胞と接触している血液に即座に加えた。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。*は、hALPCとの比較。fは、対照との比較。(Ｂ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁したhALPCの存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。ビバリルジン(Biva)またはヒルジン(Hir)を、血液に即座に加えた。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。*は、hALPCとの比較。fは、対照との比較。(Ｃ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%とヘパリン(Hepar)に懸濁した肝細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。対照的に、エノキサパリン(Eno)またはフォンダパリヌクス(Fond)を、アルブミンに懸濁した細胞と接触している血液に即座に加えた。肝細胞(白)、対照(アルブミン) (灰色)。*は、肝細胞との比較。fは、対照との比較。(Ｄ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁した肝細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。ビバリルジン(Biva)またはヒルジン(Hir)を、血液に即座に加えた。肝細胞(白)、対照(アルブミン) (灰色)。*は、肝細胞との比較。fは、対照との比較。 (Ａ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%とヘパリン(Hepar)または血液に即座に加えたエノキサパリン (Eno)もしくはフォンダパリヌクス(Fond)に懸濁したhALPCの存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。抗凝固薬の組み合わせは、ビバリルジン(Biva)を血液に即座に加えた場合に得られた。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。*は、hALPCとの比較。fは、対照との比較。＄は、ビバリルジンとの比較。(Ｂ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%にとヘパリン(Hepar)または血液に即座に加えたエノキサパリン(Eno)もしくはフォンダパリヌクス(Fond)に懸濁した肝細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。抗凝固薬の組み合わせは、ビバリルジン(Biva)を血液に即座に加えた場合に得られた。肝細胞(白)、対照(アルブミン) (灰色)。*は、肝細胞との比較。fは、対照との比較。＄は、ビバリルジンとの比較。 TFについての免疫蛍光を、カバーガラス上に置き、パラホルムアルデヒドで固定したhALPC (Ａ)について行った(倍率20×)。核は、DAPIにより明示した(青色染色)。(Ｂ)陰性対照(１次抗体なし)。通常のRT-PCRにより評価した、hALPCおよび肝細胞における組織因子および組織因子経路阻害物質(TFPI) mRNA発現。組織因子(TF)、選択的スプライシングされた組織因子(asTF)、組織因子経路阻害物質(TFPI)、グリセルアルデヒド３-リン酸脱水素酵素(GAPDH) (技術対照)。リアルタイム-PCRにより評価した、hALPCおよび肝細胞の組織因子mRNA (TFおよびas-TF)およびTFPI発現。hALPC細胞および肝細胞のうちのTF遺伝子(Ａ)、選択的スプライシング形as-TF (Ｂ)およびTFPI遺伝子(Ｃ)のmRNAの半定量的発現。CAPAN-2細胞およびHUVECは、それぞれTF、asTFおよびTFPIの陽性対照である。組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、TF抗体とのインキュベート(TF+)もしくはインキュベートなし(TF−)の後のヒトアルブミン５%に懸濁した細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。肝細胞(白)、hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。hALPC TF− 対 hALPC TF＋ｐ<0.01;肝細胞 TF− 対肝細胞 TF＋ｐ<0.01; hALPC TF＋対対照ｐ<0.001;肝細胞対対照、有意性なし。ヘパリン(Hepar) (10 UI/ml、50 UI/mlおよび100 UI/ml)を補ったかまたは補っていないアルブミンに懸濁した細胞を血液中で30分間インキュベートした後に、抗Xa活性(UI/ml)を、血液の遠心分離の後に得られた血漿中で測定した。hALPC (黒)、肝細胞(Hep) (白)、対照(灰色)。細胞注入中に、患者は、ビバリルジン(1.75 mg/kg)を受ける。逐次的細胞注入の合間に、用量を0.25 mg/kgまで２〜４時間かけて減らした。トロンボエラストメトリー(門脈における(port)かまたは中心静脈(central line)を介する(centr)CT)、血小板(PLT) (正常値: 150〜350 10exp3/μl)およびＤダイマーレベル(正常値: <500 ng/ml)、トロンビン時間(TT、正常値: 15〜24秒)、プロトロンビン時間(PT、正常値:９〜14秒)ならびに部分トロンボプラスチン時間(PTT、正常値: 20〜33秒)を含む凝固試験をそれぞれ、各注入の前、開始の20分後および最後に行った。Ａクリグラー-ナジャーの患者;Ｂ 1a型糖原病の患者。 (Ａ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、いくつかの濃度(Hepar-10UI/ml、Hepar 5x-50UI/ml、Hepar10x-100UI/ml)のヘパリン(Hepar)を含むかもしくは含まないヒトアルブミン５%に懸濁したhALPC (黒)の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。対照(アルブミン) (灰色)。対照対 hALPC Hepar 5x ｐ<0.01。(Ｂ)組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、通常濃度もしくは通常濃度の５倍のフォンダパリヌクス (Fond)、エノキサパリン(Eno)を含むかまたは含まないヒトアルブミン５%に懸濁したhALPC (黒)の存在下あるいは非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。対照(アルブミン) (灰色)。対照対 hALPC Fond 5x、ｐ<0.01;対照対 hALPC Eno 5x、ｐ<0.01; Fond 対 Fond 5x、n.s.; Eno 対 Eno 5x、n.s. 組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁したhALPCの存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。増加させた濃度のヒルジン(Hir) (２×(Hir 2x)または５×(Hir 5x))を血液に即座に加えた。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。対照対 hALPC Hir 2x、ｐ<0.01; hALPC 対 hALPC Hir 2x、ｐ<0.01; hALPC Hir 対 hALPCs Hir 2x、n.s.。組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヒトアルブミン５%に懸濁したhALPCの存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。増加させた濃度のビバリルジン(Biva) (２×(Biva 2x))を血液に即座に加えた。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。対照対 hALPC Biva 2x、ｐ< 0.01。組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヘパリン(Hepar)を含むかもしくは含まないヒトアルブミン５%に懸濁したhALPCの存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。エノキサパリン(Eno)またはフォンダパリヌクス(Fond)を、ヘパリンに懸濁したかまたはしていない細胞を含む血液に即座に加えた。hALPC (黒)、対照(アルブミン) (灰色)。対照対 hALPC Hepar + Eno、ｐ<0.01;対照対 hALPC Hepar + Fond、ｐ<0.01。組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヘパリン(10 UI/ml) (Hepar)を含むかもしくは含まないヒトアルブミン５%に懸濁したhALPC、肝細胞、皮膚線維芽細胞、骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)、骨髄造血幹細胞(BMHSC)、肝臓筋線維芽細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。線維芽細胞Hepar 対対照n.s.;肝臓筋線維芽細胞 Hepar 対対照ｐ<0.01。組織因子(ExTem 20μL)を加えてカルシウム再添加した後の、ヘパリン(10 UI/ml) (Hepar)を含むかもしくは含まないヒトアルブミン５%に懸濁した肝臓筋線維芽細胞の存在下または非存在下でのクエン酸塩添加全血(300μl)のROTEMによりアッセイした凝固時間(CT)。抗凝固薬の組み合わせは、ビバリルジン(Biva)を、ヘパリンに懸濁した細胞と接触している血液に即座に加えた場合に得られた。

本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「an」および「the」は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、単数および複数の両方の言及を含む。
用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」および「含まれる(comprised of)」は、本明細書で用いる場合、「含む(including)」、「含む(includes)」または「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義であり、包括的または拡張可能であり、追加の言及していないメンバー、要素または方法ステップを排除しない。この用語は、「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」も包含する。

終点による数値範囲の言及は、それぞれの範囲内の包摂される全ての数および画分とともに、言及する終点を含む。
用語「１つ以上」、例えばメンバーの群のうちの１つ以上のメンバーは、それ自体明確であるが、さらなる例示のために、この用語は、なかでも、上記のメンバーのいずれか１つ、または上記のメンバーのいずれか２つ以上、例えば上記のメンバーのいずれか≧３、≧４、≧５、≧６もしくは≧７などおよび上記のメンバー全てまでについての言及を包含する。
測定可能な値、例えばパラメータ、量、時間などに言及する場合に本明細書で用いる用語「約」は、特定した値およびそこからの変動、特に特定した値およびそこからの＋/−10%以下、好ましくは＋/−５%以下、より好ましくは＋/−１%以下、さらにより好ましくは＋/−0.1%以下の変動(そのような変動が本発明において行われることが適当である限り)を包含することを意味する。修飾語「約」が言及する値自体も、具体的にそして好ましくは開示されることが理解される。

本明細書で引用する全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
そうでないと明記しない限り、技術的および科学的用語を含む本発明の開示において用いる全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。さらなる手引きのために、用語の定義を、本発明の教示をよりよく認識するために含める。

本明細書に記載されている組み合わせ、組成物、キット、方法および使用における好ましい細胞は、成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞または肝臓筋線維芽細胞、より好ましくは成体肝臓前駆細胞または肝臓筋線維芽細胞、最も好ましくは成体肝臓前駆細胞である。
本明細書で用いる場合、用語「凝固促進活性を有する細胞」は、凝固カスケードを活性化し、凝固もしくは血餅形成を誘導できるかまたはそのような性質を有する細胞を包含する。

本発明で意図する凝固促進活性を有する細胞は、任意の段階にて凝固カスケードを誘因でき、それにより最終的にフィブリノゲンが、架橋されて血餅になるフィブリンに変換される。例えばそして限定することなく、凝固促進活性を有する細胞は、組織因子を発現でき、その発現は、第Ｘ因子から第Xa因子への活性化を誘因し、これが次に、プロトロンビンからトロンビンへの切断を介して、フィブリンへのトロンビン媒介フィブリノゲン変換を介する血餅形成を導く。用語「凝固促進活性を有する細胞」は、「凝固促進性細胞」と交換可能に用いることができる。用語「凝固促進活性」は、「血栓形成促進活性」と交換可能に用いることができる。細胞の凝固促進活性は、特定の細胞の特徴、例えばそして限定することなく、特異的マーカー、例えば組織因子の発現の存在(または非存在)により決定でき、細胞の凝固促進活性は、例えばそして限定することなくトロンボエラストメトリーのような技術により等しく決定できる。簡単に述べると、トロンボエラストメトリーは、血液(または拡張により、凝固カスケードの成分を含有する任意の試料、例えば血漿)における止血試験のための確立された粘弾性法であり、これにより試料中の弾性変化を血餅形成と相関させる。例えばそして限定することなく、トロンボエラストメトリー測定は、ROTEM(登録商標)デルタ分析器(Pentapharm, Munich, Germany)で行うことができる。あるいは、凝固促進活性は、Johanssonら(Diabetes, 2005, 54:1755〜1762)に記載される配管ループ法(tubing loop method)により測定できる。凝固促進活性は、例えば、特異的サイトカインプロフィールからも明らかであり、それにより決定することもできる(例えばvan der Pollら Regulatory role of cytokines in disseminated intravascular coagulation. Semin Thromb Hemost. 2001, 27:639〜51で概説されている)。

本発明で意図する凝固促進活性を有する細胞は、その移植のために特に適切であるかまたはそのために構成されてよい。細胞は、同種異系細胞(すなわち細胞が移植される対象者と同じ種の異なる個体から単離された)であってよいか、または代わりに自家細胞(すなわち細胞が移植される対象者と同じ対象者から単離された)であってよいか、または異種細胞(すなわち細胞が移植される対象者と異なる種の対象者から単離された)でさえあってよい。凝固促進性細胞は、初代細胞であってよいか、または代わりにインビトロでの操作に供された細胞であってもよい。本明細書で用いる場合、用語「インビトロでの操作」は、体外での細胞の任意の種類の操作のことをいう。そのような操作の例は、限定することなく、細胞における効果を誘出する薬物もしくはその他の化合物の投与；特定の細胞構成成分の枯渇；遺伝子操作；遺伝子治療；安定的もしくは一過的トランスフェクション、(偽)ウイルス感染または形質転換；分化；脱分化；サブクローニングなどである。細胞の起源に関係なく、細胞は、移植の前に貯蔵(例えば凍結保存)および/または増殖もしくは継代に供することができることが明確である。細胞は、１つ以上の特異的タンパク質(細胞にとって自己ものであるか、すなわち自家であるか否かに関わらず)を発現するか、またはその発現を増加もしくは減少させる(または完全もしくは実質的に完全に遮断する)ように誘導してよい。インビトロでの操作の代わりに、移植される細胞は、ドナーからの単離前に操作に供することができる(例えば薬物処置、遺伝子治療など)。凝固促進活性を有する細胞は、株化細胞であってもよい。

ある実施形態において、本明細書で意図する凝固促進性細胞は、非造血(幹)細胞であってよい。なぜなら、上記の細胞は、凝固促進活性を示さない傾向があるからである。
細胞によりもたらされる機能を回復または改良するために細胞を移植することの他に、非限定的な例において、移植するために作製する細胞は、限定することなく、がん細胞(例えば動物モデルにおけるがんの研究のため)、細胞ベースのワクチンまたは免疫寛容剤(immunotolerance agents)などを含み得る。

所望により、細胞に、対象者に導入する前に、興味対象の核酸を安定的または一過的に形質転換できる。興味対象の核酸配列は、それらに限定されないが、上記の細胞の成長、分化および/または機能を増強する遺伝子生成物をコードするものを含む。例えばそして限定することなく、肝臓細胞により通常発現されるタンパク質の発現系を、安定的または一過的な様式で、そのように形質転換された(好ましくは肝臓)細胞を用いるそのようなタンパク質の発現により利益を受ける疾患または状態、例えば肝臓代謝の先天性障害を処置する目的のために導入できる。細胞形質転換の方法は、当業者に知られている。

本明細書で意図する細胞、例えば特に本明細書で意図する凝固促進性細胞は、特にヒトまたは非ヒト哺乳類もしくは霊長類起源の細胞を含む、好ましくは動物起源、より好ましくは温血動物、さらにより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類起源のものであってよい。好ましい細胞、例えば凝固促進性細胞は、ヒト起源のものである。用語「哺乳類」は、本明細書をとおして用いる場合、それらに限定されないが、ヒト、家庭および農業の動物、動物園の動物、競技用動物、ペットの動物、コンパニオン動物ならびに実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ウシ(cattle)、ウシ(cows)、ヒツジ、ウマ、ブタならびに霊長類、例えば尻尾のあるサル(monkey)および尻尾のないサル(apes)を含むそのように分類される任意の動物を含む。

本明細書で意図する細胞、特に本明細書で意図する凝固促進性細胞は、限定することなく、前駆細胞、幹細胞または部分的もしくは完全に分化した細胞、例えば終末分化細胞(すなわち有糸分裂後であり得る完全に専門化された細胞)を包含し得る。
好ましくは、本明細書で意図するように、細胞、例えば凝固促進性細胞、特に前駆または幹細胞は、成体起源のもの(例えば成体前駆または幹細胞)、すなわち胎仔段階またはより好ましくは生誕後(分娩後)の生物に存在するかまたはそれから得られる(例えばそこから取り出されるかまたは単離される)ものであってよい。

例えばそして限定することなく、本明細書で意図する細胞の成体起源、例えば成体肝臓前駆細胞は、新生仔組織から、または任意のその後の発達段階の組織、例えばなかでもヒトの発達において幼児、小児、若年者、青年または成人と通常称する段階の組織からの起源のことをいうことができる。例えば、ヒト細胞(例えばヒト成体肝臓前駆細胞)について、成体起源は、好ましくは正期での生誕後の任意の時間での組織(例えば肝臓組織)からの起源のことをいうことができ、例えば生誕後少なくとも１ヶ月齢、例えば生誕後少なくとも２ヶ月齢、少なくとも３ヶ月齢、例えば少なくとも４ヶ月齢、少なくとも５ヶ月齢、例えば少なくとも６ヶ月齢、例えば生誕後１年齢以上、５年齢以上、少なくとも10年齢以上、15年齢以上、20年齢以上または25年齢以上であってよい。

用語「前駆体」または「前駆細胞」は、同義であり、全般的に、適当な条件下で、少なくとも１つのより専門化された細胞型、例えばなかでも比較的より専門化された前駆細胞または最終的には終末分化細胞を生じることができる、専門化されていないかもしくは専門化の程度が比較的低い増殖能のある細胞のことをいう。前駆細胞は、例えば、前駆細胞が、細胞分裂を受ける前に分化して別の比較的より専門化された細胞になる場合に、または上記の他の細胞が、該前駆細胞の１回以上の細胞分裂および/もしくは分化の後に生成されるならば、上記の別の細胞を「生じる」ことができる。

用語「幹細胞」は、全般的に、自己再生できる、すなわち適当な条件下で分化することなく増殖できる前駆細胞のことをいう。この用語は、実質的に無限の自己再生ができる、すなわち幹細胞の子孫の一部が、専門化されていないかまたは母幹細胞の専門化の程度が比較的低い表現型、分化能、および増殖能を保持する幹細胞、ならびに有限の自己再生を示す、すなわちさらなる増殖および/または分化についての幹細胞の子孫の能力が、母細胞と比較して明白に低減している幹細胞を包含する。

前駆または幹細胞は、本明細書で意図する場合、多能性(すなわち、標準的な当該技術において受け入れられた試験、例えばなかでもSCIDマウスにおいて奇形腫を形成する能力、または組織培養において３つ全ての胚葉の同定可能な細胞を形成する能力により、適当な条件下で３つ全ての胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉の誘導物である異なる細胞型の子孫を生成できる)、多分化能(すなわち、適当な条件下で生物の２以上の異なる臓器もしくは組織のそれぞれから少なくとも３つの細胞型の子孫を生成できる(上記の細胞型は、同じかまたは異なる胚葉を起源とし得る)が、生物の全ての細胞型を生じることができない)であり得るか、または１つだけもしくはいくつか(例えば１、２または３)の細胞系統に拘束され得る。

原型の哺乳動物多能性幹細胞(mPS)は、任意の種類の哺乳動物胚性組織、例えば胚性、胎生または胎生前(pre-foetal)組織に由来してもよい。mPS細胞の定義に含まれるものは、限定することなく、例えばEvansおよびKaufman 1981 (Nature 292: 154〜6)ならびにMartin 1981 (PNAS 78: 7634〜8)により記載されるマウス胚性幹細胞;例えばIannacconeら1994 (Dev Biol 163: 288〜292)により記載されるラット多能性幹細胞;例えばDoetschmanら1988 (Dev Biol 127: 224〜227)により記載されるハムスター胚性幹細胞;例えばGravesら1993 (Mol Reprod Dev 36: 424〜433)により記載されるウサギ胚性幹細胞;例えばNotarianniら1991 (J Reprod Fertil Suppl 43: 255〜60)およびWheeler 1994 (Reprod Fertil Dev 6: 563〜8)により記載されるブタ多能性幹細胞;例えばNotarianniら1991 (既出)により記載されるヒツジ胚性幹細胞;例えばRoachら2006 (Methods Enzymol 418: 21〜37)に記載されるウシ胚性幹細胞;例えばThomsonら1998 (Science 282: 1145〜1147)に記載されるヒト胚性幹(hES)細胞;例えばShamblottら1998 (PNAS 95: 13726)に記載されるヒト胚性生殖(hEG)細胞;その他の霊長類からの胚性幹細胞、例えば、例えばThomsonら1995 (PNAS 92:7844〜7848)に記載されるアカゲザル幹細胞または例えばThomsonら1996 (Biol Reprod 55: 254〜259)に記載されるマーモセット幹細胞により例示される、様々な型の胚性幹細胞である。

述べたように、原型「ヒトES細胞」は、Thomsonら1998 (既出)により、および米国特許第6,200,806号に記載されている。この用語の範囲は、胚盤胞期のヒト胚に由来するか、または３つの胚葉への細胞の実質的な分化前の多能性幹細胞をカバーする。ES細胞、特にhES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊または胚盤胞全体に典型的に由来する。桑実胚期からのhES株化細胞の誘導は、文書化されており、そのようにして得られたES細胞も本発明において用いることができる(Strelchenkoら2004. Reproductive BioMedicine Online 9: 623〜629)。述べたように、原型「ヒトEG細胞」は、Shamblottら1998 (既出)により記載されている。このような細胞は、例えば、胎仔からの始原生殖細胞を含有する生殖隆起および腸間膜に由来してよい。ヒトにおいて、胎仔は、典型的に、受精後５〜11週であってよい。

明示的にそうでないことが要求される場合以外は、用語mPS細胞は、それぞれの細胞の表現型の特徴を有する初代組織細胞および樹立系統、ならびに３つの胚葉のそれぞれの子孫を生成する能力をまだ有する、そのような初代細胞または株化細胞の誘導物を含み得る。
例示的であるが限定しないヒトES細胞の樹立系統は、NIHヒト胚性幹細胞レジストリ(http://stemcells.nih.gov/research/registry)に列挙される系統、およびその亜系統、例えばBresagen Inc. (Athens, GA)からの系統hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03およびhESBGN-04、Cellartis AB (Goteborg, Sweden)からの系統Sahlgrenska 1およびSahlgrenska 2、ES Cell International (Singapore)からの系統HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5およびHES-6、MizMedi Hospital (Seoul, Korea)からの系統Miz-hES1、Technion - Israel Institute of Technology (Haifa, Israel)からの系統I 3、I 3.2、I 3.3、I 4、I 6、I 6.2、J 3およびJ 3.2、University of California (San Francisco, CA)からの系統HSF-1およびHSF-6、Wisconsin Alumni Research Foundation / WiCell Research Institute (Madison, WI)の系統H1、H7、H9、H13、H14、Cell & Gene Therapy Research Institute / Pochon CHA University College of Medicine (Seoul, Korea)からの系統CHA-hES-1およびCHA-hES-2、Geron Corporation (Menlo Park, CA)からの系統H1、H7、H9、H13、H14、H9.1およびH9.2、Goteborg University (Goteborg, Sweden)からの系統Sahlgrenska 4〜Sahlgrenska 19、Maria Biotech Co. Ltd. (Seoul, Korea)からの系統MB01、MB02、MB03、National Centre for Biological Sciences (Bangalore, India)からの系統FCNCBS1、FCNCBS2およびFCNCBS3、ならびにReliance Life Sciences (Mumbai, India)からの系統RLS ES 05、RLS ES 07、RLS ES 10、RLS ES 13、RLS ES 15、RLS ES 20およびRLS ES 21を含む。その他の例示的な樹立hES株化細胞は、UK幹細胞バンク(http://www.ukstemcellbank.org.uk/)に寄託されたものおよびその亜系統、例えばKing's College London (London, UK)からの系統WT3およびUniversity of Newcastle (Newcastle, UK)からの系統hES-NCL1 (Strojkovicら2004. Stem Cells 22: 790〜7)を含む。さらなる例示的なES株化細胞は、Cellartis AB (Goteborg, Sweden)からの系統FC018、AS034、AS034.1、AS038、SA111、SA121、SA142、SA167、SA181、SA191、SA196、SA203およびSA204ならびにその亜系統を含む。

用語「哺乳動物多能性幹細胞」には、さらに、なかでもYamanakaら2006 (Cell 126: 663〜676)、Yamanakaら2007 (Cell 131: 861〜872)およびLinら2009 (Nature Methods 6: 805〜808)で教示される誘導性多能性幹(iPS)細胞の使用を含む、非多能性哺乳動物細胞、例えば体細胞性、特に成体体細胞性哺乳動物細胞の操作、なかでも遺伝的ならびに/または成長因子および/もしくは小分子により媒介される操作により得ることができるmPS細胞を含む。

本明細書で意図する好ましい細胞、例えば本明細書で意図する凝固促進性細胞は、間葉系幹細胞を含み得る。用語「間葉系幹細胞」または「MSC」は、本明細書で用いる場合、間葉系統の細胞、典型的には３以上の間葉系統、例えば骨細胞(骨)、軟骨細胞(軟骨)、筋細胞(筋肉)、腱細胞(腱)、線維芽細胞(結合組織)、脂肪細胞(脂肪)、間質原性(stromogenic) (骨髄基質)系統の細胞を生じることができる成体中胚葉由来幹細胞のことをいう。一般的に、しかし限定されないが、細胞が、標準的な当該技術において受け入れられた分化条件および細胞表現型評価方法、例えばPittengerら1999 (Science 284: 143〜7)またはBarberiら(PLoS Med 2: e161, 2005)に記載されるものを用いて、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞系統のそれぞれの細胞を形成できるならば、細胞は、MSCとみなすことができる。MSC細胞は、例えば骨髄、血液、臍帯、胎盤、胎生卵黄嚢、真皮、特に胎生および青年期皮膚(Youngら2001. Anat Rec 264: 51〜62)、骨膜および脂肪組織(Zukら2001. Tissue Eng 7: 211〜28)から単離してよい。ヒトMSC、それらの単離、インビトロ増殖および分化は、例えばPittengerら1999 (既出)、米国特許第5,486,359号;米国特許第5,811,094号;米国特許第5,736,396号;米国特許第5,837,539号;または米国特許第5,827,740号に記載されている。

この用語は、骨髄から得られるMSC(これは、一般的に「骨髄間葉系幹細胞」、「骨髄間質細胞」または「BMSC」とよばれる)も包含する。BMSCの単離のための骨髄の試料は、例えば腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨またはその他の髄様空間から得ることができる。好ましい実施形態では、本発明で用いるMSCまたはMSC集団は、骨髄を起源としてもよく、例えば骨髄試料から単離して場合によって増殖させてもよい。骨髄を起源とするMSCおよびMSC集団は、他の組織を起源とするMSCとは異なりかつ/またはそれより好ましい特徴(例えばマーカープロフィール、機能、増殖、分化など)を有することができ、例えば限定することなく、より効率的および/またはより管理が容易に、ある細胞系統に分化できる。用語MSCおよびBMSCは、MSCまたはBMSCの子孫、例えば対象者の生体試料から得られるMSCまたはBMSCのインビトロまたはエクスビボ増殖により得られる子孫も包含する。

本明細書で意図するその他の細胞、例えば本明細書で意図する凝固促進性細胞は、限定することなく、筋肉組織(例えば衛星細胞)、内分泌組織(例えば膵臓、生殖腺、副腎、松果体、脳下垂体、甲状腺および副甲状腺)、神経組織(例えばニューロンのまたは膠組織)、血液および免疫系組織、上皮、肝臓、骨、軟骨、脂肪または内皮組織を含む組織から得られるかまたはそれに由来する(例えばそこから取り出されるかまたは単離される)成体前駆または幹細胞を含むことができる。
本明細書に記載されている特に好ましい細胞、例えば特に凝固促進活性を有する細胞は、成体肝臓由来前駆または幹細胞、より具体的には、発明の概要の項で詳述したような細胞である。

本明細書で用いる場合、成体肝臓由来前駆もしくは幹細胞、または成体肝臓前駆細胞または同様のものは、全般的に、前駆または幹細胞の特徴を有し、１つ以上の肝臓細胞型に向かって分化できる、例えば少なくとも肝分化できるかもしくは肝分化だけができる(すなわち肝細胞または肝細胞様細胞に向かって分化する)肝臓起源の細胞のことをいうことができる。

本明細書で意図する細胞、例えば部分的もしくは完全分化または成熟の凝固促進性細胞、例えば終末分化細胞(すなわち有糸分裂後であり得る完全に専門化された細胞)は、限定することなく、筋肉細胞(例えば心筋細胞、筋細胞、筋管、筋芽細胞、血管平滑筋細胞)、膵臓内分泌細胞(例えばベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞、PP生成細胞またはイプシロン細胞)、神経細胞(例えばニューロン、膠細胞、例えば星状膠細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞)、血液および免疫系の細胞(例えばＢまたはＴリンパ球、樹状細胞、顆粒球、マクロファージなど)、上皮細胞(例えばケラチノサイト、メラニン細胞、腎臓細胞、肺細胞)、肝臓の細胞(例えば肝細胞、卵形細胞)、骨の細胞(骨芽細胞、骨細胞、象牙芽細胞)、軟骨細胞、脂肪細胞、内皮細胞(例えば血管平滑筋細胞)を含み得る。融合細胞、例えば細胞ハイブリッドも意図する。

本明細書で用いる場合、用語「アンチトロンビン活性化物質」は、アンチトロンビンを直接活性化する物質(agent) (例えば化合物、物質(substance)または分子)のことをいう。それ自体で、アンチトロンビン活性化物質は、その標的、例えばトロンビン、第Xa因子および/または第IXa因子に向かうアンチトロンビンの触媒(拮抗)活性を増加させる(すなわち速度定数の増加)。特に好ましくは、アンチトロンビン活性化物質は、少なくとも第Xa因子に向かうアンチトロンビンの触媒(拮抗)活性を増加させる。別の好ましい実施形態では、アンチトロンビン活性化物質は、それに限定されないが例えばフォンダパリヌクスのように、特異的に第Xa因子に向かうアンチトロンビンの触媒(拮抗)活性を増加させることができる。アンチトロンビン活性化物質によるアンチトロンビンの活性化は、任意の手段により、例えばそして限定することなく、触媒(標的結合)部位への近づきやすさおよび/または活性の増加を導く、直接結合およびアンチトロンビンの立体構造変化の誘導により達成できる。本明細書で用いる場合、「アンチトロンビン」は、既知のアンチトロンビンのいずれか、好ましくはアンチトロンビンIII(遺伝子記号SERPINC1)のことをいう。したがって、本明細書で用いる場合、「アンチトロンビン活性化物質」は、好ましくはアンチトロンビンIIIの活性化剤のことをいう。

ある実施形態において、本発明によるアンチトロンビン活性化物質は、ヘパリンである。別の実施形態において、本発明によるアンチトロンビン活性化物質は、未分画ヘパリンおよび低分子量ヘパリンからなる群から選択される。さらなる実施形態において、本発明によるアンチトロンビン活性化物質は、フォンダパリヌクスであり、これは、２-デオキシ-６-Ｏ-スルホ-２-(スルホアミノ)-α-Ｄ-グルコピラノシル-(１→４)-Ｏ-β-Ｄ-グルコピランウロノシル-(１→４)-Ｏ-２-デオキシ-３,６-ジ-Ｏ-スルホ-２-(スルホアミノ)-α-Ｄ-グルコピラノシル-(１→４)-Ｏ-２-Ｏ-スルホ-α-Ｌ-イドピラノウロノシル-(１→４)-Ｏ-メチル-２-デオキシ-６-Ｏ-スルホ-２-(スルホアミノ)-α-Ｄ-グルコピラノシド、デカナトリウム塩と表すことができる。好ましい実施形態において、本発明によるアンチトロンビン活性化物質は、未分画ヘパリンである。本明細書で用いる場合、「未分画ヘパリン」は、特に、天然ヘパリンのことをいい、これは、様々な長さ(通常、約５〜約40 kDaの範囲である)の分子鎖からなる多分散物(polydisperse)である。本明細書で意図するように、任意の型のヘパリンを用いることができる。典型的に、製薬グレードのヘパリンは、屠殺された肉用動物の粘膜組織、例えばブタの腸またはウシの肺に由来する。本明細書で用いる場合、「低分子量ヘパリン」(LMWH)は、約８kDa未満の平均分子量を典型的に有するヘパリン(これらについて全ての鎖の少なくとも約60%が約８kDa未満の分子量を有する)のことをいう。LMWHは、ヘパリンポリマーの分画または解重合の様々な方法により得られる。LMWHの例は、限定することなく、アルデパリン、セルトパリン、エノキサパリン、パリナパリン、チンザパリン、ダルテパリン、レビパリンおよびナドロパリンを含む。

本発明者らにより企図されるように、あるいくつかのアンチトロンビン活性化物質は、(特異的に)第Xa因子に向かうアンチトロンビンの触媒(拮抗)活性を増加させることにより作用できる。したがって、いくつかの態様および実施形態において、アンチトロンビン活性化物質の代替としてまたはアンチトロンビン活性化物質に加えて、第Xa因子阻害物質、特にアンチトロンビン活性化物質以外の第Xa因子阻害物質を採用した、本明細書に記載されている組み合わせ、組成物、キット、方法および使用が企図される。このような第Xa因子阻害物質は、間接的または代わりに直接的な第Xa因子阻害物質であってよい。間接的第Xa因子阻害物質は、例えば、第Xa因子への第Ｘ因子の変換を阻害する物質を含む。直接的第Xa因子阻害物質は、アンチトロンビンをメディエータとして用いることなく、凝固カスケード中の第Xa因子に直接作用して、それにより第Xa因子が媒介するトロンビンへのプロトロンビンの変換を妨げることができる。例えばそして限定することなく、直接的第Xa因子阻害物質は、アピキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン、DX9065aおよびYM466を含む。

本明細書で用いる場合、用語「トロンビン阻害物質」は、トロンビンと直接結合してそれを不活性化する化合物のことをいう。それ自体で、トロンビン阻害物質は、触媒標的、最も著しくはフィブリノゲンについての速度定数の減少により簡便に測定されるように、トロンビンの触媒活性を著しく減少させるかまたは理想的には完全にもしくは実質的に完全に遮断する。トロンビン阻害物質によるトロンビン阻害は、可逆的または不可逆的であってよく、好ましくは可逆的である。トロンビン阻害物質によるトロンビン阻害は、任意の手段により、例えばそして限定することなく、トロンビンの触媒部位への直接結合により達成できる。

ある実施形態において、本発明によるトロンビン阻害物質は、ビバリルジンおよびヒルジンからなる群から選択される。化学的に、ビバリルジン(CAS No. 128270-60-0)は、自然に存在する薬物であるヒルジンの合成同類物(congener)である。自然に存在するヒルジンは、典型的に、このタンパク質の様々なアイソフォームの混合物を含有する。よって、用語「ヒルジン」は、本明細書で用いる場合、特に、自然に存在するヒルジンアイソフォームの１次アミノ酸配列を有する任意のタンパク質、例えばなかでもHV1、HV2、HV3、P1またはP2を含む。組換えヒルジンを作製して、ヒルジンの均質調製物、例えばそして限定することなく、レピルジンおよびデシルジンを生成できる。本明細書で意図するヒルジンは、例えばアミノ酸置換、欠失、挿入、伸長、官能化または化学改変によるヒルジンの適切な誘導体または類似体も包含し(上記の誘導体は、トロンビン阻害物質活性を有する)、遺伝子工学により生成できる１より多いヒルジンのハイブリッドをさらに包含する。例えば、WO 91/17250は、HV1の最初の46残基とその後のHV2のアミノ酸47〜65とから構成されるヒルジンについて記載している。

好ましい実施形態において、トロンビン阻害物質は、ビバリルジン(例えばThe Medicines CompanyによりAngiomax(登録商標)またはAngiox(登録商標)として製造される)である。(天然または組換え)ヒルジンおよびヒルジン誘導体ならびにビバリルジンは当業者に知られているが、さらなる手引きのために、なかでもFentonらSemin Thromb Hemost., 1998, 第24巻, 87〜91を参照されたい。

本発明の原理を具体化する特に好ましい組み合わせまたは組成物は、ヘパリン、未分画ヘパリン、低分子量ヘパリンおよびフォンダパリヌクス、好ましくは未分画ヘパリンからなる群から選択される抗トロンビン活性化剤と、ビバリルジンおよびヒルジン、好ましくはビバリルジンからなる群から選択されるトロンビン阻害物質と、場合によって、成体肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞または肝臓筋線維芽細胞、好ましくは成体肝臓前駆細胞または肝臓筋線維芽細胞、最も好ましくは成体肝臓前駆細胞からなる群から選択される細胞とを含むか、それから本質的になるかまたはそれからなることができる。

本発明の原理を具体化するさらなる特に好ましい組み合わせまたは組成物、すなわち物質１、物質２および場合によって細胞を含むか、それから本質的になるかまたはそれからなる組み合わせまたは組成物を、表１に開示する。

用語「細胞移植」は、その通常の意味を有し、特に、対象者への細胞の投与のことをいう。用語「細胞移植」は、「細胞療法」と交換可能に用いることができる。細胞移植は、当該技術において知られる任意の技術により行うことができる。例えばそして限定することなく、細胞は、対象者に注入により移植できる。典型的に、細胞注入は、非経口的に、例えば血管内、皮下、皮内または筋肉内、好ましくは血管内で行うことができる。細胞は、例えばそして限定することなく、全身、局部または病変の部位にて投与できる。具体的な用途、標的組織、治療目的または細胞型により、投与の経路、ならびに処方、濃度などに関して調節できることが明らかである。

本明細書で用いる場合、用語「血栓性合併症」または「凝固促進性合併症」は、特に、血餅形成自体とは別の、凝固促進活性を有する細胞の移植に伴う有害な影響または合併症のことをいうことがある。このような影響は、例えばそして限定することなく、細胞損失、細胞拒絶または炎症であり得る。細胞損失または細胞拒絶により、移植細胞損失または拒絶を意味する。これらの影響の結果は、投与した細胞の全量未満が移植後に意図する機能を行うために利用可能あるか、または極端な場合ではこれらのうちのどれもが利用可能でなくなるような、細胞移植効率または細胞生着能の低下である。細胞損失は、例えば、血餅への移植細胞の封入により生じることができる。細胞拒絶は、例えば、宿主の免疫応答により生じることができる。炎症応答は、例えば、凝固カスケードの活性化に伴うかまたはそれに起因することができる。代わりに、またはさらに、炎症は、細胞拒絶に伴うか、それに起因するかまたはそれを引き起こすことができる。

本明細書で教示する組み合わせを含み、１つ以上のその他の成分をさらに含む組成物も提供される。例えば、細胞の生存性を維持または増強できる成分を含めてよい。例えばそして限定することなく、このような成分は、実質的に等張条件を確実にする塩、pH安定剤、例えばバッファー系(例えば、実質的に中性のpHを確実にするため、例えばリン酸塩または炭酸塩バッファー系)、担体タンパク質、例えばアルブミン、基本培地および/もしくは培地補充物を含む培地、血清もしくは血漿、栄養素、炭水化物源、保存剤、安定化剤、抗酸化剤または当業者に公知のその他の物質を含み得る。本明細書で教示する組み合わせの各成分を、上記のような１つ以上の追加の成分と混和することにより上記の組成物を生成する方法も開示される。組成物は、例えば液体であってもよいか、または半固体もしくは固体であってもよい(例えば凍結組成物であってもよいか、またはゲルとして存在してもよいか、または固体支持体もしくは足場などの上に存在してもよい)。凍結保存剤、例えばなかでもDMSOは、当該技術において公知である。

他の場所で述べたように、本明細書で教示する医薬組成物は、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤を含む。
用語「医薬的に許容できる」は、本明細書で用いる場合、当該技術と一致して、医薬組成物の他の成分と適合し、医薬組成物のレシピエントにとって有害でないことを意味する。

本明細書で用いる場合、「担体」または「賦形剤」は、任意のおよび全ての溶剤、希釈剤、バッファー(例えば中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水)、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート化剤(例えばEDTAまたはグルタチオン)、アミノ酸(例えばグリシン)、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香料、芳香付与剤(aromatisers)、増粘剤、デポー効果を達成するための物質、コーティング、抗真菌剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、等張性調節剤、吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質にこのような媒体および物質を用いることは、当該技術において公知である。このような材料は、非毒性であり、細胞の活性に干渉しない。

担体または賦形剤またはその他の材料の精密な性質は、投与の経路に依存する。例えば、組成物は、パイロジェンフリーであり、適切なpH、等張性および安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形であってよい。医薬製剤における一般的な原理について、読者は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. MorstynおよびW. Sheridan編, Cambridge University Press, 1996;ならびにHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. ListerおよびP. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。

液体医薬組成物は、液体担体、例えば水または医薬的に許容できる水溶液を一般的に含むことができる。例えば、生理食塩水、組織もしくは細胞培養培地、ブドウ糖もしくはその他の糖溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含めてよい。
組成物は、１つ以上の細胞保護分子、細胞再生分子、増殖因子、抗アポトーシス因子または細胞における遺伝子発現を調節する因子を含んでよい。このような物質は、細胞がその環境から独立することを可能にする。

このような医薬組成物は、その中の細胞の生存性を確実にする成分をさらに含有できる。例えば、組成物は、所望のpH、より一般的には中性付近のpHを達成するために適切なバッファー系(例えばリン酸塩または炭酸塩バッファー系)を含むことができ、浸透圧ストレスを防ぐために細胞の等張条件を確実にするための十分な塩を含むことができる。例えば、これらの目的のために適切な溶液は、当該技術において知られるように、リン酸緩衝食塩水(PBS)、塩化ナトリウム溶液、リンゲル注射液または乳酸加リンゲル注射液であってよい。さらに、組成物は、担体タンパク質、例えばアルブミン(例えばウシまたはヒトアルブミン)を含むことができ、これは、細胞の生存性を増加できる。

さらに適切な医薬的に許容できる担体または添加剤は、当業者に公知であり、例えば、タンパク質、例えばコラーゲンまたはゼラチン、炭水化物、例えばデンプン、多糖類、糖類(ブドウ糖、グルコースおよびスクロース)、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムもしくはカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルファ化デンプン、ペクチン寒天、カラギーナン、クレイ、親水性ガム(アカシアガム、グアーガム、アラビアガムおよびキサンタンガム)、アルギン酸、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、デキストラン、ペクチン、合成ポリマー、例えば水溶性アクリルポリマーもしくはポリビニルピロリドン、プロテオグリカン、リン酸カルシウムなどから選択できる。

所望により、細胞調製物は、支持体、足場、マトリクスまたは組織再生を改善できる材料上で投与できる。例えば、材料は、粒状セラミック、またはバイオポリマー、例えばゼラチン、コラーゲンもしくはフィブリノゲンであり得る。多孔性マトリクスは、標準的な技術に従って合成できる(例えばMikosら, Biomaterials 14: 323, 1993; Mikosら, Polymer 35:1068, 1994; Cookら, J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997)。このような支持体、足場、マトリクスまたは材料は、生分解性または非生分解性であってよい。よって、細胞は、適切な基材、例えば多孔性または非多孔性基材上に移してかつ/またはその上で培養して、インプラントを提供できる。例えば、増殖した細胞、または培養皿において分化した細胞を、３次元固体支持体上に移して、必要であれば固体支持体を本発明の液体栄養培地中でインキュベートすることにより、それらを複製し、かつ/または分化プロセスを継続させることができる。例えば細胞を含有する液体懸濁物に３次元固体支持体を含浸することにより、上記の細胞を上記の支持体上に移すことができる。このようにして得られた含浸支持体は、ヒト対象者に移植できる。このような含浸支持体は、それらを液体培地中に浸漬することにより再培養した後に、最終的に移植することもできる。３次元固体支持体は、ヒトに移植できるように生体適合性である必要がある。これは、生分解性または非生分解性であってよい。

細胞または細胞集団は、所望の細胞型、例えば肝細胞に向かう細胞の生存、成長、増殖および/または分化を許容する様式で投与できる。細胞または細胞集団は、意図する臓器、例えば肝臓に植え接ぐことができるか、またはその中に遊走および生着できる。他の場所、組織または臓器、例えば肝臓、脾臓、膵臓、腎臓被膜、腹膜または網(omentum)における細胞または細胞集団の生着が構想できる。

ある実施形態において、上記で規定する医薬的細胞調製物は、液体組成物の形で投与できる。実施形態において、細胞またはそれを含む医薬組成物は、全身、局所、臓器内または臓器機能障害もしくは病変の部位にて投与できる。
好ましくは、医薬組成物は、治療有効量の所望の細胞を含むことができる。用語「治療有効量」は、研究者、獣医、医師またはその他の臨床家が調べようとする組織、系、動物またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘出でき、特に、処置される疾患もしくは状態の局所もしくは全身的症状または特徴の１つ以上を防止または緩和できる量のことをいう。

本発明の組み合わせ、医薬組成物およびその他の関連する態様は、本明細書に記載されている細胞、例えば特に凝固促進性細胞の移植のため、さらにより具体的には対象者における上記の細胞の移植から利益を受けることができる疾患または状態の処置のために特に有用である。
注釈を付ける場合以外は、「対象者」または「患者」は、交換可能に用いられ、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類のことをいい、具体的に、ヒト患者および非ヒト哺乳類を含む。したがって、「対象者」または「患者」は、本明細書で用いる場合、本明細書で教示する組み合わせまたは組成物を投与できる任意の動物、哺乳動物もしくはヒト患者または対象者を意味する。好ましい患者は、ヒト対象者である。

本明細書で用いる場合、「処置する」または「処置」は、治療的処置および予防的または防止的施策の両方のことをいい、ここで、その目的は、望ましくない生理的変化または障害を妨げるかまたは遅延させる(少なくする)ことである。有利なまたは所望の臨床結果は、それらに限定されないが、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化(すなわち悪化しない)、疾患増悪および合併症の出現の遅滞または遅延、疾患状態の改善または軽減を含む。「処置」は、処置を受けなかった場合に期待される生存と比較した生存の延長も意味できる。

本明細書で用いる場合、「処置を必要とする対象者」のような句は、所定の状態、好ましくは上記の状態または疾患の処置から利益を受けると考えられる対象者、例えば哺乳動物またはヒト対象者を含む。このような対象者は、典型的に、限定することなく、状態を診断された対象者、上記の状態を有しやすいかもしくは発生しやすい対象者、および/または状態を妨げようとする対象者を含む。

本明細書に記載されている組み合わせおよび医薬組成物は、単独で、またはそれぞれの障害についての任意の既知の治療もしくは活性化合物と組み合わせて用いることができる。投与は、同時または任意の順序で逐次的であってよい。
細胞が異種(すなわち自家でない)供給源に由来するならば、例えば免疫抑制剤、例えばシクロスポリンまたはタクロリムス(FK506)を用いる併用免疫抑制治療を典型的に行ってよい。

例えばそして限定することなく、本明細書で意図する組み合わせまたは医薬組成物が肝臓細胞、例えば肝臓前駆または幹細胞(例えばADHLSC細胞)または肝細胞を含有する場合、これらは、それらに限定されないが、なかでも、肝機能障害もしくは肝不全、肝炎および代謝の先天性障害を含む肝臓関連疾患の処置のために用いることができる。
肝臓の先天性代謝性機能障害の網羅的でない例は、フェニルケトン尿症およびその他のアミノ酸代謝異常症、血友病およびその他の凝固因子機能障害、家族性高コレステロール血症およびその他の脂質代謝障害、尿素サイクル障害、糖原病、ガラクトース血症、フラクトース血症、チロシン血症、タンパク質および炭水化物代謝機能障害、有機酸尿症、ミトコンドリア病、ペルオキシソームおよびリソソーム病、タンパク質合成異常、肝臓細胞トランスポーターの欠陥、グリコシル化の欠陥などを含む。

さらなる肝臓関連疾患または状態は、限定することなく、後天性進行性肝臓変性疾患、劇症肝不全および急性または慢性肝不全、ヒト肝臓指向性ウイルス感染(HBV、HAV、HCV、HEV、HDVなど)を含む。
肝臓量(mass)および/または機能の損失により代表され、本明細書に記載されている肝臓細胞を含む組み合わせまたは医薬組成物から利益を受けることができるその他の疾患状態または機能障害は、それらに限定されないが、アラジール症候群、アルコール性肝疾患(アルコール誘導性肝硬変)、a1-アンチトリプシン欠損症(全ての表現型)、高脂血症およびその他の脂質代謝障害、自己免疫性肝炎、バッド-キアリ症候群、胆道閉鎖症、Ｉ、IIおよびIII型進行性家族性胆汁うっ滞、肝臓のがん、カロリ病、クリグラー-ナジャー症候群、フラクトース血症、ガラクトース血症、炭水化物欠損グリコシル化欠陥、その他の炭水化物代謝障害、レフサム病およびその他のペルオキシソーム病、ニーマンピック病、ウォルマン病およびその他のリソソーム病、チロシン血症、トリプルＨおよびその他のアミノ酸代謝性障害、デュビン-ジョンソン症候群、脂肪肝(非アルコール性脂肪性肝炎)、ギルバート症候群、糖原貯蔵症ＩおよびIII、ヘモクロマトーシス、Ａ〜Ｇ型肝炎、ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、チロシン血症、凝固因子欠損、血友病Ｂ、フェニルケトン尿症、ウィルソン病、劇症肝不全、肝切除後の肝不全、ミトコンドリア呼吸鎖疾患を含む。

例えばそして限定することなく、組み合わせまたは医薬組成物、特に肝臓細胞を含むものは、注射(カテーテル投与も包含する)または移植、例えば局所注射、全身注射、脾臓内注射(Guptaら, Seminars in Liver Disease 12: 321, 1992も参照されたい)、門脈への注射、肝髄、例えば肝臓被膜下への注射、非経口投与または胚もしくは胎仔への子宮内注射により有利に投与できる。例えば、本明細書に記載されている肝臓細胞または肝臓由来細胞を含む組み合わせまたは医薬組成物は、肝臓細胞移植(LCT)による組織工学および細胞療法のために用いることができる。肝臓細胞移植および肝臓幹細胞移植(LSCT)は、肝臓へのアクセスと細胞の生着を導く任意の方法による、好ましくは門脈を介するが、直接の肝注射であってもよいか、または脾臓内注射による成熟肝細胞または肝臓前駆細胞の注入の技術のことをいう。別の例において、本明細書に記載されている間葉系幹細胞を含む組み合わせまたは医薬組成物は、任意の実質臓器修復(脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、腸、膀胱、胆嚢)のため、免疫障害を制御するため、クローン病およびその他の自己免疫疾患を制御するため、移植片対宿主疾患を制御するため、移植後の臓器拒絶を制御するために用いることができる。別の例において、本明細書に記載されている皮膚線維芽細胞を含む組み合わせまたは医薬組成物は、皮膚修復または骨基質形成のために用いることができる。さらなる例において、本明細書に記載されている肝臓筋線維芽細胞を含む組み合わせまたは医薬組成物は、結合組織疾患からの損傷を処置もしくは修復するため、またはその他の細胞と組み合わせて足場を創出するために用いることができる。

自家単核骨髄細胞についての現在のヒトでの研究において、１〜４×10⁷細胞の範囲の経験的な用量を用いて見込みのある結果が得られている。しかし、投与細胞の量の最適化のために異なるシナリオが要求されることがある。つまり、投与される細胞の量は、処置される対象者により変動する。好ましい実施形態において、10²〜10¹⁰または10²〜10⁹、または10³〜10¹⁰、または10³〜10⁹、または10⁴〜10¹⁰、または10⁴〜10⁹、例えば10⁴〜10⁸、または10⁵〜10⁷、例えば１×10⁵、約５×10⁵、約１×10⁶、約５×10⁶、約１×10⁷、約５×10⁷、約１×10⁸、約５×10⁸、約１×10⁹、約２×10⁹、約３×10⁹、約４×10⁹、約５×10⁹、約６×10⁹、約７×10⁹、約８×10⁹、約９×10⁹または約１×10¹⁰細胞をヒト対象者に投与できる。さらなる実施形態において、体重１kgあたり10⁶〜10⁸細胞、または体重１kgあたり１×10⁷〜９×10⁷細胞、例えば体重１kgあたり約１×10⁷、約２×10⁷、約３×10⁷、約４×10⁷、約５×10⁷、約６×10⁷、約７×10⁷、約８×10⁷、約９×10⁷または約１×10⁸細胞をヒト対象者に投与できる。例えば、このような数の細胞または体重１kgあたりこのような数の細胞は、特に、対象者に投与される細胞の総数のことをいうことができ、その投与は、１日以上にわたって(例えば１、２、３、４または５日以上にわたって)投与される１回以上の用量に適切に分配できる(例えば２、３、４、５、６、７、８、９または10回以上の用量に分配される)。しかし、治療有効用量の精密な決定は、患者のサイズ、年齢、組織損傷のサイズ、損傷が生じてからの時間を含む各患者に個別の因子に基づくことがあり、本開示および当該技術における知識から当業者が容易に確かめることができる。

適切には、投与される組成物において、細胞は、約10⁴/ml〜約10⁸/ml、好ましくは約10⁵/ml〜約10⁷/ml、さらにより好ましくは約１×10⁶/ml〜約１×10⁷/ml、例えば約５×10⁶/mlの濃度で存在できる。
上記で規定する１つ以上のその他の医薬的または生物学的活性成分と場合によって組み合わせて用いる、本明細書で開示する活性物質(例えばアンチトロンビン活性化物質、トロンビン阻害物質)の投与量または量は、個別の症例に依存し、慣用であるように、個別の状況に適合させて、最適効果を達成する。つまり、これは、処置される障害の性質および重症度、ならびに処置されるヒトもしくは動物の性別、年齢、体重、食餌、全身の健康、個別の応答性、用いる化合物の効力、代謝安定性および作用期間、投与の形態および時間、排泄速度、治療が急性もしくは慢性もしくは予防的であるかどうか、または他の医薬的もしくは生物学的活性成分を投与するかどうか、または本発明の活性物質に加えて用いられるその他の治療に依存する。

限定することなく、典型的な単回投与量は、上記の因子に依存して、約１μg/kg〜約250 mg/kg体重以上、好ましくは約１μg/kg〜約100 mg/kg体重、より好ましくは約0.01 mg/kg〜約50 mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.01 mg/kg〜約10 mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.05 mg/kg〜約10 mg/kg体重、または約0.05 mg/kg〜約1 mg/kg体重の範囲であり得る。
数日以上にわたる反復投与のために、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続する。薬剤の好ましい投与量は、約0.05 mg/kg〜約10 mg/kgの範囲であり得る。つまり、約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kgまたは10 mg/kg (またはその任意の組み合わせ)の１回以上の用量を患者に投与できる。このような用量は、単回１日用量、１回以上に分けた１日用量、または例えば点滴を用いて本質的に継続して、または例えば毎週もしくは３週間ごとに間欠的に投与してよい。

実施形態において、アンチトロンビン活性化物質、特に未分画ヘパリンは、典型的に約５〜15 UI/ml、より典型的に約８〜12 UI/ml、さらにより典型的に約10 UI/mlを含む細胞懸濁物により対象者に投与してよい。アンチトロンビン活性化物質、特に未分画ヘパリンの静脈内投与が示される場合、典型的な用量は、約10〜30 UI/kg/hr、より典型的に約15〜25 UI/kg/hr、さらにより典型的に約20 UI/kg/hrであってよい。当然のことながら、用量は、凝固試験に従って適合できる。

好ましくは、トロンビン阻害物質は、対象者に、約0.05〜約５mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜約３mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.2〜約２mg/kg体重で、より好ましくはビバリルジンについて約0.50〜約3.00 mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.50〜約２mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.75〜約1.75 mg/kg体重、またはこれもまた好ましくは約1.75〜約3.00 mg/kg体重もしくはより好ましくは約2.25〜約2.75 mg/kg体重、例えば約2.50 mg/kg体重で、より好ましくはヒルジンについて約0.2〜約0.6 mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.3〜約0.5 mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.4 mg/kg体重で投与できる。

本発明を、以下の実施例によりここで説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲をいずれの様式によっても限定しない。
実施例１：材料および方法
細胞調製物
成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(ALDSC、ADHLSC)は、以前に記載されたようにして健常肝臓ドナーから得た(NajimiらCell Transplant., 2007, 第16巻: 717〜28)。細胞を、ヘパリンを10 U/mlの濃度(明記する場合はそれ以上)で含有するかまたはしないアルブミン溶液に懸濁した。対照として、凍結保存/融解ヒト肝細胞を用いた。肝臓単離および肝細胞凍結保存/融解手順は、以前に詳細に発表された(SokalらTransplantation, 2003, 第76巻, 735〜738)。ヒト線維芽細胞は、皮膚生検(前腕の前中央側)により、８歳〜35歳のボランティアから、書面でのインフォームドコンセントの後に、以前に記載されたようにして回収した(LysyらHepatology, 2007, 第46巻, 1574〜1585)。骨髄試料は、８〜67歳の死後ドナーの椎骨または腸骨稜の吸引により回収した。吸引液は、10%ハンクス平衡塩類溶液(Invitrogen, Merelbeke, Belgium)を含有するヘパリン添加シリンジに回収し、以前に記載されたプロトコールに従って48時間以内に処理した(LysyらCell Prolif., 2008, 第41巻, 36〜58)。

成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞懸濁物の組織因子発現
古典的な膜結合形TFとTFPIとの存在を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により分析した。メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を、0.5×10⁶細胞から、製造者の使用説明に従ってTripure単離試薬キット(Roche Applied Science, Brussels, Belgium)を用いて抽出した。１ステップRT-PCRを、サーモサイクラー装置(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)上で、Invitrogenで合成したプライマーを用いて行った。TFまたはグリセルアルデヒド３-リン酸脱水素酵素(GAPDH)についてのRT-PCRは、表２に詳述するプライマーを用いて行った。

生成物を、１%アガロースゲル上の電気泳動により分離し、紫外線ランプの下で臭化エチジウムを用いて視覚化した。
TF、as-TF、TFPIおよびシクロフィリンＡについてのリアルタイムRT-PCRも、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems, California, USA)上で、表３に列挙するTaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイを用いて行った。TF発現のために、２つのアッセイ、すなわち膜形および可溶形(選択的スプライシング、asTF)の両方に存在する領域を増幅するもの(TF共通)と、膜形(古典的)のみに存在する領域を増幅する他方のもの(TF膜)とを用いた。パラメータCtは、各cDNA試料およびプライマー対について導き、シクロフィリンＡのCtを減じてΔCtを得た。次いで、ΔΔCtを、校正物質遺伝子Ctを減じることにより得て、結果を、mRNA量の倍数変化として表した(図９)。asTF発現は、TF共通とTF膜との間のΔΔCtの差として算出した。次いで、プライマー(Applied Biosystemsから得た)は、表３に詳述するとおりであった。

成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞懸濁物の凝固促進活性
測定は、ROTEM(登録商標)デルタ分析器(Pentapharm, Munich, Germany)で行った。ROTEMは、血餅形成および血餅溶解の動態および特質を、リアルタイムで評価する。凝固時間(CT)は、分析の開始から、血餅形成の開始まで、通常、２mmの振幅に達するまでの時間と定義される。血餅形成時間は、20 mmの振幅に達するまでの期間と定義される。アルファ角は、中心線と、CTの終点である２mm振幅点を通る曲線の接線との間の角度と定義される。曲線の最大振幅は、最大血餅固さと定義される。最大溶解は、測定中に検出される最大線維素溶解を表す。

簡単に述べると、短い休止期間の後に、300μlの全血を、37℃に予め温めたカップにピペットを用いて入れた。懸濁細胞を、その後、全血に加えた(特に明記しない場合は５×10⁵細胞)。Owrenバッファー(Siemens, Marburg, Germany)で希釈した組織因子(イノビン、Siemens, Marburg, Germany。最終希釈１:17000/0.35 pM)を含有する20μlのトリガー試薬を明記する場合は細胞-血液混合物に次いで加え、その後、20μlの0.2 M CaCl₂を加えることが必要であった。カルシウムを加えた後に、測定を自動的に開始した。血漿アッセイのために、細胞(明記しない場合は５×10⁵細胞)を、3.8 mlのクエン酸塩添加血液中で37℃にて30分間インキュベートした。インキュベーションの後に、全血を4500 rpmにて10分間遠心分離した。300μlの得られた血漿は、次いで、カップへのピペット操作による添加とその後の組織因子およびCaCl₂の添加の有無のプロトコールのための準備ができたことになる。

統計
統計的有意差(*ｐ<0.05、**ｐ<0.01、***ｐ<0.001)は、Mann-Whitney検定により評価した。Kruskal-Wallis検定は、１元ANOVA分析のために用いた。

実施例２：成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞の凝固促進活性
成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(ALDSC、ADHLSC)の凝固促進活性は、トロンボエラストメトリーにより証明した。この凝固促進活性は、トロンボエラストグラフ試験における凝固時間により評価される成熟肝細胞のものよりも重要である(図１)。さらに、そして肝細胞凝固促進活性とは逆に、ALDSC凝固促進活性は、単独で用いた未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン(データは示さず)、抗ビタミンＫ薬(データは示さず)またはアンチトロンビン薬(ヒルジン、ビバリルジン)により完全には阻害されないことが示される(図２〜３)。我々は、未分画ヘパリンとヒルジンまたはビバリルジンとの併用が、成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞の凝固促進活性を変調することを可能にする元来の特異的で相乗的な組み合わせであることを見出した(図４〜５)。我々は、線維芽細胞、骨髄間葉系幹細胞の凝固促進活性も証明したが、骨髄造血幹細胞については証明しなかった(図６〜７)。同様の実験を用いて、未分画ヘパリンとヒルジンまたはビバリルジンとの併用が、線維芽細胞および骨髄間葉系幹細胞の凝固促進活性を変調することも示された。

実施例３：成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞はTFを発現する
TFおよびその天然阻害物質であるTFPIのmRNAレベルでの発現を、RT-PCRを用いてアッセイした(図８)。TF mRNAの膜形および選択的スプライシングバリアント(as-TF)はともに、成体由来ヒト肝臓間葉系幹細胞(ALDSC)において発現された。さらなる実験において、リアルタイムRT-PCRを用いてTF、as-TF、TFPI mRNAレベルを図９に示すようにして定量した。

実施例４：細胞移植
ALDSCを、５×10⁶細胞/mlの濃度で、重炭酸塩(0.84 g/l)、グルコース(2.5 g/l)および未分画ヘパリン(10 UI/ml)を含有するハイブミン(Hibumin) (５%)の溶液に懸濁する。ALDSC懸濁物を、対象者に非経口的に注入する。細胞注入中に、対象者は、ビバリルジン(1.75 mg/kg)を受ける。逐次的細胞注入の合間に、対象者は、ビバリルジン(0.25 mg/kg)を、トロンボエラストメトリー試験に依存して、２〜４時間にわたって受ける。

細胞移植の際のアンチトロンビン活性化物質(例えばヘパリン)とトロンビン阻害物質(例えばビバリルジン)との併用投与が、細胞移植効率および細胞生着能を改善することが明らかである。細胞移植の際のアンチトロンビン活性化物質とトロンビン阻害物質との併用投与は、細胞の凝固促進活性を低減し、細胞移植関連血栓症および細胞移植関連合併症、例えば細胞損失、細胞拒絶および炎症を妨げる。

実施例５：ビバリルジンとヘパリンとの組み合わせは、ヒト肝臓前駆細胞が誘導する血栓症の危険性を妨げる
方法
ヒト試料についての全ての実験、およびヒトの適応外の抗凝固剤プロトコールの使用、およびインフォームドコンセントを含むプロトコールは、施設の倫理評論委員会により承認された。

細胞調製物
hALPC細胞は、健常肝臓ドナー(ｎ=６、９〜44歳)から、以前に記載されたようにして得た(Najimiら, Cell Transplant. 2007;16:717〜728)。細胞は、新しくトリプシン処理したか、または４〜６継代にて凍結保存/融解した後に研究した。細胞を、ヘパリンを10 U/mlの濃度(明記する場合はそれ以上)で含有するかまたはしないアルブミン溶液に懸濁した。対照として、凍結保存/融解ヒト肝細胞(ｎ=５、16〜44歳)も用いた。肝臓単離および肝細胞凍結保存/融解手順は、以前に詳述されたとおりであった(Sokalら, Transplantation. 2003;76:735〜738)。

骨髄試料は、８〜67歳の３名の死後臓器ドナーの椎骨または腸骨稜の吸引により回収した。吸引液は、10%ハンクス平衡塩類溶液(Invitrogen, Merelbeke, Belgium)を含有するヘパリン添加シリンジに回収し、以前に記載されたプロトコールに従って48時間以内に処理した(LysyらCell Prolif., 2008, 第41巻, 36〜58)。
ヒト線維芽細胞は、皮膚生検(前腕の前中央側)により、18歳〜35歳のボランティア(ｎ=３)から、書面でのインフォームドコンセントの後に、以前に記載されたようにして回収した(Lysyら, Hepatology. 2007;46:1574〜1585)。

ヒト肝臓非実質細胞は、我々の組織バンクにおいて行った肝臓単離、３名の異なるドナー(１つの新生児肝臓および２名の12歳ドナー)からの細胞懸濁物のろ過および２種類の速度の遠心分離の後に得た。次に、ヒト星状細胞を、確立されたプロトコールに従うNicodenz (Myegaard, Oslo, Norway)勾配遠心分離により単離した(Guimaraesら, J Hepatol. 2010;52(3):389〜397)。活性化筋線維芽細胞は、単離星状細胞から得た。

血液
血液は、29〜40歳(ｎ=５)の男性ドナーから得た。

hALPC懸濁物の凝固促進活性
測定は、ROTEM(登録商標)デルタ分析器(Pentapharm, Munich, Germany)で行った。ROTEMは、血餅形成および血餅溶解の動態および特質を、リアルタイムで評価する。凝固時間(CT)は、分析の開始から、血餅形成の開始まで、通常、２mmの振幅に達するまでの時間と定義される。血餅形成時間は、20 mmの振幅に達するまでの期間と定義される。アルファ角は、中心線と、CTの終点である２mm振幅点を通る曲線の接線との間の角度と定義される。曲線の最大振幅は、最大血餅固さと定義される。最大溶解は、測定中に検出される最大線維素溶解を表す。我々は、CTに焦点を当てた。

簡単に述べると、短い休止期間の後に、300μlの全血を、37℃に予め温めたカップにピペットを用いて入れた。懸濁細胞を、その後、全血に加えた(特に明記しない場合は５×10exp5細胞)。Owrenバッファー(Siemens, Marburg, Germany)で希釈した組織因子(TF) (イノビン、Siemens, Marburg, Germany。最終希釈１:17000/0.35 pM)を含有する20μlのトリガー試薬を細胞-血液混合物に次いで加え、その後、20μlの0.2 M CaCl₂を加えることが必要であった。カルシウムを加えた後に、測定を自動的に開始した。細胞の凝固促進活性(PCA)は、イノビンを加えない場合にも決定した。この凝固モデルにおけるTFの役割を確実にするために、細胞を室温にて10分間、0.2 mg/mL mAb 抗ヒトTF IgG1 (American Diagnostica)または0.2 mg/mL mAbマウスIgG1 (クローン11711.11; RnD Systems, Abingdon, United Kingdom)のいずれかとプレインキュベートした後に、アルブミン５%で十分に洗浄し、トロンボエラストメトリーアッセイを行った。

血漿アッセイのために、細胞(明記しない場合は５×10exp5細胞)を、3.8 mlのクエン酸塩添加血液中で37℃にて30分間インキュベートした。インキュベーションの後に、全血を4500 rpmにて10分間遠心分離した。300μlの得られた血漿は、次いで、カップへのピペット操作による添加とその後のイノビンおよびCaCl₂の添加の有無のプロトコールのための準備ができたことになる。
血漿欠乏アッセイのために、懸濁細胞(明記しない場合は５×10exp5細胞)を、300μlの血漿に加えた後に、イノビンおよびCaCl2を加えた。

PCAアッセイの変調のために、細胞を、10UI/mlの濃度の未分画ヘパリン(ヘパリンLeo(登録商標), Leo)を含むかまたは含まないアルブミン５%に懸濁した。出版物(Guimaraesら, J Hepatol. 2010;52(3):389〜397)に従って1UI/mlの濃度のエノキサパリン(Clexane(登録商標), Aventis Pharma)、0.34 mg/lの濃度(成人体重について臨床用量外挿2.5 mg、および出版物(Fengら, Clin Ther. 2009;31:1559〜1567)から)のフォンダパリヌクス (Arixtra(登録商標), GSK)、5.7μg/mlの濃度(臨床用量外挿0.4 mg/kg)のヒルジン(Refludan(登録商標), Celgene Europe Limited)、10.7μg/mlの濃度(臨床用量外挿0.75 mg/kg)のビバリルジン(Angiox(登録商標), The Medicines Company)を、次いで、血液または血漿に加えた。用量外挿は、体重による循環血液容量(70 ml/kg)に基づいた。
1800秒後に凝固が観察されないならば、トロンボエラストメトリーを任意に停止した。

配管ループ
全血実験プロトコールは、以前に記載されたモデルから適合させた(Johanssonら, Diabetes. 2005;54:1755〜1762)。ポリ塩化ビニル配管(内径6.3 mm、長さ390 mm)で作製され、Corline ヘパリン表面で処理されたループを、Corline (Uppsala, Sweden)から購入した。ループに、リン酸緩衝食塩水に懸濁した細胞試料(５×10exp5)を補ったあとに、血液を加えた。健常ボランティアからの５mLの非抗凝固血液を、次いで、各ループに加えた。約45 mL/分の血流を生じさせるために、ループデバイスを、37℃のインキュベータ中の振とう器上に置いた。開始前および開始の30分後に、血液試料を、エチレンジアミン４酢酸(最終濃度4.1 mmol/L)およびクエン酸塩(最終濃度12.9 mmol/L)試験管に回収した。血小板を、XE-2100オートメート(Sysmex, Japan)で計数し、Ｄダイマーを、免疫比濁アッセイ(Innovance Ｄダイマー, Siemens, Marburg, Germany)により、CA-7000 (Sysmex, Japan)で評価した。

抗Xa活性測定
抗Xa活性測定は、CA7000 (Siemens, Marburg, Germany)に適合するBiophen ヘパリン(LRT)キットを用いて行った。簡単に述べると、アッセイは、内因性アンチトロンビンの存在下での、試験されるヘパリン(またはその他の抗Xa物質)による一定量の第Xa因子の阻害と、過剰の第Xa因子による第Xa因子特異的発色基質の加水分解に基づく発色動態法である。ヘパリン(10 UI/ml、50 UI/mlおよび100 UI/ml)を補ったかまたは補っていないアルブミンに懸濁した細胞の血液中での30分間のインキュベーションの後に、抗Xa活性を、血液遠心分離の後に得られた血漿において測定した。

hALPC懸濁物のTFおよびTFPI発現
免疫蛍光研究を行って、TFの存在を評価した。このために、ヒト成体肝臓由来幹細胞を、カバーガラス上に置き、パラホルムアルデヒド４%(Merck, Darmstadt, Germany)で20分間固定した。次いで、これらの細胞を、Trisベースナトリウムバッファー(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4および150 mmol/L NaCl) (Organics [VWR], Leuven, Belgium)中のTriton X-100 (Sigma, Bornem, Belgium)１%と15分間、次いでTrisベースナトリウムバッファー中のミルク３%と１時間インキュベートした。１次抗体であるマウスIgG1モノクローナル抗体(mAb)抗TF (免疫グロブリン[Ig]G1 n4508; American Diagnostica, Andresy, France)をTrisベースナトリウム中で希釈(1/50)し、細胞と１時間インキュベートした。用いた２次抗体は、フルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート抗マウスIgG (Sigma)であった。核を、4-,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; Sigma)染色により明示した。陰性実験対照を行った(１次または２次抗体の非存在下)。TFの存在は、フローサイトメトリー分析によっても確認した。膜結合形のTFを検出するために、細胞を、0.5%ウシ血清アルブミンを補ったリン酸緩衝食塩水(FACSバッファー)で洗浄し、４℃にて20分間、10%補体除去プールヒト血清を含有するFACSバッファーで希釈した、TFに対するフルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートIgG1 mAb no.4508CJ (American Diagnostica)または対応するアイソタイプ一致対照mAb (BD Biosciences, Erembogedem, Belgium)とインキュベートした。サイトソル形のTFを検出するために、細胞を、Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences)と室温にて20分間インキュベートし、Permwash (BD Biosciences)で洗浄した。試料を、次いで、室温にて20分間、permwashで希釈したFITCコンジュゲート抗TF mAbまたは対応するアイソタイプ一致対照mAb (BD Biosciences)とインキュベートした。細胞蛍光は、BD FACS CANTO IIフローサイトメータを用いて測定し、BD FACS Divaソフトウェアを用いて分析した。
免疫細胞化学またはフローサイトメトリー分析により組織因子経路阻害物質(TFPI)発現を評価するために、抗TFPI抗体は得られなかった。

２つの形のTFおよびTFPIの存在を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により分析した。メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を、0.5×10exp6細胞から、製造者の使用説明に従ってTripure単離試薬キット(Roche Applied Science, Brussels, Belgium)を用いて抽出した。１ステップRT-PCRを、サーモサイクラー装置(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)上で、Invitrogenで合成したプライマーを用いて行った。TFまたはグリセルアルデヒド３-リン酸脱水素酵素(GAPDH)についてのRT-PCRは、表２に詳述するプライマーを用いて行った。
生成物を、１%アガロースゲル上の電気泳動により分離し、紫外線ランプの下で臭化エチジウムを用いて視覚化した。

TF、as-TF、TFPIおよびシクロフィリンＡについてのリアルタイムRT-PCRも、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems, California, USA)上で、表Ｂに列挙するTaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイを用いて行った。TF発現のために、２つのアッセイ、すなわち膜形および可溶形(選択的スプライシング、asTF)の両方に存在する領域を増幅するもの(TF共通)と、膜形(古典的)のみに存在する領域を増幅する他方のもの(TF膜)とを用いた。パラメータCtは、各cDNA試料およびプライマー対について導き、シクロフィリンＡのCtを減じてΔCtを得た。次いで、ΔΔCtを、校正物質遺伝子Ctを減じることにより得て、結果を、mRNA量の倍数変化として表した。asTF発現は、TF共通とTF膜との間のΔΔCtの差として算出した。プライマーは、表３に詳述するとおりであった。
CAPAN株化細胞をTF陽性対照として用い、HUVEC 株化細胞をTFPI陽性対照として用いた。

患者への注入および抗凝固プロトコール
重度のOTC欠損症(<１%活性)に罹患している３歳女児が、第１のhALPCレシピエントであった。診断は、生後12日目に確立され、OTC遺伝子の父性対立遺伝子上のエキソン６および８のデノボ変異を示すDNA分析により確認された。

彼女は、男性ドナーから、２週間の間隔で、体重１kgあたり３千万のhALPCの２回の別々の注入を受けた。合計で、患者は、９億の前駆細胞を受けた。細胞は、アルブミン５%およびヘパリン(10 UI/ml)中に懸濁した。
１回目のhALPC注入は、いずれの前投薬もなしで全身麻酔の下で行った。経皮カテーテルを、主門脈の分枝に、１回用量のセファゾリン(40 mg/kg)の注射後に蛍光透視および超音波の手引きの下で配置した。細胞注入は、50 mlシリンジを用いて、100 cc/hの流速で行った。免疫抑制を、患者に、タクロリムス(Prograft(登録商標), Astellas Pharma)単剤療法(0.1 mg/kg)を用いて行った(２回の分かれた用量で６〜７ng/mlのトラフレベルに達するような１日あたり２mgに相当)。セファゾリン(40 mg/kg)を注入後に２回、その２回の用量の間に８時間の間隔をおいて用いる予防的抗生物質療法を行った。注入および注入後の経過は、目立たないものであり、小児は、注入後３日目で退院した。

２回目のhALPC注入は、２週間後に行った。このときは、肝内門脈の分枝の部分的血栓症が生じ、注入の停止を導いた。この有害事象は、ヘパリンおよびクマリン系(coumarinic)抗凝固剤により処置した(５mg/日)。
Ｄダイマーレベルは、両方の細胞注入経過の後に著しく上昇した。この有害事象は、患者に影響しなかったが、前駆細胞の凝固促進性効果をさらに調べることを正当化した。

第２の患者は、フェノバルビタールに応答しないＩ/II中間型クリグラー-ナジャー症候群の24歳男性であった。診断は、生後１ヶ月で確立され、ホモ接合性状態のL443P変異が存在するUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ1A1遺伝子上の変異を示すDNA分析により確認された。患者は、合計で22億のhALPCを２日間にわたる７回の注入で受けた。門脈へのカテーテル配置の前に、患者は、セファゾリン(１gr)を含む前投薬を受けた。カテーテルは、超音波制御の下に門脈系に配置した。ソルメドロール(80 mg)を注入前に注射した。免疫抑制処置は、６〜８ng/mlの血液レベルを目標にするタクロリムス(Prograft(登録商標), Astellas Pharma)で構成された。具体的な凝固予防が処方された。細胞を、アルブミン５%および10 UI/mlの濃度のヘパリンに懸濁した。細胞注入中に、対象者は、ビバリルジン(1.75 mg/kg)を受けた。逐次的細胞注入の合間に、対象者は、トロンボエラストメトリー試験に応じて、２〜４時間にわたってビバリルジン(0.25 mg/kg)を受けた。トロンボエラストメトリー(CT)、血小板計数(正常値:150〜350 10exp3/μl)およびＤダイマーレベル(正常値: <500 ng/ml)、トロンビン時間(TT、正常値: 15〜24秒)、プロトロンビン時間(PT、正常値:９〜14秒)および部分トロンボプラスチン時間(PTT、正常値:20〜33秒)を含む凝固試験を、それぞれ、各注入の前、開始の20分後および最後に行った。肝臓超音波ドップラーを各注入の後に行って、門脈血流にアクセスした。

第３の患者は、遺伝子分析(G188R変異および380insC挿入)および肝臓生検でのグルコース-６ホスファターゼの不在が記録された1a型糖原病に罹患している17歳のティーンエージャーであった。彼も、門脈カテーテル配置前に抗生物質予防と、注入前にステロイドとを受けた。同じ免疫抑制計画を用いた。患者は、低血糖の再発を制御することを目的として、３日間にわたる７回の注入で投与された合計で30億の前駆細胞を受けた。肝臓超音波ドップラーでのフォローアップを含む同じ抗凝固プロトコールおよび凝固を用いた。

統計
統計的有意差(*ｐ<0.05、**ｐ<0.01、***ｐ<0.001)は、Mann-Whitney検定により評価した。有意値は、第１種過誤を回避するためにBonferroni補正に従って調整した。Kruskal-Wallis検定は、１元ANOVA分析のために用いた。

結果
hALPCの凝固促進活性
トロンボエラストメトリー法および配管ループ
ヒト成体肝臓前駆細胞(hALPC)の凝固促進活性(PCA)を、トロンボエラストメトリー法により、ヒト血液および血漿について証明した。hALPCの凝固時間(CT)は、トロンボエラストグラムにより評価されるように、肝細胞のものより小さかった(血液では、117.5±33.8秒(ｎ=15) 対 285.8±87.0秒(ｎ=11)、ｐ<0.001) (血漿では、112.6±18.4秒(ｎ=9) 対 363.0±180.1秒(ｎ=５)、ｐ<0.05) (図10Aおよび10B)。細胞を添加しない対照CTは、血液において646.2±111.7秒(ｎ=15)、および血漿において781.9±150.5 (ｎ=９)にて測定された。外来のTFを加えなかった場合に、hALPCの同等のPCAが観察された(図11)。細胞が存在しないhALPC培養培地を、細胞の代わりにトロンボエラストグラムに配置した場合に、PCAは得られなかった(図12)。

hALPCのPCAを、配管ループモデルにおいても評価した。血小板計数の減少およびＤダイマーレベルの増加が、hALPCを血液とインキュベートした後に観察された。295 000/μl〜109 000/μl (実験１)および310 000/μl〜134 000/μl (実験２)の血小板; 100 ng/ml〜700 ng/ml (実験２)および95 ng/ml〜740 ng/ml (実験２)のＤダイマー。

間葉系細胞の凝固促進活性
骨髄間葉系幹細胞(279.3±108.3秒(ｎ=３))、皮膚線維芽細胞(121.8±26.53秒(ｎ=３))および肝臓筋線維芽細胞(61.7±7.6秒(ｎ=３))のPCAも、トロンボエラストメトリー法により、ヒト全血について証明した。骨髄造血幹細胞は、非凝固促進性細胞(590.7±25.3秒(ｎ=３))の対照として用いた(図13)。

hALPCの凝固促進活性の変調
まず、凝固因子欠損血漿におけるhALPC PCAを分析した。TFの補因子である第VII因子欠損血漿を用いた場合に、PCA hALPCは、部分的にだけ減少したことが示された(298.3±42.3秒(ｎ=３)、正常血漿中のPCAと比較してｐ<0.01) (図14)。第II因子(トロンビン)または第Ｘ因子欠損血漿において、わずかなレベルでの第Ｖ因子欠損血漿と同様に、hALPCのPCAは観察されなかった(図14)。さらに、そして肝細胞PCAとは逆に(図15C)、hALPCs PCAが、容量を５倍まで増加しても(図23)、未分画ヘパリン(225.8±149.8秒(ｎ=15))、低分子量ヘパリン(112.3±22.5秒(ｎ=３))またはフォンダパリヌクス(209.7±149.7秒(ｎ=３))により完全には阻害されなかったことが示された(図15A)。ヘパリンを、細胞の非存在下で用いた場合に、凝固は観察されなかった。

トロンビン阻害薬であるヒルジンまたはビバリルジンは、用量を増加しても(２倍または５倍) (図24および25)、hALPC PCAの部分的な制御だけを可能にした(それぞれ256.3±11.8秒(ｎ=３)および380.8±114.7秒(ｎ=４)) (図15B)。肝細胞PCAは、トロンビン阻害薬であるヒルジンおよびビバリルジンにより制御された(図15D)。対照血液(細胞の非存在下)は、ビバリルジンを用いてCTが1075.0±107.2であり、ヒルジンを用いて測定可能な凝固は観察されなかった。
抗ビタミンＫ薬(INR２〜３で処置された患者から得られた血液)は、対照(細胞の不在)についてさえトロンボエラストメトリーにおいて影響を示さなかった(データは示さず)。

最後に、ビバリルジンと未分画ヘパリン(1240.0±338.7秒(ｎ=３))またはエノキサパリン(725.0±90.1秒(ｎ=３))またはフォンダパリヌクス(909.0±421.4秒(ｎ=３))との併用が、アンチトロンビン活性化物質とトロンビン阻害物質との相乗的組み合わせであり、hALPCのPCAの変調を可能にすることが証明された(図16AおよびB)。ヘパリンとエノキサパリンまたはフォンダパリヌクスとを組み合わせた場合に、hALPC PCAの完全な変調は得られなかった(図26)。

同様の実験を用いて、未分画ヘパリンが、骨髄間葉系細胞、皮膚線維芽細胞のPCAを制御できるが、肝臓筋線維芽細胞PCAに対しては不活性であったことが証明された(図27)。未分画ヘパリンとビバリルジンとの併用も、ビバリルジン単独とは対照的に、肝臓筋線維芽細胞のPCAを変調することが示された(図28)。

hALPCのPCAの分析
hALPCはTFおよびTFPIを発現する
TF発現は、免疫蛍光により最初に記録された。図17に示すように、全ての細胞がTFを構成的に発現することが見出された(均一な細胞質染色)。hALPCのフローサイトメトリー分析により、TFについての陽性で特異的な染色が確認された(膜結合形について94.9±1.0%、サイトソル形について93.6±10.2%、それぞれ対照アイソタイプ24.2±6.1%および7.6±5.8%、ならびにそれぞれ未標識細胞13.2±7.1%および3.7±4.1%と比較；ｎ=３)。

TFおよびその阻害物質であるTFPIの発現をmRNAレベルにてRT-PCRを用いても評価した(図18)。TF mRNAの膜形および選択的スプライシングバリアントはともに、hALPCにおいて発現された。TFPIも発現された。さらなる実験において、リアルタイムRT-PCRを用いて、TF、as-TFおよびTFPI mRNAレベルを定量した。図19に示すように、膜TFバリアントが優勢に発現された(ｎ=３)。さらに、TFの発現は、肝細胞と比較して、hALPCについてより重要であった(ｎ=３)。逆に、肝細胞によるTFPIの発現は、hALPCのものより高かった(ｎ=３)。

PCAの誘導におけるTFの役割を、細胞を抗ヒトTF IgGとのプレインキュベーションにより決定した。図20に示すように、hALPCのPCAは、以前に証明されたように(Fisherら, Transplantation. 2000;69:303〜307)、肝細胞とは対照的に、TFを遮断することによって部分的にだけ制御された(324.8±11.4秒(ｎ=５)、TF抗体の不在と比較してｐ<0.01 )。
図13にすでに示すように、第VII因子欠損血漿においてhALPC PCAの部分的制御だけが得られ、このことにより、hALPCのPCAが、TFと完全には関連しなかったことが確認された。

hALPCおよびヘパリン
ヘパリン単独ではhALPCに対して抗凝固効果が存在しないことと関連して、hALPC (0.05±0.03 UI/ml)と10 UI/mlの濃度のヘパリンとのインキュベーション後に得られた血漿において、わずかな抗Xa活性だけが観察された(図21)。

臨床用途-特異的抗凝固プロトコール
抗凝固プロトコールの応用は成功した。なぜなら、両方の患者において血栓性または出血性の事象が生じなかったからである。ビバリルジンを用いた場合に期待されたように、TTの実質的な増加と、PTの限定的な増加とが観察された。Ｄダイマーの穏やかな増加が両方の患者で観察され、第１の患者について1480 ng/ml、第２の患者について1840 ng/mlに達した。PTTの増加は両方の患者で観察され、検出可能な抗Xa活性と相関した(図22AおよびB)。肝臓超音波ドップラーによる門脈血流の改変は、両方の患者における注入中に見出されなかった。

ＬＭＢＰ６４５２ＣＢ

Claims

トロンボエラストメトリーにより決定して凝固促進活性を有する細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ。
前記細胞が、幹細胞および前駆細胞からなる群から選択される請求項１に記載の組み合わせ。
細胞が、成体肝臓由来前駆もしくは幹細胞、間葉系幹細胞(好ましくは骨髄間葉系幹細胞)、皮膚線維芽細胞または肝臓筋線維芽細胞である請求項１または２に記載の組み合わせ。
細胞が、組織因子を発現する請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせ。
細胞が、細胞による組織因子の発現とは独立して凝固促進活性成分を含み、かつ/またはヘパリン耐性の凝固促進活性成分を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ。
少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質と、成体肝臓前駆細胞および肝臓筋線維芽細胞からなる群から選択される細胞とを含む組み合わせ。
前記細胞、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質および少なくとも１つのトロンビン阻害物質の対象者への別々、同時または任意の順序での逐次的な投与のために構成された請求項１〜６のいずれか１項に記載の組み合わせ。
アンチトロンビン活性化物質が、未分画ヘパリン、低分子量ヘパリンおよびフォンダパリヌクスからなる群、好ましくは未分画ヘパリンから選択される請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせ。
トロンビン阻害物質が、ビバリルジンおよびヒルジンからなる群、好ましくはビバリルジンから選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み合わせ。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
医薬品として用いるための請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み合わせまたは請求項10に記載の医薬組成物。
細胞の移植において用いるため、または前記細胞の移植により引き起こされる血栓症もしくは血栓性合併症の処置において用いるため、または前記細胞の凝固促進活性のインビボでの阻害において用いるための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み合わせまたは請求項10に記載の医薬組成物。
アンチトロンビン活性化物質が、約５〜15 UI/ml、好ましくは約８〜12 UI/ml、より好ましくは約10 UI/mlを含む細胞懸濁物により、または約10〜30 UI/kg/hr、好ましくは約15〜25 UI/kg/hr、より好ましくは約20 UI/kg/hrにて静脈内投与により対象者に投与される未分画ヘパリンであり、かつ/あるいはトロンビン阻害物質が、それぞれ約0.50〜約3.00 mg/kg体重もしくは約0.2〜0.6 mg/kg体重で対象者に投与されるビバリルジンまたはヒルジンである、請求項11または12に記載の使用のための組み合わせまたは医薬組成物。
(a) 少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質を含有する水溶液中に、細胞の細胞懸濁物を含む組成物が調製され、(b) 少なくとも１つのトロンビン阻害物質を含有する水溶液が調製され、(c) (a)で規定される組成物と、(b)で規定される溶液とが、同時、別々または逐次的に対象者に投与される、請求項11または12に記載の使用のための組み合わせまたは医薬組成物。
請求項１〜６のいずれか１項で規定される細胞と、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせを提供することを含む、前記細胞の凝固促進活性をインビトロで阻害する方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み合わせと、場合によって１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む部品キットまたは製品。
請求項１〜６のいずれか１項で規定される細胞の移植において用いるため、または前記細胞の移植により引き起こされる血栓症または血栓性合併症の処置において用いるため、またはインビボでの細胞の凝固促進活性の阻害において用いるための、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせ、または前記組み合わせと、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
請求項２〜９、13および14のいずれか１項で規定される１以上の特徴をさらに含む請求項17に記載の使用のための組み合わせまたは医薬組成物。
請求項１〜６のいずれか１項で規定される細胞を、少なくとも１つのアンチトロンビン活性化物質と、少なくとも１つのトロンビン阻害物質とを含む組み合わせと接触させることを含む前記細胞の凝固促進活性をインビトロで阻害する方法。