JP2014058582A

JP2014058582A - 過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2014058582A
Application number: JP2014000536A
Authority: JP
Inventors: Richard William Wyatt Childs; ウィリアムワイアットチャイルズリチャード; Takehito Igarashi; タケヒトイガラシ; Benjamin Wynberg Jason; ベンジャミンウィンバーグジェイソン
Original assignee: GOVERNMENT OF United States, ASREPRESENTED BY SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH; US Government
Current assignee: GOVERNMENT OF United States, ASREPRESENTED BY SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH; US Government
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2014-04-03
Also published as: JP5525689B2; CA2589034C; JP2008518945A; EP1809738B1; US20140086890A1; AU2005302291B2; CA2589034A1; WO2006050270A2; US20090104170A1; AU2005302291A1; WO2006050270A3; EP1809738A2

Abstract

【課題】過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法の提供。
【解決手段】本発明は概して、濃縮ＮＫ細胞集団を含む組成物に関する。本発明はさらに、処置を必要とする哺乳動物被験体へ濃縮ＮＫ細胞集団を投与することによって、固形腫瘍または過剰増殖性障害を処置する方法に関する。本発明は、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を提供する。濃縮同種異系ＮＫ細胞集団はさらにＫＩＲ／ＫＩＲリガンド−不適合性の濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む。本発明はさらにＫＩＲ／ＫＩＲリガンド−不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を提供する。
【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年１１月２日に出願された米国仮出願番号６０／６２４，８０３に関し、その全開示は参考文献に含まれる。

（分野）
本発明は概して、濃縮ＮＫ細胞集団を含む組成物に関する。本発明はさらに濃縮ＮＫ細胞集団を必要とする哺乳動物被験体へ濃縮ＮＫ細胞集団を投与することによって、固形腫瘍または過剰増殖性障害の治療法に関する。

（背景）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は抗原非依存性の腫瘍細胞毒性を有し、マウスモデルにおいて腫瘍の増殖及び播種性転移（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）を抑制・阻止することが示されている（非特許文献１；非特許文献２）。しかし、ヒトの癌の抑制におけるＮＫ細胞の正確な役割に関しては未だ議論の余地がある。

ＮＫ細胞は特定の抗原受容体をコードする遺伝子の再配列は起こさず、むしろ活性化または阻止シグナルのバランスを通じて標的へのそれらの認識を制御する（非特許文献３）。重要なことは、それらが正常な宿主組織を破壊することを防止するためにＮＫ細胞の不活化が必要とされる（非特許文献４）。したがって、活性化リガンドの存在下でさえ、細胞上に発現した阻害性リガンドが、無効にする（ｏｖｅｒｒｉｄｉｎｇ）信号を送って、ＮＫ細胞の機能を最終的に抑制させる。近年、ますます多くのＮＫ細胞の阻害・活性化受容体が特徴付けされている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ＮＫ細胞は、その表面に発現したキラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）を介して、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩ様分子を認識できる。正常組織および悪性組織の両方におけるＭＨＣクラスＩによるＫＩＲの結合によって、ＮＫ細胞の機能は抑制される。ＭＨＣクラスＩ分子は特定のＫＩＲに対するリガンドとしての役割を果たし、ＮＫ細胞媒介性の細胞傷害性を抑制するグループに分類される。ＨＬＡ−Ｃにおいて、７７位及び８０位に位置するアミノ酸残基における多型は、その標的ＫＩＲに対する特異性を決定づける（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。ＫＩＲ２ＤＬ１は、７７位にアスパラギン、８０位にリジンを有するグループ２のＨＬＡ−Ｃ分子を認識し、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３は、７７位にセリン、８０位にアスパラギンを有するグループ１のＨＬＡ−Ｃ分子を認識する。

自己ＨＬＡ分子によるＮＫ細胞の不活化は、悪性形質転換した宿主細胞がＮＫ細胞媒介性免疫から回避を許容する機構であり得る。腫瘍−ＫＩＲリガンドは常にＮＫ細胞ＫＩＲと対応されるため、活性化リガンドの存在下でさえ、自己ＮＫ細胞はＭＨＣクラスＩ発現腫瘍によって阻害されうる。このことは、養子移入された（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｆｕｓｅｄ）自己ＮＫ（非特許文献１２）またはリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）が最も転移性の高い固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を媒介できないことを部分的に説明しうる（非特許文献１３）。ＭＨＣクラスＩ発現を喪失しているか、またはドミナントな活性化リガンドを有する腫瘍細胞のみがこのような集団に感受性になると予想されうる（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。

Ｍｏｒｅｔｔａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）３：６−８Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０００）９７：２７３１−２７３６Ｍｏｒｅｔｔａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１９：１９７−２２３Ｖｉｌｃｈｅｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）２０：２１７−２５１Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）７：８９−１０１Ｔａｋｅｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９７）１５５：６７−７７Ｌａｎｉｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６：３５９−３９３Ｌｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１）１８１：２２３−２３３Ｍｏｒｅｔｔａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１８２：８７５−８８４Ｗｉｎｔｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５８：４０２６−４０２８Ｗｉｎｔｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１：５７１−５７７Ｆｒｏｈｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０００）２３：４９９−５０４Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８５）３１３：１４８５−１４９２Ｌｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９１）２５３：１９９−２０２Ｇｉｅｂｅｌら、Ｂｌｏｏｄ，（２００３）１０２：８１４−８１９Ｃｈｉｌｄｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０００）３４３：７５０−７５８Ｒｉｎｉら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．（２００１）１６５：１２０８−１２０９Ｂｒｅｇｎｉら、Ｂｌｏｏｄ，（２００２）９９：４２３４−４２３６Ｕｅｎｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９８）１６：９８６−９９３Ｈｅｎｔｓｃｈｋｅら、ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，（２００３）３１：２５３−２６１Ｓｔｒａｉｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００３）２１：３７８５−３７９１

自己ＨＬＡ分子又はＭＨＣクラスＩ発現腫瘍によるナチュラルキラー細胞の不活化を抑制するか、または無効にする組成物及び方法の発見が当該分野において必要とされる。ＮＫ細胞の不活化によって、腫瘍細胞が宿主ＮＫ細胞媒介性免疫から回避可能となりうる。

（要約）
本発明は概して、濃縮ＮＫ細胞集団を含む組成物に関する。処置を必要とする哺乳動物被験体へ濃縮ＮＫ細胞集団を投与する工程を包含する、固形腫瘍または過剰増殖性障害を処置する方法を提供する。本発明は、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を提供する。濃縮同種異系ＮＫ細胞集団はさらにＫＩＲ／ＫＩＲリガンド−不適合性の濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む。本発明はさらにＫＩＲ／ＫＩＲリガンド−不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を提供する。

固形腫瘍の処置又は固形腫瘍の再発を予防するための有効量で、増強剤（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）（例えば、化学薬品や化学療法薬）と、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法を提供する。増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせるように作用する。一態様では、増強剤は化学療法剤または他の腫瘍感作因子でありうる。固形腫瘍の治療又は固形腫瘍の再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法を提供する。

固形腫瘍を処置する方法は、哺乳動物被験体に対する本発明の組成物の投与を含む。本発明は、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンドが不適合（「ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性」）である同種異系ＮＫ細胞を含む組成物を利用した方法を提供し、この方法はＫＩＲ／ＫＩＲリガンドの適合した自己および同種異系の対応するものよりもｉｎｖｉｔｒｏにおいて固形腫瘍に対する強い細胞傷害性を示す。本発明ではさらに、グループ１（Ｃ−Ｇ１）又はグループ２（Ｃ−Ｇ２）のいずれかのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合であり、適合したＫＩＲ−抑制性ＨＬＡ−Ｃリガンドを欠くＥＢＶ−ＬＣＬ、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫（ＭＥＬ）細胞に対する細胞傷害性が上昇しているが、ＫＩＲ−リガンドの適合した標的に対する細胞傷害性が最小限であるような癌患者又は健常人ドナーの血液から濃縮およびクローン化された同種異系ＮＫ集団を提供する。この細胞傷害性作用は、ＮＫ細胞へのγ線照射後少なくとも４８時間にわたって持続する。

本発明はさらに、「ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性」であり、グループ１（Ｃ−Ｇ１）又はグループ２（Ｃ−Ｇ２）のいずれかのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合である患者からｉｎｖｉｔｒｏで分離および増殖可能な“自己ＣＤ１５８ａ陽性又はＣＤ１５８ｂ陽性のＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞（ＡＫＩ−ＮＫ細胞）”の少数集団を提供する。これらのＡＫＩ−ＮＫ細胞は、自己“バルク（ｂｕｌｋ）”ＮＫ細胞や他の自己ＮＫ細胞部分集団と比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで自己腫瘍細胞及びＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性の強化を示した。

ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３⁻ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、ＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞）を高率に増殖させる方法を提供する。ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合することが判明しているＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を欠くか、またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がヘテロ接合性に発現しているＥＢＶＬＣＬフィーダー細胞を使用して、ＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞を有意により高率に増殖可能である。

固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体への組成物の投与前のＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。この方法はさらにＮＫ細胞へのγ線照射後４８時間までの被験体へのγ線照射済みＮＫ細胞集団の投与を含む。

固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。さらに詳細な態様では、増強剤は５−フルオロウラシルでありうる。

固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。さらに詳細な態様では、増強剤は５−フルオロウラシルでありうる。

固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。

固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。

固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。

過剰増殖性障害を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。

過剰増殖性障害を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法を提供する。この方法はさらに、哺乳動物被験体に対する組成物の投与前でのＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む。一態様では、過剰増殖性障害は、血液の悪性疾患、固形腫瘍、黒色腫、尿生殖器の悪性疾患である。詳細な態様では、尿生殖器の悪性疾患は膀胱、泌尿器、腎臓、睾丸、前立腺の悪性疾患である。

他の実施形態では、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘発させるか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法は、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する有効量の濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物へ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を含む。一態様では、腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、黒色腫、尿生殖器の悪性疾患である。詳細な態様では、尿生殖器の悪性疾患は膀胱癌、泌尿器癌、腎臓癌、睾丸癌、または前立腺癌である。

他の実施形態では、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘発させるか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法は、増強剤と、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する有効量の濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とへ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。さらなる態様では、腫瘍細胞は哺乳動物被験体の膀胱内にある。この方法はさらに、ＫＩＲとＫＩＲリガンドとの結合の阻害による、ＮＫ細胞集団の細胞傷害性を強化する工程を含む。詳細な態様では、この方法はＫＩＲ細胞質ドメインに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ＫＩＲ細胞質ドメインに対するアンチセンスＲＮＡ、ＫＩＲ細胞質ドメインに対するリボザイム、またはＫＩＲ細胞外ドメインもしくはＫＩＲ細胞質ドメインに対する抗体でＮＫ細胞集団を処理する工程を含む。

哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘発させるか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法は、増強剤と、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する有効量の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とへ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。さらなる態様では、腫瘍細胞は哺乳動物被験体の膀胱内にある。

他の実施形態では、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘発させるか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法は、増強剤と、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する有効量の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とへ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を含む。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。さらなる態様では、腫瘍細胞は哺乳動物被験体の膀胱内にある。

哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘発させるか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法は、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する有効量のＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物へ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を含む。さらなる態様では、腫瘍細胞は哺乳動物被験体の膀胱内にある。一態様では、濃縮自己ＮＫ細胞集団は、ＫＩＲグループ１内のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座がホモ接合である。ホモ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座がＣｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、Ｃｗ８、Ｃｗ１２、Ｃｗ１３、Ｃｗ１４、Ｃｗ１５０７、またはＣｗ１６である、請求項４９記載の方法。さらなる態様では、濃縮自己ＮＫ細胞集団は、ＫＩＲグループ２内のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座がホモ接合である。ホモ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座がＣｗ２、Ｃｗ０３０７、Ｃｗ０３１５、Ｃｗ４、Ｃｗ５、Ｃｗ６、Ｃｗ０７０７、Ｃｗ０７０９、Ｃｗ１２０５、Ｃｗ１２０４１、Ｃｗ１２０４２、Ｃｗ１５、Ｃｗ１６０２、Ｃｗ１７またはＣｗ１８である、請求項５０記載の方法。

さらなる態様では、濃縮自己ＮＫ細胞集団は、Ｂｗ４又はＢｗ６内のＨＬＡ−Ｂ遺伝子座がホモ接合である。ホモ接合性のＨＬＡ−Ｂ遺伝子座がＢｗ−５、Ｂｗ−１３、Ｂｗ−１５１３、Ｂｗ−１５１６、Ｂｗ−１５１７、Ｂｗ−１５２３、Ｂｗ−１５２４、Ｂｗ−１７、Ｂｗ−２１、Ｂｗ−２７、Ｂｗ−３７、Ｂｗ−３８、Ｂｗ−４４、Ｂｗ−４７、Ｂｗ−４９、Ｂｗ−５１、Ｂｗ−５２、Ｂｗ−５３、Ｂｗ−５７、Ｂｗ−５８、Ｂｗ−５９、Ｂｗ−６３またはＢｗ−７７である、請求項５１記載の方法。ホモ接合性のＨＬＡ−Ｂ遺伝子座がＢｗ−７、Ｂｗ−８、Ｂｗ−１２、Ｂｗ−１４、Ｂｗ−１８、Ｂｗ−２７０８、Ｂｗ−３５、Ｂｗ−３９、Ｂｗ−４０、Ｂｗ−４００５、Ｂｗ−４１、Ｂｗ−４２、Ｂｗ−４５、Ｂｗ−４６、Ｂｗ−４８、Ｂｗ−５０、Ｂｗ−５４、Ｂｗ−５５、Ｂｗ−５６、Ｂｗ−６０、Ｂｗ−６１、Ｂｗ−６２、Ｂｗ−６４、Ｂｗ−６５、Ｂｗ−６７、Ｂｗ−７１、Ｂｗ−７２、Ｂｗ−７３、Ｂｗ−７５、Ｂｗ−７６、Ｂｗ−７８またはＢｗ−８１である、請求項５１記載の方法。さらなる態様では、被験体はホモ接合性のＫＩＲリガンドを有しており、かつＮＫ集団が自己ＨＬＡ分子と結合できないＫＩＲを発現することを停止させることができない。被験体は例えば、Ｂｗ４又はＢｗ６内にＨＬＡ−Ｂ遺伝子座を有することができる。被験体は例えば、ＫＩＲグループ１又はＫＩＲグループ２内にＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有することができる。濃縮自己ＮＫ細胞集団は例えば、ＫＩＲグループ１又はＫＩＲグループ２内にホモ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有することができる。濃縮自己ＮＫ細胞集団は例えば、ＫＩＲグループ１又はＫＩＲグループ２内にヘテロ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有することができる。

さらなる態様では、方法は、ＫＩＲとＫＩＲリガンドとの結合阻害によるＮＫ細胞集団の細胞傷害性を強化する工程を含む。詳細な態様では、方法は、ＫＩＲ細胞質ドメインに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ＫＩＲ細胞質ドメインに対するアンチセンスＲＮＡ、ＫＩＲ細胞質ドメインに対するリボザイム、またはＫＩＲ細胞外ドメインもしくはＫＩＲ細胞質ドメインに対する抗体でＮＫ細胞集団を処理する工程を含む。

増強剤による腫瘍細胞の処理を含む、ＮＫ細胞集団の腫瘍細胞に対する細胞傷害性を高める方法を提供する。一態様では、増強剤はＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を起こさせる。増強剤は例えば、化学薬剤又は化学療法剤でありうる。詳細な態様では、増強剤はプロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありうる。

ＥＢＶリンパ芽球性細胞株を使用したＮＫ細胞の増殖を含む、哺乳動物被験体からＮＫ細胞の部分集団を増殖させる方法を提供する。一態様では、部分集団はＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団である。詳細な態様では、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団はＫＩＲ２ＤＬ２／３である。別の態様では、ＮＫ細胞は自己ＮＫ細胞集団である。詳細な態様では、自己ＮＫ細胞の部分集団は少なくとも１０^４倍に増殖される。

末梢血単核細胞を使用したＮＫ細胞の増殖を含む、哺乳動物被験体からＮＫ細胞の部分集団を増殖させる方法を提供する。一態様では、部分集団はＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団である。ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団は例えば、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ１、またはＮＫＢ１を発現できる。さらなる態様では、ＮＫ細胞は自己ＮＫ細胞集団であり、自己ＮＫ細胞の部分集団は少なくとも１０^４倍に増殖される。詳細な態様では、自己ＮＫ細胞の部分集団は少なくとも１０^５倍に増殖される。

ＫＩＲとＫＩＲリガンドとの結合阻害を含む、ＮＫ細胞集団の細胞傷害性を増大させる方法が提供される。この方法はさらに、ＫＩＲ細胞質ドメインに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）によるＮＫ細胞集団の処理による、腫瘍に対するＮＫ細胞の細胞傷害性の強化を含む。この方法はさらに、ＫＩＲ細胞質ドメインに対するアンチセンスＲＮＡでＮＫ細胞を処理することによって、腫瘍に対するＮＫ細胞の細胞傷害性の強化を含む。この方法はさらに、ＫＩＲ細胞外ドメイン又はＫＩＲ細胞質ドメインに対する抗体でＮＫ細胞を処理することによって、ＮＫ細胞の細胞傷害性の強化を含む。一態様では、抗体はモノクローナル抗体又は一本鎖Ｆｖ抗体である。さらなる態様では、ＮＫ細胞集団は同種異系ＮＫ細胞集団である。さらなる態様では、ＮＫ細胞集団は自己ＮＫ細胞集団である。

ストリンジェントな条件下でキラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）の標的遺伝子とハイブリダイズする核酸分子の哺乳動物への投与、そして標的遺伝子の発現の減弱を含む、哺乳動物における固形腫瘍又は過剰増殖性障害を処置する方法を提供する。一態様では、この方法はさらに、核酸分子と濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団との接触を含む。さらなる態様では、核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらなる態様では、核酸分子は二本鎖ＲＮＡ分子である。詳細な態様では、二本鎖ＲＮＡ分子は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。さらなる態様では、核酸分子はＫＩＲ標的遺伝子の細胞内ドメインとハイブリダイズする。

他の実施形態では、キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法は、（ｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制されるべき生物系を提供する工程、（ｉｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする転写産物にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドとこの系とを接触させる工程、および（ｉｉｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する工程を含む。一態様では、生物系は濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団である。さらなる態様では、この方法は、哺乳動物被験体における濃縮ＮＫ細胞集団へアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程、そして固形腫瘍又は過剰増殖性疾患の状態に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増大させる工程を含む。

他の実施形態では、ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法は、（ｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制されるべき生物系を提供する工程、（ｉｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする転写産物にハイブリダイズする二本鎖ＲＮＡ分子と系とを接触させる工程、および（ｉｉｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する工程を含む。一態様では、生物系は濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団である。詳細な態様では、この方法はさらに、哺乳動物被験体における濃縮ＮＫ細胞集団へ二本鎖ＲＮＡを投与する工程、そして固形腫瘍又は過剰増殖性疾患の状態に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増大させる工程を含む。さらなる態様では、二本鎖ＲＮＡ分子は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物。
（項目２）
さらにＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物。
（項目４）
固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法。
（項目５）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ＮＫ細胞へのγ線照射後４８時間まで、前記被験体へ前記γ線照射済みＮＫ細胞集団を投与する工程をさらに包含する、項目５に記載の方法。
（項目７）
固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法。
（項目８）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目７に記載の方法。
（項目１２）
固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法。
（項目１３）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法。
（項目１８）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法。
（項目２０）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
固形腫瘍を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法。
（項目２２）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
過剰増殖性障害を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、増強剤と濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とを哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法。
（項目２７）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
過剰増殖性障害を縮小もしくは除去するか、またはその発生もしくは再発を予防するための有効量で、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、過剰増殖性障害を処置または予防する方法。
（項目３２）
前記哺乳動物被験体へ前記組成物を投与する前に、さらに前記ＮＫ細胞集団へのγ線照射を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
過剰増殖性障害が血液の悪性疾患、固形腫瘍、黒色腫、または尿生殖器の悪性疾患である、項目１９に記載の方法。
（項目３４）
前記尿生殖器の悪性疾患が膀胱、尿路、腎臓、睾丸、又は前立腺の悪性疾患である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための有効量で、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物へ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を包含する、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
（項目３６）
哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための有効量で、増強剤と濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物とへ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を包含する、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
（項目３７）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための有効量で、増強剤と濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とへ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を包含する、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
（項目４１）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、または腫瘍細胞の増殖を抑制するための有効量で、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性の濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物へ腫瘍細胞を接触または曝露させる工程を包含する、哺乳動物被験体において腫瘍細胞死を誘導するか、もしくは腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
（項目４５）
前記腫瘍細胞が前記哺乳動物被験体の膀胱内にある、項目３５に記載の方法。
（項目４６）
前記腫瘍細胞が前記哺乳動物被験体の膀胱内にある、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
前記腫瘍細胞が前記哺乳動物被験体の膀胱内にある、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
前記腫瘍細胞が前記哺乳動物被験体の膀胱内にある、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記濃縮自己ＮＫ細胞集団がＫＩＲグループ１内にホモ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有する、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記濃縮自己ＮＫ細胞集団がＫＩＲグループ２内にホモ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有する、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
前記濃縮自己ＮＫ細胞集団がＢｗ４又はＢｗ６内にホモ接合性のＨＬＡ−Ｂ遺伝子座を有する、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記ホモ接合性ＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座がＣｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、Ｃｗ８、Ｃｗ１２、Ｃｗ１３、Ｃｗ１４、Ｃｗ１５０７またはＣｗ１６である、項目４９に記載の方法。
（項目５３）
前記ホモ接合性ＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座がＣｗ２、Ｃｗ０３０７、Ｃｗ０３１５、Ｃｗ４、Ｃｗ５、Ｃｗ６、Ｃｗ０７０７、Ｃｗ０７０９、Ｃｗ１２０５、Ｃｗ１２０４１、Ｃｗ１２０４２、Ｃｗ１５、Ｃｗ１６０２、Ｃｗ１７またはＣｗ１８である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記ホモ接合性ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座がＢｗ−５、Ｂｗ−１３、Ｂｗ−１５１３、Ｂｗ−１５１６、Ｂｗ−１５１７、Ｂｗ−１５２３、Ｂｗ−１５２４、Ｂｗ−１７、Ｂｗ−２１、Ｂｗ−２７、Ｂｗ−３７、Ｂｗ−３８、Ｂｗ−４４、Ｂｗ−４７、Ｂｗ−４９、Ｂｗ−５１、Ｂｗ−５２、Ｂｗ−５３、Ｂｗ−５７、Ｂｗ−５８、Ｂｗ−５９、Ｂｗ−６３またはＢｗ−７７である、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記ホモ接合性ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座がＢｗ−７、Ｂｗ−８、Ｂｗ−１２、Ｂｗ−１４、Ｂｗ−１８、Ｂｗ−２７０８、Ｂｗ−３５、Ｂｗ−３９、Ｂｗ−４０、Ｂｗ−４００５、Ｂｗ−４１、Ｂｗ−４２、Ｂｗ−４５、Ｂｗ−４６、Ｂｗ−４８、Ｂｗ−５０、Ｂｗ−５４、Ｂｗ−５５、Ｂｗ−５６、Ｂｗ−６０、Ｂｗ−６１、Ｂｗ−６２、Ｂｗ−６４、Ｂｗ−６５、Ｂｗ−６７、Ｂｗ−７１、Ｂｗ−７２、Ｂｗ−７３、Ｂｗ−７５、Ｂｗ−７６、Ｂｗ−７８またはＢｗ−８１である、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記被験体がホモ接合性のＫＩＲリガンドを有し、かつＮＫ集団が自己ＨＬＡ分子と結合できないＫＩＲを発現することを停止させることができない、項目４４に記載の方法。
（項目５７）
前記被験体がＢｗ４又はＢｗ６内にＨＬＡ−Ｂ遺伝子座を有する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記被験体がＫＩＲグループ１又はＫＩＲグループ２内にＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有する、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記濃縮自己ＮＫ細胞集団がＫＩＲグループ１又はＫＩＲグループ２内にホモ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記濃縮自己ＮＫ細胞集団がＫＩＲグループ１又はＫＩＲグループ２内にヘテロ接合性のＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を有する、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
前記腫瘍が、血液の悪性疾患、固形腫瘍、黒色腫、または尿生殖器の悪性疾患である、項目３５に記載に記載の方法。
（項目６２）
前記尿生殖器の悪性疾患が、膀胱癌、尿路癌、腎臓癌、睾丸癌、又は前立腺癌である、項目３５に記載の方法。
（項目６３）
腫瘍細胞を増強剤で処理する工程を包含する、ＮＫ細胞集団の腫瘍細胞傷害性を強化する方法。
（項目６４）
前記増強剤がＮＫ細胞による殺傷に対して前記腫瘍の感作を起こさせる、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記増強剤が化学薬品又は化学療法薬である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記増強剤がプロテアソーム阻害剤又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
ＥＢＶリンパ芽球性細胞株を使用したＮＫ細胞の増殖を含む、哺乳動物被験体からのＮＫ細胞部分集団の増殖方法。
（項目６８）
前記部分集団がＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記ＮＫ細胞が自己ＮＫ細胞集団である、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記自己ＮＫ細胞の部分集団を少なくとも１０ ^４倍に増殖させる、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団がＫＩＲ２ＤＬ２／３である、項目６８に記載の方法。
（項目７２）
末梢血単核球を使用したＮＫ細胞の増殖を含む、哺乳動物被験体からのＮＫ細胞部分集団の増殖方法。
（項目７３）
前記部分集団がＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ＮＫ細胞が自己ＮＫ細胞集団である、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記自己ＮＫ細胞の部分集団を少なくとも１０ ^４倍に増殖させる、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記自己ＮＫ細胞の部分集団を少なくとも１０ ^５倍に増殖させる、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団がＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ１またはＮＫＢ１を発現する、項目７３に記載の方法。
（項目７８）
ＫＩＲとＫＩＲリガンドとの結合を阻害する工程を包含する、ＮＫ細胞集団の細胞傷害性の強化方法。
（項目７９）
前記ＫＩＲ細胞質ドメインに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）でＮＫ細胞集団を処理することによって、腫瘍に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ＫＩＲ細胞質ドメインに対するアンチセンスＲＮＡでＮＫ細胞を処理することによって、腫瘍に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記ＫＩＲ細胞外ドメイン又はＫＩＲ細胞質ドメインに対する抗体でＮＫ細胞を処理することによって、ＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記抗体がモノクローナル抗体又は一本鎖Ｆｖ抗体である、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記ＮＫ細胞集団が同種異系ＮＫ細胞集団である、項目７８に記載の方法。
（項目８４）
前記ＮＫ細胞集団が自己ＮＫ細胞集団である、項目７８に記載の方法。
（項目８５）
ＫＩＲとＫＩＲリガンドとの結合阻害によるＮＫ細胞集団の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目８６）
前記ＫＩＲ細胞質ドメインに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、該ＫＩＲ細胞質ドメインに対するアンチセンスＲＮＡ、該ＫＩＲ細胞質ドメインに対するリボザイム、または該ＫＩＲ細胞外ドメインもしくは該ＫＩＲ細胞質ドメインに対する抗体で前記ＮＫ細胞集団を処理する工程をさらに含む、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
ＫＩＲとＫＩＲリガンドとの結合阻害による、ＮＫ細胞集団の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目８８）
前記ＫＩＲ細胞質ドメインに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、該ＫＩＲ細胞質ドメインに対するアンチセンスＲＮＡ、該ＫＩＲ細胞質ドメインに対するリボザイム、または該ＫＩＲ細胞外ドメインもしくは該ＫＩＲ細胞質ドメインに対する抗体で前記ＮＫ細胞集団を処理する工程をさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
ストリンジェントな条件下でキラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）の標的遺伝子とハイブリダイズする核酸分子の哺乳動物への投与、そして該標的遺伝子の発現の減弱を含む、哺乳動物における固形腫瘍又は過剰増殖性障害を処置する方法。
（項目９０）
前記核酸分子と濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団との接触をさらに含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
前記核酸分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
前記二本鎖ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記核酸分子が前記ＫＩＲ標的遺伝子の細胞内ドメインにハイブリダイズする、項目８９に記載の方法。
（項目９５）
（ｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制されるべき生物系を提供する工程、（ｉｉ）該ＫＩＲタンパク質をコードする転写産物にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドと該系とを接触させる工程、（ｉｉｉ）該ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する工程を含む、キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
（項目９６）
前記生物系が濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
哺乳動物被験体における濃縮ＮＫ細胞集団へ前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程、そして固形腫瘍又は過剰増殖性障害に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
（ｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制されるべき生物系の提供、（ｉｉ）ＫＩＲタンパク質をコードする転写産物にハイブリダイズする二本鎖ＲＮＡ分子と該系とを接触させる工程、（ｉｉｉ）該ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する工程を含む、ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
（項目９９）
前記生物系が濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団である、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
哺乳動物被験体における濃縮ＮＫ細胞集団へ前記二本鎖ＲＮＡ分子を投与する工程、そして固形腫瘍又は過剰増殖性障害に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する工程をさらに含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記二本鎖ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目９８に記載の方法。

図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄは、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／３）及びＣＤ１５８ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）陽性ＮＫ集団の単離を示している。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄは、ＲＣＣ及び黒色腫細胞が、ＫＩＲ適合株よりもＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞株の細胞傷害性作用に対して感受性が高いことを示している。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、限界希釈クローニングによって単離された同種異系ＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞株ではＫＩＲ不適合腫瘍標的に対する細胞傷害性が増大していることを示している。図４Ａでは、γ線照射されたＮＫ細胞が、照射後少なくとも４８時間にわたって腫瘍細胞に対する細胞傷害性を維持していることを示している。図４Ｂでは、γ線照射されたＮＫ細胞が、照射後少なくとも４８時間にわたって腫瘍細胞に対する細胞傷害性を維持していることを示している。図４Ｃでは、γ線照射されたＮＫ細胞が、照射後少なくとも４８時間にわたって腫瘍細胞に対する細胞傷害性を維持していることを示している。図５Ａは、自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性が増大したサブドミナントなＮＫ細胞画分の同定及び増殖を示している。図５Ｂは、自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性が増大したサブドミナントなＮＫ細胞画分の同定及び増殖を示している。図５Ｃは、自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性が増大したサブドミナントなＮＫ細胞画分の同定及び増殖を示している。図５Ｄは、自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性が増大したサブドミナントなＮＫ細胞画分の同定及び増殖を示している。図５Ｅは、自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性が増大したサブドミナントなＮＫ細胞画分の同定及び増殖を示している。図６は、抑制性ＫＩＲ細胞質ロングドメインをノックダウンするＲＮＡｉのレンチウイルス形質導入、そして示されたＮＫ細胞抗腫瘍効果の増大を示している。図７は、デプシペプチド又はベルケード（Ｖｅｌｃａｄｅ）で腫瘍細胞を前処理することで、腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介性溶解に対する感受性が高まることを示している。図８は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作されたマウス腎細胞癌（ＲＥＮＣＡ）のＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。図９は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作されたヒト腎細胞癌の同種異系ＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。図１０は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作されたヒト腎細胞癌の自己ＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。図１１は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作されたヒト腎細胞癌の自己ＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。図１２は、ヒト腎細胞癌の細胞株と化学薬品との培養を最適化するための経時変化を示している。図１３は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作されたヒト腎細胞癌のＮＫ細胞に対する感受性の増大がＴＲＡＩＬを含む機構を介して起こりうることを示している。図１４は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作されたヒト腎細胞癌のＮＫ細胞に対する感受性の増大がＦａｓリガンドを含む機構を介して起こりうることを示している。図１５は、ヒト腎細胞癌の細胞株における生存率（アポトーシス）、増殖、ＭＨＣクラスＩ発現、ＭＩＣ−Ａ／Ｂ発現を比較している。図１６は、ヒトの腫瘍をＮＫ細胞攻撃に感作させるヒトでの臨床試験を示している。

（発明の詳細な説明）
本発明は概して、濃縮ＮＫ細胞集団を含む組成物に関する。濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を提供する。濃縮同種異系ＮＫ細胞集団はさらにＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞を含む。濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を提供する。本発明はさらに、上記のように、固形腫瘍を治療するため、もしくはその再発を予防するための有効量で、濃縮同種異系又は自己ＮＫ細胞集団の組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法に関する。キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）を介した細胞不活化は、潜在的に、腫瘍細胞を宿主のＮＫ細胞媒介性免疫から回避可能にする。本発明は、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンドが不適合である同種異系ＮＫ細胞を含む組成物を利用した方法を提供し、この方法は、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンドの適合した自己および同種異系の方法よりも、ｉｎｖｉｔｒｏで固形腫瘍に対する強い細胞傷害性を示す。本発明ではさらに、グループ１（Ｃ−Ｇ１）又はグループ２（Ｃ−Ｇ２）のいずれかのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合であり、適合したＫＩＲ−抑制性ＨＬＡ−Ｃリガンドを欠くＥＢＶ−ＬＣＬ、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫（ＭＥＬ）細胞に対する細胞傷害性が上昇しており、ＫＩＲ−リガンドの適合した標的に対する細胞傷害性が最小限であるような癌患者又は健常人ドナーの血液から濃縮およびクローン化された同種異系ＮＫ集団を提供する。この細胞傷害性作用は、ＮＫ細胞へのγ線照射後少なくとも４８時間にわたって持続する。

ＫＩＲ及びそのＨＬＡクラスＩリガンドをコードする遺伝子は、異なる染色体上に位置する。結果として、自己ＨＬＡ分子と結合できないＫＩＲを発現するＮＫ細胞はまた、健常者および癌患者に存在することもできる。本発明はさらに、グループ１（Ｃ−Ｇ１）又はグループ２（Ｃ−Ｇ２）のいずれかのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合性である患者からｉｎｖｉｔｒｏで分離および増殖可能な、自己ＣＤ１５８ａ陽性又はＣＤ１５８ｂ陽性のＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞（ＡＫＩ−ＮＫ）の少数集団を提供する。これらのＡＫＩ−ＮＫは、自己「バルク（ｂｕｌｋ）」ＮＫ細胞や他の自己ＮＫ細胞部分集団と比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで自己腫瘍細胞及びＥＢＶ−ＬＣＬに対する強化した細胞傷害性を有することが示された。ＨＬＡ−ＣグループＩ対立遺伝子がホモ接合である癌患者３例及び健常人ドナー２例において、ＣＤ３−／ＣＤ１５８ａ＋／ＣＤ１５８ｂ− ＡＫＩ−ＮＫ細胞の小集団（通例＜１％）が、流動選別によって単離された。ＡＫＩ−ＮＫ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで増殖させ、５例全てで、ＣＤ３−／ＣＤ１５８ａ−／ＣＤ１５８ｂ＋ＫＩＲ適合「バルク」非選択自己ＮＫ細胞集団と比較して、自己腫瘍細胞及び／又は自己ＥＢＶ−ＬＣＬ株に対する細胞傷害性が増大していた。

これらのデータに基づき、本発明はさらに、初期又は進行期の固形腫瘍を有する患者へ養子移入された同種異系又は自己ＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞の抗腫瘍能を利用した免疫療法レジメンを開発することによって、固形腫瘍の治療法を提供する。

以下のことが判明している。

１）キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）リガンドがＫＩＲに不適合な同種異系ＮＫ細胞は、ＫＩＲ適合集団と比較して、固形腫瘍に対する細胞傷害性が増大している。

２）非選択“バルク”ＮＫ細胞集団と比較して自己固形腫瘍細胞及び／又はＥＢＶリンパ芽球性細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）に対して細胞傷害性の強化した、自己「ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性」ナチュラルキラー細胞集団が、ヒトにおいて単離および増殖可能である。

３） γ線照射されたＮＫ細胞は、照射後４８時間まで腫瘍標的に対する顕著な細胞傷害性を保持している。さらに、照射後少なくとも２４時間は、ＫＩＲ不適合腫瘍標的を殺傷する能力を保持している。

４）高率のＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３⁻ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、またはＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞）の増殖方法が開発されている。照射済みＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞を、ＩＬ−２を含む濃縮ＮＫ細胞培養液に加えた場合、ＮＫ細胞集団は急速に増殖可能である。さらに、フィーダー細胞として特定のＮＫ細胞ＫＩＲに対するＭＨＣクラスＩリガンドを欠くＥＢＶ−ＬＣＬ細胞を使用する場合、所望のＫＩＲを発現するＮＫ細胞集団が選択的に増殖される。例えば、グループＩＩのホモ接合性ＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞（ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合することが判明しているＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の発現がない）又はＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の発現がヘテロ接合性であるＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞をＮＫ細胞の増殖に使用した場合、より高率のＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞が選択的に増殖する。

“Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌｓ（ナチュラルキラー細胞）”とは、特定の抗原刺激の不在下で、ＭＨＣクラスによる制限なく、標的細胞を殺傷する免疫系の細胞である。標的細胞は、腫瘍細胞又はウイルスの寄生した細胞でありうる。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の存在及びＣＤ３表面マーカーの不在によって特徴付けられる。ＮＫ細胞は通常、正常末梢血の単核球画分の約１０−１５％を占める。歴史的に、ＮＫ細胞は、予備免疫または活性化なしに、特定腫瘍細胞を溶解する能力によって最初に同定された。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩの提示をダウンレギュレートすることでＣＴＬ反応を回避しうるウイルスや腫瘍に対する「予備的な（ｂａｃｋｕｐ）」防御機構をもたらすと考えられる。直接的な細胞傷害性殺傷への関与に加えて、ＮＫ細胞はまた、癌または感染症の抑制に重要となりうるサイトカイン産生においても重要な役割を果たし、また胚子着床にも関与しうる。

“Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ（細胞傷害性）”及び“Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ（細胞溶解性）”とは、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞の活性を述べるために使用する場合、同義語となることを意図している。一般に、細胞傷害活性は、様々な生物学的、生化学的、生物物理学的機構のいずれかによる標的細胞の殺傷と関連する。細胞溶解性とは、より具体的には、エフェクターが標的細胞の細胞膜を溶解させて、その物理的な完全性を破壊する活性をいう。これは標的細胞の死をもたらす。理論に拘束されたくないが、ＮＫ細胞の細胞傷害作用は細胞溶解に起因すると考えられる。

“ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌ（ＮＫ細胞の活性化）”とは、ＮＫ細胞の異質細胞又は異常細胞に対する細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性の活性自体、またはプレアクティブな（即ち、既に活性化している）ＮＫ細胞の異質細胞又は異常細胞に対する細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性の上昇、ならびにサイトカイン産生の刺激などの他の生物学的機能の上昇をいう。

“Ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌ（標的細胞）”とは、本発明のＮＫ細胞の細胞傷害活性によって殺傷される細胞を示す。これらとしては、具体的には、悪性細胞又はそうでなければ癌由来細胞、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ヘルペスのような病原性ウイルスによって感染された細胞が挙げられる。

“ＡｎｅｎｒｉｃｈｅｄＮＫｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（濃縮ＮＫ細胞集団）”とは、所望の抗腫瘍／細胞傷害活性を有する細胞の部分集団に選択され、細胞マーカー（例えば、細胞表面マーカー又は細胞内マーカー）によって選択可能なＮＫ細胞集団を示す。濃縮ＮＫ細胞集団は、細胞マーカーへ蛍光プローブを結合させ、そして、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）カラム、免疫磁気ビーズを使用したネガティブ除去（ｎｅｇａｔｉｖｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、もしくは当該分野で公知の他の細胞選択および分離方法によって濃縮ＮＫ細胞集団を選択することによって、単離可能である。

“Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ”又は“Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ（同種異系の）”とは、一卵性（同一の）双生児ではない、同じ種の異なる個体から採取された組織、細胞、ＤＮＡを示す。２以上の個体又はこれらの個体の細胞は、各個体の配列において１以上の遺伝子座が同一ではない場合、同種異系である。

“Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ”又は“Ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ”又は“Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ（自己の）”とは、個体自身の組織から採取された組織、細胞、ＤＮＡをいう。例えば、ＮＫ細胞の自己移入および移植において、ドナーとレシピエントとが同一人物である。“Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ（自己の）”は自己と関連するか、もしくは生物自体に由来している。

“ＫＩＲ／ＫＩＲｌｉｇａｎｄ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅＮＫｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合性ＮＫ細胞集団）”とは、ＮＫ細胞集団が細胞表面に発現しているキラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）を介して、例えば腫瘍細胞または悪性組織上のＭＨＣクラスＩ及びクラスＩ様分子を認識することができないために、ＮＫ細胞の細胞傷害性を保持したＮＫ細胞を示す。正常組織、悪性組織いずれのＭＨＣクラスＩによるＫＩＲの結合によっても、ＫＩＲ／ＫＩＲリガンド不適合の場合を除いて、ＮＫ細胞の機能抑制が可能となる。ＭＨＣクラスＩ分子は、特定のＫＩＲに対するリガンドとしての役割を果たし、ＮＫ細胞媒介細胞傷害を抑制するグループに分類される。例えば、ＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ｃにおいて、７７位及び８０位に位置するアミノ酸残基における多型は、その標的ＫＩＲに対する特異性を決定づける。

“ＫＩＲｌｉｇａｎｄ（ＫＩＲリガンド）”とは、キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、例えば、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に結合する分子をいう。

“Ｐａｔｉｅｎｔ（患者）”、“Ｓｕｂｊｅｃｔ（被験体）”、“Ｍａｍｍａｌ（哺乳動物）”は互換的に使用され、ウサギ、ラット、マウス、他の動物などの実験動物の他、ヒトの患者及びヒト以外の霊長類などの哺乳動物をいう。動物には全ての脊椎動物（例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、鶏、両生類、は虫類などの哺乳類及び非哺乳類）が含まれる。

“Ｔｒｅａｔｉｎｇ（処置する）”又は“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（処置）”は、症状の発症、合併症、疾患の生化学的兆候を予防および遅延させるための、本発明の濃縮ＮＫ細胞の組成物、化合物、薬品の投与、症状の緩和、疾患、症状、障害（例えば、癌、転移性癌、転移性固形腫瘍）のさらなる進行の停止および抑制を含む。処置は予防的であり得、つまり補助化学療法（疾患の発症の予防又は遅延、もしくはその臨床および亜臨床的症状の発現の予防）、又は疾患発症後の症状の治療的抑制又は緩和であり得る。

“Ａｎａｍｏｕｎｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｏｒｅｄｕｃｅｏｒｅｌｉｍｉｎａｔｅｔｈｅｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｏｒｔｏｐｒｅｖｅｎｔｉｔｓｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｒｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ（固形腫瘍を縮小又は排除する、もしくはその発生および再発を予防するための有効量）”又は“Ａｎａｍｏｕｎｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｏｒｅｄｕｃｅｏｒｅｌｉｍｉｎａｔｅｔｈｅｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｏｒｔｏｐｒｅｖｅｎｔｉｔｓｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｒｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ（過剰増殖性障害を縮小又は排除する、もしくはその発生および再発を予防するための有効量）”とは、患者の検査データ、生存率データ、腫瘍マーカー値の上昇又は抑制、遺伝的プロファイルに基づく感受性の低下、環境因子に対する曝露によって測定される、腫瘍の病状又は過剰増殖性障害に対する、治療後の患者の転帰又は生存率を改善させる治療用化合物の量を示す。

“Ｃａｎｃｅｒ（癌）”、“Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ（悪性）”、“Ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒ（固形腫瘍）”、“Ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒ（過剰増殖性障害）”は同義語として使用され、多数の特有の構造的及び／又は分子的特性の他、細胞の無制御な異常増殖、局所的に又は血流やリンパ系を介して他の身体部分へ拡大する（つまり転移する）病的細胞の能力によって特徴付けられる多数の疾患をいう。“Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ（癌性の）”、“Ｍａｌｉｇｎａｎｔｃｅｌｌ（悪性細胞）”、“Ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｃｅｌｌ（固形腫瘍細胞）”は、特定の構造特性を有し、分化しておらず、浸潤および転移能を有する細胞と理解される。“Ｃａｎｃｅｒ（癌）”とは、癌腫や肉腫を含む、哺乳動物で見出される全ての種類の癌、新生物、悪性疾患を示す。例えば、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、脳腫瘍、頭頸部癌、神経髄芽細胞腫、骨肉腫、肝臓癌、結腸癌、泌尿生殖器癌、膀胱癌、腎臓癌、睾丸癌、子宮癌、卵巣癌、頸癌、前立腺癌、黒色腫、中皮腫、肉腫である。（ＤｅＶｉｔａら、（ｅｄｓ．），２００１，ＣａｎｃｅｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，６ｔｈ．Ｅｄ．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ参照；この参考文献は、その全体が本明細書において参考として援用される）。

“Ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（癌関連の）”とは、核酸およびその発現の有無、又はタンパク質およびそのレベルもしくは活性の有無と、対象細胞における悪性疾患の発症との関係を示す。例えば、正常細胞では発現しない、もしくは低レベルでしか発現しない特定遺伝子の発現と癌とが関連し得る。反対に、癌関連遺伝子は、悪性細胞（又は形質転換中の細胞）では発現していない、もしくは悪性細胞中において正常細胞で発現しているよりも低レベルでしか発現していない遺伝子であり得る。

癌との関連で、“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ（形質転換）”という用語は、正常細胞が悪性化する際に受ける変化をいう。真核生物において、“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ（形質転換）”という用語は、細胞培養での正常細胞の悪性細胞への変化を述べるために使用する。

“Ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ（過剰増殖性障害）”とは、正常な組織増殖よりも細胞が急速に増殖する疾患又は異常を示す。したがって、過剰増殖中の細胞は、正常細胞よりも急速に増殖する細胞である。

“Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌ（増殖中の細胞）”は、活発に細胞分裂を起こしており、指数増殖している細胞である。“Ｌｏｓｓｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ（細胞増殖制御の喪失）”とは、正常では細胞分裂の適切な制限を保証する細胞周期制御を失った細胞の特性をいう。このような制御を失った細胞は、刺激シグナルがなくとも正常速度よりも速く増殖し、抑制シグナルには応答しない。

“Ａｄｖａｎｃｅｄｃａｎｃｅｒ（進行癌）”は腫瘍の原発部位にはもはや局在していない癌、または対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）に従って病期ＩＩＩ、ＩＶの癌を意味する。

“Ｗｅｌｌｔｏｌｅｒａｔｅｄ（耐容性良好である）”とは、治療の結果として生じ、治療決定に影響を及ぼしうる健康状態の有害な変化がないことをいう。

“Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ（転移性の）”とは、免疫不全マウスの乳腺脂肪体及び／又は血液循環への注入時に免疫不全マウスの肺、肝臓、骨、脳に腫瘍の二次病変を形成できる腫瘍細胞（例えば、ヒトの固形腫瘍又は尿生殖器の悪性疾患）をいう。

（癌の処置）
“Ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒ（固形腫瘍）”としては、肉腫、黒色腫、癌腫、他の固形腫瘍癌が挙げられるが、これらに限定されない。

“Ｓａｒｃｏｍａ（肉腫）”とは、胎生結合組織様の物質から構成され、一般に繊維状物質又は均質物質に埋め込まれた緊密に凝集した細胞からなる腫瘍をいう。肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉種、Ａｂｅｍｅｔｈｙ肉腫、脂肪肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫、絨毛腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、血管拡張性肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

“Ｍｅｌａｎｏｍａ（黒色腫）”とは、皮膚または他の器官の色素細胞系から生じる腫瘍をいう。黒色腫としては、例えば、末端性黒子性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性の若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、表在拡大型黒色腫が挙げられる。

“Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（癌腫）”とは、周辺組織に浸潤して転移を起こす傾向のある、上皮細胞から構成される悪性新生物を示す。典型的な癌腫としては、例えば、細葉細胞癌、腺房細胞癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質癌、細気管支肺胞上皮癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支癌、脳状癌、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、脳梁癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌、円柱細胞癌、腺管癌、硬性癌腫、胎生期癌、脳様癌、類表皮癌（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様上皮腫、外向発育癌、潰瘍癌、繊維性癌、膠様癌、膠様癌、巨細胞癌、巨細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞腫、毛母癌、血液様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞腫、硝子様癌、過剰芽フロイド癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａｉｎ
ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、蚕食性癌、Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌、レンズ状癌、脂肪腫性癌、リンパ上皮癌、髄様癌、髄様癌、黒色癌、軟性癌、粘液性癌、粘液分泌癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、印環細胞癌、粘液類表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｎｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌、粘膜癌、粘液腫様癌、鼻咽腔癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌腫、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌腫（ｓｏｌａｎｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）、回転楕円面細胞癌腫、紡錐細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、線状癌（ｓｔｒｉｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張性癌、毛細血管拡張様癌、移行上皮癌、結節癌、結節癌、疣状癌、絨毛癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａｖｉｆｌｏｓｕｍ）が挙げられる。

“Ｌｅｕｋｅｍｉａ（白血病）”とは、造血臓器の進行性の悪性疾患であり、通常、血液及び骨髄中の白血球及びその前駆細胞の誤った増殖および発生を特徴とする。白血病は通常、（１）疾患の持続時間および特徴−−急性又は慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄（骨髄性）、リンパ系（リンパ性）、単球性；ならびに（３）血中の異常細胞数の増加又は非増加−−白血病性又は非白血病性（亜白血病性）、に基づいて臨床的に分類される。白血病としては、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、無白血球白血病、好塩基性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリーセル白血病、血芽球白血病、血球母細胞白血病、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、リンパ性白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性顆粒球白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞性白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化白血病が挙げられる。

さらなる癌としては、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺癌、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、睾丸癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、泌尿生殖器系癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質細胞癌、前立腺癌が挙げられる。

（増強剤）
哺乳動物被験体に対する固形腫瘍の処置又は固形腫瘍の再発を予防するための有効量で、増強剤（例えば、化学薬品や化学療法薬）及び濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物を投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法が提供される。哺乳動物被験体に対する固形腫瘍の処置又は固形腫瘍の再発を予防するための有効量で、増強剤（例えば、化学薬品や化学療法薬）及び濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物を投与する工程を包含する、固形腫瘍を処置する方法が提供される。“Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇａｇｅｎｔ（増強剤）”とは、ＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を生じさせることによって治療プロファイルを改善させるように作用する化合物をいう。一態様では、増強剤は、化学療法剤または他の腫瘍感作因子でありうる。詳細な態様では、この増強剤はプロテアソーム阻害剤（例えば、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ））、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、デプシペプチド）であり得る。さらに詳細な態様では、この増強剤は、５−フルオロウラシルであり得る。

増強剤（例えば、化学薬品又は化学療法薬）は、疾患治療に有用な化合物又は薬剤をいう。化学薬品又は化学療法薬は、例えば腫瘍性疾患又は癌などの疾患の治療において、ＮＫ細胞による殺傷に対して腫瘍の感作を生じさせるように作用する。癌の化学療法薬は、一般に抗腫瘍薬とも呼ばれる。多数の併用薬物療法、薬物送達手段、治療スケジュールの他、多数の化学療法化合物群が存在し、１００近くの個々の薬剤を包含している。これらの化学療法薬は、それぞれ化合物の種類や治療される病状などのいくつかの基準に従って分類され得る。癌細胞の急速な分裂または細胞周期の標的特異的段階を利用してある種の薬剤が開発されており、もう１つの分類方法をもたらしている。薬剤は種類、副作用の重症度、薬物送達手段によっても分類可能である。しかし、化学療法薬の最も一般的な分類は、化合物群によるもので、これは、これらの化合物の作用機構を広く網羅している。

参照する参考資料に応じて、抗新生物薬の分類には若干の違いがある。化合物群としては、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、アルカロイド、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、ホルモン及びホルモン類似物質、免疫賦活剤、感光剤、混合型の他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第６，９１１，２００号を参照のこと。その開示は、その全体が本明細書中に援用される）。

プロテアソーム阻害剤としては、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）、ＰＳＩ（Ｎ−カルボベンゾイル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、ＭＧ−１３２（Ｎ−カルボベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、ＭＧ−１１５（Ｎ−カルボベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−ＣＨＯ）、ＭＧ−１０１又はＣａｌｐａｉｎＩｎｈＩ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎｏｒＬｅｕ−ＣＨＯ）、ＡＬＬＭ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、Ｎ−カルボベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｎ−カルボベンゾイル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ、Ｎ−カルボベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ、Ｎ−カルボベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、Ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ、ＮＦ−κＢ
ＭＷ２７８１のＳＮ５０ＮＬＳ、Ｂａｙ１１−７０８２、カプサイシン、ＰＤＴＣ、ＡＬＬＮ、ＭＧ−２６２、ＰＰＭ−１８、ＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ、Ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。

ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤には、以下の構造クラスが含まれるが、これらに限定されない：１）ヒドロキサム酸、２）環状ペプチド、３）ベンズアミド、４）短鎖脂肪酸（米国特許第６，９０５，６６９号参照。その開示は、その全体が本明細書中に援用される）。（ＨＤＡＣ）阻害剤として使用される環状ペプチドは、主に、環状テトラペプチドである。環状ペプチドの例としては、デプシペプチド、ＴｒａｐｏｘｉｎＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、ＦＲ９０１２２８が挙げられるが、これらに限定されない。ＴｒａｐｏｘｉｎＡは、２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル（ＡＯＥ）部分を含む環状テトラペプチドである（Ｋｉｊｉｍａｅｔａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４２９−２２４３５，１９９３）。Ａｐｉｃｉｄｉｎは、強力な広域スペクトルの抗原虫活性を示し、ナノモル濃度でＨＤＡＣ活性を阻害する真菌代謝物である（Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａｔｔｒａｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３１４３−１３１４７，１９９６）。ＦＲ９０１２２８は、クロモバクテリウム−ビオラセウムから単離されるデプシペプチドであり、マイクロモル濃度でＨＤＡＣ活性を阻害することが示されている。

（検出可能な標識）
アッセイで使用される具体的な標識又は検出基は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的方法によって検出可能である。アッセイで使用されるＮＫ細胞上の細胞マーカーへの抗体の特異的結合を著しく妨げない限り、標識の具体的な型は、本発明における決定的な局面ではない。検出基は、検出可能な物理的、化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、アッセイ又は免疫アッセイの分野において十分に開発されており、概して、このような方法において有用な標識のほとんどを本発明に適用可能である。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的方法によって検出可能な任意の組成物である。本発明の有用な標識としては、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性同位元素（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１２１Ｉ、^１１２Ｉｎ、^９９ｍＴｃ）、マイクロバブルなどの他の造影剤（超音波画像診断）、^１８Ｆ、^１１Ｃ、^１５Ｏ（ポジトロン放射断層撮影）、^９９ｍＴＣ、^１１１Ｉｎ（単一光子放出型コンピュータ断層撮影）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、コロイド金、色ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色測定用標識が挙げられる。このような標識の使用を記載した特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、同第４，３６６，２４１号が挙げられ、それらの開示は全て、全ての目的について、本明細書中に援用される。ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈＥｄ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ＥｕｇｅｎｅＯＲ．）もまた参照のこと。

標識は、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の化合物と、直接的又は間接的に結合可能である。前述のとおり、広範に種々の標識が、要求される感度、化合物との結合しやすさ、安定性要件、適用可能な機器、使い捨て器具に応じて選択され、使用され得る。

非放射性標識は、間接的な方法によって付着される場合が多い。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子と共有結合される。次に、リガンドは、固有に検出可能であるか、またはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、化学発光化合物）と共有結合したかのいずれかである、抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。多数のリガンド及び抗リガンドが使用可能である。リガンドが天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、サイロキシン、コルチゾール）を有する場合、標識された天然型抗リガンドと組み合わせて使用可能である。あるいは、任意のハプテン化合物又は抗原性化合物を、抗体と組み合わせて使用可能である。

分子は、シグナル発生化合物（例えば、酵素又はフルオロフォアとの結合による）と直接結合させることもできる。標識として目的の酵素は、主に、ヒドロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ）又はオキシドレダクターゼ（特に、ペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物には、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。使用可能な様々な標識化又はシグナル発生システムの概説は、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。その全体が、本明細書中に参考として援用される。

標識の検出手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出方法としては、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーで使用される写真用フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、生じる蛍光を検出することによって検出可能である。蛍光は、写真用フィルム、電荷結合素子（ＣＣＤ）や光電子増倍管などの電子感知器の使用によって目視で検出可能である。同様に、酵素標識は、適当な基質を酵素に与えて、生じる反応生成物を検出することで検出可能である。最後に、標識と関連する色を観察するだけで簡単な熱量標識を検出可能である。このように、各種の計量（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）アッセイにおいて、共役金はピンク色を呈することが多いが、各種の共役ビーズはビーズの色を呈する。

一部のアッセイ形式では、標識化化合物の使用は不要である。例えば、標的抗体の存在を検出するために凝集アッセイを使用可能である。この場合、標的抗体を含む検体によって抗原コーティングされた粒子を凝集させる。この形式では、いずれの化合物も標識する必要はなく、標的抗体の存在を簡単な目視検査で検出する。

しばしば、細胞マーカー及び細胞マーカーに対する抗体には、検出可能なシグナルを与える物質を共有結合又は非共有結合させることで標識する。

（処置計画）
本発明は、薬学的に受容可能なキャリアとともに製剤された、疾患（例えば、転移性癌、固形腫瘍、過剰増殖性障害）の処置用の濃縮ＮＫ細胞集団を含む医薬組成物を提供する。一部の組成物は、本発明の複数（例えば、２以上）の濃縮ＮＫ細胞集団の組み合わせを含む。

予防に用いる場合、疾患又は病状（即ち、過剰増殖疾患又は固形腫瘍）に感受性のある、もしくはそのリスクのある患者に対して、過剰増殖疾患又は固形腫瘍の再発リスクを除外又は軽減し、重症度を軽減させ、発病（疾患の生化学的、組織学的及び／又は行動上の症状、その合併症、発病中に呈する中間の病理学的表現型を含む）を遅らせるための十分量の医薬組成物又は薬剤を投与する。治療で用いる場合、そのような疾患の疑われる、もしくはそれを既に罹患している患者に対して、その合併症及び発病中での中間の病理学的表現型を含む病状（生化学的、組織学的及び／又は行動上）を治癒する、もしくは少なくとも部分的に停止させるための十分量の組成物又は薬剤を投与する。治療又は予防上の処置を完了するための適当量は、治療又は予防の有効量と定義される。予防および治療計画において、十分な抗増殖反応が得られるまで、通常、数種の用量で薬剤を投与する。通常、抗増殖反応をモニターして、抗増殖反応が弱まった場合、繰り返し投与する。

（ＲＮＡおよびＤＮＡ干渉法）
（短鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ））
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を介した転写後遺伝子サイレンシングの機構であり、アンチセンスやリボザイムに基づくアプローチとは異なる（ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡの概説については、Ｊａｉｎ，Ｋ．Ｋ．，２００４，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ５：２３９−４２を参照のこと）。ＲＮＡ干渉は、ストリンジェントな条件下でキラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）標的遺伝子にハイブリダイズして標的遺伝子の発現を弱める核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）の哺乳動物への投与によって、腫瘍又は過剰増殖疾患の状態を治療する方法として有用である。ｄｓＲＮＡ分子は、まずＤＩＣＥＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ４０９：３６３）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素による、小さな２つの２１ヌクレオチド鎖からなるｄｓＲＮＡ分子へのプロセシング後に、様々な種類の細胞におけるｍＲＮＡの配列特異的な分解を指向すると考えられている。このｄｓＲＮＡ分子は、それぞれ、５’リン酸および３’水酸基を有し、他方の鎖と厳密に相補的な１９ヌクレオチドの領域を含み、その結果、２ヌクレオチド３’側に突出した１９ヌクレオチドの二本鎖領域が存在する。このようにＲＮＡｉは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介しており、これは通常、約１９ヌクレオチド長の二本鎖領域からなり、各鎖１〜２ヌクレオチド３’側に突出しており、全長約２１〜２３ヌクレオチドとなっている。哺乳動物細胞では、３０ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡは通常、インターフェロン反応を介した非特異的ｍＲＮＡ分解を誘導する。しかし、インターフェロン反応よりもむしろ、哺乳動物細胞内でのｓｉＲＮＡの存在が配列特異的な遺伝子サイレンシングをもたらす。

一般に、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、好ましくは、約１９ｂｐ長のＲＮＡ二本鎖からなり、さらに必要に応じて、１又は２の一本鎖オーバーハング又はループからなる。ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリダイズする２本のＲＮＡ鎖からなるか、もしくは代わりに自己ハイブリダイズ部分を含む一本鎖ＲＮＡからなる。ｓｉＲＮＡは、１つ以上の遊離の鎖末端を含み、これはリン酸及び／又は水酸基を含み得る。ｓｉＲＮＡは通常、ストリンジェントな条件下で、標的転写産物とハイブリダイズする部分を含む。ｓｉＲＮＡの１つの鎖（又は、ｓｉＲＮＡの自己ハイブリダイズ部分）は通常、標的転写産物の部分と厳密に相補的であり、このことは、ｓｉＲＮＡが１つのミスマッチもなく標的転写産物とハイブリダイズすることを意味する。完全な相補性の得られていない本発明の特定の実施態様では、任意のミスマッチがｓｉＲＮＡ末端、もしくはその近傍に位置することが通常好ましい。

ｓｉＲＮＡがトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどの方法で哺乳動物内に移入された場合、もしくは様々なプラスミド法のいずれかによって細胞内で発現させた場合、遺伝子発現をダウンレギュレートすることが示されている。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉は、例えばＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４４８において概説されている（Ｙｕ，Ｊ．ら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：６０４７−６０５２；Ｓｕｉ，Ｇ．ら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ．，９９：５５１５−５５２０；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，
Ｐ．ら、２００２，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．１６，９４８−９５８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．ら、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６，５５０−５５３；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄＴａｉｒａ，Ｋ．，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４９７−５００；Ｐａｕｌ，Ｃ．ら、２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：５０５−５０８も参照のこと）。これらの参考文献または他の参考文献で記載されているとおり、ｓｉＲＮＡは２本の個々の核酸鎖又はヘアピン（ステムループ）構造を形成可能な自己相補部位を有する１本の鎖からなり得る。構造、長さ、ミスマッチの数、ループの大きさ、オーバーハング内のヌクレオチドの同一性などにおける多数のバリエーションが、効果的なｓｉＲＮＡ誘発性遺伝子サイレンシングと一致する。理論に拘束されることを望まないが、多様な異なる前駆体の細胞内プロセシング（例えば、ＤＩＣＥＲによる）が効果的に遺伝子サイレンシングを媒介可能なｓｉＲＮＡ産生をもたらすと考えられる。一般に、イントロンよりもエクソンを標的とする方が好ましく、標的転写産物の３’部位内の領域と相補的な配列を選択することも好まれ得る。一般に、ほぼ等モル比の異なるヌクレオチドを含む配列を選択して、単一の残基が複数回繰り返される箇所を避けることが好ましい。

このようにｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の二本鎖領域と各鎖に１〜２ヌクレオチドの３’オーバーハングとを有する、全長約２１〜２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子からなり得る。本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡは、ｉｎｖｉｖｏでプロセシングを受けて、このような分子を生じうる様々なＲＮＡ構造も含む。このような構造には、相互にハイブリダイズしてステム、ループ、そして必要に応じてオーバーハング（好ましくは、３’オーバーハング）を形成する２本の相補的分子を含むＲＮＡ鎖を含む。好ましくは、ステムは約１９ｂｐ長、ループは約１〜２０、より好ましくは約４〜１０、最も好ましくは約６〜８ヌクレオチド長、そして／又はオーバーハングは、約１〜２０、より好ましくは約２〜１５ヌクレオチド長である。本発明の特定の実施態様では、ステムは最低１９ヌクレオチド長であり、約２９ヌクレオチド長までが可能である。４ヌクレオチド以上のループはそれより短いループほど立体障害を受けにくく、従って、好まれ得る。オーバーハングは、５’リン酸及び３’水酸基を含み得る。オーバーハングは複数のＵ残基（例えば、１〜５個のＵ残基）で構成できるが、必ずしもその必要はない。上記の従来のｓｉＲＮＡは、標的となるｍＲＮＡの分解を誘導し、それによってタンパク質の合成速度も低下させる。従来の経路を介して作用するｓｉＲＮＡに加えて、テンプレート転写産物の３’ＵＴＲに結合するある種のｓｉＲＮＡは、従来のＲＮＡ干渉（例えば、転写産物の安定性の低下よりも、転写産物の翻訳量の減少による）と関連するが、それとは異なる機構によってテンプレート転写産物によってコードされるタンパク質の発現を抑制し得る。このようなＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれ、通常、約２０〜２６ヌクレオチド長（例えば、２２ヌクレオチド長）である。それらは、小さな一時的（Ｓｍａｌｌｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）として知られているより大きな前駆体又はｍＲＮＡ前駆体に由来すると考えられ、これらは通常約７０ヌクレオチド長で、約４〜１５ヌクレオチドのループを有する（Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ｅｔａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ１０６：２３−２４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３：８３４−８３８；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．ら、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，２６５４−２６５９を参照のこと）。この種の内因性ＲＮＡが、哺乳動物を含む多くの生物において同定されており、転写後遺伝子サイレンシングの機構が広範囲に存在する可能性を示唆している（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４，８５３−８５８；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．，２００２，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ１８：１７１−１７３、及び上述の２本の論文中の参考文献）。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、哺乳動物細胞中で標的部位を含む標的転写産物の翻訳を阻害することが示されている（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ら、２００２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ９：１−２０）。

３’ ＵＴＲ（又は標的転写産物の別の領域）内に結合して翻訳を阻害する天然型又は人工の（即ち、ヒトによって設計された）ｍＲＮＡなどのｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二本鎖中のより多くのミスマッチを受容可能であり、特に二本鎖の中央領域内のミスマッチを受容可能である。実際に、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳を抑制することが示されているｍＲＮＡが示すように、天然型のｓｔＲＮＡはこのようなミスマッチを示すことが多いため、一部のミスマッチが望ましい、もしくは必要であり得るとの証拠がある。例えば、標的転写産物にハイブリダイズする場合、このようなｓｉＲＮＡは、ミスマッチ領域によって分離された完全に相補的な２本の伸長を含むことが多い。様々な構造が可能である。例えば、ｍＲＮＡは複数の非同一（ミスマッチ）領域を含みうる。非同一（ミスマッチ）領域は、標的とｍＲＮＡとの両方が対合しないヌクレオチドを含むという意味で、対称である必要はない。通常、完全に相補的なストレッチは、少なくとも５ヌクレオチド長（例えば、６、７ヌクレオチド長以上）であり、ミスマッチ領域は、例えば１、２、３、４ヌクレオチド長であり得る。

ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体を模倣するように設計されたヘアピン構造は、細胞内でプロセシングを受けて、標的転写産物の発現を減少又は抑制可能な分子になる（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ら、２００２，ＲＮＡ８：８４２−８５０）。これらのヘアピン構造は、１９ｂｐの二本鎖構造を形成する２本のＲＮＡ鎖からなる従来のｓｉＲＮＡに基づいており、クラスＩ又はクラスＩＩヘアピンに分類される。クラスＩヘアピンは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖（即ち、その抑制を目的とする標的転写産物と相補的な鎖）の５’又は３’末端においてループを組み込むが、その他の点では従来のｓｉＲＮＡと同じである。クラスＩＩヘアピンは、ステム中の１つ以上のヌクレオチドミスマッチに加えて、１９ヌクレオチドの二本鎖領域と二本鎖のアンチセンス鎖の３’又は５’末端のいずれかにループを含む点で、ｍＲＮＡ前駆体と類似している。これらの分子は、細胞内でプロセシングを受けて、サイレンシングを媒介可能な小さなＲＮＡ二本鎖構造になる。これらは、天然型ｍＲＮＡ及びｓｔＲＮＡで考えられるように、翻訳抑制を通じてよりも、標的ｍＲＮＡの分解を通じてその効果を示すと思われる。

このように、二本鎖構造を含む多様なＲＮＡ分子の集合が様々な機構を通じてサイレンシングを媒介可能であることが明らかである。本発明の目的のためには、分解誘発、翻訳抑制、もしくは他の方法によってかに関わらず、その一部が標的転写産物に結合してその発現を低下させる、任意のこのようなＲＮＡが、ｓｉＲＮＡと見なされ、このようなｓｉＲＮＡ（即ち、ＲＮＡの前駆体としての役割を果たす）を生じる構造は、本発明の実施に際して有用である。

本発明において、ｓｉＲＮＡは治療の目的（例えば、腫瘍又は過剰増殖性障害のリスクにさらされた、もしくはそれを罹患している被験体においてＫＩＲタンパク質の発現を調節する）で有用である。一実施形態では、抗体、アンチセンスベクター、二本鎖ＲＮＡベクターを併用した、濃縮ＮＫ細胞集団による固形腫瘍又は過剰増殖性障害の治療的処置である。

したがって、本発明は（ｉ）抑制性ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する生物系を提供する工程、（ｉｉ）抑制性ＫＩＲタンパク質をコードする転写産物を標的とするｓｉＲＮＡと系との接触の工程を包含する、抑制性ＫＩＲタンパク質をコードする遺伝子の発現の抑制方法を提供する。本発明の特定の実施態様では、この生物系はＮＫ細胞を含み、接触工程は細胞内でのｓｉＲＮＡの発現を含む。本発明の特定の実施態様では、生物系は被験体（例えば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物被験体）を含み、接触工程は被験体へのｓｉＲＮＡ投与、もしくは被験体内でのｓｉＲＮＡ発現を含む。本発明の特定の実施態様では、ｓｉＲＮＡは、誘導的及び／又は細胞型特異的もしくは組織特異的に発現させる。

“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｓｔｅｍ（生物系）”とは、生体分子（例えば、核酸、ポリペプチド、多糖類、脂質など）、細胞又は細胞集団、組織、器官、生物などを入れる器、ウェル、容器を意味する。通常、生物系は、細胞又は細胞集団（例えば、ＮＫ細胞）であるが、上記方法は、精製又は組み換え型タンパク質を使用した器内でも実施できる。

本発明は、ＫＩＲタンパク質をコードする転写産物を標的とするｓｉＲＮＡ分子を提供する。特に、本発明は、濃縮ＮＫ細胞集団内において、このような転写産物の多型変異体をコードする転写産物を選択的又は特異的に標的とするｓｉＲＮＡ分子を提供する。“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ（選択的に）”又は“Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｔａｒｇｅｔｅｄｔｏ（特異的に標的とする）”の用語は、ここでは、ｓｉＲＮＡが他の変異体（即ち、被験体での存在が化学療法に耐性の腫瘍性疾患に対する感受性又は有無を示さないような変異体）よりも変異体の発現をより大きく減少させることを示すことが意図される。ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ群は、必要に応じて、さらなる化合物と共に、キットの形態で提供可能である。

（短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により媒介される転写後遺伝子サイレンシングの機構であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ストリンジェントな条件下でキラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）標的遺伝子にハイブリダイズして、当該標的遺伝子の発現を弱める核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）の哺乳動物への投与による、哺乳動物における腫瘍性疾患の処置方法として有用である（ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡの概説については、Ｊａｉｎ，
Ｋ．Ｋ．，２００４，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ５：２３９−４２を参照のこと）。本発明のＲＮＡ干渉のさらなる方法は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。特定の所望のｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを、トランスフェクション又はウイルス媒介感染によって標的細胞内に移入させる。一度、細胞内に入れば、ＤＮＡ配列は継続的にＲＮＡ分子に転写され、ＲＮＡ分子は分子内の塩基対合を介してそれ自体が折れ曲がり、ヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、細胞によってプロセシングを受けた場合、移入されたｓｉＲＮＡ分子と同等であり、細胞によって利用されて所望のタンパク質のＲＮＡｉを媒介する。ｓｈＲＮＡの使用は、タンパク質発現の安定かつ長期間の抑制が可能なため、ｓｉＲＮＡトランスフェクションよりも有利である。トランスフェクションされたｓｉＲＮＡによるタンパク質発現の抑制は、数日以上の長期間にわたって起こることのない一過性の現象である。一部の例では、このことが好ましく、望まれ得る。より長期間のタンパク質の抑制が必要な場合、ｓｈＲＮＡ媒介性の抑制が好ましい。

（完全／部分長アンチセンスＲＮＡ転写産物）
アンチセンスＲＮＡ転写産物は同じ細胞内の他のＲＮＡ転写産物の一部又は全てと相補的な塩基配列を有する。このような転写産物は、ＲＮＡスプライシングの調節、ＲＮＡ輸送の調節、ｍＲＮＡ翻訳の調節などの様々な機構を通じて遺伝子発現を調節することが示されている（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，１９９２，ＡｎｎＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：７０；Ｎｅｌｌｅｎ，１９９３，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８：４１９；ＢａｋｅｒａｎｄＭｏｎｉａ，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９：３；Ｘｕら、２０００，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７：４３８；ＦｒｅｎｃｈａｎｄＧｅｒｄｅｓ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１５９；ＴｅｒｒｙｎａｎｄＲｏｕｚｅ，２０００，ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．５：
１３６０）。

（アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド）
アンチセンス核酸は通常、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）の一部分と相補的な一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ）であるため、標的に結合して二本鎖を形成する。通常、これらは１５〜３５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、長さは１０から約５０ヌクレオチドに及び得る。通常、結合によって標的核酸の機能を低下又は抑制する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに結合した場合には転写を阻害し、ｍＲＮＡに結合した場合には翻訳を阻害し、そして／又は核酸の分解を導き得る。抑制性ＫＩＲポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ核酸と相補的な配列からなるアンチセンス核酸又はペプチド核酸の投与によって減少され得る。アンチセンス技術及びその応用は、当業者に周知であり、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，
Ｍ．Ｉ．（ｅｄ．）ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２０００，Ｖｏｌｕｍｅｓ３１３ａｎｄ３１４，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ及び本明細書の参考文献に記載されている。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（ｅｄ．）， “ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＤｒｕｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” （１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ及び本明細書で引用されている参考文献も参照のこと。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内の任意のＲＮＡ転写産物の一部と相補的な塩基配列で合成可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライシングの調節、ＲＮＡ輸送の調節、ｍＲＮＡの翻訳の調節などの様々な機構を通じて遺伝子発現を調節可能である（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，１９９２）。安定性、毒性、組織分布、細胞取り込み、結合親和性などのアンチセンスオリゴヌクレオチドの様々な特性は、（ｉ）ホスホジエステル骨格（例えば、ペプチド核酸、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ホスホロアミデートオリゴヌクレオチド）の置換、（ｉｉ）糖ベース（例えば、２’−Ｏ−プロピルリボース、２’−メトキシエトキシリボース）の修飾、（ｉｉｉ）核酸（例えば、Ｃ−５プロピニルＵ、Ｃ−５チアゾールＵ、及びフェノキサジンＣ）の修飾などの化学修飾を通じて改変可能である（Ｗａｇｎｅｒ，１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１：１１１６；Ｖａｒｇａら、１９９９，Ｉｍｍｕｎ．Ｌｅｔｔ．６９：
２１７；Ｎｅｉｌｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：７１，１９９９；Ｗｏｏｌｆ，１９９０，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：１７６３）。

（リボザイム）
リボザイム又はデオキシリボザイムと呼ばれる特定の核酸分子が、配列特異的なＲＮＡ分子の切断を触媒することが示されている。切断部位は、ＲＮＡ又はＤＮＡ酵素内のヌクレオチドと標的ＲＮＡ内のヌクレオチドとの相補的な対合によって決まる。したがって、ＲＮＡおよびＤＮＡ酵素は、任意のＲＮＡ分子を切断するように設計され得、これによって分解率を高め得る（ＣｏｔｔｅｎａｎｄＢｉｒｎｓｔｉｅｌ，１９８９，ＥＭＢＯＪ．８：３８６１−３８６６；Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌ，ＡｃｉｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２４３；Ｕｓｍａｎら、１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：５２７；Ｓｕｎら、２０００，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５２：３２５；ＣｏｔｔｅｎａｎｄＢｉｒｎｓｔｉｅｌ，１９８９，ＥＭＢＯＪ．８：３８６１−３８６６も参照のこと）。

（ＳＣＦＶファージライブラリー）
キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）の細胞内ドメイン又は細胞外ドメインに対するｓｃＦｖ抗体ライブラリーを使用して、固形腫瘍又は過剰増殖性障害の処置が可能である。ＫＩＲタンパク質へ特異的に結合する抗体組成物の同定のためのファージディスプレイライブラリーでの１つのアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
ＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３，１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０，１９９０参照）。バクテリオファージ外殻タンパク質上にディスプレイされるｓｃＦｖライブラリーの様々な実施態様が記述されてきた。例えば、ＷＯ９６／０６２１３、ＷＯ９２／０１０４７（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌｅｔａｌ．）、ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）に記載されているような、ファージディスプレイ法の改良も知られており、これらは参考として本明細書中に援用される。例えば、ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）及びＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）に記載されているような、Ｆａｂライブラリーのディスプレイも知られている。

抗体又は抗体断片はファージ又はファージミド粒子の表面に存在するため、良好な結合活性を保持した変異体を同定するために、固形腫瘍又は過剰増殖性障害の処置のためのＮＫ細胞上のＫＩＲと関連する適当な抗原に対してディスプレイベクターにクローニングされたハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体断片を選択可能である。例えば、ＢａｒｂａｓＩＩＩら、ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１を参照のこと。この内容は参考として本明細書中に援用される。例えば、Ｆａｂ断片の場合、軽鎖及び重鎖Ｆｄ産物はｌａｃプロモーターの制御下にあり、そして各鎖は、細菌宿主のペリプラスム間隙を指向させるために、そのプロモーターに融合されたたリーダーシグナルを有する。この間隙において、抗体断片が適切にアセンブル可能となり得る。重鎖断片はファージの外殻タンパク質ドメインとの融合体として発現させられ、これによって組み立てられた抗体断片が新たに作られたファージ又はファージミド粒子の外殻内に組み込み可能になる。新しいファージミド粒子の生成には、ファージの必要な全遺伝子を含むヘルパーファージの添加が必要となる。抗体断片のライブラリーがファージ又はファージミド表面上に提示されると、パニングと呼ばれる過程が続く。これは、ｉ）ファージ又はファージミド粒子の表面上にディスプレイされた抗体が目的の抗原に結合し、ｉｉ）未結合のものは洗い流され、ｉｉｉ）結合粒子は抗原から溶出され、ｉｖ）追加選択用に濃縮プールを増幅させるために、溶出粒子を新しい細菌宿主に曝露させる方法である。通常、抗体クローンの特異的結合をスクリーニングする前にパニングを３回または４回実施する。この方法で、ファージ／ファージミド粒子によって、遺伝子型（ＤＮＡ）と結合表現型（抗体）との関連付けが可能となり、抗体ディスプレイ技術の使用を成功させる。しかし、選択及び／又はスクリーニングのための溶菌性ファージベクター（改変Ｔ７又はＬａｍｂｄａＺａｐシステム）内への抗体断片ライブラリーのクローニングなど、このヒト化プロセスにおいて他のベクター型を使用可能である。

目的のハイブリッド抗体及び／又はハイブリッド抗体断片の選択後、当業者に周知の任意の方法によってそれらが大量生産（例えば、原核生物又は真核生物細胞での発現など）され得ることが企図される。例えば、抗体の重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来の方法を利用してハイブリッド抗体又は断片を産生可能であり、ここでＣＤＲ、そして必要に応じて、本来の種の抗体結合における特異性を保持するために必要な可変領域の枠組みの最小部位（本明細書に記載の方法に従って作成）が、元の種の抗体由来であり、抗体の残り部分が、本明細書に記載のとおりに操作可能な標的種の免疫グロブリン由来であり、これによってハイブリッド抗体の重鎖の発現用ベクターを作成する。

詳細な実施態様では、様々な癌疾患を伴う５、１０、１５、２０人以上の患者の末梢血リンパ球から、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ライブラリーを調製可能である。次に、完全にヒトの高親和性ｓｃＦｖ抗体を合成シアリルＬｅｗｉｓ^ＸとＬｅｗｉｓ^ＸＢＳＡコンジュゲートを使用して選択可能である。１例の研究では、これらのヒトｓｃＦｖ抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、膵臓腺癌細胞の細胞表面へのフローサイトメトリー結合によって実証されているとおり、シアリルＬｅｗｉｓ^ＸとＬｅｗｉｓ^Ｘに特異的であった。ヌクレオチド配列決定により、少なくとも４つの固有のｓｃＦｖ遺伝子が含まれていることが明らかになった。Ｋ_ｄ値は１．１〜６．２×１０^−７Ｍであり、二次免疫反応由来のｍＡｂの親和性と同程度であった。これらの抗体は、糖鎖抗原の構造及び機能の究明、そしてヒトの腫瘍疾患の処置における有益な試薬となりうる（Ｍａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６９５３−６９５８，１９９９）。

さらに詳細な実施態様では、ファージディスプレイコンビナトリアル抗体ライブラリーを使用して、転移細胞と関連する適当な抗原（例えば、ＮＫ細胞上のＫＩＲタンパク質）に対する多種類の抗体を生成および選択可能である。ファージの外殻タンパク質であるｐＶＩＩ及びｐＩＸを使用して、抗体のＦｖ部分のヘテロ二量体構造をディスプレイすることが可能である。この方法の態様は、繊維状バクテリオファージのｐＩＸ上にディスプレイされる４．５×１０^９の大きなヒトの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリーの作成に拡大されている。さらに、ライブラリーの多様性、品質、有用性が６種の異なるタンパク質抗原に対するｓｃＦｖクローンの選択によって実証された。特に、選択されたクローンの９０％以上が、わずか３回のパニング後にそれらの各抗原に対する結合に陽性を示した。分析されたｓｃＦｖは高品質であることもまた、判明した。例えば、動態分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって、ブドウ球菌のエンテロトキシンＢ及びコレラ毒素Ｂサブユニットに対するｓｃＦｖの解離定数は、それぞれナノモル及びナノモル以下であり、免疫によって得られるｍＡｂと同程度又はそれ以上の親和性をもたらした。異なるタンパク質間のみならず、より密接に関連したタンパク質間［例えば、トウゴマ（“リシン”）凝集素（ＲＣＡ_６０、ＲＣＡ_１２０）］で両者間の８０％以上の配列相同性にもかかわらず、高い特異性が得られた。ｐＩＸディスプレイライブラリーの性能が、ｐＩＩＩディスプレイ型の性能を上回り、多様な標的抗原のパニングに理想的に適する可能性を、この結果は示唆した（Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
９９：１２６１２−１２６１６，２００１）。

抗体又は他の結合剤と抗原との特異的結合は、少なくとも１０^−６Ｍの結合親和性を意味する。好ましい結合剤は、少なくとも１０^−７Ｍの結合親和性で結合し、好ましくは、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍである。エピトープという用語は、抗体への特異的結合の可能な抗原決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な分子の表面基からなり、固有の電荷特性の他、固有の三次元構造特性を有する。立体構造又は非立体構造エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われる点で区別される。

（有効量）
本明細書に記載されている疾患（例えば、転移癌、固形腫瘍、過剰増殖性障害）の処置のための濃縮ＮＫ細胞集団の組成物の有効量は、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるのか、他の投薬、処置が予防的または治療的のいずれを目的としているのか、といった多くの異なる要因によって変動する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニックの哺乳動物を含めたヒト以外の哺乳動物も処置可能である。処置用量を漸増させて、安全性および有効性を最適化する必要がある。

濃縮ＮＫ細胞集団の投与において、用量は患者１人当たり約１×１０^６から約１×１０^１２ＮＫ細胞である。濃縮ＮＫ細胞集団の投与において、用量はレシピエントの体重１ｋｇ当たり約１×１０^５から約１×１０^９ＮＫ細胞、もしくはレシピエントの体重１ｋｇ当たり約５×１０^６から約１×１０^８、ＮＫ細胞である。典型的な処置計画は、２週間に１回又は１ヶ月に１回又は３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。一部の方法では、２種以上の濃縮ＮＫ細胞集団を同時に投与し、この場合、投与される各濃縮ＮＫ細胞集団の用量は示された範囲内に収まる。濃縮ＮＫ細胞集団は複数回投与できる。一回投与の間には１週間、１ヶ月、又は１年の間隔を置くことができる。患者での濃縮ＮＫ細胞集団の血中濃度測定で示されるように、間隔は不定期でも可能である。代替的な方法として、濃縮ＮＫ細胞集団は徐放性製剤としても投与可能であり、この場合、投与回数を減らす必要がある。用量及び回数は、患者における濃縮ＮＫ細胞集団の半減期に応じて変動する。投与の用量及び回数は、処置が予防的とまたは治療的のいずれを目的とするのかによって変動し得る。予防で用いる場合、長期間にわたり、比較的低頻度で比較的低用量を投与する。一部の患者は、その後処置を受け続ける。治療で用いる場合、疾患の進行が軽減する、もしくは終結するまで、または好ましくは、患者が病状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要となる場合がある。その後、患者に予防計画を施すことができる。

（投与経路）
疾患（例えば、転移性癌、固形腫瘍、過剰増殖性障害）の処置用の濃縮ＮＫ細胞集団の組成物は、静脈内、膀胱内、髄腔内、非経口、局所、皮下、経口、経鼻、動脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内により投与可能である。予防的／アジュバントとして、もしくは疾患の処置として、濃縮ＮＫ細胞集団は過剰増殖性障害又は固形腫瘍（例えば、尿生殖器の悪性疾患）を標的とし、かつ／又は治療上の処置を目的としている。最も標準的な免疫原の投与経路は皮下であるが、他の経路も同様に効果的である。次に最も一般的な経路は筋肉注射である。この種の注射は腕又は脚の筋肉に施されるのが最も標準的である。一部の方法では、沈着物が蓄積した特定組織内に薬剤を直接注射する（例えば、頭蓋内注射）。静脈注射時の筋肉注射が、濃縮ＮＫ細胞集団の投与において好ましい。一部の方法では、特定の治療用の濃縮ＮＫ細胞を膀胱内に直接注射する。

本発明の薬剤は、各種の過剰増殖性障害を含む様々な疾患の治療において少なくとも部分的に有効な他の薬剤との選択的な併用投与が可能である。腫瘍が脳へ転移した場合、本発明の薬剤は、本発明の薬剤の血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を促進させる他の薬剤と併用投与することも可能である。

（処方）
疾患（例えば、転移性癌、固形腫瘍、過剰増殖性障害）の処置のための濃縮ＮＫ細胞集団の組成物
疾患（例えば、転移性癌、固形腫瘍、過剰増殖性障害）の処置のための濃縮ＮＫ細胞集団の組成物は、活性医薬品（即ち、他の医薬品として受容可能な様々な化合物）を含む医薬組成物として投与される場合が多い（例えば、ＡｌｆｏｎｓｏＲＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，（旧Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００３、その全体が本明細書において参考として援用される）。好ましい型は、目的の投与方法や治療への用途に左右される。組成物は、目的の処方に応じて、医薬品として受容可能な、毒性のないキャリア又は希釈剤を含むことも可能で、これらは動物やヒトへ投与するための医薬組成物の処方に一般的に使用される賦形剤として定義される。組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように、希釈剤を選択する。このような希釈剤の例は、１０％不活化ヒトＡＢ血清又は１０％自己血清を含むＸ−ｖｉｖｏ２０ｍｅｄｉａ（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリーランド州ウォーカーズビル）である。このような希釈剤のさらなる例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他のキャリア、アジュバント、又は毒性のない非治療用の非免疫原性安定剤なども含むことができる。

医薬組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖類、ポリラクチド、ポリグリコール酸及び共重合体（ラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ、アガロース、セルロースなど）、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質凝集体（油滴、リポソームなど）などの大きく代謝の遅い高分子を含むことも可能である。加えて、これらのキャリアは免疫促進物質（即ち、アジュバント）としても機能できる。

非経口投与の場合、本発明の組成物を、水油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの滅菌液にできる医薬キャリアを用いて、生理学的に受容可能な希釈剤中の物質溶液又は懸濁液という注射可能な投薬形態で投与できる。また、湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤などが組成物中に存在できる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、又は合成起源、例えば、ビーナッツオイル、大豆油、鉱物油の成分である。一般に、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射液剤には好ましい液体キャリアである。濃縮ＮＫ細胞集団は、有効成分を徐放できるように処方可能な蓄積注射又はインプラント製剤の形で投与可能である。典型的な組成物は、５０ｍＭＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭＮａＣｌの水性緩衝液で製剤され、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整された５ｍｇ／ｍＬの濃縮ＮＫ細胞集団を含む。

通常、組成物は、液体溶液又は懸濁液として、注射物質として調製する。注射前の液体溶媒中への溶解又は懸濁に適した固形も調製できる。上記のとおりに、アジュバント効果を高めるために、製剤を乳化するか、もしくはリポソーム又はポリラクチド、ポリグリコリド、共重合体などのマイクロ粒子内に封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７，１９９０；Ｈａｎｅｓ，ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ，２８：９７−１１９，１９９７、その全体が本明細書において参考として援用される）。本発明の薬剤は、有効成分を徐放又はパルス放出できるように処方可能な蓄積注射又はインプラント製剤の形で投与可能である。

他の投与方法に適したさらなる処方には、経口、経鼻、肺への投与、座薬、経皮投与が含まれる。

座薬では、結合剤及びキャリアとしては、例えばポリアルキレングリコール又はトリグリセライドが挙げられる。このような座薬は、有効成分を０．５〜１０％、好ましくは１〜２％含む混合物から形成され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル剤、カプセル、徐放製剤、粉末の形態であり、有効成分を１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％含む。

局所適用は、経皮又は皮内送達を可能にする。局所投与は、コレラ毒素又は無毒化誘導体、又はこれらのサブユニット、もしくは他の同様の細菌毒素と薬剤を同時投与することで促進可能である（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８５１，１９９８）。成分を混合物として、もしくは化学架橋又は融合タンパク質として発現させることで得られる連結分子として使用することで、同時投与が可能となる。

代替的な方法として、皮膚パッチまたはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を使用して、経皮送達が可能となる（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：３５２１−２４，１９９５；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３６８：２０１−１５，１９９８、その全体が本明細書において参考として援用される）。

医薬組成物は通常、患者への投与に適した形態の濃縮ＮＫ細胞集団の組成物を含む。医薬組成物は通常、無菌的で、実質的に等張であり、米国食品医薬品局の医薬品製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）の全規則を全面順守して処方設計される。

（毒性）
好ましくは、本明細書に記載の治療に有効量の濃縮ＮＫ細胞集団の組成物が、深刻な毒性を生じることなく治療的有用性をもたらす。

本明細書に記載のＮＫ細胞集団の毒性は、細胞培養又は実験動物での標準的な医薬用手順によって測定される［例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死となる用量）又はＬＤ_１００（集団の１００％が致死となる用量）］。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用において毒性のない用量範囲で処方計画を立てる際に使用可能である。本明細書に記載の濃縮ＮＫ細胞集団の用量は、毒性のほとんどない有効量を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、採用した剤形や使用した投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。厳密な処方、投与経路、用量は、患者の状態を考慮して各医師によって選択可能である（例えば、Ｆｉｎｇｌら、ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓ
ＯｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，１９７５、その全体が本明細書において参考として援用される）。

（キット）
本発明の組成物（例えば、濃縮ＮＫ細胞集団）を含むキット及び使用方法も本発明の範囲内である。キットは、本発明の少なくとも１種の追加試薬、もしくは１種以上の追加ヒト抗体（例えば、最初のヒト抗体とは異なる抗原中のエピトープに結合する、補体活性を有するヒト抗体）をさらに含むことができる。キットは通常、キットの内容物の目的の用途を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上、キットと同梱、もしくは他の方法でキットに添付された文書又は記録を含む。

典型的な実施形態
（実施例１）
同種異系ＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞の単離及び増殖
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株の作成：１００μｇ／ｍＬサイクロスポリンＡ（ＣＳＡ，ＳａｎｄｏｚＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ，ワシントンＤＣ）存在下で、Ｂ９５−８細胞株（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から回収されたＥＢＶ上精とともに末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を培養することによって、ＥＢウイルス形質転換リンパ芽球性細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）を樹立した。ヒト黒色腫（ＭＥＬ）細胞株Ｓｔ−ＭＥＬ及びＲ−ＭＥＬ、そしてヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞株Ｗｈ−ＲＣＣを、転移病巣の生検及び腎腫瘍の１次試料（国立癌研究所［ＮＣＩ］）から樹立した。ヒトＲＣＣ細胞株ＳＪ−ＲＣＣを、ＮＣＩから入手した腎摘出術での検体から樹立して、当研究所にて維持した。ＥＢＶ−ＬＣＬ、ＭＥＬ、ＲＣＣ株は１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０で維持した。ＭＨＣクラスＩタイピングは、配列特異的プライマーによるＰＣＲ（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を用いて、国立衛生研究所ＨＬＡ研究所にて実施された。簡単に説明すると、まずゲノムＤＮＡを、Ｂｕｎｃｅら、ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ，４６：３５５−３６７，１９９５（その全体が本明細書において参考として援用される）に記載のプライマー及びＰＣＲ条件を利用して、末梢血リンパ球又は腫瘍サンプルから抽出した。最終ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイド染色よって２％アガロースゲル上で可視化して、大まかなバンドサイズの有無によって結果を判定した。この試験の目的のために、単一ＨＬＡ−Ｃ反応性ＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＬ２／３又はＫＩＲ２ＤＬ１；表１）への結合が予測されるＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合性となるように、腫瘍株を特異的に選択した。

ＨＬＡ−Ｃグループの患者をＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子及び対応するＫＩＲリガンドによってグループ分けした。
^＊ＳＫＥＭは、ＲＣＣ患者ＳＪにおいてＨＬＡが同一の同胞ドナーである。
＋Ｗｈ−ＲＣＣはＨＬＡ−Ｃｗ遺伝子座を喪失していた。

ＮＫ細胞培養液：バルクＮＫ細胞及び限界希釈クローニングにより単離されたＮＫ細胞を、１０％ヒトＡＢ結成、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５００ＩＵ／ｍＬインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含むＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ無血清培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、メリーランド州ガイザースバーグ）で増殖させた（特に指定のない場合）。バルクＮＫ細胞及び限界希釈クローニングにより単離されたＮＫ細胞も、１０％不活化ヒトＡＢ血清又は１０％自己血清を含むＸ−ｖｉｖｏ２０培地（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖させた。

フローサイトメトリー：以下の抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して、フローサイトメトリーによって細胞表面の表現型を決定した：抗ＣＤ１６−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（クローンＢ７３．１マウス免疫グロブリンＧ１［ＩｇＧ１］；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホゼ）、抗ＣＤ１５８ａ−ＰＥ（クローンＥＢ６、マウスＩｇＧ１；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、フランスマルセイユ）、抗ＣＤ１５８ｂ−ＰＥ（クローンＧＴＬ８３、マウスＩｇＧ１；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ５６−Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ（クローンＭＹ３１、マウスＩｇＧ１；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ＣＤ３−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（クローンＳＫ７、マウスＩｇＧ１；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ−ＰＥ（クローンＨＩ１１１、マウスＩｇＧ１；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、及び抗ヒトＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−ＰＥ（クローンＧ４６−２．６、マウスＩｇＧ１；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）。細胞は対応するアアイソタイプの一致する対照ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でも染色した。全てのサンプルを、ＥＰＩＣＳＸＬ−ＭＣＬ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、フロリダ州マイアミ）を使用して分析した。ＥＸＰＯ３２ＡＤＣソフトウェア（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を、データ収集及び分析のために使用した。

腫瘍細胞株上のＮＫＧ２リガンドの評価：ＮＫＧ２Ｌ、ＭＩＣＡ（Ｍ３６３）、ＭＩＣＢ（Ｍ３６４）、ＭＩＣＢ（Ｍ３６４）、ＵＬＢＰ１（Ｍ２９５）、ＵＬＢＰ２（Ｍ３１１）、ＵＬＢＰ３（Ｍ５５１）に対する非結合体化抗体（Ａｍｇｅｎ、ワシントン州シアトル）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合ヒツジ抗マウス免疫グロブリン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）で二次抗体染色を実施した。Ｉ−３０９反応性ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）であるＭＡＢ２７２を使用して、特異的染色を明らかにした。ＦＡＣＳｃａｎ機器（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、染色を評価した。

自己又は同種異系ＮＫ細胞の単離及び増殖：５〜２５リットルのアフェレーシス療法後の癌患者又は健常人ドナーから、最初に、単核球を回収した。次に、以下の２つの異なる免疫磁気ビーズ法の１つを利用して、ネガティブ除去によって単核球画分のＮＫ細胞を濃縮した。１）メーカーの推奨条件に従ったＤｙｎａｌｂｅａｄｓ（ＤｙｎａｌＮＫ細胞単離キット、ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ、ニューヨーク州レイクサクセス）、２）ｃＧＭＰガイドラインに従ったＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ５６ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓＮＫ細胞単離機器の使用。これは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＴ細胞ＣＤ３ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用したＴ細胞除去段階と、その後のＣＤ５６^＋ＮＫ細胞のポジティブ選択からなる２段階手順を包含する。

次に、単離したＮＫ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで２〜４週間にわたり、１０％不活化ヒトＡＢ血清又は１０％自己血清および５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（４−７日ごとにＩＬ−２を添加）を含むＸ−ｖｉｖｏ２０培地（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で増殖させた。１日目及び１５日目に、２つの異なる照射されたフィーダー集団のうちの１つを、バルクＮＫ細胞に添加した：１）各ＮＫ細胞に対して１０〜１００個のＥＢＶＬＣＬ細胞（通常、２０個のＥＢＶＬＣＬ細胞）の比率の、照射（７５〜１００Ｇｙ）された同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬ、もしくは２）各ＮＫ細胞に対して５０−１００個のＰＢＭＣ（通常、１００個のＰＢＭＣ）の比率の、照射（２５〜１００Ｇｙ、通常５０Ｇｙ）された自己又は同種異系ＰＢＭＣ。ＰＢＭＣフィーダーを使用して、ＮＫ細胞を４週間にわたって２−３ｌｏｇまで増殖させ、一方、ＥＢＶＬＣＬフィーダーは通常、同じ時間間隔で４−５ｌｏｇまで増殖する。

同種異系ＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞の単離及び増殖：メーカーの推奨条件に従い、免疫磁気ビーズ（ＤｙｎａｌＮＫ細胞単離キット、ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ、ニューヨーク州レイクサクセス）を使用したネガティブ除去によって、グループ１（Ｃ−Ｇ１；ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合）又はグループ２（Ｃ−Ｇ２；ＫＩＲ２ＤＬ１に結合）のいずれかのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合性である健常人ドナーから得たＰＢＭＣからＮＫ細胞集団を濃縮した。ＰＢＭＣを緩やかに転倒混和しながら、４℃で１０分間にわたり、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ３６、抗ＣＤｗ１２３、抗ＨＬＡクラスＩＩＤＲ／ＤＰを含む抗体の混合物と培養した。細胞を、ＰＢＳ／０．１％ヒトＡＢ血清で洗浄し、５００ｇで８分間遠心分離した。上精を捨てて、細胞の沈殿をＰＢＳ／０．１％ヒトＡＢ血清に再懸濁させ、除去Ｄｙｎａｂｅａｄｓの添加後、４℃で１０分間インキュベートした。この細胞懸濁液を、磁性粒子濃縮器（ＤｙｎａｌＭＰＣ）内に２分間置いた後、上精の除去そして除去ビーズ段階を繰り返した。ＮＫ細胞の純度をフローサイトメトリーで測定した（通常、９８％以上の範囲内）。濃縮ＮＫ細胞の一部分を使用して、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及びフィーダー細胞として１ウェル当たり１０^４個の照射（１００Ｇｙ）された同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬを含む９６ウェルＵ底プレート内に、１〜１０細胞／ウェルの密度での限界希釈により、ＮＫ細胞株を作成した。培養液の半分を新鮮なＩＬ−２を含む新しいＮＫ細胞培地と週１回交換した。濃縮ＮＫ細胞の残り部分を、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び照射（１００Ｇｙ）された同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞（ＥＢＶ−ＬＣＬ対ＮＫ細胞の比率１，０００：１；ＥＢＶ−ＬＣＬ対ＮＫ細胞の比率２０：１も使用した）を含むＮＫ細胞培地中で、バルクＮＫ細胞集団として増殖させた。約１：１から１０００：１の範囲のＥＢＶ−ＬＣＬ対ＮＫ細胞比率が、ＮＫ細胞を増殖させる際に有効であり得る。増殖から２週間後、バルクＮＫ細胞を抗ＣＤ１５８ｂ−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ５６Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅで染色し、次いでＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｄａｋｏ−ＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＩｎｃ．，コロラド州フォートコリンズ）を使用して分類し、ＣＤ５６^＋／ＣＤ１５８ｂ^＋又はＣＤ５６^＋／ＣＤ１５８ａ^＋集団を単離し、上記のとおりにＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー及びＮＫ細胞培地を使用して２週間にわたり再増殖させた。ほとんどの実験において、ＮＫ細胞と反対のグループ内のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合である同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬをフィーダー細胞として使用した。

ＡＫＩ−ＮＫ細胞の単離及び増殖：メーカーの推奨条件に従い、免疫磁気ビーズ（ＤｙｎａｌＮＫ細胞単離キット、ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ、ニューヨーク州レイクサクセス）を使用したネガティブ除去によって、グループ１（Ｃ−Ｇ１；ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合）又はグループ２（Ｃ−Ｇ２；ＫＩＲ２ＤＬ１に結合）のいずれかのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合性である癌患者又は健常人ドナーから得た末梢血単核球から、ＮＫ細胞集団を濃縮した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣを緩やかに転倒混和させながら、４℃で１０分間にわたり抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ３６、抗ＣＤｗ１２３、抗ＨＬＡクラスＩＩＤＲ／ＤＰを含む抗体の混合物と培養した。細胞をＰＢＳ／０．１％ヒトＡＢ血清で洗い、５００ｇで８分間遠心分離した。上精を捨てて、細胞の沈殿をＰＢＳ／０．１％ヒトＡＢ血清に再懸濁し、除去Ｄｙｎａｂｅａｄｓの添加後、４℃で１０分間培養した。細胞懸濁液を磁性粒子濃縮機（ＤｙｎａｌＭＰＣ）内に２分間置いた後、除去ビーズ段階を繰り返した。次いで、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ１５８ｂ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１５８ａ−ＰＥ、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、抗ＮＫＢ１−ＡＰＣで染色した。ＭｏＦｌｏフローセルソーターを使用して、ＮＫ細胞を５つの異なるＮＫ部分集団に分類した：ＣＤ３陰性ＮＫ細胞（バルクＮＫ）、ＣＤ１５８ｂ−／ＣＤ１５８ａ−／ＮＫＢ１−／ＣＤ３− ＮＫ細胞、ＣＤ１５８ｂ＋／ＣＤ１５８ａ−／ＮＫＢ１−／ＣＤ３− ＮＫ細胞、ＣＤ１５８ａ＋／ＣＤ１５８ｂ−／ＮＫＢ１−／ＣＤ３− ＮＫ細胞、ＮＫＢ１＋／ＣＤ１５８ｂ−／ＣＤ１５８ａ−／ＣＤ３− ＮＫ細胞。別の方法として、ＮＫ細胞を抗体結合磁気ビーズ（例えば、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１５８ａ、抗ＣＤ１５８ｂ）によって分類可能であり、ビーズに結合したＮＫ細胞を磁気カラムで濃縮した。抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１５８ａ、抗ＣＤ１５８ｂ磁気ビーズに結合する二次抗体と一緒に磁気ビーズも使用可能である。次に分類された細胞を刺激因子として照射したＥＢＶ−ＬＣＬ（ＥＢＶ−ＬＣＬ対ＮＫ細胞比率：１，０００：１）を使用して直接増殖させるか、または１ウェル当たり５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及びフィーダー細胞として１０^４個の照射（１００Ｇｙ）した同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬを含む２００μＬのＮＫ細胞培養液の入った９６ウェル丸底細胞培養プレート内で、限界希釈によってクローニングした。

ＮＫバルク集団、フローソーティングされたＮＫ部分集団、及びＮＫクローンを、上記のとおりにＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー及びＮＫ細胞培地を使用して、４〜６週間にわたって増殖させた。次に、ＮＫ集団を再び表現型分類して、全集団中の２％以上を占める任意のＴ細胞集団を、ＤｙｎａｌＣＤ３ワンステップ磁気ビーズ除去によって除去した。フローソーティング又はツーステップＤｙｎａｌ磁気ビーズ除去法のいずれかによって、他のＫＩＲ発現ＮＫ細胞の有意な存在を除去した。

ＮＫ細胞増殖の最適化：バルクＮＫ細胞の増殖において、Ｃ−Ｇ１又はＣ−Ｇ２がヘテロ接合性又はホモ接合性であるＥＢＶ−ＬＣＬをフィーダーとして使用し、増殖したＣＤ１５８ａ⁻又はＣＤ１５８ｂ⁻ＮＫ細胞の割合をフローサイトメトリーによって測定した。約１：１から１，０００：１の範囲のＥＢＶ−ＬＣＬ対ＮＫ細胞比率を、ＮＫ細胞の増殖に使用可能である。バルクＮＫ細胞をトリパンブルー染色することによって増殖倍率を測定し、増殖後の生存細胞総数を増殖前の生存細胞数で除算した。

細胞傷害性アッセイ：ＮＫ細胞の増殖後、自己及び同種異系ＫＩＲ適合／ＫＩＲ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ及び固形腫瘍株に対する、ＮＫ細胞の細胞傷害性を試験した。標準的なクロム遊離試験（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ，１０３：１３８３−１３９０，
２００４、その全体が本明細書において参考として援用される）を利用して、ＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。簡単に説明すると、１０^６個の標的細胞を、１００μＣｉのＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）と一緒に１時間培養して、洗浄し、０．７〜１×１０^４細胞／１００μＬの濃度で再懸濁した。各１００μＬのエフェクター（エフェクター：標的比率１０〜２０：１）及び標的（２又は３のレプリケート）を、９６ウェル丸底プレート（ＮａｌｇｅＮｕｎｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューヨーク州）で全容積２００μＬ／ウェルで共培養した。３７℃で５時間培養後、１００μＬの上清を回収して、ガンマカウンターでその放射能含有量を測定した。

次式を用いて特異的溶解の割合を算出した：１００×［試験サンプルからの放出量（ｃｐｍ）−自然放出量（ｃｐｍ）］／［最高放出量（ｃｐｍ）−自然放出量（ｃｍｐ）］。示された全ての値が、二連で＋／−標準偏差の平均を表している。一部の標的を２０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体Ｗ６／３２（抗全クラス１ＭＨＣモノクローナル抗体；ＤＡＫＯ）と前培養させて、ＭＨＣクラスＩ遮断のＮＫ細胞の細胞傷害性に及ぼす影響を評価した。

（実施例２）
ＥＢＶＬＣＬフィーダー細胞株上でのＮＫ細胞の増殖
ＥＢＶＬＣＬフィーダーを含むＮＫ細胞は、１０^４倍以上に増殖可能であり、これはＩＬ−２含有ＳＣＧＭ培地中で培養されたＮＫ細胞集団よりも有意に高く、ＩＬ−２含有ＳＣＧＭ培地では約１０^２倍の正味の増殖が通常認められる。表２を参照のこと。高率のＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞を増殖させる方法を開発した。ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合することが判明しているＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の発現を欠いた、もしくはそれがヘテロ接合性であるＥＢＶＬＣＬフィーダーを使用して、有意に高い割合のＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞を増殖可能である。

ＥＢＶ−ＬＣＬをＰＢＭＣと培養した場合，ＮＫ細胞の好ましい増殖が起こる（Ｐｅｒｕｓｓｉａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌ．，６：１７１−１８８，１９８７；Ｍａｉｎｉｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４４６−４５４，１９９４，その全体が本明細書において参考として援用される）。したがって、ＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞を使用して、バルクＮＫ細胞集団の増殖を高めることが可能であるか否かを調べた。ＰＢＭＣからネガティブ除去によって濃縮（通常、ＣＤ３⁻及びＣＤ５６⁻が９０％以上）されたＮＫ細胞（１×１０^３）を５００ＩＵのＩＬ−２を含む幹細胞増殖倍地（ＳＣＧＭ）のみ、もしくは１×１０^６個の照射したＥＢＶ−ＬＣＬを加えて培養した。１４日後、ＥＢＶ−ＬＣＬフィーダーを含むＮＫ細胞が、ＩＬ−２を含むＳＣＧＭ培地のみで増殖させたＮＫ細胞集団と比較して１０^４倍以上に増殖し、ＩＬ−２を含むＳＣＧＭ培地のみの場合には、通常、約１０^２倍の正味の増殖が認められた。ＮＫ細胞のＨＬＡ−Ｃグループが不適合な場合と比較して、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子が適合したＥＢＶ−ＬＣＬを使用した場合、ＮＫ細胞の増殖において有意差は認められなかった。しかし、ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合することが判明しているＨＬＡ−Ｃの対立遺伝子の発現を欠いているか、もしくはヘテロ接合性であるＥＢＶ−ＬＣＬフィーダーを使用した場合、ＨＬＡ−Ｃグループ１がホモ接合性であるドナーから有意に高い割合でＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞が増殖された（表２）。ＩＬ−２濃度の５−５００ＩＵ／ｍＬの変動は、ＥＢＶ−ＬＣＬをフィーダーに使用した場合、ＮＫ細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。

ＨＬＡ−Ｃグループ１（Ｃ−Ｇ１）がホモ接合である健常人ドナー（ＫＲ０３５０）のＰＢＭＣから陰性セレクションによってＮＫ細胞を濃縮し、照射済みＥＢＶＬＣＬフィーダーを使用してｉｎｖｉｔｒｏで増殖させた：１）ＨＬＡ−Ｃグループ２（Ｃ−Ｇ２）ＥＢＶＬＣＬ、２）自己ＥＢＶＬＣＬ、３）ＨＬＡ−Ｃグループはヘテロ接合性のＥＢＶＬＣＬである。２週間後、増殖させたＮＫ細胞をカウントして、表現型分析を実施した。Ｃ−Ｇ２がホモ接合性であるフィーダー細胞と自己フィーダー細胞間でのＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１５８ｂ＋陽性集団における差は有意であった（＊ｐ＝０．００８５）。値は３回の独立した実験での平均値±ＳＤを表している。
＊＊値は２回の独立した実験での平均値を表している。

（実施例３）
同種異系ＮＫ細胞は、ＫＩＲリガンド適合の腫瘍標的よりもＫＩＲリガンド不適合な腫瘍標的に対して細胞傷害性がより高い
ＫＩＲリガンド適合の腫瘍標的よりもＫＩＲリガンド不適合な腫瘍標的に対して同種異系ＮＫ細胞の細胞傷害性はより高かった。腫瘍がＮＫ細胞エフェクター上で発現される特異的ＫＩＲに対するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を欠く場合にバルク同種異系ＮＫ集団による殺傷に対する黒色腫及びＲＣＣの感受性が高まるか否かを判断するためにｉｎｖｉｔｒｏでの評価をまず実施した。ＨＬＡ−Ｃグループ１（Ｃ−Ｇ１）がホモ接合性のドナーから陰性セレクションによってＰＢＭＣから濃縮されたＮＫ細胞を、照射済みＥＢＶ−ＬＣＬをフィーダー細胞に使用してｉｎｖｉｔｒｏで増殖させた。２週間後、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／３）を発現しているＮＫ細胞をフローソーティングによって単離し、さらに２週間増殖させて、残存する結合抗体を除去した（図１Ａ）。ＫＩＲリガンド適合（例えば、Ｃ−Ｇ１ホモ接合）又はＫＩＲリガンド不適合（例えば、Ｃ−Ｇ２ホモ接合）である腫瘍標的のＣＤ１５８ｂ濃縮（約８０％陽性）バルクＮＫ細胞の細胞傷害作用に対する感受性における差をｉｎｖｉｔｒｏで試験した。

ＫＩＲ適合Ｃ−Ｇ１ホモ接合性の腫瘍の対応するものよりも有意に高い割合で、ＫＩＲ不適合、Ｃ−Ｇ２ホモ接合性の黒色腫及びＲＣＣ株がＣＤ１５８ｂ濃縮ＮＫ細胞によって溶解された（図１Ｂ）。ＫＩＲリガンド不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ標的と比較し、ＫＩＲリガンド適合（自己）に対して細胞傷害性の同様のパターンが認められた。同様に、Ｃ−Ｇ２ホモ接合性のＫＩＲ適合標的と比較して、ＣＤ１５８ａ濃縮ＮＫ細胞はより高い割合のＫＩＲ不適合、Ｃ−Ｇ１ホモ接合性のＥＢＶ−ＬＣＬ及び黒色腫細胞を溶解した（図１Ｂ、Ｄ）。

図１は、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／３）及びＣＤ１５８ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）陽性ＮＫ集団の単離を示している。図１Ａでは、ＨＬＡ−Ｃグループ１（Ｃ−Ｇ１）がホモ接合性である健常人ドナー（ＫＲ０３５０）のＰＢＭＣから陰性セレクションによってＮＫ細胞を濃縮し、照射済みＥＢＶＬＣＬフィーダーを使用してｉｎｖｉｔｒｏで増殖させた。２週間後、ＣＤ３−／ＣＤ５６＋／ＣＤ１５８ｂ＋ＮＫ細胞をフローソーティングによって単離して、さらに２週間増殖させて、残存する表面の結合抗体を除去した。図１Ｂでは、エフェクターと標的の比率２０：１では、ＣＤ１５８ｂで濃縮したＮＫ細胞（８０％陽性）は、ＨＬＡ−Ｃグループ１ホモ接合性のＫＩＲ適合腫瘍標的と比較して、有意に高い割合のＨＬＡ−Ｃグループ２（ＫＩＲ不適合）ホモ接合性のＫＩＲ不適合ＥＢＶＬＣＬ、黒色腫、およびＲＣＣ細胞を溶解した。図１Ｃでは、ＨＬＡ−Ｃグループ２（Ｃ−Ｇ２）がホモ接合である健常人ドナーＭＯＲＲＣからフローソーティングによってＣＤ１５８ａ＋ＮＫ細胞集団を単離した。図１Ｄでは、これらの細胞は、ＨＬＡ−Ｃグループ２ホモ接合性ＫＩＲ適合標的と比較して、有意に高い割合のＨＬＡ−Ｃグループ１がホモ接合（ＫＩＲ不適合）のＥＢＶＬＣＬ及び黒色腫細胞を溶解した。

ＫＩＲ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ集団を特異的に殺傷するＮＫ細胞株を、健常人ドナー又は癌患者から単離して、ＫＩＲリガンド不適合黒色腫又はＲＣＣ標的と比較して、ＫＩＲリガンド適合に対するそれらの細胞傷害作用を評価した。Ｃ−Ｇ１又はＣ−Ｇ２がホモ接合性である健常人又は癌患者からのＰＢＭＣのＮＫ細胞集団をネガティブ除去によって濃縮し、同種異系ＫＩＲリガンド不適合ＥＢＶ−ＬＣＬをフィーダー細胞に使用して限界希釈によってクローニングした。蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を使用して、ＮＫ株の表現型を決定して、ＫＩＲ適合（自己）又はＫＩＲ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ標的に対する細胞傷害性を試験した。

Ｃ−Ｇ１がホモ接合である健常人ドナー（ＫＲ０３５０）から３４種のＣＤ３−／ＣＤ５６−ＮＫ細胞株を増殖させた。９種がＣ−Ｇ２がホモ接合性のＥＢＶ−ＬＣＬ細胞を溶解させた（エフェクター：標的［Ｅ／Ｔ］比率２０：１で３５−１００％の溶解）。ＫＩＲ適合（自己）ＥＢＶ−ＬＣＬの溶解は最低限であったか、又はほとんど認められなかった（データ省略）。８−５株は追加実験用に十分に増殖した（図２Ａ）。

この株には自己ＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性はなく、Ｃ−Ｇ２がホモ接合であるＥＢＶ−ＬＣＬをほぼ１００％溶解し、これはＫＩＲ不適合による殺傷と矛盾しなかった。Ｅ／Ｔ比率２０：１では、ＫＩＲリガンド適合（Ｃ−Ｇ１ホモ接合）腫瘍標的よりも有意に高い割合で、ＫＩＲリガンド不適合の黒色腫及びＲＣＣ細胞（Ｃ−Ｇ２ホモ接合）が殺傷された（図２Ｂ）。同様に、Ｃ−Ｇ１がホモ接合性である広範囲に転移した黒色腫を有する患者（Ｓｔ）のＰＢＭＣからの限界希釈後に濃縮ＮＫ細胞を増殖させた。この患者からのＮＫ株Ｓ−８は、ＫＩＲリガンド適合自己標的（ＥＢＶ−ＬＣＬの５％、黒色腫細胞の１９％）よりも有意に高い割合で、ＫＩＲリガンド不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ（９５％）及び黒色腫細胞（７２％）を殺傷した（図２Ｃ）。

Ｃ−Ｇ２がホモ接合であるＫＩＲリガンド適合同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬ及び黒色腫細胞と比較して、Ｃ−Ｇ１がホモ接合であるＫＩＲリガンド不適合同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬ及び黒色腫細胞に対する細胞傷害性の増大したＣ−Ｇ２がホモ接合である健常人ドナーからもＮＫ株を増殖可能であった（図２Ｄ）。

図２はＲＣＣ及び黒色腫細胞がＫＩＲ適合株よりもＫＩＲ不適合ＮＫクローンの細胞傷害作用に対して感受性の高いことを示している。癌患者Ｓｔ（ＨＬＡ−Ｃグループ２がホモ接合）又はＨＬＡ−Ｃグループ１がホモ接合である健常人ドナーからＮＫ細胞を濃縮して、限界希釈法によってクローニングした。（Ａ）Ｃ−Ｇ１ホモ接合性の健常人ドナー（ＫＲ０３５０）から増殖させたＮＫ細胞株８−５は、ＫＩＲ適合自己ＥＢＶ−ＬＣＬ又はＫＩＲ適合同種異系Ｃ−Ｇ１ホモ接合性黒色腫及びＲＣＣ細胞よりも、Ｃ−Ｇ２ホモ接合性のＫＩＲ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ、黒色腫、ＲＣＣ細胞を有意に高い割合で殺傷した（Ｂ）。（Ｃ）広範囲に転移した黒色腫を有するＣ−Ｇ１ホモ接合性の患者（Ｓｔ）から増殖させたＮＫ株Ｓ−８は、自己ＫＩＲ適合ＥＢＶ−ＬＣＬ及び黒色腫細胞よりも有意に高い割合で、ＫＩＲ不適合Ｃ−Ｇ２ホモ接合性ＥＢＶＬＣＬ及び黒色腫細胞を殺傷し、この場合、最小限の細胞傷害性しか認められなかった。３サンプルの平均値＋／−ＳＤを示している。（Ｄ）Ｃ−Ｇ２ホモ接合性の健常人ドナー（ＭＯＲＲＣ）から増殖したＭＯＲＲＣ
ＮＫ細胞株１０は、ＫＩＲ不適合Ｃ−Ｇ１ホモ接合性の標的に対する細胞傷害性は認められたが、ＫＩＲ適合Ｃ−Ｇ２ホモ接合性の標的には細胞傷害性は認められなかった。

ＭＨＣクラスＩ遮断によって、ｉｎｖｉｔｒｏでＫＩＲリガンド適合腫瘍に対するＮＫ細胞の細胞傷害性の増大が認められている。したがって、ＭＨＣクラスＩがモノクローナル抗体Ｗ６／３２で遮断されたＫＩＲリガンド適合ＮＫ細胞標的腫瘍と比較して、ＲＣＣ及び黒色腫細胞に対する同種異系ＫＩＲリガンド不適合ＮＫ細胞の細胞傷害能を調べた。

健常人、ＳＫＥＭ（Ｃ−Ｇ１ホモ接合性；ＨＬＡの同一なＲＣＣ患者ＳＪと同胞）のＰＢＭＣから濃縮したＮＫ細胞を限界希釈後に増殖させ、ＫＩＲ適合（Ｃ−Ｇ１ホモ接合）対ＫＩＲ不適合（Ｃ−Ｇ２ホモ接合）標的に対する細胞傷害性をスクリーニングした。Ｃ−Ｇ２不適合対Ｃ−Ｇ１適合ＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性の有意に高い３種のＮＫ株（ＳＫＥＭＮＫ株２、６および７；図３Ａ）を同定した。

Ｅ／Ｔ比率１０：１では、ＮＫ株がＶｏｌｌｅＥＢＶ−ＬＣＬ（Ｃ−Ｇ１適合）の４−２５％を溶解した。ＶｏｌｌｅＥＢＶ−ＬＣＬをモノクローナル抗体Ｗ６／３２（全クラス１ＭＨＣ抗体）と前培養した場合、全３株での細胞傷害性が有意（８０％より高く）に増大し、ＮＫ細胞のＫＩＲリガンドとして機能する標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子と一致している（図３Ｂ）。ＳＫＥＭＮＫ株は、実質的に細胞傷害性の認められないＫＩＲリガンド適合Ｃ−Ｇ１ホモ接合性ＳＪＲＣＣ細胞に対するよりも、ＫＩＲリガンド不適合Ｃ−Ｇ２ホモ接合性Ｒ黒色腫細胞に対する細胞傷害性が有意に高かった。ＳＪＲＣＣ細胞を全ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体Ｗ６／３２で前処理することで、このＫＩＲ適合腫瘍標的に対して全３種のＮＫ細胞株の細胞傷害作用が大幅に増大した。

図３は、限界希釈クローニングによって単離された同種異系ＫＩＲ不適合ＮＫ細胞株のＫＩＲ不適合腫瘍標的に対する細胞傷害性の増大を示している。図３Ａでは、健常人ドナーＳＫＥＭ（Ｃ−Ｇ１ホモ接合：ＨＬＡの同一なＲＣＣ患者ＳＪの同胞）のＰＢＭＣから限界希釈によってＮＫ細胞株２、６、および７を単離した。図３Ｂでは、全３種の株は、少数のＣ−Ｇ１ホモ接合性ＫＩＲ適合ＶＯＬＬＥＥＢＶＬＣＬを溶解した。ＶＯＬＬＥ
ＥＢＶＬＣＬをＷ６／３２で前培養することで、全３株の細胞傷害作用が有意に増大し、ＮＫ細胞の機能を阻害するＭＨＣクラスＩ分子と一致していた。図３Ｃでは、実質的に細胞傷害性の認められなかったＫＩＲ適合（Ｃ−Ｇ１ホモ接合）ＳＪ細胞と比較して、ＮＫ株２、６、および７はＫＩＲリガンド不適合Ｒ−ＭＥＬ細胞（Ｃ−Ｇ２ホモ接合）に対する細胞傷害性が有意に高かった。ＳＪＲＣＣ細胞をＷ６／３２で前培養することで、ＫＩＲ適合ＲＣＣ標的に対する全３株の細胞傷害作用が有意に増大した。

（実施例４）
γ線照射済みＮＫ細胞は照射後少なくとも４８時間に亘って、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を維持するｉｎｖｉｔｒｏでのデータは、養子移入されたＫＩＲ不適合同種異系ＮＫ細胞はｉｎｖｉｖｏでも有益な抗腫瘍作用を持ちうることを示唆している。したがって、γ線照射がＮＫ細胞媒介性の腫瘍細胞傷害性に及ぼす影響をさらに調べた。健常人ドナーのＰＢＭＣから増殖させたバルクＮＫ細胞にγ線照射（５０Ｇｙ）して、照射後０、２４、４８、６０、９６時間後のＮＫ細胞感受性Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性を試験した（図４Ａ）。大部分のＮＫ細胞がＦＡＣＳによって速やかにアネキシンＶ又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性（図４Ｂ）となったが（照射誘発性のアポトーシス及び細胞死と一致）、Ｋ５６２細胞に対する有意な細胞傷害性が照射後４８時間まで依然として測定可能であった。健常人ドナーＫＲ０３５０からのＮＫ細胞株８−５は、照射から２４時間後にＫＩＲ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞に対する殺傷能力を保持しており、非照射対照と比較して細胞傷害能のわずかな低下しか認められなかった（図４Ｃ）。

γ線照射済みＮＫ細胞は照射後４８時間まで腫瘍標的に対する有意な細胞傷害性を保持している。さらに、それらは、照射後少なくとも２４時間にわたってＫＩＲ不適合腫瘍標的の殺傷能力を保持している。図４は、γ線照射済みＮＫ細胞が照射後少なくとも４８時間にわたって腫瘍細胞に対する細胞傷害性を保持することを示している。健常人ドナーＫＲ０３５０のＰＢＭＣから増殖させたバルクＮＫ細胞にγ線照射（５０Ｇｙ）して、Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性を試験した。図４Ａは、ＮＫ細胞へのγ線照射から０、２４、４８、６０、９６時間後の同種異系ＮＫ細胞によるＫ５６２腫瘍細胞の溶解率を示している。図４Ｂは、照射がＮＫのアポトーシス（アネキシンＶ陽性）及びネクローシス（ヨウ化プロピジウム陽性）を引き起こしたが、ＮＫ細胞の持続的な細胞傷害性がγ線照射後４８時間まで認められたことを示している。図４Ｃは、ドナーＫＲ０３５０からのＣ−Ｇ１ホモ接合性ＮＫ細胞株（８−５）が５０Ｇｙのγ線照射から２４時間後にＫＩＲ不適合Ｒ−ＥＢＶＬＣＬ細胞に対して高レベルの細胞傷害性を保持していることを示している。

（実施例５）
自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増大したサブドミナントＮＫ細胞画分の同定及び増殖
自己ＨＬＡ分子と結合できないＫＩＲ分子を発現しているサブドミナントＮＫ細胞集団（ＡＫＩ−ＮＫ細胞）をｉｎｖｉｔｒｏで単離および増殖させることができ、これらは未選択の“バルク”ＮＫ細胞と比較して、自己腫瘍標的に対する細胞傷害性が有意に増大する。図５を参照のこと。

図５は、自己腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増大したサブドミナントなＮＫ細胞画分の同定及び増殖を示している。図５Ａは、グループ１ＫＩＲリガンド（Ｃｗ０１，０３）がホモ接合である患者から採取されたＰＢＭＣのＮＫ細胞を、免疫磁気ビーズ（ＤｙｎａｌＮＫ細胞単離キット）を使用したネガティブ除去によって濃縮した。照射済みＥＢＶＬＣＬフィーダー細胞を使用してＮＫ細胞を２週間以上にわたり増殖させた。ＣＤ１５８ａ＋／ＣＤ１５８ｂ− ＮＫ細胞である自己ＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞（ＡＫＩ−ＮＫ）のサブドミナント画分（１．７％）を同定した。図５Ｂでは、ＮＫ細胞をバルクで増殖（バルクＮＫ細胞）させたか、あるいは、３つの異なる部分集団、１）ＣＤ１５８ｂ＋／ＣＤ１５８ａ−ＫＩＲ適合ＮＫ細胞、２）ＣＤ１５８ｂ−／ＣＤ１５８ａ−（“ナルＮＫ細胞”）、３）ＣＤ１５８ｂ−／ＣＤ１５８ａ＋（ＡＫＩ−ＮＫ）ＮＫ細胞）にＦＡＣＳを使用して分類した。分類されたＮＫ細胞集団をＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞を使用してｉｎｖｉｔｒｏで２週間にわたって増殖させた。図５Ｃは、全てで４つの異なるＮＫ細胞画分がＫ５６２細胞によって殺傷されたことを示している。図５Ｄは、バルクＮＫ細胞、ＣＤ１５８ｂ＋／ＣＤ１５８ａ−ＫＩＲ適合ＮＫ細胞及びナルＮＫ細胞と比較して、自己腫瘍細胞（腎細胞癌ＲＣＣ）に対するＡＫＩ−ＮＫ細胞の細胞傷害性が増大していることを示している。

（実施例６）
抑制性ＫＩＲの発現及び機能をノックアウトするためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）
これらの結果に基づき、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を使用して、抑制性ＫＩＲの発現と機能をノックアウトし、これによって腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増大させる。ＮＫ細胞の抑制性ＫＩＲ細胞質ロングドメインを特異的にノックダウンするＲＮＡｉをコードするレンチウイルスベクターを開発中である。ＲＮＡｉは抑制性のＫＩＲ２ＤＬ２／３及び２ＤＬ１の細胞質ロングテールに特異的である。

図６は、抑制性のＫＩＲ細胞質ロングドメインをノックダウンするように機能するＲＮＡｉのレンチウイルスによる移入によるＮＫ細胞抗腫瘍効果の増大を実証するために、提案された実験を示している。ネガティブ除去又はポジティブセレクションによってバルクＮＫ集団を濃縮する。抑制性のＫＩＲ２ＤＬ２／３及び２ＤＬ１の細胞質ロングテールに特異的なＲＮＡｉをコードするレンチウイルスベクターをバルクＮＫ細胞に移入する。このような移入されたＮＫ細胞は、野生型ＮＫ細胞集団と比較して、腫瘍細胞に対する細胞傷害性が増大することが予測される。

提案された実験では、自己ＮＫ細胞にこのレンチウイルスベクターを移入させる。ＲＮＡｉの移入によって、ＳＨＰ−１（チロシンホスファターゼ）のＩＴＩＭへの結合能が破壊されて、抑制性ＫＩＲを介したＮＫ細胞の不活性化を防止する。重要なことは、相補的な活性化ＫＩＲ（即ち、２ＤＳ２／３及び２ＤＳ１）の細胞質ショートテールがインタクトなままで、下流のＮＫ細胞の活性化カスケードを引き起こすことが可能となる。移入されて、抑制性ＫＩＲの機能を不活化するＮＫ細胞では、自己及び同種異系腫瘍標的に対する細胞傷害性の増大が予測される。このような集団では、養子移入された場合、転移性の固形腫瘍及び血液の悪性疾患の退行を誘導することがさらに予測される。

（実施例７）
上皮起源の腫瘍細胞に対して同様のＮＫ細胞媒介性の効果がｉｎｖｉｔｒｏで生じることが実証されている。より具体的には、黒色腫及びＲＣＣ細胞では、ＨＬＡ不適合に起因して、腫瘍の抑制性のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子が結合できないＫＩＲを発現する同種異系ＮＫ細胞の細胞傷害作用に対する感受性がより高い。同じＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子グループを欠く標的に対して同種反応性を有するＮＫ細胞の頻度が高い、グループ１又はグループ２のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合であるドナー又は患者からＮＫ細胞株を生成した。さらに、ＫＩＲ不適合がＮＫ細胞の細胞傷害性に及ぼす影響を評価し得るために、グループ１又はグループ２のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子がホモ接合であるＥＢＶ−ＬＣＬ、黒色腫、ＲＣＣ腫瘍標的を使用した。

頻度が異なるものの、ＨＬＡ−Ｃグループ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬを選択的に殺傷するＮＫ細胞は、試験した全ドナーから単離可能であった。ほとんどの場合、ＫＩＲ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性の増大したＮＫ細胞も、ＫＩＲリガンド適合腫瘍細胞と比較して、有意に高い割合で、適合する抑制性ＨＬＡ−ＣＫＩＲリガンドを欠く黒色腫及びＲＣＣを殺傷した。細胞傷害性のレベル差は顕著な場合が多く、ほとんど溶解の起こらないＫＩＲ適合標的と比較して、ＫＩＲリガンド不適合腫瘍標的の溶解は大幅に高かった（６０％より高い）。このＮＫ細胞の現象は、健常人ドナーに限られていた。Ｃ−Ｇ１又はＣ−Ｇ２がホモ接合性の癌患者からのＮＫ細胞株を同定し、これは、自己腫瘍は殺傷できないが、同種異系ＫＩＲリガンド不適合腫瘍株に対する有意に高い細胞傷害性を持つ。ＫＩＲ不適合性はＨＬＡ−Ｃ遺伝子座に限定されていた。ＫＩＲが不適合であるこのようなＮＫ細胞集団のＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座は評価されておらず、ＡＭＬ及びＥＢＶ−ＬＣＬ細胞に対して生じるものと同様の細胞傷害性の増大が推測できる。

表４は、濃縮自己ＮＫ細胞集団のＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子座を示している。ＨＬＡ−Ｃグループ１のＣｗ対立遺伝子は、α１ヘリックス内のＳｅｒ７７とＡｓｎ８０が共通しており、ＫＩＲ２ＤＬ２／３を結合する（ＣＤ１５８ｂ）。ＨＬＡ−Ｃグループ２のＣｗ対立遺伝子は、α１ヘリックス内のＡｓｎ７７とＬｙｓ８０が共通しており、ＫＩＲ２ＤＬ１を結合する（ＣＤ１５８ａ）。“Ｂｗ４”グループに該当するＨＬＡ−Ｂ遺伝子座は、ＮＫＢ１ＫＩＲと結合する。“Ｂｗ６”グループに該当するＨＬＡ−Ｂ遺伝子座はＮＫＢ１ＫＩＲには結合しない。

活性化シグナルと抑制シグナルとのバランスによって標的細胞がＮＫ細胞媒介性の溶解に感受性となるか否かが最終的に決まる。骨髄性白血病（ＡＭＬ及びＣＭＬ）細胞上のＬＦＡ−１の存在そしてＮＫ細胞耐性ＡＬＬ細胞上でのその不在は、この接着分子がＮＫ細胞活性化受容体のリガンドとして機能しうることを示唆した。同種反応性ＮＫ細胞の殺傷開始に必要となる、これらの実験で使用した腫瘍細胞上の活性化リガンドを研究中である。フローサイトメトリー分析によって、本研究で使用した全てのＲＣＣ及び黒色腫株のＬＦＡ−１陰性が示された。しかし、本試験で使用された腫瘍株は、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの既知のリガンドである、ＭＨＣクラスＩ鎖関連抗原（ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢ）（Ｂａｕｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：７２７−７２９，１９９９；Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：７３０−７３２，１９９９）又はＵＬ１６結合タンパク質（Ｃｏｓｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：２７３−２８３，１９９７；Ｃｏｓｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１４：１２３−１３３，２００１；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１８１：１８５−１９２，２００１；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：６７１−６７９，２００２）（ＵＬＢＰ；表５参照）の種々の密度を有した。Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｂｌｏｏｄ，９４：３３３−３３９，１９９９。各引用の全体が本明細書において参考として援用される。

ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現；フローサイトメトリーを使用して、ストレス誘導性の表面糖タンパク質ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３を測定した。

研究によって、これらのリガンドを含む白血病、リンパ腫（Ｓａｌｉｈら、Ｂｌｏｏｄ，１０２：１３８９−１３９６，２００３）及び黒色腫株（Ｐｅｎｄｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：１０７６−１０８６，２００１；Ｐｅｎｄｅら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６２：６１７８−６１８６，２００２）は、ＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞によって特異的に溶解可能であることが示されている。異なる活性化リガンドの発現レベルを代理マーカーとして利用して、ＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞に感受性であるこれらの悪性疾患を同定しうるか否かは不明なままである（Ｎａｔａｒａｊａｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：８５３−８８５，２００２）。各引用の全体が本明細書において参考として援用される。

ＩＬ−２投与又はＬＡＫ細胞の養子移入によって固形腫瘍に対する宿主のＮＫ細胞媒介性の免疫を増強する試みはほとんど成功していない（Ａｔｋｉｎｓら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ；１８：１９７−２０７，２００１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８５：６２２−６３２，１９９３、各々の全体が本明細書において参考として援用される）。腫瘍のＨＬＡクラス１又はクラス１様リガンドによるＮＫ細胞の機能のＫＩＲ媒介性阻害は、自己ＮＫ細胞治療を制限する主要因子となりうる。マウス及びヒトでの研究によって、同種反応性ＮＫ細胞がＧＶＨ反応を誘発しないことが示されている（Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：２０９７−２１００，２００２、この全体が本明細書において参考として援用される）。これらの知見は、ＫＩＲ適合又は自己ＮＫ集団と比較してＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞の腫瘍細胞傷害性の増大を示した本発明者らのデータと合わせて、ヒトにおけるそれらの抗腫瘍能を研究するための理論的根拠として利用可能である。照射済みＥＢＶ−ＬＣＬをフィーダーとして使用して、ＰＢＭＣをフィーダーとして使用した場合に達成可能と先に報告された最大限の増殖の１０^４倍、１０^２倍にバルクＮＫ集団を増殖させた。したがって、わずか１０−２５ｍＬの末梢血の開始材料からの養子移入で１０^１０以上の同種異系ＮＫ細胞をｅｘｖｉｖｏで増殖可能であったと思われる。この集団には、長期生着や、Ｔリンパ球混入の結果として輸血に伴って起こりうるＧＶＨＤを予防するために、同種異系の設定での養子移入前に照射が必要になると思われる。照射がＮＫ細胞のアポトーシス、そして最終的には細胞死を誘発したことは驚くことではない。しかし、本発明者らのｉｎｖｉｔｒｏのデータは、一定レベルのＮＫ細胞の細胞傷害機能が５０Ｇｙへの曝露後４８時間まで持続したことを示した。実際に、γ線照射された、部分的に不適合な同種異系ＰＢＭＣの注入が、転移性ＲＣＣを伴う一部の患者において疾患の退行を誘導したことが最近報告されている。本発明者らのデータは、ＫＩＲ不適合の養子移入され、照射済み同種異系ＮＫ細胞が、比較的低い割合のＮＫ細胞を含む未操作の同種異系ＰＢＭＣの注入と比較して、同様又はさらに増大された抗腫瘍作用を有する可能性を示唆している。

大きな転移病変から単離された新鮮な初期継代の腫瘍細胞に関する予備データは、樹立された腫瘍株で認められるのと同様にＫＩＲ不適合性ＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。

最後に、同種異系造血幹細胞の移植が、進行性のサイトカイン不応性転移性ＲＣＣを伴う一部の患者において移植片対腫瘍効果を誘導することが最近示された（Ｓｔｏｒｂら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ），３７２−３９７，２００３、その全体が本明細書において参考として援用される）。ＨＬＡ適合同胞をドナーとして使用したため、同種反応性ＮＫ細胞は増殖しないと考えられる。ＫＩＲ不適合のＮＫ細胞に対するＲＣＣ及び黒色腫細胞の感受性の増大を示す本研究のデータは、ＫＩＲ不適合同種移植後のＡＭＬに対して見られるＮＫ細胞媒介性の抗腫瘍作用が、選択された固形腫瘍に対するのと同様に誘導されうることを示唆している。無関係のドナーを利用した転移性ＲＣＣに対する移植の試みは既に進行中である（Ｕｅｎｏら、Ｂｌｏｏｄ，１０２：３８２９−３８３６，２００３その全体が本明細書において参考として援用される）。本発明者らの所見に基づいて、ＫＩＲ不適合の、単一ＨＬＡ不適合（ＧＶＨの方向）である無関係のドナーの利用を評価する試験を考慮する必要がある。これは移植後の同種反応性ＮＫ細胞の注入の影響を検証する機会も与え、この注入は、生着を促進させ、ＧＶＨＤのリスクを減らし、不適合移植マウスモデルの白血病を根治することが過去に示されている（Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：２０９７−２１００，２００２その全体が本明細書において参考として援用される）。

（実施例８）
ＮＫ細胞の殺傷に対して腫瘍細胞を感作させる方法
本発明は、腫瘍細胞をＮＫ細胞媒介性の溶解により感受性にすることによって腫瘍疾患を治療する方法を提供する。腫瘍細胞を増強剤（例えば、化学薬品、化学療法薬）と、濃縮同種異系ＮＫ細胞集団を含む組成物又は濃縮自己ＮＫ細胞集団を含む組成物とで処置する方法を提供する。図７では、ＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を化学薬品（例えば、デプシペプチド又はベルケード）で治療後、ＮＫ細胞の感受性アッセイを実施した。結果は、ＮＫ細胞単独での腫瘍細胞の処理と比較して、化学薬品と濃縮ＮＫ細胞集団との併用による腫瘍細胞の処理によって、腫瘍細胞をＮＫ細胞媒介性の溶解により感受性にすることを実証している。化学薬品デプシペプチドはヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、ヒストンデアセチラーゼの酵素活性を阻害することで遺伝子発現調節を妨げる。デプシペプチドは、マウスモデルにおいて細胞増殖を阻害し、腫瘍形成を予防することによって抗腫瘍作用を有することが示されている。実験ではデプシペプチド処理時のＭＩＣ−Ａ／Ｂ誘導が示された。化学薬品ベルケード（ボルテゾミブ）はプロテアソーム阻害剤である。実験では、プロテアソーム阻害剤ＰＳ−３４１がｃ−ＦＬＩＰレベルの低下によってＴＲＡＩＬ媒介性のアポトーシスに対して腫瘍細胞を感作させることが示されている（ＳａｙｅｒｓＴＪ，Ｂｌｏｏｄ１０２：３０３−３１０，２００３）。さらなる実験では、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブが、薬剤の移植片対腫瘍効果を保持しながら急性移植片対宿主病を抑制することが示されている（ＫａｉＳｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：８１２０−８１２５，２００４）。

図７は、デプシペプチド又はベルケードによる腫瘍細胞の前処理によって、ＮＫ細胞媒介性の溶解に対する腫瘍細胞の感受性が高まることを示している。ＲＥＮＣＡ腫瘍細胞をデプシペプチド［２５ｎｇ／ｍＬ］又はベルケード［１０ｎＭ］で４０時間処理して、３７℃で１時間、^５１Ｃｒ標識した。その後、標準的な細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞のＮＫ細胞感受性を試験した。Ｂ１０．ｄ２マウスの脾細胞から、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および顆粒球の陰性磁気ビーズ除去によってＮＫ細胞を精製した。フローサイトメトリーによるＤＸ５及びＣＤ３染色によってＮＫ細胞の純度を評価した。ＮＫ細胞の純度は常に９０−１００％であった。

図８は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作させたマウス腎細胞癌（ＲＥＮＣＡ）のＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。１０ｎＭベルケード又は２５ｎｇ／ｍＬデプシペプチドの存在下でＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を１４時間培養した。その後、細胞を１時間^５１Ｃｒ標識して、標準的な４時間アッセイにおいてＮＫ細胞媒介性溶解に対する感受性を試験した。マウスの自己Ｂａｌｂ／ｃＮＫ細胞を未処理（□）、ベルケード（○）、デプシペプチド（△）で処理したＲＥＮＣＡ細胞株（Ｂａｌｂ／ｃ由来）に対して試験した。

図９は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作させたヒトの腎細胞癌（ＲＣＣ）の同種異系ＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。１０ｎＭベルケード又は２５ｎｇ／ｍＬデプシペプチドの存在下でヒト（ＪＯＨＷ）及びマウス（ＲＥＮＣＡ）腫瘍細胞をそれぞれ４０時間、１４時間培養した。その後、細胞を１時間^５１Ｃｒ標識して、標準的な４時間アッセイにおいて同種異系ＮＫ細胞媒介性溶解に対する感受性を試験した。

図１０は、ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作させたヒトの腎細胞癌（ＲＣＣ）の自己ＮＫ細胞に対する感受性の増大を示している。１０ｎＭベルケード又は２５ｎｇ／ｍＬデプシペプチドの存在下でヒト（ＪＯＨＷ）及びマウス（ＲＥＮＣＡ）腫瘍細胞をそれぞれ４０時間、１４時間培養した。その後、細胞を１時間^５１Ｃｒ標識して、標準的な４時間アッセイにおいて自己ＮＫ細胞媒介性溶解に対する感受性を試験した。

図１１は、デプシペプチド又はベルケードで事前に感作させたヒト腎細胞癌（ＳＡＵＪ
ＲＣＣ又はＳＴＡＲＴＲＣＣ）の自己ＮＫ細胞に対する感受性の増大が示している。ヒトＲＣＣ細胞株ＳＴＡＲ又はＳＡＵＪを２５ｎｇ／ｍＬデプシペプチド又は１０ｎＭベルケードで２４時間処理して、３７℃で１時間、^５１Ｃｒ標識した。その後、標準的な細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞のＮＫ細胞感受性を試験した。末梢血から、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および顆粒球の陰性磁気ビーズ除去によって自己ＮＫ細胞を精製した。フローサイトメトリーによるＣＤ５６及びＣＤ３染色によってＮＫ細胞の純度を評価した。ＮＫ細胞の純度は常に９０−１００％であった。

図１２は、ヒトＲＣＣ細胞株と化学薬品又は化学療法薬とのインキュベーションを最適化するための経時変化を示している。ヒトＲＣＣ細胞株ＪＯＨＷを１０ｎＭのベルケードで２、８、１６、２４、４０時間処理して、その後、３７℃で１時間ラベリングした。標準的な細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞のＮＫ細胞感受性を試験した。同種異系ランダムドナーから、Ｔ細胞（ＣＤ３）の陰性磁気ビーズ除去及びＣＤ５６^＋細胞の陽性磁気ビーズセレクションによってＮＫ細胞を精製した。フローサイトメトリーによるＣＤ５６及びＣＤ３染色によってＮＫ細胞の純度を評価した。ＮＫ細胞の純度は常に９０−１００％であった。

ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作したヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）のＮＫ細胞に対する感受性の増大は、ＴＲＡＩＬ（図１３）又はＦａｓリガンド（図１４）を含む機構を介して起こる。ベルケード又はデプシペプチドで事前に感作し、ＴＲＡＩＬ又はＦａｓリガンドで１６時間培養したＲＣＣ細胞において細胞溶解が増加した。４種のヒトＲＣＣ細胞株（ＪＯＨＷ、ＰＯＲＪＣ、ＳＡＵＪ、ＳＴＡＲ）をデプシペプチド［２５ｎｇ／ｍＬ］又はベルケード［１０ｎＭ］で２４時間処理して、その後、３７℃で１時間^５１Ｃｒ標識した。次に細胞を９６ウェルプレートに４，０００細胞／ウェルで播種した。組み換え型ＴＲＡＩＬ［７５−３００ｎｇ／ｍＬ］又は組み換え型Ｆａｓリガンド［１２．５−１００ｎｇ／ｍＬ］を細胞に加えて、上精を１６時間の培養後に回収した。ＴＲＡＩＬ及びＦａｓリガンドによる溶解レベルを^５１Ｃｒの自然放出量及び^５１Ｃｒの最大放出量に基づいて算出した。

図１５ではＲＣＣ細胞株を比較しており、生存率（アポトーシス）、増殖、ＭＨＣクラスＩ発現、ＭＩＣ−Ａ／Ｂ発現における差はない。３種のヒトＲＣＣ細胞株（ＪＯＨＷ、ＳＡＵＪ、ＳＴＡＲ）及び１種のマウスＲＣＣ細胞株（ＲＥＮＣＡ）をデプシペプチド［２５ｎｇ／ｍＬ］又はベルケード［１０ｎＭ］で６−４０時間処理した。アポトーシスレベルをＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ、７−ＡＡＤ染色（上左図）によって評価した。ヒトＲＣＣに対するＨＬＡ−ＡＢＣ、およびマウスＲＣＣに対するＨ−２Ｄｄ／ＫｄによるフローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩ発現を評価した（下左図）。ヒトＲＣＣ上のＭＩＣ−Ａ／Ｂ発現をモノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリーによって評価した（下右図）。様々な濃度のデプシペプチド及びベルケードでヒト／マウスＲＣＣを７２時間処理した。増殖分析のために細胞を^３Ｈチミジン標識した（上右図）。

さらなる試験では、他の腫瘍細胞（例えば、前立腺、結腸、黒色腫、リンパ腫、乳房）におけるＮＫ細胞の殺傷に対する増強剤（例えば、化学薬品又は化学療法薬）の感作を測定する。腫瘍及びＮＫ細胞のマイクロアレイ分析、遮断、腫瘍の表現型を使用して作用機構を明確にする。これらのアッセイを利用して、治療に対する反応性を予測する。マウスの処置モデルを開発する。

図１６では、ＮＫ細胞の攻撃に対してヒトの腫瘍を感作させるヒトでの臨床試験を提案している。アフェレーシスによって癌患者からＮＫ細胞を単離する。ＮＫ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで増殖させる。患者を、例えば、ＦＤＡが多発性骨髄腫の処置に承認しているベルケード（ボルテゾミブ）などの化学薬品で処置して、ＮＫ細胞の養子移入後のＮＫ細胞の殺傷に感作させる。

分子量などの物理的特性や化学式などの化学的特性についての範囲を本明細書で使用する場合、そこでの範囲及び特定の実施態様の全ての組み合わせ及び部分的組み合わせを含むことを意図する。

本文書内で引用又は記載されている、各々の特許、特許出願、刊行物の開示はその全体が本明細書において参考として援用される。

当業者であれば、本発明の実施形態に対して多数の変化及び改変が可能であり、かつ、このような変化及び改変が本発明の精神から逸脱せずになされ得ることを十分に理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内のこのような同等の全てのバリエーションに係る。

Claims

本願明細書に記載された発明。