JP2010539970A5

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Publication number: JP2010539970A5
Application number: JP2010527592A
Authority: JP
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2014-05-22
Anticipated expiration: 2028-10-03

Claims

ヒト臍帯から細胞を単離するための方法であって、
ａ）前記ヒト臍帯を血液から分離し、採取後７２時間以内に処理される場合には室温で、又は、４８〜１４４時間の範囲の時間内に処理される場合には２〜８℃の範囲の間、乾燥で又は１８６μｇ／ｍｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌＮａＨＣＯ₃、９０μｇ／ｍｌＮａＨ₂ＰＯ_４・７Ｈ₂Ｏ、２０００μｇ／ｍｌグルコースならびに１％のペニシリンとストレプトマイシンの等モル混合物を含有する滅菌溶液中に浸漬し、滅菌密閉容器で実験室施設に輸送する回収工程と、
ｂ）１８６μｇ／ｍｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌＮａＨＣＯ₃及び９０μｇ／ｍｌＮａＨ₂ＰＯ_４・７Ｈ₂Ｏを含有する溶液での３回の臍帯洗浄工程と、
ｃ）滅菌ピンセットを用いて実施される、外膜（羊膜）除去工程と、
ｄ）前記臍帯を、メスを用いて、その縦軸に沿って横方向に分画して、約２．５ｃｍの長さの画分を得る分画工程と、
ｅ）凝血塊が同定された位置でメスを用いて切開を行い、前記凝血塊を除去する、ｄ）から得られた前記画分からの血液凝固除去工程と、
ｆ）ｅ）から得られた画分を７つの群にし、７つの群が、以下の工程で独立に処理される、グループ化工程と、
ｇ）約１：２：２：３７の組織量、フラスコの底面積（ｃｍ²）、消化容積（ｍｌ）及びフラスコ総容積（ｍｌ）間の一定割合を維持しながら、０．０７５％（重量／総消化容積）の濃度のコラゲナーゼＩＩと０．１２５％（重量／総消化容積）の濃度のトリプシンとを組み合わせた作用によって、ｐＨ緩衝した消化溶液を含有する滅菌密閉フラスコで実施され、前記フラスコを、培養時間、温度、散熱、周囲湿度及び撹拌の規定の条件下で、より詳しくは、各々約２．５ｃｍ（２．５ｇ）を有し、血液凝固を含まない、７臍帯画分の群から出発し、３５ｍｌの消化溶液の容積を使用し、総容量が６５０ｍｌであり、消化時には６１５ｍｌと７つの群を浸漬させた容量との差分からなるヘッドスペースを有する非通気型密閉培養フラスコ中で培養し、消化溶液は、酵素を除いて、１８６μｇ／ｍｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌＮａＨＣＯ₃、９０μｇ／ｍｌＮａＨ₂ＰＯ_４・７Ｈ₂Ｏ、１０００μｇ／ｍｌグルコース及び７６μｇ／ｍｌ（０．２６０ｍＭ）ＥＤＴＡからなり、ｐＨ６．４以上を維持し、酵素反応液を、１００振動／分（ｏｐｍ）の一定速度での撹拌のもと、密閉乾式培養器中、３７℃の一定温度で４時間培養する、ｆ）から得られた７画分の各群の細胞解離工程と、
ｈ）ｇ）に記載されるように、前記組織から解離した細胞を、消化が、室温で５〜３００分の範囲で行われたフラスコの静置水平培養と、前記消化溶液の消化後の上清である消化上清を、任意の未消化組織の吸引を避けながら、前記溶液のピペッティングによって５０ｍｌの遠心分離管に移すことと、次に、前記消化反応を行ったフラスコからのすべての未消化組織の除去を続け、前記遠心分離管に、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地３５ｍｌを加え、これでは、非通気型フラスコカップが、フィルター含有通気型カップと置き換えられており、最大表面コンフルエンスが達成されるまで、接着及び細胞成長／増殖を促進するよう、７２時間毎に培養培地を交換して、７％ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養を続けることによって回収する第１次細胞回収段階と、
ｉ）ｇ）に記載のとおりに、前記組織から解離し、ｈ）に記載されるようにして得られた前記消化上清中に含まれる細胞を、ｈ）から得た前記５０ｍｌ遠心分離管を、室温、３５０ｇで１０分間遠心分離し、遠心分離後に、前記３５ｍｌの上清容積を、フィルター含有通気型カップを備えた静置培養フラスコに移し、同じ培養フラスコに、３５ｍｌの、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地を加え、前記培養フラスコを、７％ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養し、最大表面コンフルエンスが達成されるまで、接着及び細胞成長／増殖を促進するよう、前記培養培地を７２時間毎に交換することによって回収する第２次細胞回収段階と、
ｊ）ｇ）に記載のとおりに前記組織から解離した細胞を、ｉ）に記載のとおりに前記消化上清の遠心分離によって得られた細胞沈渣として回収し、２ｍｌの、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる溶液に再懸濁し、２ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する２．５ｍｌの滅菌クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中、１℃／分の温度低下速度で速度制御冷凍庫を使用して、−８０℃に低下させて直接凍結保存する、第３の細胞回収段階と、
ｋ）最終細胞密度が、結局、１．０ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する１．５ｍｌ滅菌クライオバイアル中、約３×１０⁶個細胞／ｍｌのものであるよう、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する、０．５ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）の溶液の混合物の液体窒素の前記気相における前記直接凍結保存からなる、細胞培養が最大表面コンフルエンスに達した後の、ｈ）及びｉ）に記載されるように始まった細胞集団の凍結保存段階と
を含むことを特徴とするヒト臍帯から細胞を単離するための方法。
細胞の大部分が、間葉系細胞にとって適当な表面及び培養培地において接着及び増殖する能力を有し、細胞の大部分が、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、細胞の大部分が、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現せず、細胞の大部分が、２４時間で１．７倍になる増殖速度と繊維芽細胞様形態を維持しながら、前記最大表面コンフルエンスに達するまで、接着及び拡大／増殖からなる最大１８段階の拡大能力を有し、細胞の大部分が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞及び神経細胞に、部分的に、又は最終的に分化する能力を維持することを特徴とする請求項１記載の方法。
最初の接着及び拡大サイクル（Ｐ０）の最後に、臍帯１グラムあたり約８．６（±０．１）×１０⁵個細胞を生じることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
これらに限定されないが、例えば、前記工程ｋ）を伴うまたは伴うことなく、静脈への局所注射又は腰椎穿刺のような全身又は局所的な投与経路によって患者に細胞を投与し、患者への投与前では細胞はいかなる分化にも供されていないような細胞治療手順へ適用することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項記載の方法。
これらに限定されないが、例えば、任意の前駆細胞又は幹細胞、通常、胚幹細胞、造血幹細胞及び生殖前駆細胞などの細胞の増殖、分化および移植効果の支持体として、単離した細胞を使用することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項記載の方法。
単離した細胞を、例えば、それだけには限らないが、サイトカイン、ケモカイン及びその他の増殖因子などの分子の合成による免疫調節能に派生することによる治療に使用することを特徴とする請求項５記載の方法。
単離した細胞を、病的患部、例えば、それだけには限らないが、腫瘍増殖が存在する領域に遊走及び／又は接着する細胞の能力に派生することによる細胞治療に使用することを特徴とする請求項４乃至６の何れか１項記載の方法。
前記細胞を、天然又は合成の分子又は分子化合物、例えば、それだけには限らないが、タンパク質、ペプチド、小有機分子、オリゴ糖、多糖、プロテオグリカン、脂質又は上記のものの任意の組合せの局所投与のための担体として機能させることを特徴とする請求項４乃至７の何れか１項記載の方法。
細胞療法手順、例えば、それだけには限らないが、細胞が、中間の凍結保存段階を伴って又は伴わずに、中間の細胞拡大段階を伴って又は伴わずに、静脈内への局所注射又は腰椎穿刺によってなど、全身又は局所的な投与経路によって患者に投与され、細胞を事前に、部分的又は最終的に分化した、ヒト身体の任意の細胞種、例えば、それだけには限らないが、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞及びグリア細胞を含めた神経細胞と平滑筋細胞、骨格筋細胞、腱細胞、線維芽細胞、毛包細胞、内分泌腺細胞ならびに神経前駆細胞及び神経系細胞、例えば、ニューロン、オリゴデンドロサイト及び星状細胞をはじめとするグリア細胞以外の神経細胞、結膜上皮、皮膚上皮、角膜上皮、網膜上皮、肝臓上皮、腎臓上皮、膵臓上皮、小腸上皮、結腸上皮、膀胱上皮、子宮上皮、咽頭上皮及び喉頭上皮由来の細胞への誘導インビトロ分化を受ける手順に適用されることを特徴とする請求項４乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
無傷の細胞、細胞抽出物又は細胞成分を含有する薬理学的組成物に、単離した細胞を適用することを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
哺乳類細胞培養のための表面及び／又は表面層及び／又は支持体の製造において、前記薬理学的組成物を使用することを特徴とする請求項１０に記載の方法。