JP2014023544A - 培養軟骨製造方法および培養軟骨 - Google Patents
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Abstract
【課題】骨髄由来間葉系幹細胞を用いた方法に比べて低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成する。
【解決手段】、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種するステップＳ１と、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養するステップＳ２とを備え、臍帯血由来間葉系幹細胞を培養するステップＳ２の間、スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて培養軟骨を形成する培養軟骨製造方法を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種するステップＳ１と、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養するステップＳ２とを備え、臍帯血由来間葉系幹細胞を培養するステップＳ２の間、スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて培養軟骨を形成する培養軟骨製造方法を提供する。
【選択図】図１
Description
本発明は、培養軟骨製造方法および培養軟骨に関するものである。
従来、骨髄由来間葉系幹細胞から軟骨形成を誘導する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
しかし、骨髄液を採取するには侵襲性が高く、また微量の軟骨しか形成させることができないという不都合がある。
本発明は、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた方法に比べて低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成できる培養軟骨製造方法および培養軟骨を提供する。
本発明は、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた方法に比べて低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成できる培養軟骨製造方法および培養軟骨を提供する。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて培養軟骨を形成する培養軟骨製造方法を提供する。
本発明は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて培養軟骨を形成する培養軟骨製造方法を提供する。
上記発明においては、前記スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなることが好ましい。
また、本発明は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて製造される培養軟骨を提供する。
上記発明においては、前記スキャホールドが、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなっていてもよい。
上記発明においては、前記スキャホールドが、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなっていてもよい。
本発明によれば、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた方法に比べて低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成できるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る培養軟骨製造方法および培養軟骨について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養軟骨製造方法は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種するステップＳ１と、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を、スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて培養するステップＳ２とを備えている。
スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンであることが好ましい。
本実施形態に係る培養軟骨製造方法は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種するステップＳ１と、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を、スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて培養するステップＳ２とを備えている。
スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンであることが好ましい。
本実施形態に係る軟骨製造方法によれば、骨髄由来間葉系幹細胞を使用することなく、臍帯血由来間葉系幹細胞を使用するので、患者に対する侵襲が少なくて済み、患者にかかる負担を軽減することができるという利点がある。
したがって、低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成することができるという利点がある。
したがって、低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成することができるという利点がある。
次に、本実施形態に係る軟骨製造方法および培養軟骨の一実施例について説明する。
（実施例１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験
１５mlのポリプロピレン製チューブに臍帯血由来間葉系幹細胞を２×１０５個加え、遠心分離によりペレットを形成させ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３および５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２を含む軟骨誘導培地［ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）、５０ｍｇ／ｍＬのＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０−７Ｍのデキサメサゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸二リン酸、４０μｇ／ｍＬのプロリン、１００μｇ／ｍＬのピルビン酸］で培養した。
（実施例１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験
１５mlのポリプロピレン製チューブに臍帯血由来間葉系幹細胞を２×１０５個加え、遠心分離によりペレットを形成させ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３および５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２を含む軟骨誘導培地［ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）、５０ｍｇ／ｍＬのＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０−７Ｍのデキサメサゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸二リン酸、４０μｇ／ｍＬのプロリン、１００μｇ／ｍＬのピルビン酸］で培養した。
その結果、誘導に伴い（１〜６週間）、ペレットの大きさと透明度が増大し、軟骨関連遺伝子のＳｏｘ９、コラーゲンタイプ２Ａ１、アグリカン、コラーゲンタイプ１０Ａ１を発現した。培養３週目のペレットのパラフィン切片を作製し、トルイジンブルー染色した結果、赤紫色（メタクロマジー）に染色された。
また、免疫染色により軟骨細胞マーカーのタイプＩＩコラーゲンも陽性反応を示した。これらの結果から、臍帯血由来間葉系幹細胞は軟骨細胞に分化できることが明らかになった。さらに、他の組織由来の間葉系幹細胞である骨髄由来間葉系幹細胞から誘導した軟骨様ペレットに比べ、その大きさが著しく増大していた。このことから、軟骨再生における間葉系幹細胞ソースとして臍帯血由来間葉系幹細胞は有力なものであることが実証された。
（実施例２）Ｉｎ ｖｉｖｏでの実験
直径５ｍｍ、高さ３ｍｍからなるコラーゲンスポンジに臍帯血由来間葉幹系細胞を１×１０６個包埋し、軟骨分化誘導培地で２週間培養した。
その後、細胞を含むコラーゲンスポンジを５週齢のヌードマウス皮下に移植した。
直径５ｍｍ、高さ３ｍｍからなるコラーゲンスポンジに臍帯血由来間葉幹系細胞を１×１０６個包埋し、軟骨分化誘導培地で２週間培養した。
その後、細胞を含むコラーゲンスポンジを５週齢のヌードマウス皮下に移植した。
その結果、図２（ａ）に示されるように、移植後４週目で白く堅い組織が形成された。その組織のパラフィン切片を作製し、図２（ｂ）に示されるようにトルイジンブルー染色したところ、図２（ｃ）に示されるようにメタクロマジーに染色された円形の軟骨様細胞がみられた。また、軟骨細胞マーカーのタイプＩＩコラーゲンに対する抗体により免疫染色を行った結果、図２（ｄ）に示されるように、円形の軟骨様細胞の周囲に陽性反応が示された。
これらの結果から、臍帯血由来間葉系幹細胞はヌードラット関節下環境において軟骨形成することが明らかになった。
これらの結果から、臍帯血由来間葉系幹細胞はヌードラット関節下環境において軟骨形成することが明らかになった。
（実施例３）任意の軟骨組織の製造、培養中のスキャホールドへの刺激
実施例２における臍帯血由来間葉系幹細胞の培養中、培養液交換時または１日おきにスキャホールド上に１ｇのウエイトを置いて６０Ｇで１分間の遠心力を与えた。
その結果、コラーゲンのスキャホールドは、細胞が均質に分布した移植しやすい平板状の形状に変化した。さらに、ウエイトを置かないものに比べて軟骨形成能優位であった。
なお、上記実施形態においてはスキャホールドとしては、コラーゲンを用いてきたが、これに代えてゼラチンでも同様の培養軟骨が形成される。
実施例２における臍帯血由来間葉系幹細胞の培養中、培養液交換時または１日おきにスキャホールド上に１ｇのウエイトを置いて６０Ｇで１分間の遠心力を与えた。
その結果、コラーゲンのスキャホールドは、細胞が均質に分布した移植しやすい平板状の形状に変化した。さらに、ウエイトを置かないものに比べて軟骨形成能優位であった。
なお、上記実施形態においてはスキャホールドとしては、コラーゲンを用いてきたが、これに代えてゼラチンでも同様の培養軟骨が形成される。
Ｓ１ 播種ステップ
Ｓ２ 培養ステップ
Ｓ２ 培養ステップ
Claims (4)
- 臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、
該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、
前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて培養軟骨を形成する培養軟骨製造方法。 - 前記スキャホールド上に１ｇのウエイトを置いて６０Ｇで１分間の遠心力を与えて培養軟骨を形成する請求項１に記載の培養軟骨製造方法。
- 臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、
該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、
前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に遠心力を与えて製造される培養軟骨。 - 前記スキャホールド上に１ｇのウエイトを置いて６０Ｇで１分間の遠心力を与えて培養軟骨を形成する請求項３に記載の培養軟骨。
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