JP2014155471A

JP2014155471A - 血小板産生流路装置及び血小板産生方法

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Publication number: JP2014155471A
Application number: JP2013028809A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Oba; 隆之大場
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2013-02-18
Filing date: 2013-02-18
Publication date: 2014-08-28

Abstract

【課題】体外において巨核球から血小板を効果的に大量産生する血小板産生流路装置及び血小板産生方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る血小板産生流路装置は、制御された形状及び配置で複数の微小孔（１３）が形成され、その一方側の表面（１１）に巨核球（Ｍ）が配置される多孔薄膜（１０）と、前記多孔薄膜の前記一方側に設けられ、前記巨核球が培養される培養室（２０）と、前記多孔薄膜の他方側に設けられ、前記培養室内で前記巨核球が培養される間、培養液（Ｓ）が流れる微小流路（３０）と、を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、血小板産生流路装置及び血小板産生方法に関し、特に、体外において巨核球から血小板を大量産生するための流路装置に関する。

血小板は、体内において、骨髄中で造血前駆細胞が巨核球へと分化し、さらに当該巨核球の細胞質が断片化して、血液中に放出されることにより産生される。また、近年、ｉＰＳ細胞（induced Pluripotent Stem cell）を用いて、体外において巨核球から血小板を産生することも報告されている。

しかしながら、血小板は、凍結保存ができないため、当該血小板を含む血液を採取してから、あるいはｉＰＳ細胞に由来する巨核球を用いて産生されてから、数日程度しか保存できない。一方、造血前駆細胞は、凍結保存が可能である。

そこで、特許文献１では、不織布等の支持多孔膜と有機高分子の多孔薄膜とを積層して作製された複合膜を培養液中に浸漬し、当該多孔薄膜で仕切られた２つの領域のうち、当該支持多孔膜側の領域に血小板前駆細胞を配置し、当該多孔薄膜側の領域でスターラーを用いて培養液の回転流を生じさせることにより当該多孔薄膜にシェアストレスを与え、当該血小板前駆細胞より血小板を産生する方法が提案されている。

特開２００９−２９７０２３号公報

しかしながら、上記特許文献１に記載の方法では、例えば、回転流によってシェアストレスを発生させるため、多孔薄膜の表面内で培養液の流速に分布が生じ、当該表面の全体に均一なシェアストレスを与えることができないといった問題や、不織布等の支持多孔膜に血小板前駆細胞を配置するため、当該血小板前駆細胞の配置を直接的に制御できないといった問題があった。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、体外において巨核球から血小板を効果的に大量産生する血小板産生流路装置及び血小板産生方法を提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る血小板産生流路装置は、制御された形状及び配置で複数の微小孔が形成され、その一方側の表面に巨核球が配置される多孔薄膜と、前記多孔薄膜の前記一方側に設けられ、前記巨核球が培養される培養室と、前記多孔薄膜の他方側に設けられ、前記培養室内で前記巨核球が培養される間、培養液が流れる微小流路と、を備えることを特徴とする。本発明によれば、体外において巨核球から血小板を効果的に大量産生する血小板産生流路装置を提供することができる。

また、前記複数の微小孔の各々の孔径は、２〜１５μｍであることとしてもよい。また、前記複数の微小孔の平均孔径は、２〜１５μｍであることとしてもよい。また、前記複数の微小孔は、孔径加工精度±１０％以下で形成されていることとしてもよい。また、前記多孔薄膜の厚さは、５〜４０μｍであることとしてもよい。また、前記複数の微小孔の開口率は、４〜４５％であることとしてもよい。また、前記微小流路は、前記培養液を１〜１００ｍｍ／秒の流速で流すことができるよう形成されていることとしてもよい。

また、前記血小板産生流路装置は、前記多孔薄膜近傍の温度を制御する温度制御部をさらに備えることとしてもよい。この場合、前記温度制御部は、前記温度を３０〜４０℃に制御することとしてもよい。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る血小板産生方法は、制御された形状及び配置で複数の微小孔が形成された多孔薄膜と、前記多孔薄膜の一方側に設けられた培養室と、前記多孔薄膜の他方側に設けられた微小流路と、を備えた血小板産生流路装置を準備すること、前記培養室内において前記多孔薄膜の前記一方側の表面に巨核球を配置すること、前記微小流路に培養液を流しながら前記培養室内で前記巨核球を培養して血小板を産生すること、及び前記微小孔を介して前記微小流路内の前記培養液中に放出された前記血小板を回収すること、を含むことを特徴とする。本発明によれば、体外において巨核球から血小板を効果的に大量産生する血小板産生方法を提供することができる。

また、前記血小板産生方法において、前記微小流路に１〜１００ｍｍ／秒の流速で前記培養液を流すこととしてもよい。

本発明によれば、体外において巨核球から血小板を効果的に大量産生する血小板産生流路装置及び血小板産生方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る血小板産生流路装置の一例の基本構造、及び当該装置を使用して巨核球から血小板を産生する様子を概略的に示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例において使用された血小板産生流路装置の断面を示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例において使用された血小板産生流路装置を平面視で示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例において形成された多孔薄膜を平面視で示す説明図である。本発明の一実施形態に係る多孔薄膜における微小孔の配置パターンの一例を示す説明図である。本発明の一実施形態に係る多孔薄膜における微小孔の配置パターンの他の例を示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程の他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例における多孔薄膜の形成に含まれる複数の工程のさらに他の一つを示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例において多孔薄膜に配置された巨核球を観察した結果の一例を示す説明図である。本発明の一実施形態に係る実施例において巨核球からの血小板の産生を評価した結果の一例を示す説明図である。本発明の一実施形態に係る血小板産生流路装置の他の例の基本構造を概略的に示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。

本実施形態に係る血小板産生流路装置（以下、「本装置」という。）は、体外において巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する装置である。本実施形態に係る血小板産生方法（以下、「本方法」という。）は、体外において巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する方法である。

図１には、本装置１の一例の基本構造、及び本方法により本装置１を使用して巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する様子を概略的に示す。図１に示すように、本装置１は、制御された形状及び配置で複数の微小孔１３が形成され、その一方側の表面１１に巨核球Ｍを配置する多孔薄膜１０と、当該多孔薄膜１０の当該一方側に設けられ、当該巨核球Ｍを培養する培養室２０と、当該多孔薄膜１０の他方側に設けられ、当該培養室２０内で当該巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する間、培養液Ｓが流れる微小流路３０と、を備える。

また、本方法は、制御された形状及び配置で複数の微小孔１３が形成された多孔薄膜１０と、当該多孔薄膜１０の一方側に設けられた培養室２０と、当該多孔薄膜１０の他方側に設けられた微小流路３０と、を備えた血小板産生流路装置（本装置１）を準備すること、当該培養室２０内において当該多孔薄膜１０の当該一方側の表面１１に巨核球Ｍを配置すること、当該微小流路３０に培養液Ｓを流しながら当該培養室２０内で当該巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生すること、及び当該微小孔１３を介して当該微小流路３０内の当該培養液Ｓ中に放出された当該血小板Ｐを回収すること、を含む。

多孔薄膜１０は、制御された形状及び配置で複数の微小孔１３が形成され、本装置１において巨核球Ｍを培養する際に当該巨核球Ｍを配置する表面１１を有するものであれば特に限られない。

多孔薄膜１０は、例えば、基板の微細加工により形成されることとしてもよい。微細加工は、例えば、ＭＥＭＳ（ＭｉｃｒｏＥｌｅｃｔｒｏＭｅｃｈａｎｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）の加工技術であり、より具体的には、例えば、フォトリソグラフィである。

多孔薄膜１０は、例えば、エッチング等の微細加工により、基板の一部を削って厚さを減じることにより形成されたものであることとしてもよい。この場合、本装置１は、微細加工により基板の一部を削って厚さを減じることにより形成された多孔薄膜１０と、当該多孔薄膜１０より厚く、当該多孔薄膜１０を囲む当該基板の他の一部から構成された枠部とを一体的に有する基板部を備えることとしてもよい（後述）。

多孔薄膜１０を構成する材料は、特に限られず、無機材料及び／又は有機材料を使用することができる。無機材料製の多孔薄膜１０は、耐熱性に優れている点で好ましい。無機材料製の多孔薄膜１０は、例えば、無機材料製の基板（例えば、シリコンウェハ）の微細加工により形成される。

多孔薄膜１０は、巨核球Ｍが配置される一方側の平坦な表面１１と、他方側の平坦な表面１２とを有することとしてもよい。また、一方側の表面１１と他方側の表面１２とは平行に形成されていることとしてもよい。

多孔薄膜１０の厚さは、当該多孔薄膜１０が、その一方の表面１１における巨核球Ｍの配置及び培養に耐える力学的強度を有し、且つ当該巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの微小孔１３を介した微小流路３０への放出を著しく妨げない範囲であれば特に限られないが、例えば、５〜４０μｍであることとしてもよく、５〜３０μｍであることとしてもよく、５〜２０μｍであることとしてもよい。

例えば、多孔薄膜１０の厚さが５〜２０μｍである場合には、当該多孔薄膜１０が、巨核球Ｍから血小板Ｐが産生される生体内環境における血管壁（厚さ１０μｍ程度）に類似した構造となり好ましい。

複数の微小孔１３は、制御された形状及び配置で形成されたものであれば特に限られない。制御された形状及び配置で形成された複数の微小孔１３は、例えば、基板の微細加工により形成された複数の微小孔１３であることとしてもよい。微細加工は、例えば、ＭＥＭＳの加工技術であり、より具体的には、例えば、フォトリソグラフィである。

微小孔１３は、多孔薄膜１０の一方側の表面１１から他方側の表面１２まで貫通する孔である。また、微小孔１３は、巨核球Ｍが通過できず血小板Ｐが通過できる形状及びサイズで形成されている。

複数の微小孔１３の各々の孔径（各微小孔１３の直径）は、当該微小孔１３を巨核球Ｍが通過できず血小板Ｐが通過できる範囲であれば特に限られないが、例えば、２〜１５μｍであることとしてもよく、２〜１０μｍであることとしてもよく、２〜５μｍであることとしてもよい。

例えば、各微小孔１３の孔径が２〜５μｍである場合には、成熟した巨核球が当該微小孔１３を通過することを防止できるだけでなく、未成熟の巨核球が当該微小孔１３を通過することも確実に防止することができる。

複数の微小孔１３の平均孔径は、当該微小孔１３を巨核球Ｍが通過できず血小板Ｐが通過できる範囲であれば特に限られないが、例えば、２〜１５μｍであることとしてもよく、２〜１０μｍであることとしてもよく、２〜５μｍであることとしてもよい。

複数の微小孔１３は、例えば、孔径加工精度±１０％以下で形成されていることとしてもよい。すなわち、制御された形状及び配置で形成された複数の微小孔１３は、孔径加工精度±１０％以下で形成された複数の微小孔１３であることとしてもよい。

さらに、制御された形状及び配置で形成された複数の微小孔１３は、例えば、平均孔径が２〜１５μｍであり、孔径加工精度±１０％以下で形成された複数の微小孔１３であることとしてもよい。この場合、複数の微小孔１３の平均孔径は、２〜１０μｍであることとしてもよく、２〜５μｍであることとしてもよい。なお、例えば、多孔薄膜１０に平均孔径が１０μｍの複数の微小孔１３が孔径加工精度±１０％で形成されている場合、当該複数の微小孔１３の孔径は、９〜１１μｍの範囲内となる。

複数の微小孔１３の開口率は、多孔薄膜１０が、その一方の表面１１における巨核球Ｍの配置及び培養に耐える力学的強度を有し、且つ当該巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの当該微小孔１３を介した微小流路３０への放出を著しく妨げない範囲であれば特に限られないが、例えば、４〜４５％であることとしてもよく、４〜３５％であることとしてもよく、４〜２５％であることとしてもよい。

培養室２０は、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される表面１１側に設けられ、その内部で当該巨核球Ｍが培養される部屋であれば特に限られない。培養室２０は、例えば、その内部で巨核球Ｍが培養される間、多孔薄膜１０の微小孔１３を介して微小流路３０と連通する以外は密閉される部屋である。また、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される表面１１は、培養室２０の微小流路３０側の内壁面を構成することとしてもよい。

巨核球Ｍの培養において、培養室２０には、当該巨核球Ｍを含む培養液Ｓが収容される。すなわち、多孔薄膜１０の表面１１に配置された巨核球Ｍは、培養室２０に収容された培養液Ｓ中で培養される。

微小流路３０は、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される表面１１と反対側に設けられ、培養液Ｓが流れる流路であれば特に限られない。微小流路３０内において、培養液Ｓは、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される表面１１と反対側の表面１２と接しながら流れる。

微小流路３０は、培養液Ｓの流れる方向（図１に示す矢印Ｘの指す方向）（以下、「流れ方向Ｘ」という。）において、少なくとも多孔薄膜１０の上流端から下流端まで直線的に形成されていることとしてもよい。この場合、微小流路３０の流れ方向Ｘにおける長さは、多孔薄膜１０のそれ以上となる。このため、微小流路３０内の培養液Ｓは、流れ方向Ｘにおいて、多孔薄膜１０の表面１２の上流端から下流端まで接触しながら流れる。

また、微小流路３０は、多孔薄膜１０の表面１２に沿った方向であって、流れる方向に直交する方向（以下、「幅方向」という。）において、当該多孔薄膜１０の一方端から他方端まで形成されていることとしてもよい。この場合、微小流路３０の幅方向における長さ（当該微小流路３０の幅）は、多孔薄膜１０のそれ以上となる。このため、微小流路３０内の培養液Ｓは、幅方向において、多孔薄膜１０の表面１２の一方端から他方端まで接触しながら流れる。

このように、微小流路３０が、多孔薄膜１０の表面１２の全体にわたって直線的に形成されることにより、当該微小流路３０内において、培養液Ｓを当該表面１２の全体と接触させながら直線的に流すことができ、その結果、当該表面１２の全体に均一なシェアストレスを与えることができる。

微小流路３０は、培養液Ｓを１〜１００ｍｍ／秒の流速で流すことができるよう形成されていることとしてもよい。すなわち、微小流路３０は、その内部を培養液Ｓが、１ｍｍ／秒（生体の毛細血管における血液の流速と同等の流速）〜１００ｍｍ／秒（生体の静脈における血液の流速と同等の流速）で流れることができるような形状及びサイズで形成される。この場合、微小流路３０内において、生体における血管内の血液流れを模した培養液Ｓ流れを形成することができる。

本方法においては、上述したような本装置１の培養室２０内において多孔薄膜１０の一方側の表面１１に巨核球Ｍを配置する。巨核球Ｍの配置は、例えば、当該巨核球Ｍを含む培養液Ｓを培養室２０内に入れて、当該巨核球Ｍを多孔薄膜１０の表面１１上に沈降させることにより行う。また、巨核球Ｍの配置は、例えば、当該巨核球Ｍの前駆細胞を含む培養液Ｓを培養室２０内に入れて、当該前駆細胞を多孔薄膜１０の表面１１上に沈降させ、さらに当該培養室２０内で当該前駆細胞を培養して当該巨核球Ｍに分化させることにより行うこととしてもよい。

巨核球Ｍの由来は、特に限られず、ヒトの巨核球であることとしてもよく、ヒト以外の動物の巨核球であることとしてもよい。また、巨核球Ｍは、生体から採取された血液に由来する巨核球であることとしてもよく、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞に由来する巨核球であることとしてもよく、株化された巨核球であることとしてもよく、株化された前駆細胞に由来する巨核球であることとしてもよい。

次いで、本方法においては、微小流路３０に培養液Ｓを流しながら培養室２０内で巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する。具体的に、例えば、図１に示すように、多孔薄膜１０の複数の微小孔１３を介して微小流路３０と連通する以外は密閉された培養室２０内において当該多孔薄膜１０の一方側の表面１１に巨核球Ｍを配置した状態で、当該微小流路３０の上流端から下流端まで、培養液Ｓを当該多孔薄膜１０の他方側の表面１２と接触させながら流すことにより、当該培養室２０内で当該巨核球Ｍを培養するとともに、当該巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する。

ここで、微小流路３０に培養液Ｓを流すことにより、多孔薄膜１０の複数の微小孔１３を介して、当該多孔薄膜１０の当該微小流路３０と反対側の表面１１に配置された巨核球Ｍに対して、血小板Ｐの産生を促進するシェアストレスを与えることができる。

特に、上述のとおり、多孔薄膜１０が平坦な表面１１，１２を有し、微小流路３０が当該多孔薄膜１０の全体に沿って直線的に形成されている場合には、当該多孔薄膜１０の全体に分散された巨核球Ｍに均一なシェアストレスを与えることができる。

微小流路３０内における培養液Ｓの流速は、巨核球Ｍに血小板Ｐの産生を促進するシェアストレスを与えることができ、且つ当該血小板Ｐの回収を著しく妨げない範囲であれば特に限られないが、例えば、当該微小流路３０に１〜１００ｍｍ／秒の流速で培養液Ｓを流すこととしてもよい。

この場合、微小流路３０における培養液Ｓの流速を、生体の毛細血管における血液の流速と同等の１ｍｍ／秒から、生体の静脈における血液の流速と同等の１００ｍｍ／秒までの範囲とすることにより、当該微小流路３０内において、生体における血管内の血液流れを模した培養液Ｓ流れを形成し、巨核球Ｍからの血小板Ｐの産生を効果的に促進することができる。

また、微小流路３０における培養液Ｓの流速は、本装置１内における血小板Ｐの産生速度と当該培養液Ｓの流量とに基づき算出される当該培養液Ｓ中の当該血小板Ｐの濃度が、当該血小板Ｐの回収に支障のない範囲となるよう決定することとしてもよい。

そして、本方法においては、多孔薄膜１０の表面１１上で巨核球Ｍを培養することにより、当該巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する。すなわち、巨核球Ｍは、多孔薄膜１０の表面１１上において、その細胞質の一部を突起状に変形させ、その後、当該巨核球Ｍに形成された突起の先端がちぎれて、血小板Ｐとして培養液Ｓ中に放出される。

なお、巨核球Ｍの培養に使用される培養液Ｓは、当該培養液Ｓ中で巨核球Ｍから血小板Ｐを産生できる溶液であれば特に限られない。また、微小流路３０に培養液Ｓを流す方法は、特に限られず、例えば、本装置１は、当該微小流路３０に当該培養液Ｓを流すための推進力を発生させる送液部を備えることとしてもよい。送液部は、例えば、培養液Ｓを圧送するためのポンプであることとしてもよい。

また、本装置１は、例えば、微小流路３０の上流端に接続され当該微小流路３０に培養液Ｓを流入させるための上流流路部と、当該微小流路３０の下流端に接続され当該微小流路３０から当該培養液Ｓ（例えば、血小板Ｐを含む培養液Ｓ）を流出させるための下流流路部とを備えることとしてもよい。上流流路部及び下流流路部は、例えば、樹脂製のチューブであることとしてもよい。

また、本装置１は、例えば、上流流路部の上流端に接続され、微小流路３０に流入させる培養液Ｓを収容した上流容器部と、下流流路部の下流端に接続され、当該微小流路３０から流出する当該培養液Ｓ（例えば、血小板Ｐを含む培養液Ｓ）を収容する下流容器部とを備えることとしてもよい。上流容器部及び下流容器部は、例えば、樹脂製又はガラス製の容器であることとしてもよい。

そして、本方法においては、巨核球Ｍから多孔薄膜１０の微小孔１３を介して微小流路３０内の培養液Ｓ中に放出された血小板Ｐを回収する。すなわち、巨核球Ｍは、微小孔１３が開口する多孔薄膜１０の表面１１に配置され、当該微小孔１３は血小板Ｐが通過できる形状及びサイズで形成されているため、当該表面１１に配置された巨核球Ｍから産生された血小板Ｐは、当該微小孔１３を介して微小流路３０内を流れる培養液Ｓ中に放出される。

なお、血小板Ｐの微小孔１３を介した放出は、培養室２０内又は多孔薄膜１０の微小孔１３内で産生された血小板Ｐが当該微小孔１３を通過して微小流路３０に放出されることであることとしてもよく、及び／又は当該微小孔１３を介して微小流路３０内に突出した巨核球Ｍの細胞質の一部から血小板Ｐが放出されることであることとしてもよい。

微小流路３０内を流れる培養液Ｓ中に放出された血小板Ｐは、当該微小流路３０の流れ方向Ｘにおける下流端から回収する。すなわち、巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを含む培養液Ｓを微小流路３０の下流端から回収することにより、当該血小板Ｐを回収する。

上述した本装置１及び本方法によれば、体外において巨核球Ｍから血小板Ｐを効果的に大量産生することができる。すなわち、制御された形状及び配置で複数の微小孔１３が形成された多孔薄膜１０を使用することにより、当該多孔薄膜１０の一方側の表面１１への巨核球Ｍの配置を直接的に制御し、且つ、微小流路３０において当該多孔薄膜１０の他方側の表面１２と接触させながら培養液Ｓを流すことにより、適切に配置された当該巨核球Ｍにシェアストレスを効果的に与えて、血小板Ｐを効率よく産生することができる。

例えば、基板の微細加工により平均孔径２〜１５μｍの複数の微小孔１３が孔径加工精度±１０％以下及び開口率４〜４５％で形成された厚さ５〜４０μｍの多孔薄膜１０と、当該多孔薄膜１０の一方側に設けられた培養室２０と、当該多孔薄膜１０の他方側に設けられた微小流路３０とを備える本装置１を使用して、当該培養室２０内において当該多孔薄膜の当該一方側の表面１１に巨核球Ｍを配置し、当該微小流路３０に培養液Ｓを流しながら当該培養室２０内で当該巨核球Ｍを培養する場合には、当該巨核球Ｍにシェアストレスを効果的に与えながら効率よく血小板Ｐを産生し、当該微小孔１３を介して当該微小流路３０内の当該培養液Ｓ中に放出された当該血小板Ｐを効率よく回収することができる。

この場合、複数の微小孔１３の平均孔径は、２〜１０μｍであることとしてもよく、２〜５μｍであることとしてもよい。また、複数の微小孔１３の開口率は、４〜３５％であることとしてもよく、４〜２５％であることとしてもよい。また、多孔薄膜１０の厚さは、５〜３０μｍであることとしてもよく、５〜２０μｍであることとしてもよい。

また、例えば、ｉＰＳ細胞から誘導した巨核球Ｍ又は巨核球Ｍの前駆細胞（例えば、造血前駆細胞）を予め凍結保存しておき、当該巨核球Ｍ又は前駆細胞を任意のタイミングで解凍し、そのまま本装置１内で培養することにより、生体外において血小板Ｐを短期間で大量に産生することができる。したがって、本装置１及び本方法によれば、生体外において、巨核球Ｍから血小板Ｐを工業的に大量産生することも期待できる。

また、本装置１は、多孔薄膜１０近傍の温度を制御する温度制御部をさらに備えることとしてもよい。この温度制御部は、例えば、多孔薄膜１０近傍の温度を３０〜４０℃に制御することとしてもよい。

温度制御部は、多孔薄膜１０近傍の温度を制御するものであれば特に限られない。すなわち、多孔薄膜近傍の温度を制御する温度制御部は、例えば、本装置１の培養室２０内の培養液Ｓ及び／又は微小流路３０内の培養液Ｓの温度を制御する温度制御部であることとしてもよい。

具体的に、温度制御部は、例えば、本装置１の培養室２０に収容されている培養液Ｓ及び／又は微小流路３０を流れる培養液Ｓの温度を測定する温度センサー（例えば、熱電対を含む温度センサー）と、当該温度センサーによる温度測定結果に基づき当該培養液Ｓを加熱するヒーターとを有することとしてもよい。この場合、温度制御部は、本装置１の培養室２０内の培養液Ｓ及び／又は微小流路３０内の培養液Ｓの温度を、巨核球Ｍからの血小板Ｐの産生に適した所定の温度範囲内に維持することができる。この温度範囲は、例えば、３０〜４０℃であることとしてもよい。

また、温度センサーは、例えば、その検出部（例えば、当該温度センサーの先端部）が培養室２０内の培養液Ｓ中に浸漬されるよう設けられることとしてもよい。この場合、例えば、巨核球Ｍの培養中において、その検出部が培養室２０内の培養液Ｓ中に浸漬されることにより、当該巨核球Ｍが浸漬されている当該培養液Ｓの温度を迅速且つ正確に測定することができる。本装置１が上述のような温度制御部を備えることにより、巨核球Ｍを血小板Ｐの産生に適した温度で確実に安定して培養することができる。

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

［血小板産生流路装置の製造］
本実施例では、ＭＥＭＳの加工技術を用いて、血小板産生流路装置として、図２Ａ及び図２Ｂに示すような本装置１を製造した。図２Ａには、本装置１の断面を示し、図２Ｂには、本装置１を平面視で示す。なお、図２Ｂでは、本装置１の培養室２０の上方の開口部を塞ぐ蓋部２３を取り外した状態を示している。

本実施例では、図３に示すように、後述する基板の微細加工により、当該基板の一部に複数の微小孔１３を形成するとともに、当該一部を削って厚さを減じることにより形成された多孔薄膜１０と、当該多孔薄膜１０を囲む当該基板の他の一部である枠部１４とを一体的に有する基板部４０を製造した。基板１００としては、Ｓｉ製のウェハを用い、当該基板１００の中央の矩形範囲（２ｍｍ×２ｍｍ）に、厚さが１０μｍの多孔薄膜１０を形成した。

多孔薄膜１０においては、平均孔径が４μｍである複数の微小孔１３を、孔径加工精度±１０％以下で、一定の孔間距離（隣接する２つの微小孔１３のうち一方の微小孔１３の中心と他方の微小孔の中心との距離）９μｍにて規則的に配置されるよう形成した。

複数の微小孔１３の規則的な配置は、図４Ａに示すようなハニカム配置とした。なお、複数の微小孔１３の配置は、例えば、図４Ｂに示すように、基板を構成するＳｉの結晶軸方向に直近の微小孔１３が配置されないようなシフトタイプの配置等、リソグラフィ／エッチング加工技術による制御された意図的な配置であれば特に限られない。

図５Ａ〜図５Ｌには、無機材料製の基板１００の微細加工による多孔薄膜１０の形成に含まれる工程を示す。基板１００としては、シリコンウェハの一種である、一般的なＳＯＩ（ＳｉｌｉｃｏｎｏｎＩｎｓｕｌａｔｅｒ）ウェハを使用した。

この基板１００は、図５Ａに示すように、Ｓｉ基板１０１上に積層されたＢＯＸ（ＢｕｒｉｅｄＯｘｉｄｅ）層１０２及びＳＯＩ層１０３を有していた。以下、図５Ｂ〜図５Ｋについては、基板１００のうち、図５Ａに示す一点鎖線Ｖで囲まれた部分に着目して説明する。

まず、図５Ｂに示すように、基板１００の表面１００ａ（ＳＯＩ層１０３の表面）に塗布したレジスト１１０に、複数の微小孔１３の配置パターン（図４Ａに示す配置）を露光して形成した。

次いで、図５Ｃに示すように、形成された配置パターンに従い、ＳＯＩ層１０３をドライエッチングした。ドライエッチングは、ＳＦ_６及びＣ_４Ｆ_８を用いる一般的なＢｏｓｃｈプロセスによる誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）により行った。

エッチング後、図５Ｄに示すように、レジスト剥離液等を用いて、レジスト１１０を除去した。レジスト除去後、図５Ｅに示すように、プラズマＣＶＤ法（３００℃程度のＳｉＨ_４、Ｎ_２Ｏガスを用いる一般的なＲＦプラズマＣＶＤ法）により、ハードマスク１２０として、基板１００の表面全体を被覆する厚さ３μｍ程度のＳｉＯ_２膜を形成した。さらに、図５Ｆに示すように、ＳＯＩ層１０３側のハードマスク１２０上に、保護膜として、レジスト１１１を塗布した。

そして、図５Ｇに示すように、基板１００を上下反転させて、当該基板１００の裏面１００ｂ（図５Ａ参照）側のハードマスク１２０上に、レジスト１１２を塗布した。その後、このレジスト１１２に、最終的に矩形の多孔薄膜１０（２ｍｍ×２ｍｍ）が形成されるよう露光して、当該矩形に対応する、Ｓｉ基板１０１の厚さを見込んだサイズの矩形の溝を形成した。

次いで、図５Ｈに示すように、上記溝の形状に従い、ＨＦ水（フッ化水素水）等を用いて、ハードマスク１２０であるＳｉＯ_２膜をエッチングした。エッチング後、図５Ｉに示すように、レジスト剥離液等を用いて、レジスト１１２を除去した。

レジスト除去後、図５Ｊに示すように、上記溝の形状に従い、Ｓｉ基板１０１を、ＢＯＸ層１０２で止まるように、ウェットエッチングした。ウェットエッチングは、ＴＭＡＨ（水酸化テトラメチルアンモニウム）やＫＯＨ（水酸化カリウム）を用いる一般的なシリコンウェットエッチングプロセスにより行った。

さらに、図５Ｋに示すように、多孔薄膜１０を形成する矩形範囲において、ＢＯＸ層１０２及びハードマスク１２０（ＳｉＯ_２膜）をＨＦ水等を用いたウェットエッチングにより除去した。その結果、図５Ｋに示すように、複数の微小孔１３が規則的な配置で形成された多孔薄膜１０を得た。

最後に、図５Ｌに示すように、ダイシングにより、基板１００から、多孔薄膜１０及び枠部１４を一体的に有するＳｉチップである基板部４０（図３参照）を切り出した。なお、図５Ｌにおいて一点鎖線Ｖで囲む部分が、１つの基板部４０に相当する。

微小流路３０は、孔及び溝が形成された複数枚の石英チップを積層することにより形成した。微小流路３０は、流れ方向Ｘの長さ２ｍｍ超、幅（幅方向の長さ）２ｍｍ、高さ０．３ｍｍの直線状に形成された。すなわち、微小流路３０は、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、その内部を培養液Ｓが多孔薄膜１０の表面１２の全体と接触しながら直線的に流れるよう形成された。なお、微小流路３０の形成には、石英に代えて、ホウケイ酸ガラス等の他の材料を用いることとしてもよい。

さらに、図２Ａに示すように、多孔薄膜１０に対応する位置に貫通穴が形成された金属製の上ホルダー２１を、当該多孔薄膜１０を有する基板部４０に積層することにより、培養室２０を形成した。なお、培養室２０内で巨核球Ｍを培養する際には、図２Ａに示すように、上ホルダー２１の貫通穴の上方の開口部は、蓋部２３で塞いだ。

また、微小流路３０の下方側には、当該微小流路３０の上流端及び下流端のそれぞれの開口に対応する位置に貫通穴が形成された金属製の下ホルダー２２を積層した。そして、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、多孔薄膜１０を有する基板部４０と微小流路３０とを挟む上ホルダー２１と下ホルダー２２とを固定具５０（ボルト及びナット）で固定した。積層した部品の間（例えば、基板部４０及び微小流路３０と上ホルダー２１との間、当該微小流路３０と下ホルダー２２との間）には、シーリング材（Ｏリング）を配置することにより、液漏れを防止した。

また、微小流路３０の上流端には、下ホルダー２２を介して、図示しないシリコンチューブを上流流路部として接続した。さらに、上流流路部の上流端には、微小流路３０に流入させる新鮮な培養液Ｓが収容された図示しないガラス瓶を上流容器部として接続した。

一方、微小流路３０の下流端には、下ホルダー２２を介して、図示しないシリコンチューブを下流流路部として接続した。さらに、下流流路部の下流端には、微小流路３０から回収された培養液Ｓを収容するための図示しないガラス瓶を下流容器部として接続した。また、シリコンチューブには、送液部として、培養液Ｓを圧送するためのシリンジポンプを接続した。

［血小板の産生］
ｉＰＳ細胞から誘導した巨核球Ｍを含む培養液Ｓを培養室２０に注入し、当該培養液Ｓ中で当該巨核球Ｍを沈降させることにより、当該巨核球Ｍを多孔薄膜１０の表面１１に配置した。培養液Ｓとしては、０．１％のＢＳＡ（ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ）が添加されたＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ液を用いた。

次いで、送液部を作動させて、上流流路部を介して培養液Ｓを微小流路３０に流入させるとともに、下流流路部を介して当該培養液Ｓを当該微小流路３０から流出させることにより、当該微小流路３０に培養液Ｓを流しながら培養室２０内で巨核球Ｍの培養を開始した。

培養液Ｓの流量は３８０μＬ／分とした。この結果、微小流路３０内の培養液Ｓの流速は、約１０ｍｍ／秒となった。そして、微小流路３０に培養液Ｓを８時間流し続け、当該微小流路３０から流出してくる培養液Ｓを下流容器部に回収した。また、比較例として、ｉＰＳ細胞から誘導した巨核球Ｍを含む５０ｍＬの培養液Ｓを樹脂製のシャーレ内に入れて、当該巨核球Ｍを８時間静置培養した。

図６には、予め蛍光色素で染色された巨核球Ｍを、多孔薄膜１０の一方側の表面１１に配置し、当該多孔薄膜１０の他方側から蛍光顕微鏡で観察した結果の一例を示す。図６に示すように、蛍光染色され、多孔薄膜１０の表面１１に配置された巨核球Ｍが、微小孔１３を通して観察された。

図７には、本装置１を用いた本方法により巨核球Ｍから血小板Ｐを産生した実施例と、シャーレ内において巨核球Ｍから血小板Ｐを産生した比較例とについて、培養条件（培養細胞、培養液、回収された培養液量、培養時間及び培養温度）と、血小板Ｐの産生量を評価した結果とを示す。

血小板Ｐの産生量は、実施例及び比較例のそれぞれについて、培養された巨核球Ｍの数に対する、回収された血小板Ｐの数の比率を算出し、さらに、当該比較例の当該比率を「１」とした場合における、当該実施例の当該比率を算出することにより評価した。

その結果、図７に示すように、実施例においては、比較例の８６倍もの数の血小板Ｐを産生することができた。すなわち、本装置１を用いた本方法によれば、生体外における巨核球Ｍからの血小板Ｐの産生を顕著に促進し、当該血小板Ｐを大量産生できることが確認された。

図８には、本装置１の他の例を示す。図８に示す例において、本装置１は、培養室２０内の培養液Ｓ及び／又は微小流路３０内の培養液Ｓの温度を制御する温度制御部を備え、当該温度制御部は、当該培養室２０内の培養液Ｓの温度を測定する温度センサー６０（例えば、熱電対）と、当該温度センサー６０による温度測定結果に基づいて培養液Ｓを加熱するヒーターとを備えている。

この温度センサー６０は、その先端の検出部が培養室２０内に突出し、当該培養室２０内で巨核球Ｍを含む培養液Ｓに浸漬されるよう設けられているため、当該培養液Ｓの温度を正確且つ迅速に測定することができる。

そして、温度制御部は、温度センサー６０による温度測定結果に基づき、必要に応じて、微小流路３０に流入する培養液Ｓを図示しないヒーターで加熱することにより、培養室２０内の培養液Ｓの温度を、巨核球Ｍからの血小板Ｐの産生に適した所定の温度範囲（例えば、３０〜４０℃）に維持する。

１血小板産生流路装置、１０多孔薄膜、１１一方側の表面、１２他方側の表面、１３微小孔、１４枠部、２０培養室、２１上ホルダー、２２下ホルダー、２３蓋部、３０微小流路、４０基板部、５０固定具、６０温度センサー、１００基板、１００ａ表面、１００ｂ裏面、１０１Ｓｉ基板、１０２ＢＯＸ層、１０３ＳＯＩ層、１１０，１１１，１１２レジスト、１２０ハードマスク、Ｍ巨核球、Ｐ血小板、Ｓ培養液。

Claims

制御された形状及び配置で複数の微小孔が形成され、その一方側の表面に巨核球が配置される多孔薄膜と、
前記多孔薄膜の前記一方側に設けられ、前記巨核球が培養される培養室と、
前記多孔薄膜の他方側に設けられ、前記培養室内で前記巨核球が培養される間、培養液が流れる微小流路と、
を備える
ことを特徴とする血小板産生流路装置。
前記複数の微小孔の各々の孔径は、２〜１５μｍである
ことを特徴とする請求項１に記載の血小板産生流路装置。
前記複数の微小孔の平均孔径は、２〜１５μｍである
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の血小板産生流路装置。
前記複数の微小孔は、孔径加工精度±１０％以下で形成されている
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の血小板産生流路装置。
前記多孔薄膜の厚さは、５〜４０μｍである
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の血小板産生流路装置。
前記複数の微小孔の開口率は、４〜４５％である
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の血小板産生流路装置。
前記微小流路は、前記培養液を１〜１００ｍｍ／秒の流速で流すことができるよう形成されている
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の血小板産生流路装置。
前記多孔薄膜近傍の温度を制御する温度制御部をさらに備える
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の血小板産生流路装置。
前記温度制御部は、前記温度を３０〜４０℃に制御する
ことを特徴とする請求項８に記載の血小板産生流路装置。
制御された形状及び配置で複数の微小孔が形成された多孔薄膜と、前記多孔薄膜の一方側に設けられた培養室と、前記多孔薄膜の他方側に設けられた微小流路と、を備えた血小板産生流路装置を準備すること、
前記培養室内において前記多孔薄膜の前記一方側の表面に巨核球を配置すること、
前記微小流路に培養液を流しながら前記培養室内で前記巨核球を培養して血小板を産生すること、及び
前記微小孔を介して前記微小流路内の前記培養液中に放出された前記血小板を回収すること、
を含む
ことを特徴とする血小板産生方法。
前記微小流路に１〜１００ｍｍ／秒の流速で前記培養液を流す
ことを特徴とする請求項１０に記載の血小板産生方法。