JP2014506926A

JP2014506926A - ホルモン補充療法のためのカプセル化された細胞

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Publication number: JP2014506926A
Application number: JP2013556716A
Authority: JP
Inventors: オパラ，エマニュエル; ヨー，ジェイムズ・ジェイ; ソール，ジャスティン・エム; シヴァナンダン，シッタジョディ; アタラ，アンソニー
Original assignee: ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-02-21
Publication date: 2014-03-20
Anticipated expiration: 2032-02-21
Also published as: US20160206665A1; CA2828961A1; EP3138571A1; EP2680862A4; US9283251B2; EP2680862A1; WO2012121874A1; JP6046644B2; US9763986B2; CA2828961C; EP2680862B1; US20140127308A1

Abstract

マイクロカプセルを含む組成物が説明され、本マイクロカプセルは、哺乳動物の生きた卵巣顆粒膜細胞、および、哺乳動物の生きた卵巣卵胞膜細胞の両方を含む。いくつかの実施形態では、顆粒膜細胞および卵胞膜細胞は、組成物中で別々のマイクロカプセルに含まれ、いくつかの実施形態では、顆粒膜細胞および卵胞膜細胞は、組成物中で共に同じマイクロカプセルに含まれる。本組成物は、エストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンを送達するために使用される可能性があるため、好ましくは卵母細胞を含まないか、または、実質的に卵母細胞を含まない。本組成物の使用方法、および、本組成物を含む医薬製剤も説明される。

Description

本発明は、ホルモン補充療法をそのような治療が必要な対象に行うための組成物および方法に関する。

エストロゲンは、多方面にわたるホルモンであり、女性における様々な生理学的機能に不可欠である。女性において、外科的切除、除去療法または閉経期により卵巣からのエストロゲン産生が減少すると、様々な生理学的な影響が生じる。ホルモン補充療法は、エストロゲン産生の損失を補うことができるが、薬理学的な手段を介した送達は、常に高い血清濃度をもたらす。臨床的な合併症としては、心疾患および癌の発生率の増加が挙げられる。したがって、エストロゲンを送達する新しい方法および技術が求められている。

本発明の第一の態様は、マイクロカプセルを含むか、マイクロカプセルからなるか、または、本質的にマイクロカプセルからなる組成物または医薬組成物であり、該マイクロカプセルは、哺乳動物の生きた卵巣顆粒膜細胞、および、哺乳動物の生きた卵巣卵胞膜細胞の両方を含む。いくつかの実施形態では、顆粒膜細胞および卵胞膜細胞は、組成物中で別々のマイクロカプセルに含まれ、いくつかの実施形態では、顆粒膜細胞および卵胞膜細胞は、組成物中で共に同じマイクロカプセルに（例えば、マイクロカプセルの同じ層、コア、またはセグメント中で互いに混合された状態で）含まれる。本組成物は、主としてエストロゲンの送達を目的とし、任意選択的にさらにプロゲステロンの送達も目的とし、したがって、好ましくは卵母細胞を含まないか、実質的に卵母細胞を含まない。

いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、コアと、コアを取り囲む補助層とを含み、コアは顆粒膜細胞を含み、補助層は卵胞膜細胞を含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、コアと補助層との間に第一の半透層をさらに含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、補助層を取り囲む第二の半透層をさらに含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、第二の半透層を取り囲む外側の多糖類層をさらに含む。いくつかの実施形態では、半透層は、ポリカチオン（例えば、ポリアミン）で形成される。

いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、多糖類ヒドロゲルなどのヒドロゲルを含む（例えば、コアが、多糖類ヒドロゲルなどのヒドロゲルを含み、取り囲む層が、多糖類ヒドロゲルなどのヒドロゲルを含む）。

本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象へのエストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンの投与方法であり、本方法は、対象に、本明細書で説明される組成物を治療有効量で投与することを含む。

本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象にエストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンを投与するための、または、それを必要とする対象にエストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンを投与するための医薬品を調製するための、本明細書で説明される組成物の使用である。

本明細書に記載の図面と以下の明細書において、本発明をより詳細に説明する。本明細書において引用される全ての米国特許の参照の開示は、参照することによりそれらの全体が本明細書の一部をなすものとする。

卵巣の内分泌細胞のカプセル化を示す概略図である。不連続パーコール密度勾配法Ｃを用いて精製した、単離された顆粒膜細胞（Ａ）および卵胞膜細胞（Ｂ）の純度のフローサイトメトリー分析を示す図である。顆粒膜細胞におけるＦＳＨ−ＲおよびＣＹＰ１９（アロマターゼ）に関する免疫蛍光染色（上のパネル）、ならびに、卵胞膜細胞におけるＬＨ−ＲおよびＣＹＰ１７Ａ１（１７、２０リアーゼ）に関する免疫蛍光染色（下のパネル）を示す画像である。アルギン酸塩ヒドロゲルマイクロカプセル中のカプセル化された細胞の位相差顕微鏡および走査電子顕微鏡の画像であり、高い充填密度の細胞（ＡおよびＣ）、および、低い充填密度の細胞（ＢおよびＤ）を示す。これは、様々な細胞の充填密度を達成する能力を実証する。マイクロカプセル中の細胞の生存／死亡に関する染色を示す画像であり、緑色は生細胞を示し、赤色は死細胞を示す。図５Ａは、顆粒膜細胞マイクロカプセルと卵胞膜細胞マイクロカプセルとを別々に培養するか、共培養して、Ｅ_２産生への作用を確認したグラフである。図５Ｂは、共培養系におけるＬＨ＋ＦＳＨのＥ_２産生への作用を示すグラフである。図５Ｃは、顆粒膜細胞マイクロカプセルと卵胞膜細胞マイクロカプセルとの長期培養における継続的なＥ_２産生を示すグラフである。＊は、基準時の状態と比較したＰ＜０．０５における有意性を意味する。（記載なし）多層マイクロカプセルの概略図である。ｉｎｖｉｖｏでの組織構築物による継続的なＥ２およびプロゲステロンの産生を示すグラフである。各データポイントは、６つの値の平均＋標準誤差を示す。図８Ａは、２Ｄ系においてＦＳＨおよびＬＨに応答してなされる、卵胞膜細胞と共培養された顆粒膜細胞による１７β−エストラジオール産生を示すグラフである。図８Ｂは、２Ｄ系においてＦＳＨおよびＬＨに応答してなされる、卵胞膜細胞と共培養された顆粒膜細胞によるプロゲステロン産生を示すグラフである。各データポイントは、６つの値の平均＋標準誤差を示す。

「対象」は、本明細書で用いられる場合、一般的に、哺乳動物の対象である。ヒトの対象が好ましいが、対象は、いくつかの実施形態では、獣医学的な目的の場合、イヌおよびネコなどのその他の動物であってもよい。対象は、一般的に雌である。対象は、任意の適切な年齢であってよいが、対象は、典型的には成体であり、いくつかの実施形態では、閉経期の雌の対象である。

「治療する」は、本明細書で用いられる場合、対象に利益を与える任意のタイプの治療を指し、対象における少なくとも１つの症状の発症を遅らせること、または、その重症度を減少させることを含むが、これらに限定されない。

「薬学的に許容される」は、本明細書で用いられる場合、疾患の重症度と治療の必要性を考慮して、過度に有害な副作用を起こさずに本明細書において説明される治療を達成するために、化合物または組成物が対象に投与するのに好適であることを意味する。

１．細胞
本発明を実施するのに使用される細胞は、一般に、適切なドナーから採取された生きた哺乳動物細胞である。ドナーは、一般に、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サル、チンパンジー、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ）である。ドナーは、治療されている対象と同じ種に属するものでもよいし、または、異なる種に属するものでもよい。いくつかの実施形態では、ドナーは、治療を受けている対象と同じであってもよく、このような場合、対象から適切な細胞が採取され、その後の使用のために保存された。

細胞は、当技術分野で公知の技術に従って、ドナーから単離され、所望に応じてマイクロカプセル製造のために培養される。例えば、ＳａｎｊａｙＫ．Ａｇａｒｗａｌら、ＬｅｐｔｉｎＡｎｔａｇｏｎｉｚｅｓｔｈｅＩｎｓｕｌｉｎ−ＬｉｋｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ−ＩＡｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＳｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＧｒａｎｕｌｏｓａａｎｄＴｈｅｃａＣｅｌｌｓｏｆｔｈｅＨｕｍａｎＯｖａｒｙ、Ｊ．ＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ８４：１０７２〜１０７６（１９９９年）；ＪｏｎＣ．Ｈａｖｅｌｏｃｋら、Ｏｖａｒｉａｎｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ２２８、６７〜７８（２００４年）；ＪｅｓｓｉｃａＫ．Ｗｉｃｋｅｎｈｅｉｓｓｅｒら、Ｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｔｈｅｃａｃｅｌｌｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅ、ＴｒｅｎｄｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ１７、６５〜７１（２００６年）を参照。一般に、新しい組織は、切り刻むこと、薄くそぐこと、粉砕、および／または、コラゲナーゼ消化によって分割される。続いて所望の細胞は、洗浄、濾過、遠心分離、または、摘み取り手順により夾雑細胞および夾雑材料から単離され、任意選択的に、カプセル化の前に所望に応じて培養および／または凍結保存される。

２．マイクロカプセルの製造
生細胞のカプセル化は、公知の技術、または、当業者には明らかであるそれらのバリエーションによって行うことができる。例えば、Ｏｐａｒａに付与された米国特許第６，７８３，９６４号および米国特許第６，３６５，３８５号を参照（これらの開示は、参照することによりそれらの全体が本明細書の一部をなすものとする）。

本発明において有用なマイクロカプセルは、任意選択的に、ただしいくつかの実施形態では好ましくは、細胞を含む内部を取り囲む少なくとも１つの半透膜を有する。半透膜は、栄養素、生物学的に活性な分子、およびその他の選択された生成物を、表面の膜を通ってマイクロカプセルのコア中に拡散させることを可能にする。表面の膜は、膜の分子量カットオフを決定するサイズの孔を含む。膜の孔サイズは、エストロゲン、および、いくつかの実施形態ではプロゲステロンが、カプセル内部から外部環境に通過できるように、ただし宿主免疫反応因子が侵入する余地を与えないように選択される（ここでカプセル化された細胞は、自己由来ではない）。このような半透膜は、典型的には、以下でさらに考察されるように、ポリカチオン、例えばポリアミン（例えば、ポリリシン、および／または、ポリオルニチン）から形成される。

カプセル化技術の非限定的な例示的な実施形態の一つにおいて、Ｌｉｍらに付与された米国特許第４，３９１，９０９号は、細胞を、アルギン酸ナトリウムを含む生理食塩水に懸濁し、細胞を含む液滴を製造する方法を説明している。細胞を含むアルギン酸塩の液滴は、生理食塩水中の塩化カルシウムに注がれる。負電荷を有するアルギン酸塩の液滴がカルシウムと結合し、アルギン酸カルシウムゲルを形成する。マイクロカプセルは、生理食塩水中で洗浄され、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｌ−オルニチン（またはそれらの組合せ）と共にインキュベートされ、正電荷を有するポリ−ｌ−リシンおよび／またはポリ−Ｌ−オルニチンがカルシウムイオンで置換され、負電荷を有するアルギン酸塩と（イオン）結合し、高分子電解質の外側半透膜が生成される。アルギン酸ナトリウムの外側コーティングは、マイクロカプセルをアルギン酸ナトリウム溶液で洗浄し、ポリ−Ｌ−リシンおよび／またはポリ−Ｌ−オルニチン層にイオン結合させることにより付加してもよい（これは、対象においてポリカチオン性膜が組織と接触することにより引き起こされる可能性がある任意の炎症性反応を低減させるのに役立つ）。この技術により、「単一壁」マイクロカプセルと呼ばれるものが製造される。「二重壁」マイクロカプセルは、単一壁マイクロカプセルの場合と同じ手順を行うことによって製造することができるが、クエン酸ナトリウムとの任意のインキュベートの前に、マイクロカプセルは、再度、ポリ−ｌ−リシンおよびアルギン酸ナトリウムとインキュベートされる。

カプセル化法のさらなる非限定的な例において、Ｃｈａｎｇら、米国特許第５，０８４，３５０号は、より大きいマトリックス中に封入されたマイクロカプセルを開示しており、マイクロカプセルがより大きいマトリックス内に入ると、マイクロカプセルは液化される。Ｔｓａｎｇら、米国特許第４，６６３，２８６号は、アルギン酸ポリマーを用いたカプセル化を開示しており、ゲル層は、ポリリシンなどのポリカチオン性ポリマーで架橋されており、第二の層は、第二のポリカチオン性ポリマー（例えばポリオルニチン）を用いて形成され、続いて第二の層は、アルギン酸塩でコーティングされてもよい。Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇらに付与された米国特許第５，７６２，９５９号は、アルギン酸カルシウム／バリウムが所定比率の固形の（キレート化されていない）アルギン酸塩ゲルのコアを有し、コア中に高分子材料を含むマイクロカプセルを開示している。Ｈｕｂｂｅｌｌら付与された米国特許第５，８０１，０３３号および米国特許第５，５７３，９３４号は、最外層の高分子コーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を有するアルギン酸塩／ポリリシンマイクロスフェアを説明しており、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１３：８６３（１９９１年）は、生体適合性を改善するための、マイクロカプセル表面上にポリ−ｌ−リシンとポリエチレンオキシドとのグラフトコポリマーを包含するアルギン酸塩／ポリリシンマイクロカプセルを説明しており、米国特許第５，３８０，５３６号は、ポリエチレン（オキシド）などの水溶性の非イオン性ポリマーの最外層を有するマイクロカプセルを説明している。Ｗｅｂｅｒらにに付与された米国特許第５，２２７，２９８号は、予めポリリシンアルギン酸塩でコーティングされた細胞に、第二のアルギン酸塩ゲルのコーティングを提供する方法を説明しており、いずれのアルギン酸塩コーティングもポリリシンで安定化される。Ｗｅｂｅｒらに付与された米国特許第５，５７８，３１４号は、精製したアルギン酸塩の複数のコーティングを用いたマイクロカプセル化法を提供する。Ｄｏｒｉａｎらに付与された米国特許第５，６９３，５１４号は、繊維を形成しないタイプのアルギン酸塩の使用を報告しており、アルギン酸塩コーティングの外面は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンを含むアルカリ土類金属のカチオンと反応して、アルカリ土類金属のアルギン酸塩コーティングを形成する。アルギン酸塩コーティングの外面は、ポリリシンと反応しない。Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇに付与された米国特許第５，８４６，５３０号は、カプセル化の前に、重合性アルギン酸塩、または、ポリリシンなどの重合性ポリカチオンで個々にコーティングされた細胞を含むマイクロカプセルを説明している。

所望に応じて、アルギン酸塩−ポリリシンマイクロカプセルをクエン酸ナトリウム中でインキュベートすることにより、ポリ−ｌ−リシンと反応しなかったあらゆるアルギン酸カルシウムを溶解させることができ、すなわち、細胞を含むアルギン酸ナトリウムの内部コアを溶解させて、細胞を含むコア部分を液化したマイクロカプセルを製造することができる。ＬｉｍおよびＳｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１０：９０８（１９８０年）を参照。このようなマイクロカプセルは、本明細書において、「キレート化」、「中空」または「液状」コアを有することを指す。

所望に応じて、マイクロカプセルに含まれる細胞の生理学的な反応性を保持しながら、または、そのような反応性を過度に損なうことなくマイクロカプセルの耐久性を高めるために、マイクロカプセルを、硫酸ナトリウムなどの生理学的に許容可能な塩または類似の物質で処理するか、またはインキュベートしてもよい。例えば、Ｏｐａｒａに付与された米国特許第６，７８３，９６４号を参照。

現在のところ好ましいマイクロカプセルの製造方法の一つは、Ｏ．Ｋｈａｎｎａら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｅｄａｌｇｉｎａｔｅｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓｆｏｒｔｈｅｓｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−１Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．ＰａｒｔＡ：９５Ａ：６３２〜６４０（２０１０年）で説明されている。

マイクロカプセルは、任意の適切なサイズであってよく、例えばその直径は、１０、２０または３０マイクロメートルから、最大１０００、２０００、または５０００マイクロメートルである。マイクロカプセルは、任意の適切な量の細胞を含んでいてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、顆粒膜細胞は、マイクロカプセル１つあたり１，０００個または２，０００個の細胞から、マイクロカプセル１つあたり最大１×１０^６個、１×１０^８個、または１×１０^９個の細胞の量でマイクロカプセルに含まれ、卵胞膜細胞は、マイクロカプセル１つあたり１，０００個または２，０００個の細胞から、マイクロカプセル１つあたり最大１×１０^６個、１×１０^８個、または１×１０^９個の細胞の量でマイクロカプセルに含まれる。

本発明のマイクロカプセルは、所望に応じて、製造後に投与してもよいし、その後の使用のために冷蔵および／もしくは冷凍保存してもよいし、ならびに／または、その後の使用のために培養してもよい。本発明のマイクロカプセルは、それらの製造様式により所望に応じて、製剤化および／または投与の前に（例えば、滅菌生理食塩水中で）洗浄してもよい。

３．製剤化および投与
本発明のマイクロカプセルは、そのものを投与してもよいし、または、任意の適切な技術によって投与用に製剤化してもよく、例えば滅菌生理食塩水と混合することによって製剤化してもよい。本発明のマイクロカプセルは、エストロゲン補充療法が使用される任意の状態のための治療として対象に投与してもよい。マイクロカプセルは、任意の適切な技術によって投与してもよく、このような技術としては、外科的移植または注射が挙げられるが、これらに限定されない。これらはいずれも、皮下、腹腔内、筋肉内、またはその他の任意の適切な区画に行ってもよい。投与される細胞の投与量は、公知の技術または当業者には明らかであるそれらのバリエーションに従って決定することができる。比較のために、糖尿病の治療において、国際膵島移植登録機関（ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｓｌｅｔＴｒａｎｓｐｌａｎｔＲｅｇｉｓｔｒｙ）は、正常血糖値を達成するためには、レシピエントの体重１キログラムあたり少なくとも６，０００個の細胞の移植を推奨している。本発明において、移植される細胞の数は、対象の年齢および状態、治療されている具体的な障害などによって決定される。本発明のいくつかの実施形態では、レシピエントの体重１キログラムあたり１，０００個、２，０００個、または３，０００個の細胞から、レシピエントの体重１キログラムあたり最大２０，０００個、４０，０００個、または６０，０００個の細胞が投与される。

本発明の方法によって治療される対象または患者は、閉経期に付随する可能性がある、骨粗鬆症、ホットフラッシュ、不規則な月経、膣萎縮、膣および／もしくは膀胱の感染症、失禁（例えば、切迫尿失禁、ストレス失禁）、疲労、睡眠障害、興奮性、気分変動、うつ、筋肉量の低下、脂肪組織の増加、皮膚が薄くなり弾力がなくなること、骨組織の減少、認知障害など、子宮摘出、卵巣摘出、または、エストロゲンもしくはホルモンの補充療法が用いられるその他の状態の１種または複数に苦しむ対象、または、それらの危険性が高い対象を含む。

以下の非限定的な実施例で本発明をより詳細に説明する。

［ラット卵巣の単離］
図１で図解されているように、生後２１日目のフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）３４４ラットに、連続して３日間、ゴマ油に溶解した１．５ｍｇ／０．２ｍｌの１７β−エストラジオール（Ｅ２）を皮下注射した。最後の注射から２４時間後にラットを安楽死させ、卵巣を切り出し、実施例２で説明されているようにして内分泌細胞を単離した。

［細胞の単離および精製］
ＬｉおよびＨｅａｒｎ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４５、１６９〜１８１（２０００年）に従って、Ｅ２処理した未成熟ラットの卵巣から内分泌細胞を単離した。ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、および、アンホテリシンＢ（２５μｇ／ｍｌ）を含む氷冷した培地１９９（Ｍ１９９）中で卵巣を採取した。外側の組織を取り除いた後、卵巣を氷冷したＭ１９９で２回洗浄し、続いて緩く詰め込まれた顆粒膜細胞を卵胞から放出させるために２７Ｇの注射針で丁寧に穴を開け、このようにして採取された細胞を氷上で維持した。残った卵巣を切断して約０．２５ｍｍ^２の細かい断片にし、この過程で放出された細胞を採取し、氷上で別々に維持した。続いて卵巣の断片をＭ１９９中でコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮアーゼ（１０μｇ／ｍｌ）と共にときどき混合しながら９０分インキュベートした。酵素消化した断片をパスツールピペットを用いて分散することにより単一細胞の懸濁液を得て、その細胞を回収し、別々の分画として氷上で保存した。このようにして回収された異なる分画からの細胞を、ＭａｇｏｆｆｉｎおよびＥｒｉｃｋｓｏｎ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２２、２３４５〜２３４７（１９８８年））と同様にして精製した。簡単に言えば、細胞を不連続パーコール密度勾配法（底部は４４％、中間部はｄ＝１．０５５のパーコール（比重を１．０５５に調節）、および、上部は２０％）の上にローディングし、４℃で４００×ｇで２０分遠心分離した。第一の相間（２０％の層とｄ＝１．０５５の層との間）からの細胞を顆粒膜細胞として回収し、第二の相間（ｄ＝１．０５５の層と４４％の層との間）からの細胞を卵胞膜細胞として回収した（図１Ｃを参照）。トリパンブルー法を用いて細胞の生存率を調べたところ、生存率は８５〜９５％の範囲であった。細胞特異的マーカーを用いたフローサイトメトリー分析によって各細胞型の純度を評価した。

［フローサイトメトリーを用いた細胞の解析］
不連続パーコール密度勾配法を用いて精製した細胞の分画（１つの細胞型あたり５×１０^６個の細胞）を３．７％ホルムアルデヒド中で１５分間固定した。

ラット卵巣から単離した細胞型の純度を確認するために、細胞を細胞特異的マーカーで染色し、フローサイトメトリーで定量した。異なる相間からの細胞（図１Ｃを参照）を一次抗体と共にインキュベートした。ＣＹＰ１９に対する抗体（マウス抗ＣＹＰ１９、Ａｂｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２５０５４９）およびＦＩＴＣがコンジュゲートされた二次抗体を使用して、顆粒膜細胞を検出した。ＣＹＰ１７Ａ１に対する抗体（ヤギ抗ＣＹＰ１７Ａ１、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−４６０８５）、および、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５がコンジュゲートされたロバ抗ヤギＩｇＧ二次抗体を使用して、卵胞膜細胞を検出した。細胞を適切な一次抗体と共に１時間インキュベートした。続いて未結合の抗体を洗い落とし、細胞を適切な二次抗体と共に１時間インキュベートした。未結合の二次抗体を洗い落とした後、フローサイトメトリーを用いて細胞を解析した。フローサイトメトリー分析から、パーコール密度勾配法で第一の相間から回収した細胞の７４．１５％がＣＹＰ１９について陽性染色され（図１Ａ）、第二の相間から得られた細胞の６９．９１％がＣＹＰ１７Ａ１について染色された（図１Ｂ）ことが明らかになった。二次抗体のみとインキュベートした細胞を対照として使用した。

［顆粒膜細胞および卵胞膜細胞の培養］
Ｔ１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．、ＮＹ、米国）中で、精製した顆粒膜細胞および卵胞膜細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２の雰囲気下で、加湿空気中で別々にインキュベートし、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（２５μｇ／ｍｌ）、および、１０％ＦＢＳが補充されたＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で２４時間培養した。顆粒膜細胞用の培地を、顆粒膜細胞用の増殖培地（Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、および、アンホテリシンＢ（２５μｇ／ｍｌ）、２００ｎｇ／ｍｌのＦＳＨ、１００ｎＭのＥ２、および、１０ｎＭのＩＧＦ−Ｉを含むＭｃＣｏｙの５Ａ）と交換し、さらに７２時間培養した。同様にして、卵胞膜細胞を、卵胞膜細胞用の増殖培地（Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（２５μｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＨ、１０ｎＭのＩＧＦ−Ｉが補充されたＭｃＣｏｙの５Ａ培地）中で、さらに７２時間増殖させた。

［免疫蛍光染色］
各細胞型を、それぞれの増殖培地中のチャンバースライド上で培養し、ステロイド生成に関する必須の細胞成分の発現に関してスクリーニングした。細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で１５分固定した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＳＡ（１％）を含むＰＢＳでブロックした。次に、単分子層を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、顆粒膜細胞を、ウサギ抗ＦＳＨＲ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−１３９３５）、および、マウス抗ＣＹＰ１９（Ａｂｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２５０５４９）と共にインキュベートした。同様にして、卵胞膜細胞を、ウサギ抗ＬＨＲ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−２５８２８）、および、ヤギ抗ＣＹＰ１７Ａ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−４６０８５）と共にインキュベートした。一次抗体と共に一晩インキュベートした後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体と共に４℃で２時間インキュベートした。未結合の二次抗体を洗い落とし、細胞核をＤＡＰＩで対比染色し、カバースライドを載せた。蛍光顕微鏡を用いて画像を得て、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏｐｌｕｓソフトウェア、バージョン６．３．１．５４２を用いて合成画像を作製した。

卵胞膜細胞は、ＬＨ受容体（ＬＨＲ）およびＣＹＰ１７Ａ１について陽性染色され（図２）、顆粒膜細胞は、ＦＳＨ受容体（ＦＳＨＲ）およびＣＹＰ１９について陽性を示した（図２）。

［別々にカプセル化された顆粒膜細胞および卵胞膜細胞］
培養細胞を、１〜３％（ｗ／ｖ）の超高純度の低粘度マンヌロン酸（ＬＶＭ）高含有アルギン酸塩溶液中で、マルチノズル押出機を通じて塩化カルシウム溶液内に向かって５〜１５分間の間（架橋のため）押出すことにより、別々にカプセル化して、直径がおよそ３００〜６００マイクロメートルのマイクロカプセルを製造した。全てのカプセル化および洗浄ステップは、室温で行われる。続いて顆粒膜細胞を含むマイクロカプセル、および、卵胞膜細胞を含むマイクロカプセルをそれぞれ等量部で共に合わせ、２４ウェルプレートで、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００ＩＵ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍｌ）、および、ウシ胎児血清（１０％）が補充されたＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で、３７℃および５％ＣＯ_２で、培養インサートの隔離されたチャンバーで共培養した。以下で考察されるように、生存率と１７β−エストラジオール産生を３０日にわたり定期的に評価した。

長期培養中に、マイクロカプセルに、５０ｎｇ／ｍｌの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および、５０ｎｇ／ｍｌの黄体形成ホルモン（ＬＨ）を与えた。ｉｎｖｉｔｒｏで、卵胞膜細胞においてＬＨ処理はＣＹＰ１７Ａ１（１７、２０リアーゼ）の発現を増加させ、顆粒膜細胞においてＦＳＨ処理はＣＹＰ１９（アロマターゼ）の発現を増加させた（図２）。この増加によりこれらの細胞のステロイド合成能は改善される。カプセル化により、細胞がアルギン酸塩マイクロカプセル中に均一に分配された（図３）。最適な細胞密度が、マイクロカプセルの形状および構造にとって重要な要因であることが認められ、この最適な細胞密度は、マイクロカプセル１つあたりおよそ１，０００〜１０，０００個の細胞であった。

カプセル化細胞は、最長で３０日の長期培養の間、生存能力を保ち続けた（実施例１０および図４を参照）。生存できない細胞の数は、長期培養の過程で増加した。

注目すべきことに、卵胞膜細胞を含むマイクロカプセルと共培養された顆粒膜細胞を含むマイクロカプセルは、それぞれ個々に培養した場合よりも有意に高い濃度のＥ２を産生した（図５Ａ）。

加えて、ｉｎｖｉｔｒｏの長期培養において、顆粒膜細胞を含むマイクロカプセルと卵胞膜細胞を含むマイクロカプセルとの共培養は、ＦＳＨおよびＬＨに応答して高濃度のＥ２を分泌した（図５ＢおよびＣ）。

これらのデータは、アルギン酸塩ヒドロゲルマイクロカプセル中にカプセル化した卵巣の内分泌細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、長期生存と生物活性との両方を示したことを示す。カプセル化技術を用いることによって、我々は、卵巣の内分泌ユニットをｅｘｖｉｖｏで再現可能なことを実証することができた。

追加実験において、マイクロカプセルの一部を、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＬＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で約３０日間培養し、培養培地を一日おきに採取して、性ステロイドの分泌を試験した。ＥＬＩＳＡキットを用いて培養培地中の１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を定量した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−００８）を用いて培養培地中の１７β−エストラジオールを測定した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−０１１）を用いて細胞培養培地中のプロゲステロン濃度を測定した。１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を製造元の説明書に従って定量し、それらの希釈率に応じて補正した。

顆粒膜細胞を含むマイクロカプセル、または、卵胞膜細胞を含むマイクロカプセルを別々にインキュベートしたところ、１７β−エストラジオール産生の有意な増加はなかった。同じ実験で、プロゲステロン濃度は、４日目および６日目にそれぞれ１．３ｎｇ／ｍｌおよび０．８ｎｇ／ｍｌに達した（図５Ｄおよび５Ｅを参照）。

顆粒膜細胞を含むマイクロカプセル、および、卵胞膜細胞を含むマイクロカプセルを共培養したところ、１７β−エストラジオール濃度は、１８日目に約２０ｐｇ／ｍｌに達し、プロゲステロン濃度は、２６日目に約１．５ｎｇ／ｍｌの最大値を示した（図５Ｄおよび５Ｅを参照）。

［共にカプセル化された顆粒膜細胞および卵胞膜細胞］
顆粒膜細胞と卵胞膜細胞とが共にカプセル化されるように、押出しする前にそれら２種を実質的に等量で共に混合することを除いては、この実施例は上述した実施例６と同様の方式で行われる。

マイクロカプセルの一部を、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＬＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で約３０日間培養し、培養培地を一日おきに採取して、性ステロイドの分泌を試験した。ＥＬＩＳＡキットを用いて培養培地中の１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を定量した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−００８）を用いて培養培地中の１７β−エストラジオールを測定した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−０１１）を用いて細胞培養培地中のプロゲステロン濃度を測定した。１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を製造元の説明書に従って定量し、それらの希釈率に応じて補正した。２日目以降、カプセル化細胞はゴナドトロピンに応答した。１７β−エストラジオール濃度は、２５日目には基礎レベルと比較しておよそ５倍高く、プロゲステロン濃度は、基礎レベルと比較しておよそ２倍高かった（図５Ｄおよび５Ｅを参照）。

［層中に共にカプセル化したブタ骨髄間質細胞］
Ｏ．Ｋｈａｎｎａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．ＰａｒｔＡ９５Ａ：６３２〜６４０（２０１０年）で説明された技術に従って、（図６で図解された）２層マイクロカプセルを製造した。簡単に言えば、ブタ骨髄間質細胞（ｐＢＭＳＣ）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００ＩＵ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ウシ胎児血清（１０％）が補充されたＤＭＥＭ中で、３７℃および５％ＣＯ_２で培養し、生体蛍光プローブのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒｇｒｅｅｎ、および、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてタグ付けした。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒｇｒｅｅｎをプローブとしたｐＢＭＳＣを、マルチノズル押出機を通じて塩化カルシウム溶液に向かって押出すことにより、１〜２％の低粘度マンヌロン酸（ＬＶＭ）高含有アルギン酸塩中にカプセル化した。続いてマイクロカプセルを０．０５〜０．２％のポリ−Ｌ−オルニチン溶液に４℃で約５〜３０分間懸濁し、選択透過性膜層を作製した。続いてコーティングされたマイクロカプセルを、第二のアルギン酸塩の層、すなわちＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒｏｒａｎｇｅをプローブとしたｐＢＭＳＣを含む０．５〜２％（ｗ／ｖ）の低粘度グルクロン酸高含有アルギン酸塩（ＬＶＧ）の層でコーティングした。カプセルの各層には、約１，０００〜１０，０００個の細胞が含まれる。

［２層マイクロカプセル中にカプセル化した顆粒膜細胞および卵胞膜細胞］
顆粒膜細胞を１．５％（ｗ／ｖ）ＬＶＭ中にカプセル化し、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）（０．１％ｗ／ｖ）で２０分間コーティングした。続いてＰＬＯでコーティングしたマイクロカプセルと１．５％（ｗ／ｖ）ＬＶＭに懸濁した卵胞膜細胞とを混合し、図６に示したように天然の卵胞の構造的な様式と類似した多層マイクロカプセル（多層マイクロカプセルと呼ぶ）を得るために、再度、マイクロ流体装置（図１）を用いてカプセル化した。

マイクロカプセルの一部を、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＬＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で約３０日間培養し、培養培地を１日おきに採取して、性ステロイドの分泌を試験した。ＥＬＩＳＡキットを用いて培養培地中の１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を定量した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−００８）を用いて培養培地中の１７β−エストラジオールを測定した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−０１１）を用いて細胞培養培地中のプロゲステロン濃度を測定した。１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を製造元の説明書に従って定量し、それらの希釈率に応じて補正した。２５日目には、１７β−エストラジオールは基礎レベルと比較して１０倍増加し、プロゲステロン濃度はおよそ２倍高かった（図５Ｄおよび５Ｅを参照）。

多層マイクロカプセルにおいて異なる細胞型が分別区画化されたことを実証するために、多層マイクロカプセルを合成する前に、顆粒膜細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ２９２５）で予め染色し、卵胞膜細胞をＣｅｌｌ−ｔｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ２９２７）で予め染色した。共焦点顕微鏡（ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０）を用いて多層マイクロカプセルを画像化した。

［カプセル化した卵巣の内分泌細胞の生存率］
生存／死亡解析を用いてカプセル化細胞の生存率を評価した。実施例６、７、８および９からのマイクロカプセルの一部を、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＬＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、約３０日間培養し、培養培地をおよそ３日おきに採取して、カプセル化細胞の生存率を調べた。指定された時間で、カプセル化細胞を２４ウェルプレートに移し、無血清培地中の２５μΜのＣＦＤＡＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ１２８８３）と共に、３７℃で１５分間、５％ＣＯ_２雰囲気下で、加湿空気中でインキュベートした。続いてＣＦＤＡを含む培地を１０％ＦＢＳを含む培地と交換し、上述した条件下でさらに３０分間、再度インキュベートした。続いて血清を含む培地を５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ１２８８３）と交換し、室温で２分間インキュベートし、マイクロカプセルを洗浄して過量のＰＩを除去した。続いてマイクロカプセルを倒立蛍光顕微鏡で観察し、画像化した。得られた合成画像から、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏｐｌｕｓソフトウェアのバージョン６．３．１．５４２を用いて生細胞の数と死細胞の数を解析した。

注釈：生細胞は、膜透過性の非蛍光性ＣＦＤＡのエステル基を切断し、そのＣＦＤＡを非透過性の緑色蛍光ＦＤＡに変換し、そのＦＤＡが生存可能な細胞の内部に捕獲される。一方で、死細胞は、機能が低下した膜を有するため、プロピジウムが細胞核に透過し、ＤＮＡが赤く染色される。定期的な生存／死亡解析から、カプセル化した卵巣の内分泌細胞は、長期培養の間中、長期的な生存能を有することが解明された（図４を参照）。

［ｉｎｖｉｖｏにおける組織工学的に作製された卵巣の内分泌単位の機能］
卵巣摘出術および多層マイクロカプセルの移植。６カ月齢のフィッシャー３４４ラットの左右の卵巣を麻酔下で摘出し、それらのＥ_２およびＰ_４の血中濃度を、基礎レベルに達するまで追跡した。基礎レベルに達したら、実施例９による多層マイクロカプセルを卵巣摘出ラットの大網膜で作製された小袋に入れて移植した。各実験用ラット（ｎ＝５）に、各細胞型を０．５×１０^６細胞充填したおよそ１０００個のマイクロカプセルを移植した。対照ラット（ｎ＝５）に、大網の小袋中に入れた同数の中になにも含まないアルギン酸塩マイクロカプセルを入れた。ＥＬＩＳＡキットを用いて１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの血漿濃度を定量した。ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＤＩ−９０１−１７４）を用いて血漿中の１７β−エストラジオールを測定した。ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ，Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＤＩ−９０１−０１１）を用いてプロゲステロンの血漿濃度を測定した。１７β−エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度を製造元の説明書に従って定量し、それらの希釈率に応じて補正した。卵巣摘出対照ラットと比較したところ、測定された全ての時点において組織構築物を移植したラットにおける１７β−エストラジオールの血漿濃度が有意に高かった（図７Ａ）。同様に、プロゲステロン濃度も、対照ラットの濃度よりも有意に高かった（図７Ｂ）。

ｉｎｖｉｖｏの研究でスチューデントのｔ検定を行い、マイクロカプセルを移植したラットのホルモン濃度の平均と、卵巣摘出ラットのホルモン濃度の平均とを比較した。

［２Ｄ系における長期の共培養］
顆粒膜細胞および卵胞膜細胞を単離した後、これらを、２Ｄ系中で、ゴナドトロピン、ＬＨおよびＦＳＨの存在下で、別々に培養するか、または、共培養した（図８Ａおよび８Ｂを参照）。この実施例において、プロゲステロン濃度は、培養培地中で時間がたつにつれて（２日目の０．２ｎｇ／ｍｌから、３０日目の約２ｎｇ／ｍｌに）増加したが、１７β−エストラジオール濃度は、２日目の２８ｐｇ／ｍｌから、３０日目の約５ｐｇ／ｍｌに減少した。これらのデータは、顆粒膜細胞がそれらのエストロゲン合成能を失って、プロゲステロン合成能を獲得することにより、培地中で観察されるプロゲステロン濃度を高める、異常な細胞応答を示しており、これは、天然の卵巣におけるそれらの細胞の正常な生理学的応答とは対照的である。

［統計的分析］
ＳＰＳＳソフトウェア（バージョン１０．０．１）を用いて統計分析を行った。結果は、特に他の指定がない限り平均±標準偏差として示される。ｉｎｖｉｔｒｏでの研究について、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、３つの異なるスキームのホルモン濃度の平均と対照群との比較を行い、続いて、適切な場合は、ボンフェローニ補正を用いてポストホック（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）検定を行った。差は、Ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意であるとみなされた。

これまで述べたことは、本発明を例示するためであり、本発明を制限するものではない。本発明は、以下の特許請求の範囲で定義され、特許請求の範囲の均等物も包含される。

Claims

マイクロカプセルを含む医薬組成物であって、前記マイクロカプセルが、哺乳動物の生きた卵巣顆粒膜細胞、および、哺乳動物の生きた卵巣卵胞膜細胞の両方を含む組成物。
前記顆粒膜細胞および前記卵胞膜細胞が、前記組成物中で別々のマイクロカプセルに含まれる、請求項１に記載の組成物。
前記顆粒膜細胞および前記卵胞膜細胞が、前記組成物中で共に同じマイクロカプセルに含まれる、請求項１に記載の組成物。
前記マイクロカプセルが、コアと、前記コアを取り囲む補助層とを含み、前記コアが、前記顆粒膜細胞を含み、前記補助層が、前記卵胞膜細胞を含む、請求項３に記載の組成物。
前記マイクロカプセルが、前記コアと前記補助層との間に第一の半透層をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
前記マイクロカプセルが、前記補助層を取り囲む第二の半透層をさらに含む、請求項４〜５に記載の組成物。
前記マイクロカプセルが、前記第二の半透層を取り囲む外側の多糖類層をさらに含む、請求項４〜６に記載の組成物。
前記半透層が、ポリカチオンで形成されている、請求項４〜７に記載の組成物。
前記ポリカチオンが、ポリアミンである、請求項８に記載の組成物。
前記組成物が、卵母細胞を含まない、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
前記マイクロカプセルが、ヒドロゲルを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
前記ヒドロゲルが、多糖類ヒドロゲルを含む、請求項１１に記載の組成物。
前記マイクロカプセルが、直径１０マイクロメートルから直径５０００マイクロメートルまでである、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
前記顆粒膜細胞が、マイクロカプセル１つあたり１，０００個の細胞からマイクロカプセル１つあたり最大１×１０^９個の細胞の量で前記マイクロカプセルに含まれ、
前記卵胞膜細胞が、マイクロカプセル１つあたり１，０００個の細胞からマイクロカプセル１つあたり１×１０^９個の細胞の量で前記マイクロカプセルに含まれる、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
それを必要とする対象へのエストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンの投与方法であって、前記対象に、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物を治療有効量で投与することを含む方法。
前記投与ステップが、非経口注射によって行われる、請求項１５に記載の方法。
それを必要とする対象にエストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンを投与するための、または、それを必要とする対象にエストロゲンおよび任意選択的にプロゲステロンを投与するための医薬品を調製するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物の使用。