JP2014034577A5

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Publication number: JP2014034577A5
Application number: JP2013226693A
Authority: JP
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2015-04-09
Anticipated expiration: 2025-07-21

Description

図１は、実施例１にさらに記載されるような、ＭＧＤ−ＣＳＦ（ＭＧＤ−ＣＳＦ＿エキソン４）；配列番号８）、ＭＧＣ３４６４７（ＮＰ＿６８９６６９）；配列番号１０）およびＭＧＤ−ＣＳＦ配列番号７）のエキソン４のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸同一性は（＊）によって指定する。図２は、実施例２にさらに記載されるような、哺乳動物細胞を一過性にトランスフェクトするために用いた、ｐＴＴ５−Ｇａｔｅｗａｙを生成するために用いたｐＴＴ５骨格ベクターのダイアグラムを示す。図２はまた、ｐＴＴ５−Ｇ（配列番号２７２の残基１１８２〜１２６５および２９８４〜３１２７）、ｐＴＴ５−Ｈ（配列番号２７３の残基１１８２〜１３９２および１５９７〜１６０２）およびｐＴＴ５−Ｉ（配列番号２８４および配列番号２７４の残基２９０５〜３０４８）のベクターの配列に隣接するマルチクローニング部位の核酸配列を示す。図２は、実施例２にさらに記載されるような、哺乳動物細胞を一過性にトランスフェクトするために用いた、ｐＴＴ５−Ｇａｔｅｗａｙを生成するために用いたｐＴＴ５骨格ベクターのダイアグラムを示す。図２はまた、ｐＴＴ５−Ｇ（配列番号２７２の残基１１８２〜１２６５および２９８４〜３１２７）、ｐＴＴ５−Ｈ（配列番号２７３の残基１１８２〜１３９２および１５９７〜１６０２）およびｐＴＴ５−Ｉ（配列番号２８４および配列番号２７４の残基２９０５〜３０４８）のベクターの配列に隣接するマルチクローニング部位の核酸配列を示す。図３は、実施例２にさらに記載されるような、哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトするために用いたｐＴＴ２骨格ベクターのダイアグラムを示す。図４は、実施例３および表１にさらに記載されるような、トランスフェクションの３〜６日後のプラスミドベクターでのＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。図４Ａは、２９３−６Ｅ細胞における、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＭＧＤ−ＣＳＦベクター、細胞内（細胞）および分泌された（上清）ＣＬＮ００７３２６６３の発現を示す。図４Ｂは、２９３−６Ｅ細胞における、Ｃ末端Ｈｉｓタグおよびコラーゲンリーダー配列を有するＭＧＤ−ＣＳＦベクター、細胞内（細胞）および分泌された（上清）ＣＬＮ００８１６４２４の発現を示す。図４Ａおよび図４Ｂの両方とも、発現のための正のコントロールとしてＰｏｓｉｔｏｐｅ^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（右パネル）を示す。分子量は、左側パネルに示す。図５は、実施例４および表１にさらに記載されるような、トランスフェクションの３〜６日後の、実施例２および表１に記載された構築物でトランスフェクトした細胞の増殖の程度および生存度を示す。図５Ａは、ＣＬＮ００５４２９４５（黒のバー）、ＣＬＮ００７３２６６３（明灰色のバー）、ＣＬＮ００８２１８６７（斜線のバー）、およびＣＬＮ００８１６４２４（格子模様のバー）でトランスフェクトした細胞、ならびに、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするコントロール遺伝子（濃灰色のバー）と比較した細胞増殖の程度を示している。ＣＬＮ００８１６４２４およびコントロールのＳＥＡＰの両方でトランスフェクトした細胞とも、実施例４にさらに記載されるとおり、トランスフェクションの３〜６日後に細胞数が増大した。図５Ｂは、ＣＬＮ００５４２９４５（黒のバー）、ＣＬＮ００７３２６６３（明灰色のバー）、ＣＬＮ００８２１８６７（斜線のバー）、およびＣＬＮ００８１６４２４（格子模様のバー）でトランスフェクトして、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするコントロール遺伝子（濃灰色のバー）でトランスフェクトした細胞と比較した細胞の生存度の割合を示している。ＣＬＮ００８１６４２４およびコントロールのＳＥＡＰ細胞でトランスフェクトした細胞は、生きたままであったが、ＭＧＤ−ＣＳＦ、ＣＬＮ００７３２６６３およびＣＬＮ００８２１８６７でトランスフェクトした細胞は、毒性の増大を示し、これは、培養条件に依存したが、遺伝子特異的ではなく、培養物中での経時的なそれらの生存度の低下によって証明された。図６は、ＭＧＤ−ＣＳＦを発現する付着性２９３−Ｔ細胞が、実施例５にさらに記載されるとおり、低血清濃度の培養条件に適合され得ることを示す。図６Ａは、実施例５にさらに記載されるとおり、３％ＦＢＳを有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で、そして１％ＦＢＳを有するＨｙＱ−ＣＨＯ培地中で増殖される懸濁物２９３−Ｔ細胞の培養物中でのＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。図６Ｂは、細菌宿主から生成された精製ＭＧＤ−ＣＳＦ標準（パネル４）に比較した、低血清（パネル１）で血清の非存在下（パネル２）の懸濁培養中での、そして接着培養中での（パネル３）、ＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。図７は、実施例６にさらに記載されるとおり、バイオリアクター中でのＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。発酵は６日間モニターした。サンプルは、ゲル電気泳動によって試験して、接種の１〜６日後にクマーシーブルー染色で染色した。分子量は左のパネルに示す。ＭＧＤ−ＣＳＦの位置は、矢印で示す。ゲル上のタンパク質の量を定量するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の漸増量を示す。図８Ａは、実施例７にさらに記載されるとおり、２９３−Ｔ細胞からのＭＧＤ−ＣＳＦの単離を示す。細胞培養上清（Ｓｕｐｔ）をＳｐ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（ＳＰ−Ｐｏｏｌ）、ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（Ｈｅｐ−Ｐｏｏｌ）、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｑ−Ｐｏｏｌ）に分画した。ＭＦＤ−ＣＳＦはグリコシル化されて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって３９ｋＤａのみかけの分子量を有する。分子量マーカーは、左のパネルに示す。図８Ｂは、実施例８にさらに詳細に記載されるとおり、還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＦＥ条件下でのＭＧＤ−ＣＳＦの突然変異タンパク質（ムテイン）の電気泳動遊走パターンを示す。左のパネルは、ジスルフィド結合を還元する条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示しており、そして真ん中のパネルは、ジスルフィド結合を還元しない条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。野性型ＭＧＤ−ＣＳＦであって、その天然のシグナルペプチド（ｗｔｎａｔＳＰ）とともに発現された野性型ＭＧＤ−ＣＳＦ、野性型ＭＧＤ−ＣＳＦであって、コラーゲンシグナルペプチド（ｗｔｃｏｌＳＰ）とともに発現された野性型ＭＧＤ−ＣＳＦ、ならびにシステインからセリンへの突然変異タンパク質（ムテイン）Ｃ３５Ｓ、Ｃ１６７Ｓ、Ｃ１７６Ｓ、Ｃ１７８Ｓ、Ｃ１７９Ｓ、Ｃ１９０ＳおよびＣ１９８Ｓの変異を両方のパネルに示す。精製されたＭＧＤ−ＣＳＦを、定量および比較のための標準として右のパネルに示す。Ｃ１７９ＳおよびＣ１９０Ｓは、野性型ＭＧＤ−ＣＳＦよりも低い量で発現され、そしてＣ３５Ｓは、検出可能なレベルでは発現されなかった。図９は、実施例９Ａにさらに記載されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦがＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導する能力を示す。ＮＫ細胞数は、負の緩衝液コントロール（ひし形）またはＭＧＤ−ＣＳＦでトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地（四角）に曝露した後の１ウェルあたりの相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で表した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、マウスＮＫ細胞増殖を刺激した。コントロール緩衝液は、影響なかった。ＮＫ細胞に対するＭＧＤ−ＣＳＦの増殖活性は、特異的であってかつ用量依存性であった。図１０は、実施例９Ａにさらに記載されるように、ＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導する因子についてのスクリーニングアッセイの結果を示す。上のパネルおよび下のパネルは、独立して行った２つの同一の実験を示す。ヒトＮＫ細胞の数は、試験因子に対する曝露後の相対ルシフェラーゼ単位（ｒｌｕ）で表す。ＭＧＤ−ＳＣＦで、またはＭＧＤ−ＣＳＦの供給源であるクラスター１９０６４７由来のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地は、ヒトＮＫ細胞の生存および／または増殖を刺激した。正のコントロールであるＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦも、ＮＫ細胞増殖を刺激した。図１１は、図９Ｂにさらに記載されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦが造血幹細胞増殖を誘導する能力を示す。幹細胞の数は、血球計算器で細胞をカウントすることによって決定した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、用量依存性の方式で増殖を増大させた。ＭＧＤ−ＣＳＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｍ−ＣＳＦよりも大きい程度まで、そしてＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦと同様の程度まで幹細胞増殖を誘導した。図１２は、実施例９Ｃにさらに記載されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦが骨髄球性細胞増殖を誘導する能力を示す。図１２Ａは、ＭＧＤ−ＣＳＦを含有する馴化培地が骨髄増殖を誘導する能力を、陰性コントロールの空のベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）および無関係の化合物ＣＬＮ３７３２、ＦＰＴ０２６、ＩＬ−１０および非馴化培地と；そして陽性のコントロールＧＭ−ＣＳＦと比較する。単球の数は、試験因子に対する曝露後の１ウェルあたりの相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で表した。図１２は、実施例９Ｃにさらに記載されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦが骨髄球性細胞増殖を誘導する能力を示す。図１２Ｂは、精製ＧＭ−ＣＳＦ（星）およびＭＧＤ−ＣＳＦ（四角）でトランスフェクトした細胞由来の馴化培地の両方とも、ヒト単球増殖を刺激したことを示す。コントロールベクター（ひし形）は影響なかった。単球に対するＭＧＤ−ＣＳＦの増殖活性は、特異的であってかつ用量依存性であった。図１３は、分化抗原ＣＤ６７およびＣＤ２４の存在によって測定し、実施例１０Ａにさらに詳細に記載されるような、顆粒球分化の蛍光表示式細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。負のコントロールベクター（ＶｅｃｔｏｒＣＭ）で馴化した培地、およびＭＧＤ−ＣＳＦベクター（ＭＧＤ−ＣＳＦＣＭ）で馴化した培地に対する応答における顆粒球へ分化するように誘導された造血幹細胞の数を示す。ＣＤ６７ＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ６７に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ６７陽性細胞の数を示す。ＣＤ２４ＰＥ（ｙ軸）は、ＣＤ２４に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ２４陽性細胞の数を示す。線で囲んだ三角の領域（矢印）は、４つのパネルの各々における細胞表面分化抗原ＣＤ６７およびＣＤ２４の両方について陽性の細胞数を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦＣＭは、Ｇ−ＣＳＦの非存在下（サイトカインなし）および存在下の両方で顆粒球分化を刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦによるこの刺激は、Ｇ−ＣＳＦの効果と相乗的であった。図１４は、分化抗原ＣＤ１５およびＣＤ２４の存在によって測定し、実施例１０Ａにさらに詳細に記載されるような、顆粒球分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＣＤ２４ＰＥ（ｘ軸）は、ＣＤ２４に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ２４陽性細胞の数を示す。ＣＤ１５ＡＰＣ（ｙ軸）は、ＣＤ１５に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ１５陽性細胞の数を示す。各々のグラフの上の右側の枠は、ＣＤ１５およびＣＤ３４分化マーカーの両方を細胞表面上に有するそれらの細胞の割合を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、濃度依存性の様式で顆粒球分化を誘導し、ここで５００ｎｇ／ｍｌの用量では、骨髄造血幹細胞のうち８％の顆粒球への分化が生じた。図１５は、分化抗原ＣＤ１４およびＣＤ３の存在によって測定し、実施例１０Ｂにさらに詳細に記載されるような、単球分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。負のコントロールベクター（ＶｅｃｔｏｒＣＭ）で馴化した培地、およびＭＧＤ−ＣＳＦベクター（ＭＧＤ−ＣＳＦＣＭ）で馴化した培地に対する応答において単球へ分化するように誘導された造血幹細胞の数を示す。ＣＤ１４ＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ１４に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ１４陽性細胞の数を示す。ＣＤ３ＡＰＣ（ｙ軸）は、ＣＤ３に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ３陽性細胞の数を示す。線で囲んだ卵形の領域（矢印）は、４つのパネルの各々における細胞表面分化抗原ＣＤ１４およびＣＤ３の両方について陽性の細胞数を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦＣＭは単球分化を刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦＣＭは、Ｇ−ＣＳＦの非存在下（サイトカインなし）および存在下の両方で単球分化を刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦが単球分化を誘導する能力は、ＧＭ−ＣＳＦの能力よりも大きかった。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦと相乗的に作用した。図１６は、分化抗原ＣＤ１４およびＣＤ１６の存在によって測定し、実施例１０Ｂにさらに詳細に記載されるような、単球分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＣＤ１４ＡＰＣ（ｙ軸）は、ＣＤ１４に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ１４陽性細胞の数を示す。ＣＤ１６ＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ１６に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ１６陽性細胞の数を示す。各々のグラフの上の右側の枠は、ＣＤ１４およびＣＤ１６分化マーカーの両方を細胞表面上に有するそれらの細胞の割合を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、濃度依存性の様式で単球分化を誘導し、ここで１００ｎｇ／ｍｌの用量では、骨髄造血幹細胞のうち１０％の顆粒球への分化が生じた。図１７は、分化抗原ＣＤ８６およびＣＤ１の存在によって測定し、実施例１０Ｃにさらに詳細に記載されるような、樹状細胞分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。負のコントロールベクター（ＶｅｃｔｏｒＣＭ）で馴化した培地、およびＭＧＤ−ＣＳＦベクター（ＭＧＤ−ＣＳＦ）で馴化した培地に対する応答における樹状細胞へ分化するように誘導された造血幹細胞の数を示す。ＣＤ１ａＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ１に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ１陽性細胞の数を示す。ＣＤ８６ＰＥ（ｙ軸）は、ＣＤ８６に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ８６陽性細胞の数を示す。線で囲んだ卵形の領域は、細胞表面分化抗原ＣＤ１およびＣＤ８６の両方について陽性の細胞数を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦＣＭは、樹状細胞分化を刺激した。負のコントロールでトランスフェクトされた細胞のうち４％が樹状細胞に分化したが、ＭＧＤ−ＣＳＦベクターでトランスフェクトした細胞のうち２２％が樹状細胞に分化した。図１８は、実施例１１にさらに詳細に記載されるように、ヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ａは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果に比較して、ＣＦＵ−Ｇ（左パネル）およびＣＦＵ−Ｍ（右パネル）の形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの用量依存性の刺激効果を示す。図１８は、実施例１１にさらに詳細に記載されるように、ヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ｂは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果に比較して、ＣＦＵ−ＧＭの形成（左パネル）および総コロニー形成能（ＴｏｔａｌＣＦＣ）（右パネル）に対するＭＧＤ−ＣＳＦの用量依存性の刺激効果を示す。図１８は、実施例１１にさらに詳細に記載されるように、ヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ｃは、サイトカインＩＬ−３および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下におけるＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果に比較して、ＣＦＵ−Ｇ（上の左パネル）、ＣＦＵ−ＧＭ（上の右パネル）、ＣＦＵ−Ｍ（下の左パネル）の形成および総コロニー形成能（ＴｏｔａｌＣＦＣ）（下の右パネル）に対するＭＧＤ−ＣＳＦの用量依存性の刺激効果を示す。図１９は、実施例１２にさらに詳細に記載されるように、種々の生物学的活性についてのアッセイにおけるＭＧＤ−ＣＳＦの効果のプロフィールを示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、活性化単球（ＭｏｎＰｒｏ４）の増殖および末梢性ＮＫ細胞（ＮＫＧｌｏ）の増殖を刺激した。図２０は、実施例１３にさらに詳細に記載されるように、サイトカイン分泌の種々のアッセイにおけるＭＧＤ−ＣＳＦの効果のプロフィールを示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｕｍｉｎｅｘ２−ＧＭＣＳＦ）、ＩＬ−２（Ｌｕｍｉｎｅｘ２−ＩＬ２）およびＩＬ−１３（Ｌｕｍｉｎｅｘ２−ＩＬ１３）の分泌を刺激した。図２１は、実施例１４にさらに詳細に記載されるように、ＣＦＵ−Ｍ形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。緩衝液、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦによって誘導されるＣＦＵ−Ｍ形成の例は、上の３つのパネルに示す。２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導されるＣＦＵ−Ｍ形成の用量依存性の効果は、下の３つのパネルに示される。図２２は、実施例１５にさらに詳細に記載されるように、樹状細胞形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。培地、２０ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦおよび５００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導される樹状細胞形成の例を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、球状の未分化造血幹細胞からの細長い分化した樹状細胞の形成を誘導した。

Claims

被験体において免疫応答を調節するための組成物であって、
（ａ）配列番号７、９または１０のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ免疫細胞の増殖を刺激する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）配列番号７、９または１０のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、かつ免疫細胞の増殖を刺激する活性を有する、ポリペプチド
から選択されるポリペプチドに特異的な抗体
を含み、該免疫応答の調節が、炎症の抑制および／または自己免疫疾患の抑制である、組成物。
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントから選択される、請求項１に記載の組成物。
前記免疫応答の調節が、関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、および劇症肝不全より選択される疾患の処置または予防である、請求項１に記載の組成物。
炎症性疾患の患者に投与するための、請求項１または２に記載の組成物。
自己免疫疾患の患者に投与するための、請求項１または２に記載の組成物。