JP2013532144A - SorLAとGDNFファミリーリガンド受容体の間の相互作用の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
ソーティングタンパク質関連受容体を略記したSorLA(Swiss prot ID no Q92673)は、LR11としても知られており、250kDaの1型膜タンパク質であって、Vps10pドメイン受容体ファミリーで同定された第2のメンバーである。このファミリーの受容体はすべて、受容体Vps10pをソーティングする酵母の内腔部分を構成する、2つのドメインのそれぞれに対し強い類似性を有する約600アミノ酸N−末端ドメインの構造的な特徴を共有する(Marcusson, Horazdovskyら、1994)。リガンドのなかでもとりわけ、神経栄養因子およびニューロペプチドに結合するVps10pドメイン(Vps10p−D)(Mazella, Zsurgerら、1998; Munck Petersen, Nielsenら、1999; Nykjaer, Leeら、2004; Westergaard, Sorensenら、2004; Teng, Tengら、2005)は、第1の同定メンバーであるソルチリンの内腔部分全体を構成し、酵素プロペプチド切断によりリガンド結合に対して活性化される(Mazella, Zsurgerら、1998; Munck Petersen, Nielsen ら、1999)。SorLAは、ソルチリンと同様に、その内腔ドメインがVps10pドメインのみからなるが、後ゴルジコンパートメントでフューリンによって切断される受容体前駆体として合成される。プロペプチド切断は、ニューロペプチドと受容体関連タンパク質のプロペプチド阻害可能結合のためにVps10pドメインを調整することが示されている。SorLA Vps10pドメインの配列は、配列番号3と記載する。プロペプチドによって阻害されない受容体関連タンパク質、アポリポタンパク質Eおよびリポタンパク質リパーゼの強結合が、別の内腔ドメインに位置している部位に生じることも示されている(Jacobsen, Madsenら、2001)。トランスフェクト細胞において、完全長SorLAの約10%が細胞内取込を介在し得る細胞表面上で発現される。受容体の主要プールが後ゴルジコンパートメントで確認され、新しく合成されたリガンドとの相互作用が示唆されている。SorLAは、発生中および成体において、神経系全体で異なる細胞型で高度に発現される(Kanaki, Bujoら、1998; Motoi, Aizawaら、1999; Offe, Dodsonら、2006)。興味深いことに、SorLAレベルは散発型のアルツハイマー病で低下し(Scherzer, Offeら、2004; Dodson, Gearingら、2006; Sager, Wuuら、2007)、SorLA遺伝子中の遺伝性突然変異は、遅発症性アルツハイマー病に遺伝学的に関係している(Rogaeva, Mengら、2007)。重要なことには、SorLAは、アミロイド前駆タンパク質の高親和性結合およびソーティングを介在すること、Aβ生成に対して保護を付与することが明らかとなっている(Andersen, Reicheら、2005; Offe, Dodsonら、2006; Spoelgen, von Arnimら、2006; Rogaeva, Mengら、2007)。
アジュバント:投与される免疫原性決定因子/抗原との混合が前記決定因子に対する免疫応答を増加させる、または別の形で改変する任意の物質。
SorLAまたはGDNFファミリーリガンド受容体と同じ受容体標的に結合する抗体、例えば本発明のGFRα1〜4は、免疫抗原としての対象とする小型ペプチドを含有する完全ポリペプチドまたは断片を使用して調製することができる。動物に免疫性を与えるために用いられるポリペプチドは、組換えDNA技術または化学合成により得ることができ、担体タンパク質に場合により結合していてもよい。
本治療方法における薬物送達の主要経路は、静脈内、経口および局所である。標的部位への薬物の送達または血流への薬物を導入に有効である別の薬物の投与方法(例えば、皮下注射または吸入による投与)も考えられる。
本発明の化合物は粗製化学物質として投与することも可能であるが、医薬製剤の形態中にそれら化合物が存在するのが好ましい。
本明細書に記載された医薬品−化学修飾剤複合体は経皮的に投与することができる。経皮投与は典型的には、患者の体循環への薬物の経皮的通過のための医薬品の送達に関わる。皮膚部位として、薬物を経皮的に投与するための解剖学的領域が挙げられ、前腕、腹部、胸部、背中、臀部、乳様突起部などがある。
本明細書に記載された方法に様々な型の経皮パッチを用いることができる。例えば、単純な接着パッチは、裏当て素材およびアクリル酸系接着剤から調製することが可能である。医薬品−化学修飾剤複合体および任意の促進剤を粘着性成形溶液中へ製剤化し、十分混合する。溶液を裏当て素材上へ直接流し込み、成形溶媒をオーブン内で蒸発させ、粘着フィルムを残す。剥離ライナーを接着させて、系を完成させることができる。
本発明はまた、SorLAおよびGDNFファミリーリガンド受容体の両方を含む、SorLAとGDNFファミリーリガンド受容体(例えば、GFRα1、2、3または4)の間の相互作用を調節することが可能である、新しい結合パートナーを同定するためのインビトロおよび/またはインビボにおけるアッセイを包含する。これらのアッセイは、例えば、受容体SorLAまたはGFRα1、2、3もしくは4または両方を発現する細胞を含み、応答を測定することを含む細胞系であってもよい。あるいは、インビトロアッセイは、相互作用を阻害する新しい結合パートナーの能力を測定することにより実施することもできる。下記に、本発明による各種の実施形態を記載する。
本発明はまた、SorLaとGDNFファミリーリガンドレセプター複合体(特にGFRα1)の間の相互作用を調節することが可能な薬剤を同定することができる各種アッセイに関する。
GFRα1および/またはGDNFとSorLAの相互作用を阻害する薬剤を同定するためのインビトロアッセイ
a)バイオセンサーチップにGFRα1および/またはSorLAを固定化するステップと、
b)薬剤を適用するステップと、
c)このシグナルを標準と比較するステップ
とを含むか、あるいは、
a)固相上に薬剤、GFRα1、GDNFまたはSorLAを固定化するステップと、
b)各種濃度の前記薬剤の不在下または存在下において、これらを標識化された対応物(例えば、ヨウ素化した薬剤、GFRα1、GDNFおよび/またはSorLA)とインキュベートするステップと、
c)結合をカウントまたは測定するステップ
とを含む、
GFRα1および/またはSorLAとGDNFとの相互作用を阻害する薬剤を同定するためのインビトロアッセイに関する。
1.SorLAおよびGDNFファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節することにより、ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存を高める方法。
2.GDNFファミリーリガンド受容体がGFRα1、2、3および/または4を含む群から選択される、実施形態2に記載の方法。
3.SorLAおよびGDNFファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節するために使用される薬剤がタンパク質、ペプチド、抗体または小型有機化合物から選択される、実施形態1または2に記載の方法。
4.薬剤がSorLA(配列番号1)の細胞外ドメイン、それらのアイソフォームまたは断片である、実施形態3に記載の方法。
5.断片が、SorLAのN末端Vps10pドメインの断片(配列番号3)を含むか、前記断片である、実施形態4に記載の方法。
6.薬剤がSorLAプロペプチド(配列番号2)またはそれらの断片である、実施形態3に記載の方法。
7.配列番号1、2または3に対して少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号1、2または3に対して少なくとも85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する、実施形態2〜5のいずれか1つに記載の方法。
8.薬剤がGFRα1〜4受容体の細胞外ドメイン、それらのアイソフォームまたは断片から選択される、実施形態3に記載の方法。
9.GFRα受容体が配列番号4、5、6、7、8、9、10、11または12で定義した配列またはそれらの断片を含む、実施形態8に記載の方法。
10.配列番号4、5、6、7、7、8、9、10、11または12に対して少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号4、5、6、7、8、9、10、11または12に対して少なくとも85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する、実施形態8に記載の方法。
11.タンパク質が、ニューロテンシン(配列番号13)またはそれらの断片、例えば配列番号14または15で定義した断片を含むか、それらからなる、実施形態3に記載の方法。
12.タンパク質がGDNF、それらの断片またはアイソフォームである、実施形態3に記載の方法。
13.GDNFが配列番号16または18を含むか、それらからなる、実施形態12に記載の方法。
14.配列番号16または18に対して少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号16または18に対して少なくとも85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する、実施形態13に記載の方法。
15.タンパク質が、配列番号17で定義したような、GDNFのプロペプチドを含むか、それからなる、実施形態3に記載の方法。
16.配列番号17に対して少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号17に対して少なくとも85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する、実施形態15に記載の方法。
17.抗体がGFRα1、2、3または4の細胞外ドメイン上にエピトープを有する、実施形態3に記載の方法。
18.モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、実施形態8、9または10のいずれか1つに定義した配列のいずれかの中にエピトープを有する、実施形態17に記載の方法。
19.抗体がSorLAの細胞外ドメイン上にエピトープを有する、実施形態3に記載の方法。
20.モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、実施形態4、5、6または7のいずれか1つに定義した配列のいずれかの中にエピトープを有する、実施形態19に記載の方法。
21.実施形態1〜16のいずれか1つに定義した薬剤を1つまたは複数の医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物。
22.実施形態17〜20のいずれか1つに定義した抗体およびアジュバントを含む医薬組成物。
23.ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの生存を高めるための実施形態1〜20のいずれか1つに定義した薬剤または実施形態21および22のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
24.ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの喪失に伴った疾患、および/またはニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの生存が望まれる疾患の治療で使用するための実施形態1〜20で定義した薬剤または実施形態21および22のいずれか1つに記載の医薬組成物。
25.疾患が、傷害誘発性神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害(ADHD)、薬物乱用、不安障害、および/または双極性障害(躁うつ病)を含む群から選択される、実施形態24に記載の使用。
26.実施形態1〜20のいずれか1つに定義した薬剤または実施形態21もしくは22のいずれか1つに記載の医薬組成物の有効量を投与することによる、ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの喪失に伴った疾患、および/またはニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの生存が望まれる疾患を治療する方法。
27.実施形態25に記載の疾患を治療するための実施形態26に記載の方法。
28.実施形態24または25のいずれか1つに記載の疾患応答治療用医薬を調製するための実施形態1〜20のいずれか1つに記載の化合物または実施形態21および22のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
29.SorLAおよび/またはGDNFファミリーリガンド受容体を含む、SorLAとGDNFファミリーリガンド受容体(例えば、GFRα1、2、3または4)の間の相互作用を調節することが可能な結合パートナーを同定するためのインビトロアッセイまたはインビボアッセイ。
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SorLAおよびGFRα1をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞をDSP(Pierce)と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物は、Gammabindビーズ(GE Healthcare)に結合されているSorLAまたはGFRα1に対する抗体(R&D Systems)とインキュベートした。沈殿した複合体を、SDSローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、SorLA:GFRα1複合体の存在下で明らかにされた(図5A)。SorLAおよびGFRα1の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてCaHBS(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA、0.005%Tween−20)を使用する、表面プラズモン共鳴(Biacore、Sweden)を使用して証明した。Biacore(CM5、カタログ番号BR−1000−14)製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにNHS/EDC法を使用して活性化し、その後、SorLAでコーティングした(図5C)。
SorLAおよびGFRα2をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞をDSP(Pierce)と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物を、Gammabindビーズ(GE Healthcare)に結合されているGFRα2に対する抗体(R&D Systems)とインキュベートした。沈殿した複合体を、SDSローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、SorLA:GFRα2複合体の存在下で明らかにされた(図11A)。SorLAおよびGFRα2の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてCaHBS(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA、0.005%Tween−20)を使用する、表面プラズモン共鳴(Biacore、Sweden)を使用して証明した。Biacore(CM5、カタログ番号BR−1000−14)製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにNHS/EDC法を使用して活性化し、その後、SorLAでコーティングした。
SorLAおよびGFRα3をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞をDSP(Pierce)と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物を、Gammabindビーズ(GE Healthcare)に結合されているGFRα3に対する抗体(R&D Systems)とインキュベートした。沈殿した複合体を、SDSローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、SorLA:GFRα3複合体の存在下で明らかにされた(図11A)。SorLAおよびGFRα3の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてCaHBS(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA、0.005%Tween−20)を使用する、表面プラズモン共鳴(Biacore、Sweden)を使用して証明した。Biacore(CM5、カタログ番号BR−1000−14)製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにNHS/EDC法を使用して活性化し、その後、SorLAでコーティングした。
SorLAおよびGFRα4をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞をDSP(Pierce)と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物を、Gammabindビーズ(GE Healthcare)に結合されているGFRα4に対する抗体(R&D Systems)とインキュベートした。沈殿した複合体を、SDSローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、SorLA:GFRα4複合体の存在下で明らかにされた(図11A)。SorLAおよびGFRα4の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてCaHBS(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA、0.005%Tween−20)を使用する、表面プラズモン共鳴(Biacore、Sweden)を使用して証明した。Biacore(CM5、カタログ番号BR−1000−14)製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにNHS/EDC法を使用して活性化し、その後、SorLAでコーティングした。
SorLAおよびGDNFの細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてCaHBS(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA、0.005%Tween−20)を使用する、表面プラズモン共鳴(Biacore、Sweden)を使用して証明した。Biacore(CM5、カタログ番号BR−1000−14)製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにNHS/EDC法を使用して活性化し、その後、SorLAでコーティングした(図3)。
固定化タンパク質へのリガンド、例えば、小型有機分子、ペプチドまたはSorLA、GFRα1およびGDNFを含む(ただしこれらに限定されるものではない)可溶性受容体の直接結合の測定は、例えば、標準泳動バッファーとしてCaHBS(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA、0.005%Tween−20)を使用する、表面プラズモン共鳴(Biacore、Sweden)により行うことができる。そのような薬剤は、成熟GDNFのN末端(図17)またはGFRα1ドメイン1(図16)から得ることができる。Biacore(CM5、カタログ番号BR−1000−14)製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにNHS/EDC法を使用して活性化し、その後、SorLAでコーティングした。いくつかの様々な手法を用いることができる:候補薬剤は、結合シグナル(応答単位)を受容体の1つで固定化したチップと比較し、このシグナルを空のフローセルと比較することにより同定することができる。別の手法においては、既知リガンドの阻害は、推定阻害剤の不在下または存在下でモニターすることができる。シグナルの差は、アンタゴニストの阻害ポテンシャルを表す。回収されたデータは、Biaevaluationバージョン3.1プログラムを使用して、親和性評価および阻害ポテンシャルに関するセンサーグラムを適合することにより分析することができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、Vps10pドメイン受容体、リガンドまたは推定阻害剤が固相上に固定化される、別のアッセイへと容易に変換することができる。例えば、受容体は、50mM NaHCO3、pH9.6中、4℃で16時間インキュベーションすることにより、例えばNunc製のMaxisorpマイクロタイターウェル(カタログ番号439454)に固定化することができる。室温で2時間、5%ウシ血清アルブミン(Sigma、カタログ番号A9647)を使用してブロッキングした後、ウェルをMB緩衝液(10mM HEPES、pH7.4、140mM NaCl、220mM CaCl2、および1mM MgCl2)で3回洗浄し、各種濃度の候補阻害剤の不在下または存在下において、標識リガンド(例えば、ヨウ素化)とインキュベーションすることができる。インキュベーション(例えば4℃で一晩)の後、MB緩衝液で洗浄し、結合放射活性は10%SDSを添加することにより遊離される。ウシ血清アルブミンのみでコーティングしたウェルへのトレーサーの非特異的結合を測定し、結合実験で測定された値から減じることができる。結合データポイントは、GraphPad製のプリズムソフトウェア(バージョン4)を使用して、結合方程式に合わせることができる。同様に、アンタゴニストも標識化することが可能であり、固定化受容体への結合を直接測定することができる。さらに別の構成において、受容体、リガンドまたはアンタゴニストはシンチレーションビーズ上に固定化することが可能であり、受容体結合分子が放射活性を用いて標識化されている結合をシンチレーション近接アッセイにおいて測定することができる。
SorLA:GFRα1:GDNFレセプター複合体の実体に対するアンタゴニストは、複合体全体の阻害剤として作用することができる。したがって、例えばVps10pドメイン受容体実体に結合することが可能な薬剤についてスクリーニングすることに関連する。そのような方法は、本実施例に記載されている。Vps10pドメイン受容体ファミリーのメンバーによる結合、内在化またはシグナル伝達の測定は、細胞系で行うことができる。内生的に、または、例えば受容体のcDNAを含有するプラスミドとのトランスフェクション後に、受容体の1つを発現する細胞は、候補阻害剤/アンタゴニスト化合物の不在下および存在下のそれぞれにおいて、放射標識したリガンドとインキュベートすることができる。インキュベーション後、細胞を洗浄して非特異的結合を除去し、続いて回収することができる。候補アンタゴニスト/阻害剤の受容体への結合の程度は、当業者に公知の慣用の放射リガンドアッセイを使用することにより測定する。例えば、Bylund and Toews (1993) Am J Physiol. 265(5 Pt 1):L421-9 entitled 「Radioligand binding methods: practical guide and tips」を参照。同様に、細胞内取込/内在化は、Nykjaer et al (1992) FEBS 300:13-、およびNielsen et al (2001) EMBO Jに記載されているようにして測定することができる。
SY5Y神経芽細胞腫細胞は、SorLAアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、所定の時間GDNFの濃度を高めることにより刺激した。細胞を溶解させ、細胞溶解物は、Gammabindビーズ(GE Healthcare)に結合されたRet(R&D Systems)に対する抗体とインキュベートした。沈殿タンパク質を洗浄ビーズから溶出させ(酸性緩衝液、続いて中和)、リン酸化Retを、抗ホスホチロシン(Milipore)を使用して、ウェスタンブロッティングにより視覚化した(図9に示すとおり)。
SY5Y神経芽細胞腫細胞をトリプシン−EDTA処理により回収し、その後、1%グルタマックスならびに1%P/S(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を含有するフェノールレッド(LONZA)を含まないDMEMに再懸濁させた。細胞を、50μlの最終容量で96ウェルプレートのウェルあたり20000個細胞でプレーティングした。翌日、細胞を、SorLAアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、GDNF濃度を高めることにより刺激した。GDNFなどを添加した後の最終容量は100μlであった。各種類の試料は四連として調製した。細胞は、それらの通常のインキュベーター中で72時間インキュベートした。72時間後、MultiTox−Fluor Multiplex細胞毒性試験試薬(Promega)を調製し、製造者の添付技術書類による指示のとおり細胞に加えた。簡潔に説明すると、各試料について、アッセイバッファー100μl、GF−AFC基質0.1μlおよびビス−AAF−R110基質0.1μlを混合し、ウェルに加えた。240rpmの揺動シェーカー(Ika(登録商標)KS 260 Basic)上で1分間混合した後、プレートを37℃で30分間インキュベートした。その後、蛍光をWallac VICTOR3TM 1420多重標識カウンター(Perkin ElmerTM Lifesciences)で測定した。生存能力は400nmEx/505nmEmで測定した。シグナルは生存に正比例する。
主要ニューロンの培養物は野生型マウスの脳から調製する。生後0〜2日で脳を切開し、細胞を分離し、SorLAアンタゴニストまたはアゴニストの存在下または不在下において、例えば10ng/mlのGDNFの存在下でプレーティングする。インビトロで1〜2週間培養物を成熟させた後、生存ニューロンの数を記録した。
P0〜P2ラットの腹側被蓋領域から調製された主要ドーパミン作動性ニューロン。ラットの子の頭部を除去し、脳を単離し、冷却PBSに入れた。脳は腹側を下にして置いた。最初に脳全体の後ろから中脳屈曲部を切開し、二番目に吻側から屈曲部へ切開し、切片を平面に置いた。切片の腹面端部は視床下部の頂部に沿って切開され、次に、切片の腹面端部と脳室間孔のほぼ中間を切開した。組織をより小さな区分に切り、冷却L15培地(Gibco、Invitrogen)に置いた。組織を37℃で30分間、加温パパイン溶液(L15培地、2mM EDTA、20単位/mlパパイン(TMWorthington、Medinova)、0.5mMキヌレン酸およびNaOH(pHを約7に調整))とインキュベートした。培地を除去し、組織をニューロン培地(L−グルタミンを含まないNeurobasalTM培地(Gibco、Invitrogen)、FBS、B−27(Invitrogen)、glutamax(Invitrogen)、primocin(Amaxa)、5−フルオロデオキシウリジン(Sigma)およびウリジン(Sigma))中で穏やかに摩砕することにより粉砕した。ニューロンを沈降させ(800rpm、5分)、ペレットをニューロン培地で希釈し、10ng/mlのGDNFの存在下であって、SorLAアンタゴニストまたはアゴニストの存在下または不在下において、皮質グリア細胞の層上に置いた。ニューロンをインビトロで1週間37℃にてインキュベートし、その後、これらを室温で30分間、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した。その後、これらを、0.1%トリトンX−100を含有するPBS中で15分間2回洗浄し、続いて、20分間PBS中の10%FBSとインキュベーションした。その後、カバーガラスを4℃で一晩、10%FBSのPBS中の抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体(Pel freeze、1:1000)とインキュベートした。翌日、カバーガラスを0.1%トリトンX−100含有PBSで3回洗浄し、4℃で一晩、10%FBSのPBS中のAlexa−fluor(登録商標)488ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen、1:1000)とインキュベートした。その後、カバーガラスをPBS中の0.1%トリトンX−100で2×15分、PBSで1×15分、水で1×15分洗浄した。カバーガラスをDako Flurescent Mounting Medium(Dako、Denmark)とともにスライド上にマウントした。生存ニューロンの数を、チロシンヒドロキシラーゼのポジティブニューロンの数をカウントすることにより記録した(図12に示すとおり)。
マウスをSorLAアンタゴニストまたはアゴニストで1〜30日間前処理し、透明なPlexiglas領域(40×40×35cm)から構成されているオープンフィールド試験において、アンフェタミン誘導機能促進に関して試験した。領域は、Any−mazeトラッキングシステムの制御下のコンピューター連結ビデオカメラ下に、薄暗い部屋でセットアップした。マウスを領域の隅に置き、図13に示すように、それらマウスの活動を40分間セッションの間記録した。アンフェタミン(0.1〜10mg/kg)を腹腔内または静脈内に投与した。
野生型のSorLAトランスジェニックマウスの挙動を、高架型十字迷路において、不安神経症関連挙動に関して試験した。高架型十字迷路は、うつ病、躁病および不安神経症の関連挙動に関する実験モデルとして使用される。抗うつ薬または抗不安薬でマウスを治療すると、通常、移動距離、ライン交差の数、および入場回数および壁のない走行路での経過時間が増える。高架型十字迷路は床より40cm上に設定されており、15cmの高い不透明な壁のある2つの向かい合う壁のある走行路と同じ大きさ(35×5cm)の2つの向かい合う壁のない走行路から構成されている。高架型十字迷路は、Any−mazeトラッキングシステム制御下でコンピューター連結ビデオカメラの下に、薄暗い明かりのついた部屋でセットアップした。10分間の試験セッションを各マウスについて実施し、図14に記載したように、入場回数と、壁のない走行路における滞在時間を測定した。マウスをSorLAアンタゴニストまたはアゴニストで1〜30日間事前処置した、類似の実験を実施する。
5日間1日おきに1回、成体マウスを4mg/kgのアンフェタミンまたは生理食塩水で前処理し、また一方でSorLAアンタゴニストまたはアゴニストを用いて処置し、オープンフィールドでの自発運動に関して試験した。最後のアンフェタミン前処置の後、SorLAアンタゴニスト/アゴニストによる処置を1週間継続した。16日目に、すべてのマウスがアンフェタミン(2mg/kg)の投与注射を受ける感作に関する試験を実施し、オープンフィールドにおける自発運動について試験した。
成体マウスに、20mg/kgのMPTP(1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン、ドーパミン作動性ニューロンに選択的に毒性のある薬剤)をSorLAアンタゴニスト/アゴニストと一緒に、またはSorLAアンタゴニスト/アゴニストを使用せずに注射した。注射の1日前、および注射終了の2日後に、透明なPlexiglas領域(40×40×35cm)からなるオープンフィールド試験において、運動活性を記録した。領域は、Any−mazeトラッキングシステムの制御下でコンピューター連結ビデオカメラ下の薄暗い部屋でセットアップした。マウスを領域の隅に置き、マウスの活動を60分のセッションの間記録した。最後に、免疫組織化学を使用して各種の形態学的マーカー(例えば、チロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミン輸送体)を評価するために、マウスに4%パラホルムアルデヒドを潅流した。
神経芽細胞腫細胞をトリプシン−EDTA処理で回収した。10%FBSならびに1%P/S(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を含有するDMEM−F12培地に細胞を再懸濁し、6ウェルプレートに播種した。翌日、培地を除去し、SorLAアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、GDNFの濃度を上昇させる新しい培地で細胞をインキュベートした。細胞は、それらの通常のインキュベーター中で72時間インキュベートし、この後、カメラを連結した実体顕微鏡(ライカDC300)で細胞を視覚化した。神経突起伸長は、細胞直径より2倍長いプロセスとして神経突起を定義することにより記録した。
結果として、使用前に溶解される凍結乾燥されたもの、または、非経口投与経路(例えば、静脈内(I.V.)、筋肉内(I.M.)もしくは皮下(S.C.))で投与可能であるような直ぐに使用可能な溶液としてのペプチド/ポリペプチド性質(可能な抗体系)の活性剤が開発された。固体投与形態の粘膜施用もまた、この場合における可能性を示す。得られた開発活性剤が化学的性質である場合、経口投与用の製剤ならびに例えばS.C.またはI.M.で使用するための有望な経路用の製剤が調製される。開発された薬は、予防的目的で使用されるか、長期治療のために長期間投与される。この場合、活性剤は、精神障害および行動障害の症状に至る、起こる分子的事象のプロセスに干渉し、それにより阻害する。薬が使用されるべきである精神障害および行動障害を発症する傾向にある患者を分析するために遺伝子検査が開発される場合においては、そのような診断法と関連して可能である。精神障害および行動障害が発症した場合、薬を利用する長期の治療は別の可能性を示す。論理的根拠は、その病気の症状に至る分子的事象をコンスタントに抑制することができることである。最後に、本薬は、神経系障害または精神障害および行動障害の慣用の治療法、例えば、抗精神病薬、抗うつ薬またはリチウムと一緒に併用投与することが可能である。
GDNFまたは別のGFLは、2〜120分間、SorLAアゴニスト/アンタゴニスト(例えば抗体)の存在下または不在下において、SorLAおよびGFRα受容体の両方を発現する細胞とインキュベートした。GDNFまたは別のGFLは、蛍光タグまたは蛍光抗体のいずれかにより標識化した。続いて、図6および図11および図21に示したように、内在化GDNFまたはGFLの量を、共焦点顕微鏡法を使用して評価した。
Claims (18)
- SorLAおよびGFRα1の間の相互作用を調節または阻害することにより、必要とされる患者の脳におけるGDNFの細胞外レベルを高める方法。
- GDNFの内在化および/または分解が阻害される、請求項1に記載の方法。
- SorLAおよびGFRα1の間の相互作用を調節することによるドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存を高める方法。
- 傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害(ADHD)、薬物乱用、不安障害、および/または双極性障害(躁うつ病)からなる群から選択される疾患を治療するための請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- SorLAおよびGFRα1の間の相互作用を調節および/または阻害するために使用される薬剤がSorLAまたはGFRα1に対する抗体である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がSorLAまたはGFRα1の細胞外ドメイン上の1つまたは複数の結合部位に結合する、請求項5に記載の方法。
- 結合部位が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および/または配列番号7を含むか、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および/または配列番号7に対して少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する、請求項6に記載の方法。
- 抗体がポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項5に記載の方法。
- 抗体が単離されているか、組換えである、請求項5に記載の方法。
- 抗体がヒト化抗体、キメラ抗体または単鎖抗体である、請求項5に記載の方法。
- 請求項5〜10のいずれか1項に記載の抗体および担体を含む医薬組成物。
- 請求項5〜10のいずれか1項に記載の抗体または請求項11に記載の医薬組成物の有効量を投与することによる、ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの喪失に伴った疾患の治療のため、および/またはドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存もしくは保護のための方法。
- 傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害(ADHD)、薬物乱用、不安障害、および/または双極性障害(躁うつ病)からなる群から選択される疾患を治療するための請求項12に記載の方法。
- SorLAおよびGFRα1の間の相互作用を調節することにより患者の脳におけるGDNFの細胞外レベルを高めるための、請求項5〜10のいずれか1項に記載の抗体または請求項11に記載の医薬組成物。
- GDNFの内在化および/または分解が阻害される、請求項14に記載の抗体または医薬組成物。
- ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの喪失に伴った疾患を治療するため、および/またはドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存もしくは保護のための、請求項5〜10のいずれか1項に記載の抗体または請求項11に記載の医薬組成物。
- 傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害(ADHD)、薬物乱用、不安障害、および/または双極性障害(躁うつ病)からなる群から選択される疾患を治療するための請求項14〜16に記載の抗体または医薬組成物。
- 請求項14〜17のいずれか1項に記載の疾患を治療するための薬を調製するための、請求項5〜10のいずれか1項に記載の抗体または請求項11に記載の医薬組成物の使用。
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