JP2014060939A

JP2014060939A - 細胞培養チップ及び細胞培養チップ用ジグ

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Publication number: JP2014060939A
Application number: JP2012206886A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Fujiyama; 陽一藤山; Hirohisa Abe; 浩久阿部
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-04-10
Anticipated expiration: 2032-09-20
Also published as: JP5971055B2

Abstract

【課題】長期間の細胞培養に適し、かつ細胞培養システムの構成を簡略化することができる細胞培養チップを提供する。
【解決手段】ＰＤＭＳからなる底板部材２の上面中央部に、ＰＤＭＳからなるリング状部材４とそのリング状部材４の外周を取り囲むリング状のセプタム部材８が配置されている。セプタム部材８は尖端を有する金属細管で貫通可能であるとともに金属細管の貫通により形成された穴を弾性力によって塞ぐシリコンゴムなどの弾性部材からなるものである。リング状部材４及びセプタム部材８の上にＰＤＭＳからなる天板部材１０が配置されている。リング状部材４の下端の開口面は底板部材２によって封止され、リング状部材４の上端の開口面は天板部材１０によって封止されている。これにより、リング状部材４の内側にＰＤＭＳからなる壁面によって囲われた密閉空間が形成され、この密閉空間が細胞を培養するための細胞培養室６となっている。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養を行なうための細胞培養室を内部に有する細胞培養チップに関するものである。

細胞を用いた研究は、創薬や食品、作物の開発のほか遺伝子工学など幅広い分野において行なわれている。従来、細胞はシャーレなどに入れられた培養液等により培養され、様々な実験に用いられている。

細胞の機能解明を行なう場合には、多くの薬品や導入物質による反応を調べる必要がある。したがって、特定の反応を効率よく、一度に多種類、しかも少量の試料で結果が得られる方法が望まれている。

近年、分析化学の分野では、μＴＡＳ（Micro Total Analysis System）の研究が盛んになりつつあり、マイクロチップを用いて分析の高速化、省サンプル化・省溶媒化を図ることが行なわれている（特許文献１参照。）。マイクロチップ上の微小空間中の反応では、従来の化学操作を用いた反応よりも反応効率を向上できる可能性も示されている。

特許第４２１９１５８号公報

マイクロチップを用いた細胞培養の研究は近年盛んに行なわれ、周辺装置との組合せによる自動化にも取り組まれている。例えば、細胞を自動的に培養するためには、培養液をオンラインで自動的に交換するシステムを構築する必要がある。そのため、細胞培養に用いられるマイクロチップとしては、細胞培養室に通じる流路が設けられているものが一般的である。

しかし、マイクロチップ内の培養液をオンラインで交換するシステムでは、長期間の細胞培養を実施する際に送液用チューブを含めた流路系に古い培養液が溜まる部分ができ、その部分で培養液が劣化して細胞培養に影響を与える虞があるため、長期間の細胞培養に適さないという問題があった。また、マイクロチップに溶液用チューブなどの配管を接続したシステム構成は複雑になり、マイクロチップの移動が困難になるという問題もあった。

そこで、本発明は、長期間の細胞培養に適し、かつ細胞培養システムの構成を簡略化することができる細胞培養チップを提供することを目的とするものである。

本発明にかかる細胞培養チップは、細胞培養室となる密閉空間を内部に有する細胞培養チップであって、密閉空間の側面を取り囲む側壁は、尖端を有する金属細管で貫通可能な材質で形成されているとともに、金属細管の貫通により側壁に形成された孔を弾性力によって閉じる弾性材料層を有し、密閉空間を形成している壁面の少なくとも一部はガス透過性材料により形成されているものである。

本発明にかかる細胞培養チップ用ジグは、細胞培養チップを嵌め込むチップ保持穴を有し、該細胞培養チップ用ジグの外周面からチップ保持穴の内周面に通じる貫通孔であって、チップ保持穴に嵌め込まれた細胞培養チップに向かって該細胞培養チップの外周面から金属細管を貫通させることにより該金属細管の先端を細胞培養チップの密閉空間へ導く貫通孔を少なくとも２箇所に備えたものである。

本発明の細胞培養チップでは、細胞培養室を密閉空間とし、その密閉空間の側面を取り囲む側壁を、尖端を有する金属細管で貫通可能な材質で形成するとともに金属細管の貫通により側壁に形成された孔を弾性力によって閉じる弾性材料層を有するようにしているので、細胞培養室の密閉系を維持して液漏れを防止しながら、培養液の交換が必要な場合にのみ注射針のような金属細管で側壁を貫通して培養液の交換を行なうことが可能である。このため、細胞培養室に培養液を供給するための配管を常時細胞培養室に接続しておく必要がなくなり、配管内において古い培養液が劣化することによる細胞培養への影響をなくすことができる。培養液の交換等を行なわない状態では細胞培養チップに何も装着されないため、細胞培養システムの構成が簡略化され、システムの移動が容易である。
また、細胞の培養において培養液の炭酸ガス濃度を調整することは重要である。本発明では、細胞培養室となる密閉空間の壁面の少なくとも一部がガス透過性材料により形成されているので、培養液中の炭酸ガス濃度を外気との平行により制御することが可能である。

本発明の細胞培養チップ用ジグは、チップ保持穴に嵌め込まれた細胞培養チップに向かって該細胞培養チップの外周面から金属細管を貫通させることにより該金属細管の先端を細胞培養チップの密閉空間へ導く貫通孔を少なくとも２箇所に備えているので、金属細管の先端を細胞培養室へ到達させることが容易になり、培養液の注入や培養液の交換といった作業が容易になる。

細胞培養チップの一実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は側面図である。同実施例の細胞培養チップの細胞培養室の培養液の交換時を示す平面図である。同実施例の細胞培養チップ用のジグを示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）は細胞培養チップを嵌め込んだ状態の平面図である。細胞培養チップの他の実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は側面図である。同実施例の細胞培養チップの細胞培養室の培養液の交換時を示す平面図である。同実施例の細胞培養チップ用のジグを示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）は細胞培養チップを嵌め込んだ状態の平面図である。細胞培養チップのさらに他の実施例を示す側面図である。

本発明の細胞培養チップにおいては、密閉空間の上面を封止する上面封止部材又は密閉空間の下面を封止する下面封止部材の少なくともいずれか一方がガス透過性材料からなるものであることが好ましい。そうすれば、密閉空間と外気との間で炭酸ガスの移動が活発に行なわれ、培養液中の炭酸ガス濃度の調整を効率よく行なうことができる。

さらに、密閉空間の側面を取り囲む側壁は密閉空間の周囲方向に積層された複数の層を有し、その最も内側の層は上面封止部材及び下面封止部材と接するガス透過性材料層であり、該ガス透過性材料層の外周面を弾性材料層が囲っているようにすれば、密閉空間が上面封止部材や下面封止部材だけでなく側面のガス透過性材料層を通じて外気との間で炭酸ガスのやりとりをすることができるので、培養液中の炭酸ガス濃度の調整効率を向上させることができる。

さらに、側壁の最も外側の層は弾性材料層の外周面を囲うガス透過性材料層であり、該ガス透過性材料層は上面封止部材及び下面封止部材と接しているようにすれば、密閉空間に通じ外気と接するガス透過性材料層の表面積が大きくなり、培養液中の炭酸ガス濃度の調整効率をさらに向上させることができる。

ガス透過性材料の一例としてポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳ）を挙げることができる。

本発明の細胞培養チップにおいて、密閉空間の平面形状は円形であり、該細胞培養チップの平面形状は密閉空間と中心を同じくする円形であるようにしてもよい。密閉空間や細胞培養チップの平面形状が四角形である場合には、側壁において密閉空間の中心に向かって金属細管を突き刺す場所が限られるが、密閉空間及び細胞培養チップの平面形状を円形とすることで、金属細管を突き刺す位置の自由度が増し、１つの細胞培養チップに対して金属細管を貫通させることができる回数を増やすことができる。

細胞の設置される密閉空間内の細胞設置面が該細胞設置面に設置される細胞の設置に適した材質からなるものであることが好ましい。そうすれば、密閉空間をより細胞培養に適した環境にすることができる。
細胞設置面の材質は、ポリスチレン（以下、ＰＳ）などのポリジメチルシロキサンとは異なる樹脂のほか、ガラス、シリコン又はセラミックスのいずれかから細胞に応じて決定することができる。

細胞培養チップの一実施例について図１を用いて説明する。
この実施例の細胞培養チップ１は、ガス透過性材料であるＰＤＭＳからなる底板部材２の上面中央部に、ＰＤＭＳからなるリング状部材４とそのリング状部材４の外周を取り囲むリング状のセプタム部材８が配置されている。セプタム部材８は尖端を有する金属細管で貫通可能であるとともに金属細管の貫通により形成された穴を弾性力によって塞ぐシリコンゴムなどの弾性部材からなるものである。この実施例では、セプタム部材８として、ギヤーパッキン４ＦＳｉ（株式会社マルエムの製品）をリング状に打ち抜いたものを使用している。リング状部材４の高さはセプタム部材８の高さよりも少しだけ高くなっている。リング状部材４及びセプタム部材８の上にＰＤＭＳからなる天板部材１０が配置されている。

リング状部材４の下端の開口面は底板部材２によって封止され、リング状部材４の上端の開口面は天板部材１０によって封止されている。これにより、リング状部材４の内側にＰＤＭＳからなる壁面によって囲われた密閉空間が形成され、この密閉空間が細胞を培養するための細胞培養室６となっている。天板部材１０がリング状部材４の上端に確実に接するように、リング状部材４の上端がセプタム部材８の上端よりも少しだけ高くなるように設定されている。

底板部材２は厚さが例えば１ｍｍ程度であり、平面形状が１４ｍｍ四方の板状部材である。天板部材１０は底板部材２と同じ外径を有する板状部材である。リング状部材４の外形寸法は、例えば厚さが２ｍｍであり、内径が４ｍｍ、外径が８ｍｍ、高さが２ｍｍである。セプタム部材８の外形寸法は、例えば厚みが２ｍｍ、内径が８ｍｍ、外径が１２ｍｍ、高さが１．５ｍｍである。

この細胞培養チップ１の周縁部にはＰＤＭＳ樹脂層１２が形成され、平面形状が１６ｍｍ四方の正方形となっている。ＰＤＭＳ樹脂層１２は、例えば平面形状が１６ｍｍ四方で高さが４ｍｍの型枠の内側に、底板部材２と天板部材１０の間に挟み込まれたリング状部材４及びセプタム部材８を入れ、型枠内にＰＤＭＳ樹脂を流し込んで固化させることにより形成する。これにより、底板部材２と天板部材１０の間にリング状部材４及びセプタム部材８が挟み込まれた状態で固定される。

この細胞培養チップ１のデバイス構造では、細胞培養室６が密閉空間となっているが、その上面及び下面がガス透過性材料であるＰＤＭＳで形成されているため、細胞培養室６内の培地の炭酸ガス濃度を外気との平衡によって調整することが可能であり、細胞培養に適した環境とすることができる。さらに、細胞培養室６の側壁の最も内側の層はＰＤＭＳからなるリング状部材４によって構成され、そのリング状部材４の上端及び下端がＰＤＭＳからなる底板部材２及び天板部材１０に接しているため、細胞培養室６内と外気との間の炭酸ガスの交換効率がさらに良好なものとなっている。さらには、この細胞培養チップ１の外周がＰＤＭＳによってモールドされて外気に接するガス透過性材料の表面積が大きくとられているため、細胞培養室６と外気との間の炭酸ガスの交換効率がさらに向上している。

細胞培養室６の側壁は、リング状部材４によって構成されたＰＤＭＳからなる層、セプタム部材８によって構成された弾性部材からなる層及びＰＤＭＳ樹脂層１２の複数の層からなる構造となっているが、各層は注射針などの尖端を有する金属細管により貫通することができる材質であるため、注射針を備えたシリンジポンプによって細胞培養室６内への送液や細胞培養室６からの液の排出が可能である。さらに、該側壁は弾性材料からなる層を有するセプタム構造であるため、注射針を引き抜いた後の孔がその弾性力によって塞がれ、細胞培養室６からの液漏れが生じない。これにより、注射針の貫通による細胞培養室６内へのアクセスを複数回行なうことが可能である。

図２は注射針を備えたシリンジポンプによる細胞培養室６内の培地交換の一例を示したものである。シリンジ１４に装着された注射針（金属細管）１５とチューブ１６に装着された注射針（金属細管）１７が、チップ１の外側面からＰＤＭＳ樹脂層１２、セプタム部材８及びリング状部材６を貫通して細胞培養室６にそれぞれ達している。シリンジ１４からは新たな培地が吐出され、同時にチューブ１６によって細胞培養室６内の古い培地が排出されることで、細胞培養室６内の培地の交換が行なわれる。培地交換が終了した後は注射針１５及び１７は引き抜かれる。

細胞培養室６の側面を囲う側壁はセプタム部材８の弾性部材の層を有するセプタム構造であるため、該側壁を貫通した注射針１５及び１７が引き抜かれた後に形成される孔は弾性部材の弾性力によって塞がれ、細胞培養室６は再び密閉空間となる。これにより、細胞培養室６からの液漏れが防止され、注射針１５及び１７を使用した細胞培養室６内の培地交換を複数回実行することができる。

なお、注射針１５及び１７による細胞培養チップ１の側面の貫通は、図３（Ａ）に示されるようなジグ１８を使用することによって、容易にかつ正確に実行することができる。ジグ１８は、同図（Ｂ）に示されているように、内側に設けられた穴１９に細胞培養チップ１を嵌め込んで使用する枠状の部材である。ジグ１８の互いに異なる２箇所に、外側面から内側面まで貫通した貫通孔２０及び２２が設けられている。ジグ１８の穴１９に細胞培養チップ１を嵌め込んだ状態で外側面から内側面へ向かって注射針１５及び１７を貫通させることで、注射針１５及び１７の先端を細胞培養室６へ正確に到達させることができる。なお、貫通孔２０及び２２の互いの位置関係はこの例に限定されるものではない。

図４は細胞培養チップの平面形状を円形にした実施例を示したものである。こ実施例の細胞培養チップ１ａは、底板部材２ａ及び天板部材１０ａの平面形状がリング状部材４及びセプタム部材８と中心を共有する円形になっており、周縁部に形成されたＰＤＭＳ樹脂層１２ａの平面形状も円形となっている。

この細胞培養チップ１ａも、図１から図３を用いて説明した実施例と同様に、図５に示されているように、シリンジ１４に装着された注射針（金属細管）１５とシリンジ１６に装着された注射針（金属細管）１７によって、側方からＰＤＭＳ樹脂層１２ａ、セプタム部材８及びリング状部材４を貫通することで細胞培養室６内の培地の交換等が可能となる。この実施例では、細胞培養チップ１ａの平面形状が円形であるため、側面のいかなる位置に注射針１５及び１７を突き刺してもそれら注射針１５及び１７の先端を中央部の細胞培養室６に到達させることが可能である。これにより、注射針１５及び１７による貫通を複数回実行する場合に、同じ箇所を注射針１５及び１７で貫通する必要がなく、同じ箇所を複数回貫通することによるセプタム部材８の劣化を防止することができる。

平面形状が円形である細胞培養チップ１ａの側面を注射針１５及び１７で貫通させる動作も、図６（Ａ）に示されているようなジグ１８ａを使用することによって容易にかつ正確に実行することが可能となる。ジグ１８ａは、同図（Ｂ）に示されているように、内側に設けられた円形の穴１９ａに細胞培養チップ１を嵌め込んで使用する枠状の部材である。ジグ１８ａの互いに異なる２箇所に、外側面から内側面まで貫通した貫通孔２０ａ及び２２ａが設けられている。ジグ１８ａの穴１９ａに細胞培養チップ１を嵌め込んだ状態で外側面から内側面へ向かって注射針１５及び１７を貫通させることで、注射針１５及び１７の先端を細胞培養室６へ正確に到達させることができる。なお、貫通孔２０ａ及び２２ａの互いの位置関係はこの例に限定されるものではない。

以上において説明した実施例では、細胞培養室６の底面（細胞設置面）はＰＤＭＳで形成されているが、図７に示されているように、底板部材２とリング状部材４及びセプタム部材８の間に細胞培養の足場に適した材質、例えばＰＳなどからなる足場部材２４が挿入されていてもよい。特に、接着性の細胞を培養する場合には培養時に細胞培養室６の細胞設置面の影響を大きく受けるため、培養する細胞に適した素材からなる部材によって細胞培養室６の細胞設置面を構成するか、又はそのような素材を細胞培養室６の細胞設置面にコーティングすることによりその細胞の培養に適した環境とすることができる。足場部材２４としては、ＰＳなどの樹脂のほか、ガラス、シリコン又はセラミックスを培養する細胞に応じて用いることができる。

１，１ａ，１ｂ細胞培養チップ
２，２ａ底板部材
４リング状部材
６細胞培養室
８セプタム部材
１０，１０ａ天板部材
１２，１２ａＰＤＭＳ樹脂層
１４シリンジポンプ
１５，１７注射針（金属細管）
１６チューブ
１８，１８ａ細胞培養チップ用ジグ
１９，１９ａ（細胞培養チップ嵌め込み用）穴
２０，２０ａ，２２，２２ａ（注射針貫通用）貫通孔
２４足場部材

Claims

細胞培養室となる密閉空間を内部に有する細胞培養チップであって、
前記密閉空間の側面を取り囲む側壁は、尖端を有する金属細管で貫通可能な材質で形成されているとともに、前記金属細管の貫通により前記側壁に形成された孔を弾性力によって閉じる弾性材料層を有し、
前記密閉空間を形成している壁面の少なくとも一部はガス透過性材料により形成されている細胞培養チップ。
前記密閉空間の上面を封止する上面封止部材又は前記密閉空間の下面を封止する下面封止部材の少なくともいずれか一方は前記ガス透過性材料からなるものである請求項１に記載の細胞培養チップ。
前記密閉空間の側面を取り囲む側壁は前記密閉空間の周囲方向に積層された複数の層を有し、その最も内側の層は前記上面封止部材及び前記下面封止部材と接するガス透過性材料層であり、該ガス透過性材料層の外周面を前記弾性材料層が囲っている請求項２に記載の細胞培養チップ。
前記側壁の最も外側の層は弾性材料層の外周面を囲うガス透過性材料層であり、該ガス透過性材料層は前記上面封止部材及び前記下面封止部材と接している請求項３に記載の細胞培養チップ。
前記ガス透過性材料はポリジメチルシロキサンである請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養チップ。
前記密閉空間の平面形状は円形であり、該細胞培養チップの平面形状は前記密閉空間と中心を同じくする円形である請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞培養チップ。
細胞の設置される前記密閉空間内の細胞設置面は該細胞設置面に設置される細胞の設置に適した材質からなるものである請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞培養チップ。
前記細胞設置面はポリジメチルシロキサンとは異なる樹脂、ガラス、シリコン又はセラミックスのいずれかにより形成されている請求項７に記載の細胞培養チップ。
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞培養チップを嵌め込むチップ保持穴を有する細胞培養チップ用ジグであって、
該細胞培養チップ用ジグの外周面から前記チップ保持穴の内周面に通じる貫通孔であって、前記チップ保持穴に嵌め込まれた細胞培養チップに向かって該細胞培養チップの外周面から金属細管を貫通させることにより該金属細管の先端を前記細胞培養チップの前記密閉空間へ導く貫通孔を少なくとも２箇所に備えた細胞培養チップ用ジグ。