JP2014505720A - 抗ウイルス性組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ficus arnottianaという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物に関する。
本発明の詳細な説明に入る前に、本発明は特定の実施形態に限定されるものではないことが理解されなければならない。さらに、本明細書において使用する用語は特定の実施形態のみを説明することを目的としているのであって、限定することを意図していないことも理解されなければならない。
(a)溶媒中において1:8〜1:10の重量/体積比で、30℃〜50℃で3時間〜12時間攪拌することによって、Ficus arnottianaという植物の粉砕した全体または1つ以上の部分から抽出物を調製するステップと、
(b)ステップ(a)において得られた抽出物を濃縮するステップと、
(c)随意的に、ステップ(b)において得られた抽出物を、高真空下(0.01〜5mmHg)で乾燥させるステップと、
(d)随意的に、ステップ(b)またはステップ(c)において得られた抽出物を溶媒分離によって濃縮するステップと、
(e)ステップ(b)、ステップ(c)、または、ステップ(d)において得られた抽出物を薬学的に許容可能な担体と混合し、上記組成物を得るステップとを含む。
(a)溶媒中において1:8〜1:10の重量/体積比で、30℃〜50℃で3時間〜12時間攪拌することによって、Ficus arnottianaという植物の茎からの抽出物を調製するステップと、
(b)ステップ(a)において得られた抽出物を濃縮するステップと、
(c)随意的に、ステップ(b)において得られた抽出物を、高真空下(0.01〜5mmHg)で乾燥させるステップと、
(d)随意的に、ステップ(b)またはステップ(c)において得られた抽出物を溶媒分離によって濃縮するステップと、
(e)ステップ(b)、ステップ(c)、または、ステップ(d)において得られた抽出物を薬学的に許容可能な担体と混合し、治療用剤として調合するステップとを含む。
〔実施例1〕
Ficus arnottianaからのジクロロメタン(DCM)およびメタノール(1:1)抽出物の調製
Ficus arnottianaの収集したばかりの茎を、除湿器を用いて乾燥させ、粉砕した。40℃±5℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、等速で攪拌しながら、この粗く粉砕した物質(150g)を1500mLのDCM/メタノール(1:1)に3時間浸した。抽出物を濾過した。残留物を40℃±5℃で1500mLのDCM/メタノール(1:1)に3時間浸し、抽出物を濾過した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して(約500mmHg)45℃で濃縮して、5.0gの粗抽出物を得た(試料1とする)。
(i)50gの皮からは2.5gの抽出物が得られた(試料2とする)。
(ii)50gの皮無しの茎からは2.0g抽出物が得られた(試料3とする)。
(iii)300gの小枝からは16.3gの抽出物が得られた(試料4とする)。
実施例1の試料1、試料2、試料3、試料4の濃縮
ステップ1
試料1(1g)を30mLの水/メタノール(9:1)中において室温(25℃±5℃)で懸濁および超音波処理して溶解させ、30mLの石油エーテルを用いて3回続けて溶媒分離した(60℃〜80℃)。ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して石油エーテルの層を濃縮して、0.5gの石油エーテル画分を得た(試料5とする)。
ステップ1から得られた水性濾液を、30mLのクロロホルムを用いて3回続けて溶媒分離した。ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用してクロロホルム層を濃縮して、0.10gのクロロホルム画分を得た(試料6とする)。
次に、ステップ2から得られた水層を、30mLの酢酸エチルを用いて3回続けて溶媒分離した。ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して酢酸エチル層を濃縮して、0.07gの酢酸エチル画分を得た(試料7とする)。
次に、ステップ3から得られた水層を、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して濃縮して残留有機溶剤を除去して凍結乾燥し、0.24gの水性画分を得た(試料8とする)。
(i)1gの試料2を濃縮すると、0.06gの石油エーテル画分(試料9とする)と、0.16gのクロロホルム画分(試料10とする)と、0.07gの酢酸エチル画分(試料11とする)と、0.24gの水性画分(試料12とする)とが得られた。
(ii)1gの試料3を濃縮すると、0.21gの石油エーテル画分(試料13とする)と、0.19gのクロロホルム画分(試料14とする)と、0.29gの酢酸エチル画分(試料15とする)と、0.28gの水性画分(試料16とする)とが得られた。
(iii)1gの試料4を濃縮すると、0.64gの石油エーテル画分(試料17とする)と、0.15gのクロロホルム画分(試料18とする)と、0.03gの酢酸エチル画分(試料19とする)と、0.08gの水性画分(試料20とする)とが得られた。
Ficus arnottianaという植物からのメタノール抽出物の調製
Ficus arnottianaの収集したばかりの茎を乾燥させ、粉砕した。40℃±5℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、攪拌しながら、この粗く粉砕した物質(50g)を500mLのメタノールに3時間浸した。抽出物を濾過した。残留物を40℃±5℃で500mLのメタノールに3時間浸し、抽出物を濾過した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して濃縮して、2.06gの抽出物を得た(試料21とする)。
Ficus arnottianaという植物からのメタノール/水(1:1)抽出物の調製
Ficus arnottianaの収集したばかりの茎を乾燥させ、粉砕した。40℃±5℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、等速で攪拌しながら、この粗く粉砕した物質(100g)を1Lのメタノール/水(1:1)に3時間浸した。抽出物を濾過した。残留物を40℃±5℃で800mLのメタノール/水(1:1)に3時間浸し、抽出物を濾過した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して濃縮して凍結乾燥し、5.67gのハイドロメタノール抽出物を得た(試料23とする)。
Ficus arnottianaという植物からの水抽出物の調製
Ficus arnottianaの収集したばかりの茎を乾燥させ、粉砕した。45℃±5℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、等速で攪拌しながら、この粗く粉砕した物質(50g)を500mLの水に3時間浸した。抽出物を濾過して凍結乾燥し、1.04gの抽出物を得た(試料25とする)。
調合物の調製
クリームの調製の一般的な手順
わずかに加熱した適切なガラス/ステンレス鋼製容器内において、必要量のメチルパラベンおよびプロピルパラベンを、プロピレングリコールおよび水に溶解させた(表1を参照)。実施例4の試料23を該容器に加え、機械的な攪拌機を用いて溶解/分散させた。温度は60℃〜75℃で維持した。等速で攪拌しながら、この溶液にモノステアリン酸グリセリンおよびプロピレングリコールを加えた。蜜蝋、白色軟質パラフィン、および、モノステアリン酸グリセリンを融解させて、等速で攪拌しながら上記容器に加えた。温度を室温までゆっくりと下げた。
分析的分析
第1部 実施例4の試料23の評価
実施例4の試料23(100mg)を1mLのメタノール/水(1:1)に溶解させ、1mLの0.04MのKMnO4で処理し、室温で15分間保存した。この混合物を希釈液(メタノール/水(1:1))で希釈し、0.45μのポリフッ化ビニリデン(PVDF)製フィルタで濾過し、濾液をHPLCによって分析した。
カラム: Unisphere aqua C18型、150×4.6mm、3μm
移動相A: 0.1%のトリフルオロ酢酸
移動相B: アセトニトリル
勾配: 時間(分)/%A: 0/90、25/60、30/20、35/20、36/90、40/90
作動時間: 40分
濃度: 10mg/mL
希釈液: メタノール/水(1:1)
波長: 270nm
図1は、実施例4の試料23の分析用クロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、保持時間14.3および21.8においてBM1(生物活性マーカー1)およびBM2(生物活性マーカー2)の2つの生物活性マーカーのピークを示す。いずれの生物活性マーカーも抗ウイルス活性を示した。BM1およびBM2を単離し、第3部に記載するように精製した。
実施例6の調合物IBの評価
実施例6の調合物IB(1g)を15mLのメタノール/水(1:1)に溶解させ、60℃で20分間加熱した。この結果得られた溶液を上記希釈液で20mLまで希釈し、0.45μのポリフッ化ビニリデン(PVDF)製フィルタで濾過し、濾液をHPLCによって分析した。
カラム: Unisphere aqua C18型、150×4.6mm、3μm
移動相A: 0.1%のトリフルオロ酢酸
移動相B: アセトニトリル
勾配: 時間(分)/%A: 0/90、25/60、30/20、35/20、36/90、40/90
作動時間: 40分
濃度: 50mg/mL
希釈液: メタノール/水(1:1)
波長: 270nm
図2は、実施例6の調合物IBの分析用クロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、保持時間14.3および21.8においてBM1およびBM2の2つの生物活性マーカーのピークを示す。いずれの生物活性マーカーも抗ウイルス活性を示した。BM1およびBM2を単離し、第3部に記載するように精製した。
生物活性マーカーの単離
実施例4の試料23(85.0g)を1.6Lのメタノールに溶解させ、10分間超音波処理し、30分間放置して沈殿させた。上清をデカントし濾過して、濾液1を得た。不溶性部は200mLのメタノールで洗浄し、上清は濾過して濾液2を得た。濾液1および濾液2をロータリーエバポレーターにプールして乾燥させ、26.18gの試料を得た。得られた試料のうち13.0gを36mLのメタノール/水(75:25; v:v)に溶解させ、超音波処理および遠心分離した。上清をLH−20型カラム(5×80cm)に仕込み、メタノール:水(75:25; v:v)で溶出させた。同じ試料の13.0gの別のバッチを、上述の手順で処理した。どちらの画分も収集して、HPLCによって分析した。
カラム: Unisphere、C18型、250×4.6mm、5μm
移動相A: 0.1%のトリフルオロ酢酸
移動相B: アセトニトリル
勾配: 時間(分)/%A: 0/90、30/20、35/20、36/90、40/90
作動時間: 40分
注入体積: 10μL
波長: 270nm
カラム: Redisep C18型、14×2cm
移動相A: 0.1%のトリフルオロ酢酸
移動相B: アセトニトリル
勾配: 時間(分)/%A: 0/90、30/20、35/20、36/90、40/90
流量: 30mL/分
波長: 270nm
フラッシュクロマトグラフィーの各画分をHPLCによってモニタリングした。生物活性マーカー1を含む画分をプールし、真空下40℃で乾燥するまで蒸発させて、30mgの半純粋(semipure)な生物活性マーカー1を得た。これを、シリカ系カラムを用いた半分取HPLCによってさらに精製し、5.3mgの生物活性マーカー1を得た。実施例4の試料23中に、生物活性マーカー1は0.02%〜0.8%の範囲で存在する。
カラム: Grace Silica社製、5μ(250×10mm)
移動相: メタノール/ジクロロメタン(10:90); v:v
流量: 5mL/分
波長: 270nm
試料濃度: 20mg/mL
フラッシュクロマトグラフィーの各画分をHPLCによってモニタリングした。各画分から生物活性マーカー2の結晶が得られた。これらの結晶をデカンテーションによって分離して乾燥させ、20mgの生物活性マーカー2を得た。質量分析およびNMR分析によるデータにもとづいて、生物活性マーカー2は5,7,4’−トリヒドロキシフラボンであると特定した。5,7,4’−トリヒドロキシフラボンの分子式はC15H10O5であり、分子量は270.05である。実施例4の試料23中に、生物活性マーカー2は0.01%〜0.1%の範囲で存在する。
インビトロ抗ウイルスアッセイ
〔実施例8〕
ウイルスストックの調製
使用物質
細胞株: ベロ(アフリカミドリザルの腎細胞株の腎臓の上皮細胞、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)CCL−81)
ウイルス: HSV−1(ATCC株であるVR−1493、および、インド、ピューンのNational Institute of Virologyから入手した臨床株)
: HSV−2(ATCC株であるVR−734、および、インド、ピューンのNational Institute of Virologyから入手した臨床株)
培地: Dulbecco社、Modified Eagle Medium(DMEM、Gibco、米国、Cat.番号: 12430)
血清: ウシ胎仔血清(FBS、Gibco、米国、Cat.番号: 16000−044)
トリプシン−EDTA溶液: 0.25%のトリプシン−エチレンジアミン四酢酸(トリプシン−EDTA、Gibco、米国、Cat.番号: 25200)
標準化合物: アシクロビル(Medicorp社、インド、ハイデラバード)
プラスチック器具: 組織培養フラスコ、25cm2(Nunc社、米国、Cat.番号: 156367)
: 組織培養フラスコ、75cm2(Nunc社、米国、Cat.番号: 156499)
: 遠心管、15mL(Nunc社、米国、Cat.番号: 366060)
: 遠心管、50mL(Nunc社、米国、Cat.番号: 373687)
: 96ウェルの平底プレート(Nunc社、米国、Cat.番号: 167008)
染色剤: クリスタルバイオレット(Sigma社、米国、Cat.番号:C3886−25G)
抗菌性/抗真菌性混合物: 3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(Gibco、米国、Cat.番号: 15240)
(MTT)試薬: (Trevigen社、Gaithersburg、メリーランド州、Cat.番号: 4890−25−01)
洗浄剤: (Trevigen社、Gaithersburg、メリーランド州、Cat.番号: 4890−25−02)
細胞株の維持
Antiviral Research,2005,67,24−30に記載されているようにして、細胞株を維持した。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
ウイルス(HSV−1およびHSV−2)の増殖
Antiviral Research,2005,67,24−30に記載されているようにして、ウイルスを増殖させた。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
細胞変性効果(CPE)アッセイによるウイルスのタイターの決定
World J.Gastroenterol.,2006,12:4078−4081に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
CPEアッセイによって決定したHSV−1のウイルスのタイターは、5.88×106TCID50/mLであった。
プラークアッセイによるウイルスのタイターの決定
Antiviral Res.,2005,67(1):24−30に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
(生成されたプラークの個数 × ウイルスの希釈度 × 接種材料の体積)
プラークアッセイによって決定したHSV−1のウイルスのタイターは、2.1×108pfu/mLであった。
CPE阻害アッセイ(クリスタルバイオレット染色法)により、一次抗ウイルススクリーニング検査を実施した
このアッセイは、ウイルスの生殖周期のどの段階においても活性を示す薬剤(この場合には抽出物)を検出するために設計した。Indian J.Med. Res.,2004,120:24−29に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
nd 実施せず − 0〜10%
+ 11〜25% ++ 26〜50%
+++ 51〜75% ++++ 76〜100%
CPE阻害アッセイ、MTT法
HSV−1およびHSV−2のいずれについても投与量に対する良好な反応性を示した抽出物について、IC50を決定した。IC50はCPE阻害アッセイ(MTT法)によって推定した。
(ODT)HSVは、HSV感染細胞においてある濃度の抽出物を用いて測定した吸光度である。
(ODC)HSVは、コントロールである無処置のHSV感染細胞について測定した吸光度を指す。
(ODC)mockは、コントロールである無処置のモック感染細胞について測定した吸光度を指す。
HSV−1に対する実施例1の試料1のIC50値は、15.48μg/mLであった。
細胞毒性試験
World J.Gastroenterol.,2006,12:4078−4081に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
Aは、ELISA読み取り装置で測定した吸光度を表わす。
感染後の異なる時点におけるHSV−1およびHSV−2の増殖に対する実施例4の試料23の効果の評価
この研究の目的は、実施例4の試料23によって阻害されるHSV−1/HSV−2の増殖段階を決定することである。抗ウイルス薬の候補は、例えば、吸着、融合、脱外被、逆転写、統合、核酸合成、成熟などの増殖サイクルの任意の段階において特異的にウイルスを阻害し、目標とする可能性がある(Methods in Molecular Medicine,1998,vol 10,387−405)。これらの各段階は、1時間(吸着開始)から24時間(1つのHSV増殖サイクルの完了)にわたる、ウイルスの生涯過程における異なる時点で発生する。ウイルスの生涯過程の吸着段階とは、ヘルペスウイルスが宿主細胞に取り付く初期の段階であって、ウイルス上のgCおよびgD(貯蔵糖タンパク質)と細胞表面レセプター(例えばヘパリン硫酸塩)との相互作用をともなう。ウイルスの生涯過程における取り付き段階は、ウイルスが細胞と密接に関連することを可能にする安定した取り付き段階である。吸着段階および取り付き段階に続くウイルスの生涯過程の段階は、感染後の段階として知られている。
●吸着段階に対応する0時間後に、50μg/mLでは52%の抗ウイルス活性、100μg/mLでは77%の抗ウイルス活性、200μg/mLでは64%の抗ウイルス活性が観察された。
●取り付き段階に対応する感染後1時間で、100μg/mLでは80%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは64%の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖開始に対応する感染後3時間で、100μg/mLでは90%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは70%の抗ウイルス効果が観察された。
●HSVウイルスDNA合成に対応する感染後5時間で、100μg/mLでは83%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは68%の抗ウイルス効果が観察された。
●HSVウイルスDNA合成の後期の各段階に対応する感染後7時間で、100μg/mLでは77%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは73%の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖の最大効率に対応する感染後16時間で、100μg/mLでは75%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは71%の抗ウイルス効果が観察された。
●HSVウイルス粒子の放出(増殖後に起こる、宿主細胞からの成熟したウイルス粒子の放出)に対応する感染後24時間で、100μg/mLでは36%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは37%の抗ウイルス効果が観察された。
HSV−1に対する実施例4の試料23の抗ウイルス活性は、上記のように感染後3時間でピークに達した。また、この活性は感染後0〜16時間では強力であったが、感染後24時間では大幅に低下した。
●吸着段階に対応する0時間後に、50μg/mLでは77%の抗ウイルス活性、100μg/mLでは76%の抗ウイルス活性、200μg/mLでは51%の抗ウイルス活性が観察された。
●取り付き段階に対応する感染後1時間で、100μg/mLでは66%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは52%の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖開始に対応する感染後3時間で、100μg/mLでは74%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは55%の抗ウイルス効果が観察された。
●HSVウイルスDNA合成に対応する感染後5時間で、100μg/mLでは79%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは63%の抗ウイルス効果が観察された。
●HSVウイルスDNA合成の後期の各段階に対応する感染後7時間で、100μg/mLでは83%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは67%の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖の最大効率およびウイルス粒子放出の開始に対応する感染後16時間で、100μg/mLでは83%の抗ウイルス効果、200μg/mLでは67%の抗ウイルス効果が観察された。
●感染後24時間では、抗ウイルス効果が観察されなかった。
HSV−2に対する実施例4の試料23の抗ウイルス活性は、感染後7〜16時間でピークに達した。また、この活性は感染後0〜16時間には強力であった。
単純ヘルペスウイルス(HSV−1およびHSV−2)に対する、感染前の実施例4の試料23の抗ウイルス活性の評価
ヘルペスウイルスが標的細胞に侵入するためには、自身が持つ脂質膜からなる外被を、細胞が持つ脂質膜と融合させなければならない。この複雑なウイルス侵入メカニズムは、少なくとも3種類の貯蔵糖タンパク質(gC、gB、および、gD)と、該タンパク質の持つ、例えばネクチンやヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)などの細胞表面レセプターを結合させる能力とによって媒介される(Cell.Mol.Life Sci,2008,65,1653−1668)。この前処理アッセイの目的は、ベロ細胞に吸着または侵入するために必要な、例えば上記糖タンパク質などのウイルス粒子の外被の構造、または、例えばヘパラン硫酸(HS)などの細胞表面レセプターの構造と相互作用することによって、実施例4の試料23がウイルス阻害を引き起こすことができるかどうかを確認することである。
図3は、HSV−1に対する63〜88%の阻害率が示唆するように、実施例4の試料23が200〜400μg/mLにおいて有意な阻害活性を有することを示している。実施例4の試料23のIC50値を算出すると、HSV−1に対して171.25μg/mLであった。HSV−1に対する実施例4の試料23の観察された阻害効果は、アシクロビルが3.125〜400μg/mLの濃度範囲で示した10〜40%という弱い阻害効果と比較すると強力であった。
実施例4の試料23を用いた前処理によって、ウイルスとの接触後すぐにHSV−1およびHSV−2のベロ細胞への侵入(吸着および取り付き)に対して有意な阻害が生じた。これは予防作用を示している。この阻害効果は、アシクロビルの持つ阻害効果に比べて非常に強力であった。
ウイルス吸着アッセイ
ウイルスの生涯過程には、抗ウイルス性生成物となり得る有望な候補が目標とし得る、吸着、融合、脱外被、逆転写、統合、核酸合成、成熟などの多数のステップが存在する。したがって、吸着アッセイの結果は、感染サイクル中の吸着段階においてHSV−1またはHSV−2を阻害し、ウイルス上の糖タンパク質C(gC)および糖タンパク質D(gD)がヘパラン硫酸(HS)などの細胞表面レセプターであるグリコサミノグリカン(GAG)と相互作用する、実施例4の試料23の信頼性を確認するために役立つ。
図5は、実施例4の試料23が、HSV−1ウイルスの吸着に対して100〜400μg/mLでは100%の阻害率を達成でき、50μg/mLでは阻害率が65%まで低下したことを示している。実施例4の試料23のIC50は、HSV−1に対しては44μg/mLである。
ウイルス侵入アッセイ
HSVの宿主細胞への侵入は、ウイルス粒子の外被の細胞膜との融合を引き起こす、宿主細胞の表面への初期結合に続くステップであると規定され得る。そのためには、各種糖タンパク質(gB、gD、および、gH/gL)および細胞表面成分が関与する複数回の相互作用が連続して起こることが必要である(Cell.Mol.Life Sci,2008,65,1653−1668)。このウイルス侵入アッセイの目的は、実施例4の試料23が、HSV−1ウイルスおよびHSV−2ウイルスのベロ細胞への侵入を阻害するかどうかをインビトロで確認することである。
図7は、HSV−1ウイルスに対する実施例4の試料23の阻害率が50〜400μg/mLにおいて80〜95%であるが、これより低い濃度(3.125〜25μg/mL)では低下することを示している。HSV−1ウイルスに対する実施例4の試料23のIC50を算出すると、30μg/mLであった。
上記結果は、HSV−1ウイルスおよびHSV−2ウイルスが宿主であるベロ細胞へ侵入するというステップを強力には阻害しなかったアシクロビルと比較すると、実施例4の試料23がHSV−1ウイルスおよびHSV−2ウイルスのベロ細胞への侵入を強く阻害することができたことを示唆している。
HSV−1およびHSV−2に対する実施例4の試料23の殺ウイルス活性の評価
殺ウイルスアッセイでは、培養細胞に対するウイルス粒子の感染力をブロックするために、抗ウイルス薬の連続的な存在が必要とされることが多い。また、ウイルス/抽出物複合体の希釈液は解離し、感染性ウイルスを放出することがある(Antiviral research,2010,86,196−203)。仮に試料がIC50または他の効果的な濃度においてウイルスの感染力を抑制することができないのであれば、抗ウイルス活性は該試料の殺ウイルス力とは無関連である。この研究の目的は、HSV−1およびHSV−2に対する実施例4の試料23の阻害活性が、該試料の持つ抗ウイルス効果または殺ウイルス効果に起因するものであるのかどうかをインビトロで評価することである。
図9は、200〜400μg/mLではHSV−1に対する実施例4の試料23の殺ウイルス効果が100%であり、100μg/mLでは阻害率が94%であることを示している。アシクロビルは、25〜400μg/mLの濃度範囲ではHSV−1に対して0〜32%の範囲の弱い殺ウイルス効果を示した。
実施例4の試料23は、アシクロビルと比較すると、HSV−1ウイルスおよびHSV−2ウイルスに対して強力な殺ウイルス効果を示した。
実験で使用する動物は、CPCSEA(Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals、インド、タミルナドゥ)が公開する施工中の指針にしたがって収容および飼育した。実験動物を用いる手順は、Piramal Healthcare Limited社(インド、ムンバイ、Goregaon)のIAEC(Institutional Animal Ethics Committee)によって承認を受けた。
マウスHSV−1の帯状疱疹様が広がる感染モデル
Antimicrobial Agents and Chemotherapy,June 2002,p.1766−1772に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
(b) 調合物IB
(c) 調合物IC
調合物IA、調合物IB、および、調合物ICを局所的に1日に3回、5日間にわたって塗布した。15mgの調合物IAがマウスにおいて評価対象となる225mg/kgの投与量に対応し、15mgの調合物IBがマウスにおいて評価対象となる450mg/kgの投与量に対応し、15mgの調合物ICがマウスにおいて評価対象となる675mg/kgの投与量に対応し、25mgの調合物IBがマウスにおいて評価対象となる750mg/kg投与量に対応する。
0: 顕性感染がない
1: 小胞が形成されている
2: 大きなパッチ状の帯状疱疹が形成されている
3: 培養密度の高い帯状疱疹
4: 後肢の麻痺
どの投与量グループに属するマウスも、感染後2日目までに帯状疱疹様病変の初期の徴候を示し始めた。
1 プラセボによる治療を受けたグループ
(a)マウスは感染後6日目までに重度の感染を示し始めた。
(b)すべてのマウスが感染後8日目までに死亡した。
2 アシクロビルによる治療を受けたグループ
(a)すべてのマウスが感染後7日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
(b)実験期間を通じてマウスは一匹も死亡しなかった。
3 無処置グループ(感染コントロール)
(a)マウスは感染後6日目までに重度の感染を示し始めた。
(b)すべてのマウスが感染後10日目までに死亡した。
4 調合物IBによる治療を受けたグループ(750mg/kg/日)
(a)調合物IB(750mg/kg/日)による治療を受けたマウスは90%の生存率を示した。
(b)生き残ったマウスは感染後9日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
5 調合物ICによる治療を受けたグループ(675mg/kg/日)
(a)調合物IC(675mg/kg/日)による治療を受けたマウスは80%の生存率を示した。
(b)生き残ったマウスは感染後10日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
6 調合物IBによる治療を受けたグループ(450mg/kg/日)
(a)調合物IB(450mg/kg/日)による治療を受けたマウスは60%の生存率を示した。
(b)生き残ったマウスは感染後10日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
7 調合物IAによる治療を受けたグループ(225mg/kg/日)
(a)調合物IA(225mg/kg/日)による治療を受けたマウスは20%の生存率を示した。死亡したマウスの大部分は感染後8日目以内に死亡した。
(b)生き残ったマウスは感染後9日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
調合物IBおよび調合物ICは、マウスHSV−1の帯状疱疹様が広がる感染モデルにおいて、750および675mg/kg/日という比較的高い濃度において良好な抗ウイルス活性を示した。
マウスの膣のHSV−2感染モデル
Antiviral Research,2006,69:77−85に記載されているようにして、アッセイ行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。
(a) 調合物IA
(b) 調合物IB
(c) 調合物IC
調合物IA、調合物IB、および、調合物ICを局所的に1日に3回、5日間にわたって塗布した。15mgの調合物IAがマウスにおいて評価対象となる225mg/kgの投与量に対応し、15mgの調合物IBがマウスにおいて評価対象となる450mg/kgの投与量に対応し、15mgの調合物ICがマウスにおいて評価対象となる675mg/kgの投与量に対応する。
0: 顕性感染がない
1: 単独の丘疹が数箇所、膣外組織の軽微な発赤
2: 単独の丘疹が数箇所、膣外組織の潰瘍および/または焼痂および/または膨化および発赤
3: 膣外組織の複数が融合してできた潰瘍/焼痂、中程度の膨化、および、発赤、周囲の組織への拡大
4: 膣外組織の重篤な発赤をともなう潰瘍および膨化、周囲の組織への拡大、後ろ脚の麻痺
1 プラセボによる治療を受けたグループ
(a)膣外感染の最も早い徴候は7日目に現れた。
(b)マウスの90%が14日目までに死亡した。
2 アシクロビルによる治療を受けたグループ
(a)膣外疾患の徴候を示したマウスは一匹もいなかった。
(b)実験期間を通じてマウスは一匹も死亡しなかった。
3 調合物IAによる治療を受けたグループ(225mg/kg/日)
(a)調合物I(225mg/kg/日)による治療を受けたマウスは90%の生存率を示した。
(b)10匹のマウスのうち1匹に感染後8日目までに臨床的病変が現れた。このマウスその後死亡した。その他のマウスは、どの個体もウイルスに誘発された膣外疾患の特徴的な徴候を実験期間を通じて一切示さなかった。
4 調合物IBによる治療を受けたグループ(450mg/kg/日)
(a)調合物IBの抽出物(450mg/kg/日)による治療を受けたマウスは90%の生存率を示した。
(b)10匹のマウスのうち2匹に感染後14日目までに臨床的病変が現れた。このうちの1匹のマウスはその後死亡した。その他のマウスは、どの個体もウイルスに誘発された膣外疾患の特徴的な徴候を実験期間を通じて一切示さなかった。
5 調合物ICによる治療を受けたグループ(675mg/kg/日)
(a)膣外疾患の徴候を示したマウスは一匹もいなかった。
(b)実験期間を通じてマウスは一匹も死亡しなかった。
調合物IA、調合物IB、および、調合物ICは、マウスの膣のHSV−2感染モデルにおいて、225、450、および、675mg/kg/日で抗ウイルス活性を示した。
Claims (28)
- Ficus arnottianaという植物の全体または1つ以上の部分を、溶媒中において1:8〜1:10の重量/体積比で、30℃〜50℃で3時間〜12時間攪拌し、続いて抽出物を濃縮し、さらに随意的にこの抽出物を溶媒分離(solvent partitioning)によって濃縮することによって調製される、該植物の全体または1つ以上の部分からの単離抽出物。
- Ficus arnottianaという植物の全体または1つ以上の部分から請求項1に記載のように調製される治療上有効な量の単離抽出物と、薬学的に許容可能な担体とを包含する組成物。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が該植物の茎から得られる、請求項2に記載の組成物。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が該植物の皮から得られる、請求項2に記載の組成物。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が該植物の小枝から得られる、請求項2に記載の組成物。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が1つ以上の生物活性マーカーを含有する、請求項2〜5のうちのいずれか1つに記載の組成物。
- 上記生物活性マーカーがフロリジン、5,7,4’−トリヒドロキシフラボン、または、これらの混合物である、請求項6に記載の組成物。
- 経口投与用または局所投与用として調合される、請求項2〜7のうちのいずれか1つに記載の組成物。
- クリーム、ゲル、または、軟膏の形態で局所投与用として調合される、請求項8に記載の組成物。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物を5%〜50%(w/w)含有する、請求項9に記載の組成物。
- 単純ヘルペスウイルス(HSV)によって引き起こされるウイルス感染症の治療において使用するための、Ficus arnottianaという植物からの抽出物から単離される生物活性マーカーであって、
該バイオマーカーがフロリジン、5,7,4’−トリヒドロキシフラボン、または、これらの混合物から選択される、生物活性マーカー。 - 上記ウイルス感染症がHSV−1によって引き起こされる、請求項11に記載の生物活性マーカー。
- 上記ウイルス感染症がHSV−2によって引き起こされる、請求項11に記載の生物活性マーカー。
- (a)溶媒中において1:8〜1:10の重量/体積比で、30℃〜50℃で3時間〜12時間攪拌することによって、Ficus arnottianaという植物の粉砕した全体または1つ以上の部分から抽出物を調製するステップと、
(b)ステップ(a)において得られた抽出物を濃縮するステップと、
(c)随意的に、ステップ(b)において得られた抽出物を、高真空下(0.01〜5mmHg)で乾燥させるステップと、
(d)随意的に、ステップ(b)またはステップ(c)において得られた抽出物を溶媒分離によって濃縮するステップと、
(e)ステップ(b)、ステップ(c)、または、ステップ(d)において得られた抽出物を薬学的に許容可能な担体と混合し、治療用剤として調合するステップとを含む、請求項2に記載の組成物の調製プロセス。 - Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が該植物の茎から得られる、請求項14に記載のプロセス。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が該植物の皮から得られる、請求項14に記載のプロセス。
- Ficus arnottianaという植物からの上記抽出物が該植物の小枝から得られる、請求項14に記載のプロセス。
- ステップ(a)において使用される上記溶媒が、メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、水、または、これらの複数の混合物から選択される、請求項14に記載のプロセス。
- 上記溶媒がメタノールと水との混合物である、請求項18に記載のプロセス。
- ステップ(a)において得られた上記抽出物が濃縮前に濾過される、請求項14に記載のプロセス。
- ステップ(d)において、溶媒分離するために使用される上記溶媒が水、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、n−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、または、これらの複数の混合物から選択される、請求項14に記載のプロセス。
- 被験体において単純ヘルペスウイルス(HSV)によって引き起こされるウイルス感染症の治療方法であって、
Ficus arnottianaという植物の全体または1つ以上の部分からの治療上有効な量の単離抽出物と薬学的に許容可能な担体とを包含する組成物を被験体に投与することを含む治療方法。 - 上記ウイルス感染症がHSV−1によって引き起こされる、請求項22に記載の治療方法。
- 上記ウイルス感染症がHSV−2によって引き起こされる、請求項22に記載の治療方法。
- 単純ヘルペスウイルス(HSV)によって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、Ficus arnottianaという植物の全体または1つ以上の部分からの治療上有効な量の単離抽出物を包含する組成物。
- 上記HSVがHSV−1である、請求項25に記載のように使用するための組成物。
- 上記HSVがHSV−2である、請求項25に記載のように使用するための組成物。
- Ficus arnottianaという植物の全体または1つ以上の部分からの単離抽出物と薬学的に許容可能な担体とを、単純ヘルペスウイルス(HSV)によって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療のための治療薬を製造する用途に用いる使用方法。
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