JP2014030411A - 核酸増幅反応用マイクロチップ - Google Patents

核酸増幅反応用マイクロチップ Download PDF

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Abstract

【課題】マイクロチップに導入された試料とマイクロチップ内に備えられた固相状の試薬との混合が容易な核酸増幅反応用マイクロチップを提供することを主な目的とする。
【解決手段】核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬と粒子とを備える、試薬収容領域を有する、核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。この核酸増幅反応用マイクロチップによれば、核酸増幅反応用マイクロチップに備えられた粒子によって、マイクロチップに導入された試料とマイクロチップ内に備えられた固相状の試薬との混合が簡便となる。
【選択図】図２

Description

本技術は、核酸増幅反応用マイクロチップに関する。より詳しくは、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬と粒子とを備える核酸増幅反応用マイクロチップに関する。
近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。これらのマイクロチップは、例えば、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサなどに利用され始めている。
このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ−Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化あるいは、分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。
μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を化学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、例えば、マイクロチップ上のウェル内で核酸増幅反応等の複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）などがある。
従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、核酸増幅反応に必要な物質と鋳型核酸とを予め全て混合し、反応液を調製した後、マイクロチップ内に配設された複数のウェルに反応液を導入する方法が取られていた。しかし、この方法では、反応液の調製に手間がかかり、また、ウェル内に反応液が導入されるまでに一定の時間が必要であるため、その間に反応液内で核酸増幅反応が進行し、核酸増幅反応の時間を厳密に制御できないという問題があった。
そこで、上記の問題に対し、例えば特許文献１では、ウェル内に核酸増幅反応に必要な複数の試薬が所定の順序で積層されて固着化された核酸増幅反応用マイクロチップが開示されている。
特開２０１１−１６０７２８号公報
上記の核酸増幅反応用マイクロチップでは、核酸増幅反応に必要な残りの物質と増幅対象の核酸を含む試料をウェル内に導入することで核酸増幅反応を始めることができるため、簡便でかつ核酸増幅反応の反応時間が制御された分析を行うことが可能となる。しかし、ウェル内に導入された試料と固着化された試薬との混合が不十分なまま分析が開始されてしまう場合があった。そこで、本技術は、マイクロチップに導入された試料とマイクロチップ内に備えられた固相状試薬との混合が容易な核酸増幅反応用マイクロチップを提供することを主な目的とする。
上記課題解決のため、本技術は、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬と粒子とを備える、試薬収容領域を有する、核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。
前記試薬収容領域の所定の位置に、前記粒子を収容可能な粒子収容部が設けられていてもよい。
前記粒子は、前記試薬収容領域に導入される試料よりも高比重とすることもでき、前記粒子収容部は、前記試薬収容領域の底面の凹部とすることもできる。
また、前記試薬収容領域の底面は、該底面と対向する面の方向に膨出した湾曲面からなってもよい。
前記粒子は、前記試薬収容領域に導入される試料よりも低比重とすることもでき、前記粒子収容部は、前記試薬収容領域の底面と対向する面の凹部とすることもできる。
また、前記試薬収容領域の底面と対向する面は、該底面の方向に膨出した湾曲面からなってもよい。
前記粒子は、磁性を有していてもよく、前記粒子収容部に磁力を及ぼす位置に磁性部材が配設されていてもよい。
また、前記粒子は、熱融解性を有していてもよい。
さらに、前記試薬収容領域は、前記核酸増幅反応の反応場とすることもできる。
前記核酸増幅反応用マイクロチップは、前記試薬収容領域と流路によって接続された前記核酸増幅反応の反応場を有していてもよく、前記試薬収容領域は、試料の導入部と流路によって接続していてもよい。
本技術により、マイクロチップに導入された試料とマイクロチップ内に備えられた固相状試薬との混合が容易な核酸増幅反応用マイクロチップが提供される。
本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ１ａの模式図である。図１Ａは、核酸増幅反応用マイクロチップ１ａの上面図を、図１Ｂは、図１ＡのＰ−Ｐ断面の断面図を示す。 マイクロチップ１ａの反応領域４３ａの構成を説明するための断面模式図である。 マイクロチップ１ａの変形実施形態の構成を説明するための断面模式図である。 本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ１ｂの反応領域４３ｂの構成を説明するための断面模式図である。 本技術の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ１ｃの反応領域４３ｃの構成を説明するための断面模式図である。 本技術の第五実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ１ｄの反応領域４３ｄの構成を説明するための上面模式図である。 関連技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの導入流路３３１，３３２と反応領域４３ｅの構成を説明するための上面模式図である。
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。

１．本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
（１）導入部、導入流路及び試薬収容領域
（２）試薬
（３）粒子
（４）粒子収容部
２．第一実施形態の変形実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
３．本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
４．本技術の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
５．本技術の第四実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
６．本技術の第五実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
７．関連技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
１．本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成について、図１を参照しながら説明する。
（１）導入部、導入流路及び試薬収容領域
図１Ａは、図中符号１ａで示す本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」とも称する）の上面模式図であり、図１Ｂは、図１ＡのＰ−Ｐ断面に対応する断面模式図である。マイクロチップ１ａには、核酸を含む試料をマイクロチップ１ａ内へ導入するための導入部２と、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬と粒子とを備える、試薬収容領域が設けられている。本実施形態においては、試薬と粒子が収容されている「試薬収容領域」が、核酸増幅反応の反応場であるため、本実施形態の説明では、「試薬収容領域」を「反応領域」と称して説明する。マイクロチップに設けられた「試薬収容領域」を核酸増幅反応の反応場することについては、後述する第二実施形態、第三実施形態及び第四実施形態についても同様であり、各実施形態の説明においても、「試薬収容領域」を「反応領域」と称する。
図１Ａに示すように、試薬と粒子とを備える反応領域４１ａ〜４５ａは、導入流路３１〜３５と接続している。導入部２へ導入された試料は、導入流路３１〜３５を通流し、反応領域４１ａ〜４５ａへ到達する。なお、図１及びその説明においては、導入流路３１により試料が供給される５つの反応領域を全て反応領域４１ａとし、同様に導入流路３２，３３，３４，３５により試料の供給を受ける各々の５つの反応領域を、反応領域４２ａ，４３ａ，４４ａ，４５ａとして説明する。
反応領域４１ａ〜４５ａに導入される試料とは、分析対象物、又は他の物質と反応して分析対象物を生成する物質を含む溶液を指す。分析対象物としては、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を挙げることができる。また、例えば血液などの前記分析対象物を含んだ生体試料自体、又はその希釈溶液を、反応領域４１ａ〜４５ａに導入する試料としてもよい。
図１Ｂに示すように、マイクロチップ１ａは、３つの基板層１１，１２，１３が貼り合わされてなる（図１Ｂにおいて、試薬及び粒子は、不図示。）。基板層１１，１２，１３の材料は、ガラスや各種プラスチック類とすることができる。基板層１１，１２，１３の貼り合わせは、例えば、熱融着、接着剤、陽極接合、粘着シートを用いた接合、プラズマ活性化結合、超音波接合等の公知の手法により行うことができる。なお、マイクロチップ１ａの反応領域４１ａ〜４５ａに保持された物質を、光学的に分析する場合においては、基板層１１，１２，１３には、光透過性を有し自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。
基板層１２には、導入部２、導入流路３１〜３５及び反応領域４１ａ〜４５ａが設けられている。基板層１２への導入部２等の成形は、公知の手法によって行うことができる。例えば、ガラス製基板層のウェットエッチング又はドライエッチング、あるいは、プラスチック製基板層のナノインプリント、射出成型、又は切削加工である。また、導入部２等は、基板層１１に成形されても良く、一部が基板層１１に成形され、他の部分が基板層１２に成形されていてもよく、導入部２や導入流路３１〜３５等を成形する基板層は特に限定されない。
（２）試薬
次に、図２Ａを参照しながら、マイクロチップ１ａの反応領域４１ａ〜４５ａに備えられた試薬Ｒ１，Ｒ２について説明する。図２では、マイクロチップ１ａに設けられた反応領域４１ａ〜４５ａを代表して、１つの反応領域４３ａのみ示す。
図２Ａは、反応領域４３ａの空間Ｅ１１へ試料が導入され、試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解が開始された状態を示す。反応領域４３ａには、固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２が収容されている。試薬Ｒ１，Ｒ２は、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている。具体的には、増幅の対象であるＤＮＡ、ＲＮＡ等の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、核酸増幅反応に直接必要ではないが、増幅した核酸鎖を検出するための蛍光標識等の標識を備えたプローブや、二本鎖の核酸にインターカレートする検出用試薬なども、増幅核酸鎖の検出に必要な物質として、試薬Ｒ１，Ｒ２に含まれる成分とできる。
なお、マイクロチップ１ａを用いて行う「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えばＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ法などの増幅核酸の定量を伴う反応も包含される。
図２Ａにおいては、反応領域４３ａに２種類の試薬（試薬Ｒ１と試薬Ｒ２）が収容されている例を示すが、マイクロチップ１ａの反応領域４１ａ〜４５ａに収容される試薬の数や種類は特に限定されず、１種類であっても複数であってもよい。また、反応領域４１ａ〜４５ａの各々に異なる組成の試薬Ｒ１，Ｒ２が収容されていてもよく、同じ組成からなる複数の試薬Ｒ１が、１つの反応領域４３ａに収容されていてもよい。
マイクロチップ１ａに備えられる試薬Ｒ１，Ｒ２は、所定の組成に調製した液状又はゲル状の試薬を別容器で固相化した後、反応領域４３ａ内に収容したものでもよい。また、液状又はゲル状の試薬を直接反応領域４３ａ内に導入し、反応領域４３ａ内で固相化して、反応領域４３内に固着化された試薬を、試薬Ｒ１，Ｒ２としてもよい。
（３）粒子
反応領域４３ａには、上記の試薬Ｒ１，Ｒ２の他、粒子Ｓ１が備えられている（図２Ａ参照。）。粒子Ｓ１の数は図２に示す数には限定されず、単数であっても複数であってもよい。また、粒子Ｓ１の大きさについても、反応領域４１ａ〜４５ａ内で試薬Ｒ１，Ｒ２と試料との混合に使用可能な大きさであり、かつ、後述する粒子収容部５３ａに収納可能な大きさであればよく、特に限定されない。
粒子Ｓ１は、後述する粒子収容部５３ａが反応領域４３ａ（試薬収容領域）の底面の凹部である場合には、反応領域４３ａ（試薬収容領域）へ導入される試料より高比重であることが好ましい。試料に比べ高比重となる粒子Ｓ１には、、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）やポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）等のプラスチック類からなる粒子の他、アルミナビーズ、ジルコニアビーズ、スチールボール等の金属を含む粒子や、シリカビーズやガラスビーズ等が挙げられる。
粒子Ｓ１は、反応領域４３ａ内を移動することにより、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合を促進する。粒子Ｓ１の反応領域内における移動には、反応領域４３ａに導入される試料の導入圧を利用してもよい。また、例えば、ユーザがマイクロチップ１ａを持って転倒混和の要領で、マイクロチップ１ａを裏返しながら揺するなどして、粒子Ｓ１を移動させてもよい。
図２Ａに示すように、反応領域４３ａ内の空間Ｅ１１は、導入された試料で満たされている。空間Ｅ１１内で、粒子Ｓ１が移動すると粒子Ｓ１の周囲の試料や試料中の固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２が撹拌され、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合が促進される。
（４）粒子収容部
マイクロチップ１ａには、図２Ｂに示すように、反応領域（試薬収容領域）底面６３ａに凹部が形成されている。この凹部は、粒子収容部５３ａであり、上記の試料と試薬Ｒ１，Ｒ２の撹拌に用いた粒子Ｓ１の収容が可能である。
図２Ｂは、試薬Ｒ１，Ｒ２が試料に溶解され、粒子Ｓ１が粒子収容部５３ａに収容された状態を示す。試料と試薬Ｒ１，Ｒ２とが十分に混合されたマイクロチップ１ａにおいては、反応領域４３ａで核酸増幅反応が開始される。核酸増幅反応の反応過程や反応終了後の反応領域４３ａにおける増幅核酸鎖を分析する場合、反応領域４３ａに存在する粒子Ｓ１が分析を妨げないことが望ましい。特に、増幅核酸鎖を光学的に分析する場合には、増幅核酸鎖への照射光や、増幅核酸鎖からの放出光など、これらの光の光路上に粒子Ｓ１が存在しないことが望ましい。マイクロチップ１ａでは、図２Ｂにおいて破線で示す光路Ｌを外れた位置に粒子収容部５３ａが形成されていることにより、粒子収容部５３ａへ収容された粒子Ｓ１が分析を妨げることがない。
反応領域４３ａ内の粒子Ｓ１は試料よりも高比重であるため、空間Ｅ１１内を移動した後、粒子Ｓ１自身の質量によって試料中を落下し、反応領域底面６３ａに接触する。反応領域底面６３ａは、反応領域底面６３ａと対向する面の方向に膨出した湾曲面からなるため、反応領域底面６３ａに到達した粒子Ｓ１は、反応領域底面６３ａを辺縁部に向って移動し、粒子収容部５３ａへ集まる。粒子収容部５３ａは凹部として形成された空間であるため、粒子収容部５３ａに収容された粒子Ｓ１は、ユーザがマイクロチップを振るなどして、再び粒子Ｓ１に移動させる力が加わるまでは、粒子収容部５３ａに係止されている。
マイクロチップ１ａにおいて、粒子収容部５３ａが設けられる位置は、反応領域４３ａ内の核酸鎖の分析に用いる光の光路を外れる位置であれば何れであってもよく、特に限定されない。また、粒子収容部底面７３ａに対する反応領域底面６３ａの高さｈ１は、粒子Ｓ１の大きさや数に応じて、粒子Ｓ１が粒子収容部５３ａに収容可能となる高さに決めればよい。
上述したマイクロチップ１ａにおいては、粒子Ｓ１が固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２と共に反応領域４１ａ〜４５ａ（試薬収容部）に備えられている。このため、マイクロチップ１ａに導入された試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合が促進され、試薬Ｒ１，Ｒ２の試薬への溶解が十分に行われ、反応領域４１ａ〜４５ａ間での試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解の程度にばらつきが生じ難い。また、試薬Ｒ１，Ｒ２が反応領域４１ａ〜４５ａに収容されることにより、マイクロチップ１ａ内の別の空間で試薬Ｒ１，Ｒ２を溶解した後に反応領域４１ａ〜４５ａへ導入する場合に比べ、試薬Ｒ１，Ｒ２の損失が抑制される。このため、マイクロチップ１ａを用いた分析では、試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解にかかる時間が短縮され、かつ反応領域４１ａ〜４５ａでの核酸増幅反応にばらつきが生じ難く、より高精度の分析が可能となる。
また、マイクロチップ１ａでは、反応領域４１ａ〜４５ａ内に粒子Ｓ１を収容する粒子収容部５３ａが設けられている。このため、増幅核酸鎖の分析の際に、粒子Ｓ１を反応領域４１ａ〜４５ａ内の分析を妨げない所定の位置に集めることが可能となる。粒子Ｓ１が分析の妨げとならないため、マイクロチップ１ａを用いて行う分析の精度が向上する。
なお、上述したマイクロチップ１ａを構成する基板層１１には、弾性を有する材料が用いられ、基板層１２，１３にはガス不透過性を備える材料が用いられていることが好ましい。基板層１１を弾性を有する材料で構成することで、基板層１１によって封止されているマイクロチップ１ａの導入部２へ針等の穿刺部材を用いて試料の導入を行うことが可能となる。例えば、試料を充填させたシリンジ等と穿刺部材を接続し、穿刺部材の先端をマイクロチップ１ａの外部から、基板層１１を穿通させ、導入部２まで到達させ、シリンジ内部と導入部２とを接続させ、試料をマイクロチップ１ａ内へ導入する。
弾性を有する基板層１１の材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系エラストマーの他、アクリル系エラストマー、ウレタン系エラストマー、フッ素系エラストマー、スチレン系エラストマー、エポキシ系エラストマー、天然ゴムなどが挙げられる。
一方、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成することで、反応領域４１〜４５内に導入された試料が加熱等によって気化し、基板層１１を透過して消失（液抜け）するのを防止できる。
ガス不透過性を備える基板層の材料としては、ガラス、プラスチック類、金属類及びセラミック類などが挙げられる。プラスチック類としては、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタアクリレート：アクリル樹脂）、ＰＣ（ポリカーボネート）等が挙げられる。金属類としては、アルミニウム、銅、ステンレス（ＳＵＳ）、ケイ素、チタン、タングステン等が挙げられる。セラミック類としては、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、窒化アルミ（ＡｌＮ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化ジルコニア（ＺｒＯ２）、石英等が挙げられる。
また、マイクロチップ１ａにおいては、導入部２や反応領域４１ａ〜４５ａ等の試料が導入される領域が、大気圧に対して負圧（例えば１／１００気圧）とされていることが好ましい。マイクロチップ１ａの内部が大気圧に対し負圧とされることにより、前述の穿刺部材を用いたマイクロチップ１ａへの試料の導入において、外部（シリンジ内部）との間の圧力差によって、シリンジ内の試料を穿刺部材を経て、マイクロチップ１ａ内へ自動的に吸引させることができる。マイクロチップ１ａ内を大気圧に対して負圧とするには、例えば、前述した基板層１１と基板層１２との貼り合わせを負圧下で行えばよい。
２．第一実施形態の変形実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
第一実施形態の変形実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの反応領域を、反応領域４３１ａと反応領域４３２ａを代表として、図３に示す。図３Ａ及び図３Ｂは、各々、試薬Ｒ１，Ｒ２が空間Ｅ１２，Ｅ１３に導入された試料に溶解し、粒子Ｓ１が粒子収容部５３１ａ，５３２ａに収容されている状態を示す。
第一実施形態の変形実施形態においては、反応領域４３１ａと反応領域４３２ａ等の各反応領域の構成以外については、第一実施形態と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、第一実施形態の変形実施形態の基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
図３Ａに示す反応領域４３１ａ内には、粒子Ｓ１が備えられ、光路Ｌを外れた位置に粒子収容部５３１ａが設けられている。本技術の第一実施形態に係るマイクロチップ１ａにおいて、湾曲面からなる反応領域底面は必須の構成ではなく、図３Ａに示すように、反応領域底面６３１ａが平坦であってもよい。
反応領域底面６３１ａが平坦であるため、粒子Ｓ１が自身の質量によって領域底面６３１ａに到達した後、粒子Ｓ１は、反応領域底面６３１ａ上の落下地点に留まる。そこで、例えば、ユーザがマイクロチップを傾けることにより、反応領域底面６３１ａ上にある粒子Ｓ１は移動し、粒子収容部５３１ａに集まる。
図３Ｂに示すように、粒子収容部５３２ａが形成される位置は、反応領域４３２ａの片側に限定されず、例えば、光路Ｌ（図３Ｂ、破線参照。）を挟んで両側に粒子収容部５３２ａが設けられてもよく、光路Ｌを中心に反応領域４３２ａ内に周設されていてもよい。粒子収容部５３１ａ，５３２ａが形成される位置は、例えば、増幅核酸鎖を光学的に分析する場合、増幅核酸鎖の分析を妨げる領域（図３Ａ及び図３Ｂ、光路Ｌ）を外れていればよく、特に限定されない。
また、第一実施形態に係るマイクロチップ１ａでは、粒子収容部５３１ａ，５３２ａは、反応領域底面６３１ａ，６３２ａの凹部であればよく、粒子収容部底面７３１，７３２が反応領域底面６３１ａ，６３２ａに比して下方に位置していればよい。粒子収容部底面７３１，７３２に対する反応領域底面６３１ａ，６３２ａの高さｈ２，ｈ３は、粒子Ｓ１の大きさや数に応じて、粒子Ｓ１が粒子収容部５３１ａ，５３２ａに収容可能な高さに決めればよい。
３．本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
本技術の第二実施形態に係るマイクロチップ１ｂの反応領域４１ｂ〜４５ｂについて、反応領域４３ｂを代表として、図４に断面模式図を示す。図４Ａは、反応領域４３ｂの空間Ｅ２へ試料が導入され、前述した試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解が開始された状態を示し、図４Ｂは、試薬Ｒ１，Ｒ２が試料に溶解し、粒子Ｓ２が粒子収容部５３ｂへ収容された状態を示す。
マイクロチップ１ｂは、反応領域４１ｂ〜４５ｂと反応領域４１ｂ〜４５ｂに収容されている粒子Ｓ２と、粒子収容部５３ｂ以外の構成については、第一実施形態と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、マイクロチップ１ｂを構成する基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
マイクロチップ１ｂの反応領域４３ｂには、試薬Ｒ１，Ｒ２と共に、粒子Ｓ２が備えられている（図４Ａ参照。）。粒子Ｓ２は、後述する粒子収容部５３ｂが、反応領域上面６３ｓより上方に位置するため、試料より低比重であることが好ましい。低比重となる粒子Ｓ１の材料には、例えば、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）やポリメチルペンテン（ＰＭＰ）などの各種プラスチック類が挙げられる。
反応領域４３ｂに備えられた粒子Ｓ２は、第一実施形態に係るマイクロチップ１ａに備えられた粒子Ｓ１と同様に、反応領域４３ｂに導入された試料の導入圧やユーザがマイクロチップ１ｂを転倒混和のように振ることによって反応領域４３ｂ内を移動し、試料や試料中の試薬Ｒ１，Ｒ２を撹拌して、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合を促進する。
図４Ｂに示すように、マイクロチップ１ａには、反応領域（試薬収容領域）底面６３ｂと対向する面に凹部が形成されている。この凹部は粒子収容部５３ｂであり、凹部として形成された空間に粒子Ｓ２が収容され得る。
粒子Ｓ２は、試料より低比重であるため、試料中を浮上し、反応領域上面６３ｓに到達する。反応領域（試薬収容領域）４３ｂの底面と対向する面である反応領域上面６３ｓは、反応領域底面６３ｂの方向に膨出した湾曲面からなる。このため、反応領域上面６３ｓに到達した粒子Ｓ２は、反応領域上面６３ｓの辺縁部に向って移動し、粒子収容部５３ｂへ集まる。粒子収容部５３ｂは凹部として形成された空間であるため、粒子収容部５３ｂに収容された粒子Ｓ２は、ユーザがマイクロチップを振るなどして、再び粒子Ｓ２に移動させる力が加わるまでは、粒子収容部５３ｂに係止されている。
本技術の第二実施形態に係るマイクロチップ１ｂにおいて、湾曲面からなる反応領域上面６３ｓは必須の構成ではなく、図３Ａ及び図３Ｂに示す第一実施形態の変形実施形態における反応領域底面６３１ａ，６３２ａのように、粒子Ｓ２が接触する反応領域上面６３ｓは平坦であってもよい。反応領域上面６３ｓが平坦である場合には、ユーザがマイクロチップを傾けるなどして、粒子Ｓ２を移動させ、粒子収容部５３ｂへ収容すればよい。
マイクロチップ１ｂでは、粒子収容部５３ｂは、反応領域上面６３ｓの凹部であればよく、凹部の底に当たる粒子収容部上面７３ｂが、反応領域上面６３ｓに比して上方に位置していればよい。反応領域上面６３ｓに対する粒子収容部上面７３ｂの高さｈ４は、粒子Ｓ２の大きさや数に応じて、粒子Ｓ２が粒子収容部５３ｂに収容可能となる高さであればよい。
反応領域４３ｂ内の粒子収容部５３ｂが設けられる位置は、増幅核酸鎖の分析を妨げない位置であれば何れであってもよい。例えば、増幅核酸鎖を光学的に分析する場合には、図４Ｂに破線で示す光路Ｌを外れた位置に粒子収容部５３ｂを設けることが好ましい。
上述したマイクロチップ１ｂでは、第一実施形態に係るマイクロチップ１ａと同様に試薬Ｒ１，Ｒ２が収容された領域に粒子Ｓ２が備えられることにより、粒子Ｓ２が試料や試料中の試薬Ｒ１，Ｒ２を撹拌し、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合が促進される。このため、試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解が十分に行われ、反応領域４１ｂ〜４５ｂ間での試料のばらつきが低減し、マイクロチップ１ｂを用いて精度の高い分析が可能となる。
また、マイクロチップ１ｂでは、反応領域４３ｂに粒子Ｓ２を収容する粒子収容部５３ｂが設けられることによって、試料の撹拌に用いた粒子Ｓ２が増幅核酸鎖の分析の際には、所定の位置に収まり、分析を妨げることが防止される。このため、マイクロチップ１ｂにおける分析の精度が向上する。
４．本技術の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
本技術の第三実施形態に係るマイクロチップ１ｃの反応領域４１ｃ〜４５ｃについて、反応領域４３ｃを代表として図５に断面模式図を示す。図５Ａは、反応領域４３ｃの空間Ｅ３へ試料が導入され、試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解が開始された状態を示す。図５Ｂは、試薬Ｒ１，Ｒ２が試料に溶解し、粒子Ｓ３が粒子収容部５３ｃへ捕捉された状態を示す。
マイクロチップ１ｃは、反応領域４１ｃ〜４５ｃと反応領域４１ｃ〜４５ｃに収容されている粒子Ｓ３と、磁性部材Ｍの構成以外については、、第一実施形態及と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、マイクロチップ１ｃを構成する基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
マイクロチップ１ｃの反応領域４３ｃに備えられる粒子Ｓ３は、後述する磁性部材Ｍが、反応領域４３ｃの周辺に配設されている場合、磁性を有していることが好ましい。粒子Ｓ３には、市販の磁性ラテックス粒子や磁性シリカ粒子を用いることができる。
反応領域４３ｃ内の粒子Ｓ３は、第一実施形態のマイクロチップ１ａの場合と同様に、反応領域４３ｃ内の空間Ｅ３を移動することにより、試料や試料中の試薬Ｒ１，Ｒ２を撹拌して、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合を促進する（図５Ａ参照。）。
マイクロチップ１ｃにおいては、粒子収容部５３ｃに当たる所定の空間に磁力を及ぼす位置に磁性部材Ｍが配設されている。このため、粒子Ｓ３は、磁性部材Ｍの磁力によって粒子収容部５３ｃへ集まり、粒子収容部５３ｃ内に捕捉される。図５Ｂでは、磁性部材Ｍを反応領域側面６３３の近傍に設けた例を示す。粒子Ｓ３は、磁性部材Ｍの磁力によって反応領域側面６３３の方向へ引き寄せられ、反応領域側面６３３へ到達する。
磁性部材Ｍは、電磁石で構成されていてもよく、永久磁石で構成されていてもよい。電磁石を用いた場合には、粒子Ｓ３による試料の撹拌が終了した後にコイルに電流を流して磁界を生じさせ、粒子Ｓ３を粒子収容部５３ｃに集めることができる。永久磁石を用いた場合には、試料の反応領域４３ｃへの導入圧やユーザのマイクロチップを揺らす動作程度の力によって、粒子Ｓ３が反応領域４３ｃ内を移動可能とする磁力となるように磁性部材Ｍを配設すればよい。なお、磁性部材Ｍは、マイクロチップ１ｃにおいて必須の構成ではなく、マイクロチップ外に設けられていてもよい。
反応領域４３ｃ内で磁性部材Ｍの磁力が及ぶ空間は、すなわち、粒子収容部５３ｃであり、反応領域４３ｃ内における粒子収容部５３ｃの位置は、図５Ｂに示す反応領域側面６３３に接する位置には限定されず、反応領域４３ｃにおける分析を妨げない位置であれば、何れであってもよい。図５Ｂに示すように、例えば反応領域４３ｃ内の増幅核酸鎖を光学的に分析する場合には、光路Ｌを外れた位置に粒子収容部５３ｃが設けられることが好ましい。
上述したマイクロチップ１ｃでは、磁性部材Ｍによって粒子Ｓ３が反応領域４３ｃの所定の位置に捕捉される。このため、粒子Ｓ３が増幅核酸鎖の分析を妨げず、マイクロチップ１ｃを用いて精度の高い分析が可能となる。また、反応領域４３ｃへの凹部の形成を必要としないため、マイクロチップ１ｃを構成する基板層１１，１２，１３の成形が容易となり得る。マイクロチップ１ｃの前記以外の構成及び効果は、上述した第一実施形態及び第二実施形態に係るマイクロチップと同様である。
５．本技術の第四実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
本実施形態に係るマクロチップの反応領域（試薬収容領域）に備えられる粒子は、マイクロチップを用いて行う核酸増幅反応が加熱操作を伴う場合には、熱溶融性を有することが好ましい。
上述した第一実施形態等における粒子Ｓ１〜Ｓ３と同様に、本実施形態に係るマイクロチップの反応領域内に備えられた熱溶融性を有する粒子は、反応領域内で試料や試薬Ｒ１，Ｒ２を撹拌し、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２の混合を促進する。試薬Ｒ１，Ｒ２の溶解が完了した後、マイクロチップは核酸増幅反応のために加熱される。この加熱操作によって、反応領域内の熱溶融性を有する粒子は溶解し、粒子が増幅核酸鎖の分析を妨げることが抑えられる。
熱溶融性を有する材料は、溶解して核酸増幅反応を阻害しない材料であり、かつ核酸増幅反応における加熱温度で溶解される材料であれば、特に限定されない。熱溶融性粒子の材料としては、例えば、低融点パラフィン、エイコサンやグリースなどが挙げられる。
本実施形態に係るマイクロチップでは、粒子が熱溶融性を有するため、増幅核酸鎖の分析を妨げない。また、反応領域への凹部の形成や磁性部材を必要としないため、マイクロチップの構造がより単純となり、マイクロチップの作製が容易となる。本実施形態の上記以外の構成及び効果は、上述した第一実施形態及び第二実施形態に係るマイクロチップと同様である。
６．本技術の第五実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
本技術の第五実施形態に係るマイクロチップ１ｄの反応領域４１ｄ〜４５ｄについて、反応領域４３ｄを代表として、図６に上面模式図を示す。マイクロチップ１ｄは、反応領域４１ｄ〜４５ｄと、試薬Ｒ１，Ｒ２が収容された試薬収容領域８３と、反応領域４１ｄ〜４５ｄと試薬収容領域８３を接続する排出流路３３ｂの構成以外については、、第一実施形態及と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、マイクロチップ１ｄを構成する基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
図６に示すマイクロチップ１ｄでは、試薬Ｒ１，Ｒ２と粒子Ｓ４とが備えられる試薬収容領域８３とは別に、核酸増幅反応の反応場である反応領域４３ｄが設けられている。試薬収容領域８３と反応領域４３ｄとは、排出流路３３ｂで接続している。また、試薬収容領域８３は、導入流路３３ａによって導入部２と接続している（図６において、導入部２は不図示。）。
本実施形態では、導入部２へ導入された試料が、導入流路３３ａを通流し、試薬収容領域８３へ到達する（図６、矢印Ｆ１参照。）。試薬収容領域８３において、試料は、試薬Ｒ１，Ｒ２と混合される。この際、上述した第一実施形態における粒子Ｓ１等と同様に、試薬収容領域８３に備えられた粒子Ｓ４が試薬収容領域８３内を移動することによって、試料や試料中の試薬Ｒ１，Ｒ２を撹拌し、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合を促進する。
試薬Ｒ１，Ｒ２は排出流路３３ｂの流路径よりも大きいため、溶解するまで排出流路３３ｂを通流することができない。また、粒子Ｓ４も排出流路３３ｂへの固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２の通流を妨げ得る。このため、試薬Ｒ１，Ｒ２は試薬に溶解した後、反応領域４３ｄへ導入される（図６、矢印Ｆ２参照。）。
試薬収容領域８３と排出流路３３ｂとの連通部にはフィルター９が設けられているため、粒子Ｓ４は、試薬収容領域８３内に留まる。このため、粒子Ｓ４が反応領域４３ｄへ導入され反応領域４３ｄでの分析を妨げることが防止される。なお、フィルター９を設けない場合には、粒子Ｓ４を試薬Ｒ１，Ｒ２と同様に排出流路３３ｂの流路径よりも大きくすればよい。
本実施形態に係るマイクロチップ１ｄにおいては、粒子Ｓ４が反応領域４３ｄ以外の空間に備えられているため、反応領域４３ｄに粒子Ｓ４を粒子収容する構成を設ける必要がない。マイクロチップ１ｄに備えられる粒子Ｓ４は、反応領域４３ｄにおける分析への影響を考慮する必要がないため、材質が特に限定されない。本実施形態の前記以外の構成及び効果は、上述した第一実施形態及び第二実施形態に係るマイクロチップと同様である。
７．関連技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
上述した、本技術の各実施形態に係るマイクロチップにおいて、マイクロチップ内へ導入される試料と固相状の試薬との混合を促進するために、反応領域内、あるいは試薬収容領域内で試料の旋回流が形成可能となるよう、導入流路と反応領域、あるいは試薬収容領域が接続されていてもよい。
図７Ａに、マイクロチップに設けられた反応領域４３ｅと導入流路３３１を一例として示す（図７Ａにおいて、試薬は不図示。）。導入流路３３１は、上面視略円形である反応領域４３ｅを構成する周面の接線方向に延設されている（図７Ａ、破線参照。）。このため、導入流路３３１を通流し反応領域４３ｅへ導入された試料は、略円形である反応領域側面６３３に沿って旋回し、試料による旋回流が形成される（図７Ａ、矢印参照。）。
導入流路３３１と反応領域４３ｅとの接続部分である連通部６３４は、図７に示す位置には限定されず、反応領域４３ｅ内で試料の旋回流が形成可能となる位置に設けられていればよく、導入流路３３１の延長線（図７Ａ、破線参照。）が反応領域の中心（反応領域中心６３５）を通らないことが好ましい。
また、試料の反応領域４３ｅへの導入による旋回流の形成をより容易にするために、例えば、図７Ｂに示すように、一つの反応領域４３ｅに２本の導入流路３３１，３３２が接続されていてもよく、反応領域４３ｅに接続される導入流路の数は特に限定されない。２本の導入流路３３１，３３２が反応領域４３ｅに接続される場合であっても、各導入流路３３１，３３２は、反応領域４３ｅを構成する周面の接線方向に延設されていることが好ましい（図７Ｂ、破線参照。）。試料は、導入流路３３１，３３２の各連通部６３４，６３６から反応領域４３ｅに導入され、試料の旋回流（図７Ｂ、矢印参照。）が形成される。
なお、本技術に係るマイクロチップに設けられる反応領域は、上面視略円形には限定されないが、反応領域４３ｅ内での試料の旋回流の形成を容易にするためには、反応領域４３ｅは上面視略円形であることが好ましい。
また、上記の試料による旋回流は、図７に示す反応領域４３ｅ内での形成には限定されず、上述した第五実施形態のマイクロチップ１ｄのように、試薬Ｒ１，Ｒ２が試薬収容領域８３（図６参照。）に備えられている場合には、試薬収容領域８３に試料を通流させる導入流路３３ａを、上記のように試料による旋回流が形成可能となるように形成することも可能である。
上述した反応領域４３ｅに接続する導入流路３３１，３３２の構成により、反応領域４３ｅに導入された試料は旋回流を形成し、試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合が促進される。上述した第一実施形態から第五実施形態の反応領域のように、マイクロチップに粒子が備えられている場合は、試料が旋回流を形成することによって、粒子はより大きく移動し、粒子による試料と試薬Ｒ１，Ｒ２との混合も一層促進される。
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。
（１）核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬と粒子とを備える、試薬収容領域を有する、核酸増幅反応用マイクロチップ。
（２）前記試薬収容領域の所定の位置に、前記粒子を収容可能な粒子収容部が設けられている、上記（１）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（３）前記粒子は、前記試薬収容領域に導入される試料よりも高比重である、上記（２）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（４）前記粒子収容部が、前記試薬収容領域の底面の凹部である、上記（３）の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（５）前記試薬収容領域の底面は、該底面と対向する面の方向に膨出した湾曲面からなる、上記（４）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（６）前記粒子は、前記試薬収容領域に導入される試料よりも低比重である、上記（２）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（７）前記粒子収容部が、前記試薬収容領域の底面と対向する面の凹部である、上記（６）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（８）前記試薬収容領域の底面と対向する面は、該底面の方向に膨出した湾曲面からなる、上記（７）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（９）前記粒子は、磁性を有する、上記（１）又は（２）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（１０）前記粒子収容部に磁力を及ぼす位置に磁性部材が配設されている、上記（９）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（１１）前記粒子は、熱融解性を有する、上記（１）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（１２）前記試薬収容領域は、前記核酸増幅反応の反応場である、上記（１）〜（１１）の何れかに記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（１３）前記試薬収容領域と流路によって接続された前記核酸増幅反応の反応場を有する、上記（１）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（１４）前記試薬収容領域は、試料の導入部と流路によって接続している、上記（１３）記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
本技術に係る核酸増幅用マイクロチップによれば、マイクロチップに導入される試料と固相状の試薬との混合が簡便となる。このため、臨床における遺伝子型判定や病原体判定などのための核酸検査のために、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップは用いられ得る。
Ｌ：光路
Ｍ：磁性部材
Ｒ１，Ｒ２：試薬
Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４：粒子
１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ：マイクロチップ（核酸増幅反応用マイクロチップ）
１１，１２，１３：基板層
２：導入部
３１，３２，３３，３３ａ，３３１，３３２，３４，３５：導入流路
３３ｂ：排出流路
４１ａ，４２ａ，４３ａ，４３１ａ，４３２ａ，４３ｂ，４３ｃ，４３ｄ，４３ｅ，４４ａ，４５ａ：反応領域
５３ａ，５３１ａ，５３２ａ，５３ｂ，５３ｃ：粒子収容部
６３ａ，６３１ａ，６３２ａ，６３ｂ：反応領域底面
６３ｓ：反応領域上面
６３３：反応領域側面
６３４，６３６：連通部
６３５：反応領域中心
７３ａ，７３１，７３２：粒子収容部底面
７３ｂ：粒子収容部上面
８３：試薬収容領域
９：フィルター

Claims (14)

  1. 核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬と粒子とを備える、試薬収容領域を有する、
    核酸増幅反応用マイクロチップ。
  2. 前記試薬収容領域の所定の位置に、前記粒子を収容可能な粒子収容部が設けられている、
    請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  3. 前記粒子は、前記試薬収容領域に導入される試料よりも高比重である、
    請求項２記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  4. 前記粒子収容部が、前記試薬収容領域の底面の凹部である、
    請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  5. 前記試薬収容領域の底面は、該底面と対向する面の方向に膨出した湾曲面からなる、
    請求項４記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  6. 前記粒子は、前記試薬収容領域に導入される試料よりも低比重である、
    請求項２記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  7. 前記粒子収容部が、前記試薬収容領域の底面と対向する面の凹部である、
    請求項６記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  8. 前記試薬収容領域の底面と対向する面は、該底面の方向に膨出した湾曲面からなる、
    請求項７記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  9. 前記粒子は、磁性を有する、請求項２記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  10. 前記粒子収容部に磁力を及ぼす位置に磁性部材が配設されている、
    請求項９記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  11. 前記粒子は、熱融解性を有する、請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  12. 前記試薬収容領域は、前記核酸増幅反応の反応場である、
    請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  13. 前記試薬収容領域と流路によって接続された前記核酸増幅反応の反応場を有する、
    請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
  14. 前記試薬収容領域は、試料の導入部と流路によって接続している、
    請求項１３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
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WO2016143377A1 (ja) * 2015-03-09 2016-09-15 ソニー株式会社 マイクロチップ、マイクロチップのウェル、マイクロチップを用いた分析装置及びマイクロチップを用いた分析方法

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US20140038280A1 (en) 2014-02-06

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