CN103339149A - SorLA和GDNF-家族配体受体之间的相互作用的调节 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用来提高神经元存活的方法。用于调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用的试剂选自蛋白质、肽、抗体或小有机化合物。本发明还涉及包含这些试剂的药物组合物以及所述试剂或药物组合物用于治疗与神经元损失相关和/或需要神经元存活的疾病的用途。

Description

SorLA和GDNF-家族配体受体之间的相互作用的调节

发明领域

本发明涉及Vps10p-结构域受体SorLA及其与GDNF-家族配体受体的相互作用的调节。能够调节或抑制这种相互作用的试剂在神经、精神和行为障碍的治疗中具有潜力。本发明提供能够作为经SorLA的信号传递（包括但不限于逆向运输和GDNF的分选）的调节剂的这类配体。该试剂因此根据神经、精神和行为障碍的具体类型选自拮抗剂/抑制剂和激动剂。 

本发明还涉及用于识别可调节SorLA和GDNF-家族配体受体之间的相互作用的新型试剂的检测法。 

发明背景 

神经系统疾病，特别是精神和行为障碍属于残疾的主因，其在全球15岁及以上的成年人中占有残疾的生命中的年数的大于37%，并且是可能在未来造成越来越严重的健康、社交和经济问题的疾病（Lopez和Murray1998）。 

在例如来自世界卫生组织的ICD10,第VI章,Blocks G00-G99(Diseases of the nervous system)中定义了神经系统疾病，并包括例如神经变性疾病，如帕金森氏病。 

在例如来自世界卫生组织的ICD10,第V章,Blocks F00-F99(Mental and behavioral disorders)中定义了精神和行为障碍，并包括例如重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和双相障碍（躁郁症）。 

这些障碍是常见、严重、慢性和通常威胁生命的疾病。自杀估计是多达15%的重度抑郁症和双相障碍之类障碍的患者的死因，并已经识别出许多其它有害的健康相关效应（Michelson,Stratakis等人1996；Musselman,Evans等人1998；Ciechanowski,Katon等人2000；Schulz,Beach等人2000；Kupfer2005）。越来越认识到，这些障碍中的一些是对多个器官系统具有有害作用的全身疾病。 

突触可塑性和传递中的改变的神经元活性、存活，特别是受损被认为构成神经元疾病的病理生理学。神经递质多巴胺特别涉及几种常见的脑功能障碍，尤其是帕金森氏病、精神分裂症、注意力缺陷和多动症以及药物依赖和某些内分泌紊乱。临床上用于治疗这些病症的许多药物通过影响传递来发挥作用。有三种主要的多巴胺能通路。在这种通路的多巴胺能神经元的运动控制和选择性变性中重要的黑质纹状体通路是帕金森氏病的标志。中脑边缘/中脑皮层通路从中脑中的细胞组行进至边缘系统的一部分，尤其是伏核，和行进至皮层；它 们涉及在情绪和药物诱发的回馈系统中。最后，从下丘脑行进至垂体腺的结节垂体束通路，它们调节其分泌。 

神经营养因子是神经元“存活（stay alive）”信号的有力介质并对突触传递和可塑性具有显著作用。神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）是一组相关的同源二聚体神经营养因子之一，其还包括neuturin（NRTN）、persephin（PSPN）和artemin（ARTN）。这些一起被称作GDNF家族配体（GFL）。GDNF遍布发育的神经系统表达，但在成人大脑中其在纹状体、丘脑、皮层和海马体的神经元中特别高度表达。由于逆向运输，在黑质中还发现显著量的源于纹状体的GDNF。表达在星形细胞和雪旺细胞中以及在非神经元组织，如肾、睾丸和骨骼肌中也是明确的。 

GDNF在功能上与帕金森氏病相关（Lin等人,1993）。帕金森氏病的特征在于黑质的多巴胺能神经元的进行性损失和纹状体的多巴胺能神经元支配的随后损失。这一通路是自主运动行为所必需的。随着黑质纹状体多巴胺能通路选择性退化，基底核中的多巴胺复发。在神经元损失超过50-60%以上时，其表现出基本运动症状，即震颤、运动不能、僵直、姿势不稳定和运动徐缓。这些运动症状大部分可通过多巴胺替代几乎完全逆转（Sian等人,1999）。在死后的人帕金森氏病大脑的黑质中的神经营养因子分布的研究中，NGF、NT-3和NT-4几乎或完全没有表现出改变，而GDNF、BDNF和CNTF在帕金森氏病大脑中与年龄相当的对照组相比显著减少；同时GDNF消耗明显更多（Chauhan等人,2001）。该研究集中于神经纤维网（即在由交织轴突、树突和神经胶质细胞构成的灰质中的神经元之间的致密间隙）中的神经元水平和浓度。明显地，GDNF在这两个区域中都极大减少，但在神经纤维网中相对较多。没有充分理解帕金森氏病的分子病因学，但似乎涉及GDNF。 

GDNF信号传递通过其与两种受体的相互作用介导。活性二聚体首先结合其主要受体GFRα1，其用于使该配体富集在细胞膜上，所得四聚(2:2)复合物随后与同源二聚体受体酪氨酸激酶RET相互作用以诱发RET磷酸化和形成信号传递复合物。Neuturin、persephin和artemin使用类似的信号转导机制，但这三者各自在靶向Ret受体之前结合单独类型（2-4）的GFRα。GFRα受体通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚连接到质膜上，但可通过未知的磷脂酶或蛋白酶从细胞表面释放。可溶GFRα1也可刺激RET磷酸化，但由GDNF与膜结合或可溶的GFRα1一起引发的下游信号通路不同。 

GDNF与其相关物一起在运动神经元的存活中、在交感和感觉神经元的发育中和在海马突触发生中起到重要作用。其促进成人脑损伤后的多巴胺能神经元的存活和再生长并且是成人多巴胺神经元的维持和存活所必需的。因此，GDNF是用于治疗帕金森氏病的有吸引力 的靶标。但是，在胚胎发生过程中多巴胺能系统的发育不需要GDNF、GFRα1和Ret。相反，GDNF或受体的遗传破坏在老年小鼠中造成黑质纹状体系统的加速变性。在帕金森氏病与GDNF系统之间没有得出遗传相关性，而几个报告已表明GDNF信号传导与注意力缺陷和多动症(ADHD)（Syed等人2007Am J Med Genet）和精神分裂症（Souza等人2010JPsychiatr Res）（Williams等人2007Schizophr Res）的发展之间的遗传连锁。令人感兴趣的是，腹侧被盖区和伏核中的GDNF信号传导增强降低了啮齿动物对精神兴奋药如可卡因的响应和敏感性，表明GDNF在对药物滥用的行为响应中起到关键作用。尽管Ret是公认的GDNF信号传导受体，但许多表达GFRα1的细胞不表达Ret，表明存在另外的GDNF/GFRα1受体。 

RET、GFRα1和GDNF敲除小鼠据报道共享明显类似的表型，可能是这三种蛋白质参与相同信号级联的后果。实际上，缺乏GDNF（Moore等人,1996）、GFRα1（Cacalano等人,1998；Enomoto等人,1998；Tomac等人,2000）或Ret（Durbec等人,1996；Schuchardt等人,1994）的小鼠由于肾发育不全和若干副交感神经元以及整个肠神经系统的缺乏而在出生后死亡。令人惊讶地，除GFRα1敲除小鼠的PNS和CNS中的许多其它神经元集群外的中脑多巴胺能神经元在出生时没有或几乎没有表现出异常（Tomac等人,2000）。根据这些敲除报告，尽管衍生自神经元脊（crest）的神经元谱系，例如大多数肠神经系统和颈上神经节的正常发育依赖于功能Ret，但GDNF、GFRα1和RET看起来没有参与一般而言的神经元发育，因为据报道在敲除胚胎和新生小鼠中不存在这些神经元（Durbec等人,1996）。由于敲除小鼠在出生后不久死亡，未评估耗损后的CNS长期后果。采用其它方法研究在婴幼期和成年期的后果。杂合GFRα1+/-小鼠存活至成年期并与野生型同窝出生仔畜相比表现出降低的GDNF-介导的神经保护，表现为诱发脑缺血。由此表明可达的GFRα1水平是GDNF效率中的限制因素（Tomac等人,2000）。对GFRα1+/-杂合子小鼠的研究揭示纹状体中的多巴胺的减少和与运动活性下降相伴的黑质的多巴胺能神经元的年龄相关减少（Zaman等人,2008）。区域选择性的RET切除造成特别在衰老小鼠的黑质中的巴胺能神经元的进行性损失（Kramer等人,2007）。黑质纹状体神经支配的损失间接影响多巴胺能纹状体神经元，以造成纹状体中的神经末梢的显著年龄相关性退化和降低的诱发多巴胺释放水平。RET因此对维持黑质纹状体多巴胺系统而言是关键的（Kramer等人,2007）。同样地，在具有GDNF无效突变的中脑多巴胺能神经元的连续出生后发育的研究中使用在中脑中植入了胚胎神经GDNF-/-组织的成年野生型小鼠（Granholm等人,2000）。GDNF-/-组织植入造成多巴胺能神经元数量减少和神经突增生，该研究表明，GDNF对中脑多巴胺能神经元的长 期存活而言是关键的（Granholm等人,2000）。黑质纹状体多巴胺能系统功能的年龄相关性下降是GDNF信号传导通路受损的小鼠共有的，这种表型类似于与帕金森氏病的早期相关的改变。 

GFL-GFRα-RET内聚性（cohesiveness）的指示是成年小鼠的CNS中的补充表达模式。在此，表达RET的GDNF和NRTN响应脑区共同表达GFRα1或GFRα2。反之亦然，接收来自表达GFRα1或GFRα2的神经元的投射的几个区域具有内源性GDNF和NRTN（Golden等人,1998）。该配对是特异性的，因为GFL和相应的GFRα敲除小鼠表现出非常类似的表型（Airaksinen等人,1999）。但是，关于颈上交感神经节的神经元，GDNF-/-、GFRα1-/-和RET-/-小鼠的表型相冲突。在RET敲除小鼠中完全没有这些神经元（Durbec等人,1996）；它们在GDNF-/-新生小鼠中仅在较低程度上受影响（神经元数量减少35%）（Moore等人,1996），而它们在GFRα1敲除小鼠中看起来正常和不受影响（Enomoto等人,1998）。这可通过这些神经元中的GFLs和GFRαs之间的过剩性解释，因为颈上交感神经节神经元取决于对形成、迁移和出生后存活的ARTN-GFRα3信号传导（Nishino等人,1999）。因此，GFRα3-/-小鼠能活能育，但表现出眼睑下垂的明显表型。尽管在多种多样的神经节中广泛表达GFRα3，但GFRα3-介导的信号传导在其它PNS神经节中不是决定性的（Nishino等人,1999）。GFRα2是几种神经节后副交感神经元发育中的基本因子，且GFRα2去除由于失效的胆碱能纤维神经支配而造成泪腺和唾液腺功能障碍以及小肠肌丛（即控制胃肠道运动性的肠神经系统的一部分）缺陷（Rossi等人,1999）。GFRα2-/-小鼠像GFRα3敲除小鼠一样可活（Rossi等人,1999），并且没有表现出CNA缺陷，尽管在成年CNS中遍布表达NRTN和GFRα2（Golden等人,1998）。在GFL或GFRα敲除小鼠的CNS中仅观察到次要表型的事实可归因于中枢神经元的营养过剩。 

总之，GDNF、neuturin、artemin或persephin诱发的信号传递故障在功能上或基因上与许多病症，尤其是运动神经元病、感觉再生和神经性疼痛、缺血、癫痫、帕金森氏病、药物滥用和精神分裂症相关联。 

SorLA 

分选蛋白相关受体，缩写为SorLA(Swiss prot ID no Q92673)，也被称作LR11，是250-kDa的1型膜蛋白和在Vps10p-结构域受体家族中确定的第二个成员。这一家族中的所有受体共有如下结构特征：大约600-氨基酸N-末端结构域，与构成酵母分选受体Vps10p的腔部分的两个结构域的每一个具有强相似性（Marcusson,Horazdovsky等人1994）。在配体中尤其结合神经营养因子和神经肽的Vps10p-结构域（Vps10p-D）（Mazella,Zsurger等人1998； Munck Petersen,Nielsen等人1999；Nykjaer,Lee等人2004；Westergaard,Sorensen等人2004；Teng,Teng等人2005）构成最初确定的成员Sortilin的整个腔部分并通过酶促前肽裂解活化以供配体结合（Mazella,Zsurger等人1998；Munck Petersen,Nielsen等人1999）。其腔结构域仅由Vps10p结构域构成的SorLA，类似于选蛋白，作为前受体（proreceptor）合成，其在晚期高尔基体隔室中被弗林蛋白酶裂解。已经证实，前肽裂解决定了用于神经肽和受体相关蛋白的前肽可抑制结合的Vps10p结构域。在SEQ ID NO3中给出SorLA vps10-p结构域的序列。已经证实（Jacobsen,Madsen等人2001），在位于其它腔结构域中的位点发生未受前肽抑制的受体-相关蛋白、载脂蛋白E和脂蛋白脂肪酶的积极结合。在转染细胞中，在能够介导胞吞作用的细胞表面上表达大约10%的全长SorLA。在晚期高尔基体隔室中发现主要受体库并已经表明与新合成的配体的相互作用。在发育过程中和在成年生物中都在遍布神经系统的不同细胞类型中高度表达SorLA（Kanaki,Bujo等人1998；Motoi,Aizawa等人1999；Offe,Dodson等人2006）。有趣地是，在散发形式的阿尔茨海默氏症中SorLA水平降低（Scherzer,Offe等人2004；Dodson,Gearing等人2006；Sager,Wuu等人2007），且SorLA基因中的遗传突变在基因上与迟发性阿尔茨海默氏症相关联（Rogaeva,Meng等人2007）。重要地，SorLA已显示介导淀粉样前体蛋白的高亲和力结合和分选并提供防止Aβ生成（Andersen,Reiche等人2005；Offe,Dodson等人2006；Spoelgen,von Arnim等人2006；Rogaeva,Meng等人2007）。 

尽管许多药物已可用于治疗神经、精神和行为障碍，但都具有复杂的间接作用机制并旨在减轻症状而非治疗基础病因。相反，通常相信，应开发靶向调节突触可塑性或神经元存活的信号通路的药物作为神经、精神和行为障碍的长期治疗（Manji,Drevets等人2001）。大量实验和临床数据表明GDNF信号传导在精神和行为障碍中，笼统而言在神经系统障碍中的中心功能。例如，GDNF或GFRα1-3基因中的多态性与精神分裂症相关，且GDNF多态性与注意力缺陷和多动症相关。此外，改变的GDNF血清水平与双相障碍相关。 

帕金森氏病是以归因于所选神经元，主要是致密部和黑质内的中脑多巴胺能神经元的进行性死亡的运动和认知功能受损为特征的神经变性疾病。这造成降低的多巴胺水平（Davie2008中综述）。当前帕金森氏病疗法仅是症状疗法，因为基础的神经元变性仍在继续。这种姑息疗法包括与多巴胺代谢的各种抑制剂联合施用多巴胺激动剂和LDOPA。GDNF已显示对多巴胺能神经元具有神经保护和神经再生作用（Beck等人1995；Kearns等人1995；Lin等人1993；Sauer等人1995），其已被视为对帕金森氏病的一种疗法。在帕金森氏病的MPTP-和6-OHDA-损伤动物模型中已表现出GDNF的积极作用，其中GDNF据显 示促进中脑多巴胺能神经元的存活（Gash等人1998；Tomac等人1995）。脑内GDNF注入帕金森病猕猴的实验揭示帕金森氏病的三种主要症状，即运动徐缓、僵直和姿势不稳的显著缓解（Gash等人,1996）。GDNF接受者具有中脑多巴胺能神经元的显著增强的多巴胺水平、纤维密度和细胞尺寸，且明显地，黑质中的多巴胺能神经元数量提高。GDNF疗法的问题是递送，因为GDNF难以渗透血脑屏障。在帕金森氏病啮齿动物和猴子中尝试基因疗法，具有积极结果（Zurn等人,2001）。通过包囊的基因工程细胞系递送的GDNF导致持续释放低水平GDNF和随后保护黑质多巴胺能神经元和行为复原。此外，通过慢病毒载体体系递送GDNF表明黑质的神经元的再生，以致帕金森氏病的功能缺陷逆转。但是，作为帕金森氏病疗法测试GDNF的临床试验结果具有不同结果。脑室内输注GDNF没有在帕金森氏病患者中产生症状益处并与许多不良副作用，包括恶心、幻觉和抑郁相关联（Nutt等人2003）。而将GDNF施用到纹状体中与显著的临床益处相关联（Gill等人2003），但是，在双盲的安慰剂对照试验中不能证实这些结果（Lang等人2006）。尽管临床试验由于获得不同结果而是非结论性的，但GDNF仍被视为帕金森氏病的潜在疗法，但必须克服几个障碍。这些包括GDNF的递送：其需要穿透血脑屏障，GDNF需要扩散到适当的靶并且必须使非靶递送的效应最小化以降低不良副作用。 

发明概述 

本发明涉及通过调节SorLA与GDNF-家族配体受体，如GFRα1、2、3和/或4受体之间的相互作用来提高神经元，如多巴胺能神经元的存活的方法。根据一个实施方案，可通过调节或抑制SorLA与GFRα1之间的相互作用来提高需要其的患者脑中的GDNF细胞外水平，或抑制GDNF的内化和/或退化。 

本发明特别涉及一种方法，其中用于调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用的试剂选自蛋白质、肽、抗体或小有机化合物。 

本发明还涉及包含与一种或多种可药用载体或稀释剂结合或与佐剂结合的这样的试剂的药物组合物。 

另外，本发明涉及这样的试剂或药物组合物用于提高特别是在包括如下疾病中的神经元，例如多巴胺能神经元的存活的用途:损伤诱导的神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍、和/或双相障碍（躁郁症）。 

最后，本发明涉及用于确定能够抑制SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用 的试剂的各种检测法。 

附图简述 

图1.GDNF家族配体信号传导 

图2.Vps10p-结构域受体的域结构 

图3.SorLA选择性结合GDNF而非其它GDNF-家族配体 

(A)描绘SorLA的域结构。(B)GDNF以如SPR所示的浓度依赖性方式结合到固定化SorLA上。计算出的KD为3-8nM。(C)SorLA选择性结合到GDNF而非其它GDNF家族配体artemin、neuturin和persephin上。所用神经营养因子浓度为20nM。(D)由GDNF的成熟部分而非GDNF前肽(GDNFpro)介导该相互作用。显示100nM配体浓度的感应图。(E)过量SorLA前肽（SorLApro,10μM）部分抑制GDNF结合（100nM）。(F)过量神经降压素（NT,20μM）完全抑制GDNF的结合（50nM）。(G-H)通过293细胞或稳定表达SorLA的293细胞内化50nM GDNF。内化的GDNF（绿色）通过免疫荧光法直观化。(I)通过过量神经降压素（NT,20μM）抑制GDNF内化。 

图4.SorLA和GFRα1协同吸收GDNF 

(A)通过免疫荧光法目测SorLA在45分钟期间内化的GDNF（50nM）。但是，使用10nMGDNF无法检测出内化。GDNF（50nM）没有被表达GFRα1的细胞内化，而是保持结合在表面上。(B)表达SorLA和GFRα1的细胞将GDNF内化至很大程度。(C)SorLA和GFRα1从表面内化GDNF（10nM）的过程的时间进程。 

图5.SorLA和GFRα1形成细胞表面GDNF受体复合物 

(A)如SorLA与来自表达这两种受体的细胞的GFRα1的共免疫沉淀所示，SorLA直接与细胞中的GFRα1相互作用。(B)使用抗胞外域的抗体和荧光标记第二抗体，非透化固定细胞中的SorLA(接受体)与GFRα1(供体)之间的细胞表面相互作用的荧光共振能量转移(FRET)分析。显示出代表性细胞。(C)细胞表面SorLA/GFRα1复合物形成是高度特异性的。在所有FRET通道图中在尺寸为5x5像素的感兴趣区域（ROI）内计算平均E_app%值并作为ROIs的相应平均接受体信号的函数绘图。E_app%对接受体信号的接近恒定的依赖性表明特异性相互作用。(D)显示E_app%值的正态分布的直方图，SorLA/GFRα1相互作用的平均值为16%（黑色直方图）。为了比较，在稳定转染的细胞中测量SorLA和Ret的E_app%值（灰色直方图）。平均E_app%值为6%，表明潜在的SorLA/Ret相互作用不是特异性的。(E)GFRα1以浓度依赖性方式结合到固定化SorLA胞外域上，KD为大约6nM。(F)GFRα1而非Ret胞外域（各200nM）与SorLA的特异性相互作用。(G)与SorLA/GDNF相互作用不同，过量神 经降压素（NT,20μM）没有抑制通过SorLA结合GFRα1（200nM）。(H)过量SorLA前肽（5μM）抑制GFRα1（200nM）结合到SorLA上。 

图6.通过SorLA逆行分选GFRα1/GDNF 

(A)GFRα1（绿色）在SorLA存在下随时间经过从细胞表面内化。(B)GDNF的存在看起来增强该内化。(C)单独的GFRα1在实验过程中没有内化。(D)SorLA/GFRα1相互作用在低pH下稳定，表明该复合物在内体pH下存留。(E)如50nM GDNF和50nM GFRα1与固定化SorLA的结合的SPR分析所示，SorLA/GDNF和SorLA/GFRα1不是竞争性相互作用。 

图7.SorLA调节GFRα1亚细胞定位 

(A)SorLA的存在造成GFRα1在稳定转染的细胞中的更多囊泡状定位。(B)表面生物素化实验，其显示表面局域化的GFRα1在表达SorLA的细胞中的减少。(C)如通过蔗糖梯度离心评估，SorLA降低含有flotilin（脂质筏标记物）的级分中的GFRα1的相对量。 

图8.SorLA破坏Ret表面群集 

(A)如平衡梯度离心所示，SorLA的过量表达改变内源性Ret在SY5Y成神经细胞瘤细胞中的亚细胞定位。(B)非透化的分化SY5Y细胞的Ret染色，表明在野生型SorLA过量表达时，而非通过SorLA deltatail的过量表达，表面局域化的Ret簇的存在消失。(C)表达内源性Ret和一些SorLA、过量表达野生型SorLA或缺乏胞质尾区的C-末端截断的SorLA变体（SorLA deltatail）的分化成神经细胞瘤(SY5Y)细胞的免疫荧光染色。在非转染细胞中，在强染色的分散簇中观察到内源性Ret。但是，SorLA过量表达完全破坏Ret群集。SorLA胞质尾区的截断恢复Ret群集。 

图9.SorLA调节Ret信号传导和下游功能 

(A)用6nM GDNF+/-6nM可溶GFRα1刺激SY5Y成神经细胞瘤细胞0、15和45分钟。Ret使用抗-Ret抗体免疫沉淀并通过使用抗-磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹法分析。(B)使用过量表达SorLA的成神经细胞瘤细胞的类似实验。(C)在实验过程中通过10μg/ml抗-SorLA抗体的存在恢复Ret磷酸化的SorLAs抑制。(D)通过过量前肽(SorLApro)的存在抑制内源性SorLA提高了成神经细胞瘤细胞的存活，而过量表达(SorLA)造成降低的存活。(E)通过过量前肽抑制SorLA提高了成神经细胞瘤细胞的增殖。(F)SorLA的过量表达抑制了GDNF诱导的而非视黄酸(RA)诱导的神经突增生。 

图10.SorLA调节脑中各处的GFRα1和Ret亚细胞定位 

(A)免疫印迹法显示，SorLA在年轻和年老小鼠的整个中枢神经系统中表达。(B)显示在围 绕皮层各处的神经元胞体的囊泡中的SorLA存在的免疫组织化学。(C)通过来自野生型或SorLA-/-小鼠的脑匀浆的蔗糖梯度离心评估的SorLA-/-脑中的GFRα1的改变的亚细胞定位。(D)显示SorLA-/-脑中的Ret的改变的亚细胞定位的类似实验。 

图11.SorLA是GFRα的一般分选受体 

(A)用GFRα1-4如所示短暂转染稳定表达SorLA的细胞，其随后分别使用抗-GFRα1、-2、-3和-4免疫沉淀，接着使用抗-SorLA进行免疫印迹法。(B)GFRα2（绿色）在SorLA存在下的逆行分选。(C)使用蔗糖梯度离心评估的SorLA-/-脑中的GFRα2的改变的亚细胞定位。 

图12.SorLA抑制提高GDNF-诱导的多巴胺能神经元存活 

(A)对黑质的免疫组织化学，其显示SorLA（绿色）在多巴胺能神经元（红色）中的存在。(B)在神经胶质细胞层上生长的多巴胺能神经元（红色）的原代培养物。在神经胶质和神经元中都表达SorLA。(C)SorLA和GDNF在原代多巴胺能神经元的神经元和神经胶质中的共定位。(D)SorLA和GFRα1在原代多巴胺能神经元的神经元和神经胶质中的共定位。(E)原代多巴胺能神经元的存活需要GDNF并受抗-SorLA抗体促进。 

图13.SorLA-/-小鼠表现出机能亢进和对安非他明的不敏感性 

(A)在旷场测试时SorLA-/-小鼠过度活跃。年龄逆转过度活跃。(B)年轻和年老SorLA-/-小鼠在旷场中在20分钟过程中的轨迹图。(C)SorLA-/-小鼠对10mg/kg安非他明不敏感。(D)在注射盐水或安非他明后幼年（小于8周大）野生型和SorLA-/-小鼠在旷场中在40分钟过程中的轨迹图。(E)在注射盐水或安非他明后成年（大于12周大）野生型和SorLA-/-小鼠在旷场中在40分钟过程中的轨迹图。 

图14.SorLA-/-小鼠表现出提高的冒险行为和注意力缺陷 

(A)在高架十字迷宫中测试时SorLA-/-小鼠过度活跃。(B)SorLA-/-小鼠在高架十字迷宫中的臂之间进行更多离开次数。(C)与在臂之间的总离开次数相比，SorLA-/-小鼠增加开臂中的进入次数。(D)SorLA-/-小鼠在开臂中度过的时间百分比提高。(E)野生型(n=23)和SorLA-/-(n=12)小鼠从高架十字迷宫上的跌落次数。(F)在高架十字迷宫中测试10分钟的野生型和SorLA-/-小鼠的轨迹图。 

图15.描述通过SorLA逆行分选GDNF受体的假想模型 

图16.GFRα1结构域1的截断导致对SorLA降低的亲和力。 

(A)可溶全长GFRα1（sGF Rα1FL）以浓度依赖性方式结合到SorLA上，估计的Kd=12nM。(B)GFRα1由三个同源结构域构成。缺乏与结构域1对应的序列拉伸的N-末 端截断的可溶GFRα1变体（s GFRα1Δ结构域1）结合固定化SorLA，Kd=120nM。 

图17.成熟GDNF的N-末端38氨基酸结合到SorLA上 

(A)GST与GDNF前肽（GDNFpropep）、成熟GDNF的N-末端38氨基酸（GDNFN-term）或成熟GDNF的前38个氨基酸之前的GDNF前肽（GDNFN-term propep）之间的融合蛋白结合到固定化SorLA上。包括单独的GST作为阴性对照。(B)包含成熟GDNF的前38个氨基酸的肽以浓度依赖性方式结合到SorLA上。 

图18.SorLA是CNS中的GDNF内化受体 

(A)皮质神经胶质细胞的原代培养物表达高水平的SorLA。(B)GDNF（10nM,15min）被来自野生型而非Sorl1-/-小鼠的神经胶质细胞内化。 

图19.GDNF，而非GFRα1被分类为是造成退化的溶酶体 

(A)溶酶体退化的抑制提高表达SorLA和GFRα1的细胞中的内化GDNF水平。(B-C)如通过代谢标记和接着脉冲追踪分析评估的在不存在或存在SorLA的情况下的GFRα1的逆转（Turnover）。 

图20.SorLA敲除小鼠中的提高的GDNF水平 

在来自野生型和Sorl1敲除小鼠的组织中通过ELISA测得的GDNF水平。GDNF在敲除动物的VTA和纹状体中增加（P=0.01，n=3；各自包含三个动物的库）。 

图21.通过SorLA功能阻断抗体抑制GDNF内化和退化。(A)表达GFRa1和SorLA的293细胞用非特异性兔IgG（10ug/ml）预培养2小时，随后用GDNF（10nM）和兔IgG培养15分钟。细胞随后使用GDNF抗体和荧光标记的第二抗体固定和染色。(B)使用针对SorLA胞外域产生的兔多克隆抗体的类似实验。抗-SorLA IgG的存在提高表面GDNF免疫荧光。 

发明详述 

定义

佐剂:其与施用的免疫原决定簇/抗原的混合物提高或改变对所述决定簇的免疫响应的任何物质。 

亲和力:配体与其结合位点的相互作用可以以结合亲和力表征。通常，高亲和力配体结合源于配体与其受体之间的较大分子间力，而低亲和力配体结合涉及配体与其受体之间的较小分子间力。通常，高亲和力结合涉及比低亲和力结合的情况中配体在其受体结合位点的较长停留时间。当一些结合能可用于造成受体中的构象变化时，配体与受体的高亲和力结合通常在生理学上重要，以致相关离子通道或酶的行为改变。可结合到受体上、改变受体的功 能并引发生理学响应的配体被称作该受体的激动剂。可以就可引发多少生理学响应和产生该生理学响应所需的激动剂浓度表征激动剂与受体的结合。高亲和力配体结合意味着相对较低的配体浓度足以最大占据配体结合位点和引发生理学响应。低亲和力结合意味着在最大占据结合位点并实现对配体的最大生理学响应之前需要相对较高的配体浓度。常常就占据一半受体结合位点时的配体浓度（被称作离解常数（kd））表征配体结合。亲和力也是受体与它们的配体之间，例如抗体与其抗原之间的结合强度。 

激动剂:激动剂是能够提高或实现受体活性的化合物。 

拮抗剂:拮抗剂在这种情况下与抑制剂同义。拮抗剂是能够降低效应物，如受体的活性的化合物。 

具体而言，对SorLA或GDNF-家族配体受体（GFRα1-4）的激动剂或拮抗剂可结合至它们的胞外域，例如介导SorLA与GDNF-家族配体受体（例如如SEQ ID NO5或7中给出）之间的特异性结合的结构域。能够调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用的试剂可包括SorLA或GDNF-家族配体受体的可溶片段、针对各受体的抗体、天然结合伴侣，如GDNF或神经降压素、或合成小有机化合物。 

抗体:本文所述的术语“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段（即“抗原结合部分”）或其单链。 

“全抗体”是指包含通过双硫键互连的至少两个重（H）链和两个轻（L）链的糖蛋白，或其抗原结合部分。各重链由重链可变区（在本文中缩写为V_H）和重链恒定区（在本文中缩写为C_H）构成。各轻链由轻链可变区（在本文中缩写为VL）和轻链恒定区（在本文中缩写为C_L）构成。V_H和V_L区可进一步细分成高变区，被称作互补决定区（CDR），散布着较保守的区域，被称作构架区（FR）。各V_H和V_L由以下列次序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统的第一成分（C1q）。 

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”是指保留了特异性结合抗原的能力的一个或多个抗体片段。已经显示，可通过全长抗体的片段实施抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段——由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab')2片段——包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域 构成的F_v片段；(v)由V_H结构域构成的dAb片段（Ward等人.,(1989)Nature341:544-546）；(vi)分离的互补决定区（CDR），和(vii)可任选通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H通过分开的基因编码，但它们可使用重组法通过能使它们形成单蛋白质链的合成接头连接，其中V_L和V_H区成对形成一价分子（被称作单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883）。这样的单链抗体也意在包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。 

抗原结合结构域的另一实例是免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合到免疫球蛋白铰链区多肽上的结合结构域多肽，(ii)融合到铰链区上的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合到CH2恒定区上的免疫球蛋白重链CH3恒定区。该结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。在US2003/0118592和US2003/0133939（它们全文经此引用并入本文）中进一步公开了这样的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。 

使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选片段以与完整抗体相同的方式使用。 

术语“表位”是指能特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链之类的分子的化学活性表面组构成，并通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下损失与前者而非后者的结合。 

本文所用的术语“人抗体”意在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是通过人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变）。但是，本文所用的术语“人抗体”无意包括其中衍生自另一哺乳动物物种（如小鼠）的种系的CDR序列已接枝到人构架序列上的抗体。 

本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，如(a)从针对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体动物（例如小鼠）或由其制备的杂交瘤中分离出的抗体，(b)从转化表达抗体的宿主细胞中，例如从转染瘤中分离出的抗体，(c)从重组、组合人抗体库中分离出的抗体，和(d)通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、创建或分离的抗体。这样的重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。但是，在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体施以体外诱变（或在使用针对人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），也称作亲和力成熟，因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系V_H和V_L 序列并与人种系V_H和V_L序列相关但可能并非在体内天然存在于人抗体种系清单（germline repertoire）中的序列。 

本文所用的“特异性结合”是指抗体结合至预定抗原/表位。通常，在FACS中基于IC₅₀值作为表观亲和力测量时,抗体以相当于大约10^-7M或更小，如大约10^-8M或更小，如大约10^-9M或更小、大约10^-10M或更小、或大约10^-11M或甚至更小的K_D的亲和力结合，并以相当于比其与除预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原（例如BSA，酪蛋白）的结合亲和力低至少10倍，如至少100倍的K_D的亲和力结合至预定抗原。 

抗体种类:根据它们的重链的恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归为不同种类。免疫球蛋白有至少五个主类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类（同种型），例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。与不同种类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别被称作alpha(a)、delta(d)、epsilon(e)、gamma(g)和mu(μ)。可以根据它们的恒定域的氨基序列将抗体的轻链归为两个明显不同的类型之一，被称作kappa(k)和lambda(l)。不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是公知的。 

嵌合抗体:其中可变区来自一种动物物种且恒定区来自另一动物物种的抗体。例如，嵌合抗体可以是具有衍生自小鼠单克隆抗体的可变区和人恒定区的抗体。 

互补决定区或CDR:抗体的V-结构域中的区域，它们一起形成抗体识别和结合结构域。 

恒定区或恒定域或C-域:恒定区是包含给定同种型内的其中可含有保守置换的氨基酸残基序列的抗体分子的那些结构部分。示例性的重链免疫球蛋白恒定区是本领域中被称作CH1、CH2、CH3、CH4和CH5的那些免疫球蛋白分子部分。示例性的轻链免疫球蛋白恒定区是本领域中被称作CL的免疫球蛋白分子部分。 

人抗体构架:具有衍生自人免疫球蛋白的抗原结合位点和该分子的基本所有其余免疫球蛋白衍生部分的分子。 

人源化抗体构架:具有衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，而该分子的一些或所有其余免疫球蛋白衍生部分衍生自人免疫球蛋白。抗原结合位点可包含：融合到一个或多个人恒定域上的来自非人免疫球蛋白的完整可变域；或接枝到可变域中的适当的人构架区上的一个或多个互补决定区(CDR)。在人源化抗体中，CDR可来自小鼠单克隆抗体，且该抗体的其它区域来自人。 

免疫球蛋白:血清抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。 

免疫球蛋白同种型:对具有不同H链的Ig的命名，名称是IgG(IgG1,2,3,4)、IgM、 IgA(IgA1,2)、sIgA、IgE、IgD。 

免疫学不同（Immunologically distinct）:术语免疫学不同是指能够在两种多肽之间区分抗体特异性结合多肽之一且不特异性结合另一多肽的能力。 

单克隆抗体:各种语法形式的短语单克隆抗体是指仅含一种能与特定抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体分子群。单克隆抗体因此通常对与其免疫反应的任何抗原表现出单一结合亲和力。单克隆抗体可含有具有多个抗体结合位点（各自对不同抗原有免疫特异性）的抗体分子，例如双特异性单克隆抗体。 

多克隆抗体:多克隆抗体是识别特异性的给定抗原的抗体分子的混合物，因此多克隆抗体可识别所述抗原内的不同表位。 

结合:术语“结合”或“与...缔合”是指化学体或化合物或其部分之间的邻近状况。该缔合可以是非共价的，其中通过氢键合或范德华或静电相互作用积极促进该并置，或其可以是共价的。 

结合位点:本文所用的术语“结合位点”或“结合袋（binding pocket）”是指由于其形状而有利地与另一分子、分子复合物、化学体或化合物缔合的分子或分子复合物的区域。本文所用的袋包括至少深腔，和任选浅腔。 

片段:本发明的多肽片段，包括其任何功能等同物，在一个实施方案中可包含少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸、少于15个氨基酸或甚至少于10个氨基酸。因此，片段被认为可例如分别包含大约2至大约30个氨基酸，或大约2至大约25、大约15或大约10个氨基酸。 

GDNF-家族配体受体旨在包括名为GFRα1、2、3和/或4的受体。该定义还包括其同种型，和如果规定，如例如SEQ ID NO4至12中规定的其片段或结构域。 

SorLA旨在包括如例如SEQ ID NO1至3中规定的SorLA受体或其片段或结构域。 

同源性:可以使用公知的评分矩阵，如BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85和BLOSUM90中的任一种计算氨基酸序列之间的同源性。 

配体:能与（第二）生物分子结合和形成复合物以发挥生物用途的物质、化合物或生物分子，如包括受体的蛋白质。在较窄义上，其是通过分子间力，如离子键、氢键和范德华力结合到靶蛋白上的位点上的信号触发分子。该对接（缔合）通常可逆（离解）。配体与其靶分子之间的实际不可逆共价结合在生物系统中罕见。与金属有机和无机化学中的含义不 同，配体是否结合在金属位置是无关的，因为这是血红蛋白中的情况。配体与受体的结合可改变化学构象，即受体蛋白的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的倾向或强度被称作亲和力。配体包括底物、抑制剂、活化剂、非自体受体、共受体和神经递质。放射性配体是放射性同位素标记的化合物并体内用作PET研究中的示踪剂和用于体外结合研究。 

药剂:术语“药剂”或“药物”或“药品”或“试剂”是指可用于治疗（包括预防、诊断、减轻或治愈）患者的病状、病痛、病症、疾病或损伤的任何治疗或预防剂。在术语药剂或药物的含义内可包括治疗有用的遗传决定子、肽、多肽和多核苷酸。如本文中定义，“治疗剂”、“药剂”或“药物”或“药品”或“试剂”是一种类型的生物活性剂。 

药物组合物:或组合物是指在适当施用于患者时能够引发所需治疗效果的任何化学或生物材料、化合物或组合物。 

多肽:本文所用的术语“多肽”是指包含至少两个氨基酸的分子。该氨基酸可以是天然或合成的。 

术语“多肽”也旨在包括蛋白质，即包含至少一个多肽的功能生物分子；在包含至少两个多肽时，这些可形成复合物、共价连接或非共价连接。 

序列同一性:在一个实施方案中使用包含至少25个连续氨基酸并具有与所涉蛋白质的氨基酸序列至少80%，如85%，例如90%，如95%，例如99%相同的氨基酸序列的片段测定序列同一性，其中在Wisconsin Genetics Software Package Release7.0中使用默认缺口权重（default gap weights）用算法GAP、BESTFIT或FASTA测定同一性百分比。 

本发明提供了SorLA-独立于GDNF-以明显高的亲和力结合GFRα1且这两者从转染细胞中有效共沉淀的证据（图6）。在细胞中共表达时，SorLA传达GFRα1的内化和下调，并介导其逆向运输至核周（Golgi-）隔室，由此避免溶酶体退化（图6）。明显地，使用GFRα2、3和-4的类似结果表明，SorLA可以与所有GFRα类型相互作用，且下述功能含义实际上不仅可涉及GDNF，还涉及neuturin、persephin和artemin。此外，SorLA的表达显著影响Ret信号传导的GDNF诱导，即在响应提高的GDNF浓度的Ret和GFRα1阳性细胞中，SorLA的过量表达显著抑制Ret磷酸化（图9）。在成神经细胞瘤细胞和培养的神经元上进行的功能研究与这些结果一致。因此，SorLA的存在阻碍GDNF诱导的成神经细胞瘤细胞的存活、增殖和分化（图9），并且当SorLA在功能上被抗-SorLA抗体阻断时，GDNF诱导的原代多巴胺能神经元存活显著增强（图12）。 

本发明人因此提出SorLA与GDNF-家族配体受体，如GFRα1之间的相互作用是 GDNF信号传导中的关键调节要素，以及靶向GDNF-家族配体受体和/或SorLA中的负责结合位点的药物（肽、蛋白质、合成、小有机化合物）可用于通过消除GDNF-家族配体受体与SorLA的结合来促进或阻碍GDNF功能。本发明因此涉及阻碍或减少成神经细胞瘤细胞的存活、增殖和分化并在另一实施方案中提高神经元，例如多巴胺能神经元的存活的方法。 

设想可以使用能够调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用的这些试剂或药物治疗各种疾病，且其中逆转或减少神经元损失，例如多巴胺能神经元的损失，和/或其中减少成神经细胞瘤细胞的分化、增殖和/或存活。这些疾病和损伤包括神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和/或双相障碍（躁郁症）。 

本发明人表明，GFRα:SorLA复合物的靶向作用代表用于体内治疗GFL-表型（包括行为表型，如ADHD和帕金森氏病）的全新方法。这样的策略与上述进行中的临床和临床前试验相比具有许多优点。例如，代替直接递送～36kDa GDNF家族配体二聚体，本发明人提议生成穿透血脑屏障并特异性调节SorLA与GFRα受体之间的相互作用的小分子激动剂或拮抗剂，由此提高内源性GDNF家族配体的生物活性。 

不同试剂可被认为对SorLA与GDNF-家族配体受体相互作用具有这些调节剂作用。具体而言，用于调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用的试剂选自蛋白质、肽、抗体或小有机化合物。 

该试剂可包含SorLA的胞外域（SEQ ID No1）、其同种型或其片段。通过将这种多肽施用于对象，会发生在成神经细胞瘤细胞或神经元，例如多巴胺能神经元上发现的GDNF-家族配体受体之间的竞争，由此抑制相互作用。可以考虑与GDNF-家族配体受体具有亲和力的若干片段，特别是具有大约600个氨基酸的SorLa的N-末端，其包含SorLA的N-末端Vps10p-结构域（SEQ ID NO3）。本发明的发明人另外展示，SorLA前肽（SEQ IDNO2）有效抑制这种相互作用。 

可以在不阻碍与GDNF-家族配体受体的结合的情况下对SorLA的胞外域做出各种修改。因此具有与SEQ ID NO1、2或3至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO1、2或3至少85%、90%、95%或98%序列同一性的多肽被认为能对该相互作用产生类似或相关的影响。 

该试剂或药物当然也可选自GDNF-家族配体受体的胞外域，包括GFRα1-4受体、其同种型或其片段。具体而言，如SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12中定义的序列 或其片段。SEQ ID NO7是与SorLA的结合位点，包含这种序列的肽特别优选。 

具有与SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12至少80%序列同一性，如与SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12至少85%、90%、95%或98%序列同一性的序列被认为对该相互作用产生类似或相关的影响。 

还已经表明，神经降压素也能抑制这种相互作用。因此根据一个实施方案，可以使用神经降压素（SEQ ID13）或如SEQ ID14或15中定义的其片段。 

根据本发明的另一实施方案，该蛋白质是GDNF，其是与GDNF-家族配体受体GFRα1的天然结合伴侣。因此本发明还涉及GDNF、其片段或其同种型。该GDNF蛋白可包含序列SEQ ID NO16或18。根据另一实施方案，该蛋白质具有与SEQ ID NO16或18至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO16或18至少85%、90%、95%或98%序列同一性。 

还已经表明，该前肽能调节SorLA与GDNF-家族配体受体，特别是GFRα1之间的相互作用。因此根据一个实施方案，该蛋白质包含如SEQ ID NO17中定义的GDNF的前肽或具有与SEQ ID NO17至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO17至少85%、90%、95%或98%序列同一性的蛋白质。 

本发明人进一步发现，SorLA-/-转基因小鼠表现出以注意力缺陷和过度活跃为特征的行为表型（图14），表明改变的多巴胺能活性和类似ADHD的表型。使用wt和转基因小鼠的安非他明治疗的初步实验支持这一假说，因为SorLA-/-小鼠看起来对安非他明不敏感。 

根据一个具体实施方案，本发明涉及通过调节或抑制SorLA与GFRα1之间的相互作用，例如通过抑制GDNF的内化和/或退化来提高需要其的患者脑中的GDNF的细胞外水平的方法。 

这种方法被认为可通过调节SorLA与GFRα1之间的相互作用来提高神经元，如多巴胺能神经元的存活，因此适合治疗疾病，如损伤诱导的神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和/或双相障碍（躁郁症）。 

适合调节或抑制SorLA与GFRα1之间的相互作用的试剂是针对SorLA或GFRα1的抗体。这种抗体优选结合包含例如结合位点，如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的GFRα1和/或SorLA的胞外域。 

该抗体可以是多克隆或单克隆的，如人源化、嵌合或单链抗体。 

抗体 

可以使用含有感兴趣的小肽作为免疫抗原的完整多肽或片段制备本发明的结合相同受体靶，如SorLA或GDNF-家族配体受体，如GFRα1-4的抗体。用于使动物免疫的多肽可通过重组DNA技术或通过化学合成获得并可任选与载体蛋白缀合。 

多克隆和单克隆抗体的制备是本领域中公知的。 

多克隆抗体特别可以如例如Green等人:“Production of Polyclonal Antisera”,in Immunochemical5Protocols(Manson编辑)；Humana Press,1992,第1-5页；Coligan等人:“Production of Polyclonal Antisera in Rabbits,Rats,Mice and Hamsters”，Current Protocols in Immunology,1992,第2.4.1部分以及Ed Harlow和David Lane(编辑)在“Antibodies；A laboratory manual”Cold Spring Harbor Lab.Press1988中所述获得。单克隆抗体特别可以如例如Kohler&Milstein,Nature,1975,256:495；Coligan等人在Current Protocols in Immunology,1992,第2.5.1-2.6.7部分中；和Harlow等人在Antibodies:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor,Pub.,1988,第726页（都全文经此引用并入本文）中所述获得。 

简言之，可通过用包含抗原的组合物注射例如小鼠、取出血清样品以验证抗体生成的存在、取出脾以获得B淋巴细胞、融合B淋巴细胞与骨髓瘤细胞以产生杂交瘤、克隆杂交瘤、选择产生对该抗原的抗体的阳性克隆并从杂交瘤培养物中分离抗体来获得单克隆抗体。 

可以通过各种公认技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体，包括使用蛋白质A琼脂糖的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法，参见例如Coligan等人,Current Protocols in Immunology,1992,第2.7.1-2.7.12部分和第2.9.1-2.9.3部分；和Barnes等人:“Purification of Immunoglobulin25G(IgG)”，Methods in Molecular Biology；Humana Press,1992,第10卷,第79-104页（都全文经此引用并入本文）。多克隆或单克隆抗体可任选例如通过结合到结合了针对其产生抗体的多肽的基质上和从基质洗脱来进一步纯化。 

抗GFRα1-4的抗体可购自例如R&D Systems，如人GDNF MAb(Clone27106)、小鼠IgG1人GFR alpha-4MAb(Clone215725)、小鼠IgG1人GFR alpha-2MAb(Clone129030)、小鼠IgG2B人GFR alpha-3MAb(Clone111004)、小鼠IgG1人GFR alpha-1MAb(Clone260714)、小鼠IgG1人/大鼠GDNF亲和纯化多克隆Ab、山羊IgG人GFR alpha-4亲和纯化多克隆Ab、山羊IgG人GFR alpha-1亲和纯化多克隆Ab、山羊IgG人GFR alpha-2亲和纯化多克隆Ab、山羊IgG人GFR alpha-3亲和纯化多克隆Ab、山羊IgG。 

此外，本发明人已制成针对人SorLA的整个胞外域产生的兔多克隆抗体。在CHO细胞中表达SorLA胞外域并使用亲和色谱法从培养上清液中纯化。 

这些抗体可以如图9和12中所示充当SorLA拮抗剂。 

本发明人已经以类似方式制成针对人SorLA的整个胞外域产生的一系列小鼠单克隆抗体。这些可根据它们充当SorLA激动剂或拮抗剂的能力选择。然后克隆所选抗体的互补位并可生成人源性抗体。 

一方面，本发明涉及能特异性结合GFRα1、2、3或4的胞外域上的表位的抗体的用途，具体而言,SEQ ID NO4、5、6、7、8、9、10、11或12或具有与SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12至少80%序列同一性，如与SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12至少85%、90%、95%或98%序列同一性的序列被认为对该相互作用产生类似或相关的影响。SEQ ID NO7是与SorLA的结合位点，包含这种序列的肽特别优选。 

根据另一实施方案，本发明涉及具有在SorLA的胞外域上的表位的抗体，具体而言,包含N-末端Vpsp10p-结构域（SEQ ID NO3）、SEQ ID No1或2或与SEQ ID NO1、2或3至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO1、2或3至少85%、90%、95%或98%序列同一性的序列能对该相互作用产生类似或相关的影响。 

在一个实施方案中，如上定义的抗体选自：多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、重组抗体、嵌合抗体或仅是它们的抗原部分。 

药物组合物和给药形式 

在治疗方法中的主要给药途径是静脉内、经口和局部。也考虑有效地将药物输送至靶部位或将药物引入血流的其它给药方法，如皮下注射或吸入。 

由于本发明的大部分化合物是蛋白质，最常见的给药方式是静脉内、肌肉内或皮下给药，尽管在文献中也充分描述了鼻内给药。 

可以通过常规技术制备适用于这样的给药的剂型。 

本发明的化合物可作为单一活性剂或与至少一种其它活性剂一起给药。 

制剂 

尽管本发明的化合物有可能作为原料化学品给药，它们优选以药物制剂形式存在。 

因此，本发明进一步提供医用药物制剂，其包含本发明的化合物和可药用载体或稀释剂。 

在本发明的一些实施方案中以抗体形式提供。药物制剂包括这种抗体和佐剂。 

合适的佐剂的非限制性实例选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，如毒素、细胞因子和 分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；胶束形成佐剂；皂草苷；免疫刺激复合基质（ISCOM基质）；粒子；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；y-菊粉；和包囊佐剂。 

佐剂的应用包括使用如氢氧化铝或磷酸盐（明矾）之类的试剂的应用。 

根据本发明，DDA（二甲基双十八烷基溴化铵）像DNA和y-菊粉一样也是候选佐剂，弗氏完全和不完全佐剂以及皂树皂甙如QuilA和QS21像RIBI一样可用。其它可能性是单磷酰脂质A（MPL）、上述C3和C3d和mu-ramyl二肽（MDP）。 

脂质体制剂也已知提供佐剂作用，因此根据本发明脂质体佐剂是优选的。 

也可根据本发明使用免疫刺激复合基质类型（ISCOMO基质）佐剂。 

关于免疫刺激复合物的组成和用途的细节可例如见于Morein B等人,1995,Clin.Immunother.3:461-475以及Barr IG和Mitchell GF,1996,Immunol.and Cell Biol.74:8-25（两者都全文经此引用并入本文）。 

本发明的化合物可配制成肠胃外给药（例如通过注射，例如快速浓注或连续输注）并可以与添加的防腐剂一起以单位剂型存在于安瓿、预装注射器、小体积输注或多剂容器中。该组合物可呈现如在油性或水性赋形剂中的悬浮液、溶液或乳剂之类的形式，例如在含水聚乙二醇中的溶液。油性或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油（例如橄榄油）和可注射有机酯（例如油酸乙酯）并可含有配制剂，如防腐、润湿、乳化或悬浮、稳定和/或分散剂。 

或者，活性成分可以是通过无菌固体的无菌离析或通过由溶液冻干获得的粉末形式，以在使用前用合适的赋形剂，例如无菌无热原水构造。 

肠胃外制剂中可用的油包括石油、动物油、植物油或合成油。此类制剂中可用的油的具体实例包括花生油、35大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。用于肠胃外制剂的合适脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。 

适用于肠胃外制剂的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶鎓；(b)阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐、烷基、烯烃、醚和甘油单酯硫酸盐和磺基丁二酸盐，(c)非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，例如烷基-.β.-氨基丙烯酸和2-烷基咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。 

该肠胃外制剂通常在溶液中按重量计含有大约0.5至大约25%的活性成分。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了尽可能减小或消除注射位置的刺激，这样的组合物可含有一种或多 种具有大约12至大约17的亲水-亲脂平衡（HLB）的非离子表面活性剂。这种制剂中的表面活性剂的量按重量计通常为大约5至大约15%。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如失水山梨糖醇单油酸酯，和环氧乙烷与通过环氧丙烷和丙二醇的缩合形成的疏水基料的高分子量加合物。该肠胃外制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶中，并可储存在冻干条件下，只需要在临使用前添加无菌液体赋形剂，例如水，以供注射。可以由之前描述的种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时注射液和悬浮液。 

经皮给药 

本文所述的药剂-化学改性剂复合物可经皮给药。经皮给药通常涉及为使药物经皮肤通道进入患者体循环的药剂递送。皮肤位置包括用于经皮给药的解剖区域并包括前臂、腹、胸、背、臀、乳突区等。 

通过使该复合物来源与患者皮肤长时间接触，实现经皮给药。透皮贴剂具有为身体提供药剂-化学改性剂复合物的受控递送的附加优点。参见Transdermal Drug Delivery:Developmental Issues and Research Initiatives,Hadgraft和Guy(编辑),Marcel Dekker,Inc.,(1989)；Controlled Drug Delivery:Fundamentals and Applications,Robinson和Lee(编辑),Marcel Dekker Inc.,(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs,第1-3卷,Kydonieus和Berner(编辑),CRC Press,(1987)（都全文经此引用并入本文）。可以通过在适当的介质，如弹性体基质材料中溶解、分散或以其它方式掺入药剂-化学改性剂复合物来制造这样的剂型。吸收增强剂也可用于提高该化合物的透皮通量。可通过提供速率控制膜或将该化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制这样的通量速率。 

被动经皮给药 

各种类型的经皮贴剂可用于本文所述的方法。例如，可以由背衬材料和丙烯酸酯粘合剂制备简单粘性贴剂。将药剂-化学改性剂复合物和任何增强剂配制成粘性浇注溶液并使其充分混合。将该溶液直接浇注到背衬材料上并在烤箱中蒸发浇注溶剂，留下粘性膜。可以粘贴剥离型衬层以完成该系统。 

或者，可以使用聚氨酯基质贴剂递送该药剂-化学改性剂复合物。这一贴剂的层包含背衬、聚氨酯药物/增强剂基质、膜、粘合剂和剥离型衬层。使用室温固化的聚氨酯预聚物制备该聚氨酯基质。将水、醇和复合物添加到该预聚物中以致形成粘性紧实弹性体，其可直接仅浇注在背衬材料上。 

本发明的另一实施方案利用水凝胶基质贴剂。通常，水凝胶基质包含醇、水、药物和几种亲水聚合物。这种水凝胶基质可以在背衬与粘合层之间并入经皮贴剂中。 

贮液贴剂也可用于本文所述的方法。这种贴剂包含不透或半透的热封背衬材料、热封膜、丙烯酸酯基压敏皮肤粘合剂和硅化剥离型衬层。将背衬热封到膜上以形成贮器，可随后向其中填充该复合物、增强剂、胶凝剂和其它赋形剂的溶液。 

泡沫基质贴剂在设计和组成上类似于贮液系统，只是将胶凝药剂-化学改性剂溶液封在薄泡沫层，通常聚氨酯中。这种泡沫层位于背衬和已在贴剂外周热封的膜之间。 

对被动给药系统而言，通常通过位于该贮器与皮肤之间的膜、通过从整体式装置（monolithic device）扩散或通过在该递送系统中充当速率控制屏障的皮肤本身控制释放速率。参见美国专利Nos.4,816,258；4,927,408；4,904,475；4,588,580、4,788,062；等等（都全文经此引用并入本文）。药物递送速率部分取决于膜的性质。例如，在体内的透膜药物递送速率通常高于穿透皮肤屏障。使用位于贮器与皮肤之间的限速膜最有利地控制从该装置向膜递送该复合物的速率。假设皮肤可足以被该复合物渗透（即经皮吸收大于穿透该膜的速率），该膜用于控制患者经受的剂量速率。 

可根据所需渗透程度、该复合物的性质和与构造该装置相关的机械考量选择合适的可透膜材料。示例性的可透膜材料包括各种天然和合成聚合物，如聚二甲基硅氧烷（有机硅橡胶）、乙烯乙酸乙烯酯共聚物（EVA）、聚氨酯、聚氨酯-聚醚共聚物、聚乙烯、聚酰胺、聚氯乙烯（PVC）、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯（PTFE）、纤维素材料，例如三乙酸纤维素和硝酸/乙酸纤维素，和水凝胶，例如甲基丙烯酸2-羟乙酯（HEMA）。 

根据所需装置特征，在该装置中可含有其它项，如治疗产品的其它常规组分。例如，本发明的组合物还可包括一种或多种防腐剂或抑菌剂，例如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚、苯扎氯铵等。这些药物组合物还可含有其它活性成分，如抗菌剂，特别是抗生素、麻醉剂、止痛剂和止痒剂。 

本发明的化合物可配制成作为栓剂给药。首先熔化低熔点蜡，如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物并例如通过搅拌均匀分散活性组分。然后将熔融的均匀混合物倒入尺寸方便的模具中，冷却并固化。 

可以将该活性化合物配制成包含置于聚乙二醇（PEG）载体（例如PEG1000[96%]和PEG4000[4%]）中的例如大约0.5%至大约50%本发明的化合物的栓剂。例如本发明的化合物可配制成阴道给药。除活性成分外还含有这样的载体的子宫托、卫生棉塞、霜、凝胶、膏、泡沫或喷剂在本领域中已知合适。 

本发明的化合物可配制成鼻内给药。 

将该溶液或悬浮液通过常规手段，例如用滴管、移液管或喷雾器直接施加到鼻腔 中。该制剂可以以单剂或多剂形式提供。在滴管或移液管的后一情况下，这可通过患者施加适当的预定体积的溶液或悬浮液实现。在喷雾器的情况下，这可例如借助计量雾化喷雾泵实现。 

本发明的化合物可配制成气雾剂给药，特别用于呼吸道，包括鼻内给药。该化合物通常具有例如大约5微米或更小的小粒度。可通过本领域中已知的手段，例如通过微粉化获得这样的粒度。在带有合适的推进剂的加压包装中提供活性成分，所述合适的推进剂如氯氟烃（CFC），例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。该气雾剂可方便地还含有表面活性剂，如卵磷脂。通过计量阀控制药物剂量。或者，可以以干粉，例如该化合物在合适粉末基质，如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷（PVP）中的粉末混合物的形式提供活性成分。该粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。该粉末组合物可以以单位剂型存在，例如在如明胶壳或泡沫包装的胶囊或药筒中，可借助吸入器从中施用粉末。如果需要，可以用适合活性成分的缓释或控释给药的肠溶包衣制备制剂。该药物制剂优选在单位剂型中。在这样的形式中，将该制剂细分成含有适当量的活性组分的单位剂量。该单位剂型可以是包装制品，该包装含有离散量的制剂，如成包片剂、胶囊和在小瓶或安瓿中的粉剂。单位剂型5也可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或其可以是包装形式的适当数量的任何这些。 

注射是静脉内、肌肉内、脊柱内、腹膜内、皮下、快速浓注或连续给药。 

在一个实施方案中，本发明的药物组合物以30分钟至24小时的时间间隔给药。 

在另一实施方案中，本发明的药物组合物以1至6小时的时间间隔给药。 

在另一实施方案中，本发明的药物组合物以6至72小时的时间间隔给药。 

在另一实施方案中，该药物组合物以10微克至500毫克/公斤体重的剂量给药。 

本发明的多肽和抗体可以以医学上可接受的任何方式给药。这包括肠胃外10途径注射，如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌肉内、瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内、气管内、鞘内、脑室内、脑间、肺内等，以及鼻内、眼内、直肠或局部。在本发明中还具体包括通过如贮存注射或可蚀植入物之类的手段缓释给药。 

口服也可行，只要防止蛋白质在胃中退化。 

给药可以通过定期注射快速浓注制剂进行，或可通过从体外（例如IV袋）或体内（例如生物可蚀性植入物、生物人造器官、生物相容胶囊）储器静脉或腹膜内给药而更连续进行。参见例如美国专利4,407,957、5,798,113,和5,800,828，各自经此引用并入本文。例如在美国专利5,654,007、5,780,014,和5,814,607中描述了肺内递送方法和装置，各自经此引用 并入本文。除全身递送外，也考虑直接递送至血-脑或血-视网膜屏障后的CNS。局部递送可以通过如经导管递送至一个或多个动脉，如通往CNS的大脑动脉之类的方式。在US6,042,579（Medtronic）（全文经此引用并入本文）中描述了蛋白质制剂局部用泵递送至CNS的方法。 

术语“可药用载体”是指一种或多种天然或合成的有机或无机成分，多肽或抗体与其结合以利于施用。合适的载体包括无菌盐水，尽管已知可药用的其它水性和非水等渗无菌溶液和无菌悬浮液是本领域普通技术人员已知的。 

“有效量”是指能够改善或延迟患病、退行性或受损状况的进程的量。可以根据个体确定有效量，并部分基于要治疗的症状和寻求的结果。本领域普通技术人员利用此类因素并仅用常规实验法就可确定有效量。 

脂质体系统可以是各种单层囊泡、多层囊泡或稳定的多层囊泡，并可根据本领域技术人员公知的方法，例如根据美国专利5,169,637、4,762,915、5,000,958或5,185,154（都全文经此引用并入本文）的教导制备和施用。此外，可能希望表达本发明的新型多肽以及其它所选多肽，如脂蛋白，以增强它们与脂质体的结合。 

设想了用于全身给药的各种剂量方案。在一个实施方案中，向对象施用包含抗体或多肽的制剂的方法包括施用每剂1μg/kg至30,000μg/kg对象体重的所述剂量。 

在另一实施方案中，该剂量为每剂10μg/kg至30,000μg/kg对象体重。在另一实施方案中，该剂量为每剂1030μg/kg至10,000μg/kg对象体重。在一个不同的实施方案中，该剂量为每剂5μg/kg至10,000μg/kg对象体重。在又一实施方案中，该剂量为每剂25μg/kg至3,000μg/kg对象体重。在最优选的实施方案中，该剂量为每剂50μg/kg至3,000μg/kg对象体重。在文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导；参见例如美国专利Nos.4,657,760；5,206,344；或5,225,212（都全文经此引用并入本文）。预计不同的制剂对不同的治疗化合物和不同的疾病有效，靶向一个器官或组织给药例如可能需要以与另一器官或组织不同5的方式递送。 

检测法 

本发明还包括用于识别能够调节SorLA与GDNF-家族配体受体，如GFRα1、2、3或4之间的相互作用的新型结合伴侣的体外和/或体内检测法，包括SorLA和GDNF-家族配体受体。这些检测法可以例如是基于细胞的，包含表达受体SorLA或GFRα1、2、3或4或两者的细胞并测量响应。或者，可以进行体外检测法，由此测量该新型结合伴侣抑制该相互作用的能力。下面描述本发明的各种实施方案。 

基于细胞检测法

本发明还涉及可识别能够调节SorLa与GDNF-家族配体受体复合物，特别是GFRα1之间的相互作用的试剂的各种检测法。 

可以在细胞系统中测定通过Vps10p结构域受体家族的成员结合、内化或信号传导（实施例6）。用候选试剂（抑制剂/拮抗剂）化合物孵育例如用分别编码所有三种受体的质粒转染后的表达SorLA和GFRα1和GDNF的细胞。所述试剂可例如代表针对受体SorLA和GFRα1任一的抗体，结合配体，如SorLA前肽或各受体的片段。在孵育后，可以洗涤细胞，蛋白质复合物与例如二硫代双[琥珀酰亚氨基丙酸酯](DSP,Pierce)交联，随后细胞溶解。由此获得的细胞溶解产物可随后用结合在例如琼脂糖珠上的SorLA或GFRα1或两者的抗体孵育。然后从洗过的珠粒上洗脱沉淀的复合物并通过免疫印迹法分析。 

因此在一个实施方案中，本发明涉及用于识别可结合SorLa和GDNF-家族配体受体复合物的试剂的基于细胞的筛选检测法，包括步骤 

a)用表达SorLA受体、GDNF和/或GDNF-家族配体受体的细胞孵育感兴趣的试剂 

b)溶解细胞并用SorLA或GDNF-家族配体受体的特异性抗体孵育细胞，和 

c)通过免疫印迹法分析复合物形成。 

在另一实施方案中，本发明涉及用于识别能够抑制SorLA的试剂的基于细胞的筛选法。 

针对SorLA:GFRα1:GDNF受体复合体实体的拮抗剂可充当这整个复合物的抑制剂。因此其与筛选能够结合例如Vps10p-结构域受体实体的试剂相关。在实施例8中描述了这种方法。可以在细胞系统中测定通过Vps10p结构域受体家族的成员结合、内化或信号传导。可以在分别不存在和存在候选抑制剂/拮抗剂化合物的情况下用放射性标记的配体孵育内源性地或例如用含有该受体的cDNA的质粒转染后表达受体之一的细胞。在孵育后，可以洗涤细胞以除去非特异性结合，随后收获。使用本领域技术人员公知的常规放射性配体检测法测定候选拮抗剂/抑制剂与受体的结合程度。参见例如Bylund和Toews(1993)Am J Physiol.265(5Pt1):L421-9，名为“Radioligand binding methods:practical guide and tips”。也可以如Nykjaer等人(1992)FEBS300:13-和Nielsen等人(2001)EMBO J（两者都全文经此引用并入本文）中所述测定胞吞作用/内化。 

因此根据另一实施方案，本发明涉及用于识别能够抑制SorLA的试剂的基于细胞的筛选法，包括步骤 

a)用放射性标记的试剂孵育表达SorLA受体、GDNF和/或GDNF-家族配体受体的细胞， 

b)洗涤细胞以除去非特异性结合， 

c)收获细胞， 

d)测量结合量。 

在另一实施方案中，设想了识别能够调节通过SorLA逆行分选GFRα受体的试剂的基于细胞的筛选法，其中可以在表达SorLA和GFRα受体的细胞中通过荧光标签或荧光抗体标记表面局域化的GFRα受体，并随后用SorLA激动剂/拮抗剂孵育例如大约20至大约30分钟。随后可以如图6和图11中所示使用共焦显微术评估内化的GFRα受体量。 

因此根据另一实施方案，本发明涉及用于识别能够调节通过SorLA逆行分选GFRα受体的试剂的基于细胞的筛选法，包括步骤 

a)在表达SorLA和GFRα受体的细胞中通过荧光标签或荧光抗体标记该试剂 

b)随后用SorLA激动剂/拮抗剂孵育所述细胞一段时间 

c)分析内化GFRα受体的量。 

在另一实施方案中，设想了用于识别能够提高Ret磷酸化的试剂的基于细胞的筛选法。 

可以在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下用浓度递增的GDNF刺激成神经细胞瘤细胞（例如SY5Y细胞）一段指定时间。然后可溶解细胞并用结合到Gammabind珠粒（GE Healthcare）上的抗Ret抗体（R&D Systems）孵育该细胞溶解产物。然后可从洗过的珠粒中洗脱沉淀的蛋白质（酸性缓冲液，随后中和）并可使用抗-磷酸酪氨酸(Milipore)通过免疫印迹法目测任何磷酸化Ret（如图9中所示）。 

因此本发明还涉及用于识别能够提高Ret磷酸化的试剂的基于细胞的筛选法，包括步骤 

a)在存在或不存在SorLA结合剂的情况下以递增浓度的GDNF孵育成神经细胞瘤细胞一段指定时间 

b)溶解细胞， 

c)使用抗-磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀磷酸化Ret，和 

d)目测磷酸化。 

在另一实施方案中，本发明涉及用于识别能够提高细胞存活的试剂的基于细胞的筛选法。 

可以从细胞培养物中收获成神经细胞瘤细胞（例如SY5Y）并再悬浮在生长培养基，如含有1%glutamax和1%P/S（青霉素和链霉素）的无酚红（LONZA）的DMEM中。随后 将细胞在96孔板中铺板。第二天，在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下用浓度递增的GDNF刺激细胞，并在它们的正常孵育器中孵育一段时间，例如72小时。在孵育后，可以制备MultiTox-Fluor Multiplex细胞毒性检测试剂（Promega）并如制造商的技术支持文件所示添加到细胞中，并孵育。此后用例如Wallac VICTOR3TM1420Multilabel Counter(Perkin ElmerTM Lifesciences)测量荧光，其中信号与存活成正比。 

因此本发明还涉及用于识别能够提高细胞存活的试剂的基于细胞的筛选法，包括步骤 

a)在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下用浓度递增的GDNF孵育成神经细胞瘤细胞并培养一段时间 

b)使用细胞毒性检测法测定细胞存活。 

在另一实施方案中，为了测试存活，在盖玻片而非96孔板上培养细胞。在孵育后，然后例如在PBS中的4%低聚甲醛（PFA）中固定细胞一段时间（如在室温下30分钟）并封固到载玻片上。然后如图9D中所示在荧光显微镜中直接计数细胞。 

因此本发明还涉及用于识别能够提高细胞存活的试剂的基于细胞的筛选法，包括步骤 

a)在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下用浓度递增的GDNF孵育成神经细胞瘤细胞并孵育一段时间 

b)固定细胞 

c)细胞计数。 

体外检测法

用于识别破坏GFRα1和/或GDNF与SorLA的相互作用的试剂的体外检测法可以通过例如表面等离子体共振分析（Biacore,Sweden）使用例如CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl、2mM CaCl2、1mM EGTA和0.005%Tween-20）进行试剂，如小有机分子、肽或可溶受体（包括但不限于SorLA、GFRα1和GDNF）直接结合到固定的蛋白质上的测定。这种试剂可衍生自成熟GDNF的N-末端（图17）或GFRα1结构域1（图16）。 

使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被。可以采用几种不同的方法：可以通过将结合信号（响应单位）与用受体之一固定的芯片进行比较和将这一信号与空流细胞（empty flow cell）进行比较来识别候选试剂。在另一方法中，可以在不存在或存在推定抑制剂的情况下监测已确 定的试剂的抑制。信号差描绘拮抗剂的抑制潜力。可以通过使用Biaevaluation3.1版程序就亲和力评估和抑制潜力拟合传感图来分析收集的数据。表面等离子体共振检测法容易转化成其它检测法，其中将Vps10p-结构域受体、该试剂或推定抑制剂固定在固相上。例如，可以通过孵育一定时间（例如在50mM NaHCO3,pH9.6中在4℃下16小时）来将受体固定在例如来自Nunc的Maxisorp微滴定孔（目录号439454）中。在室温下使用5%牛血清白蛋白（Sigma,目录号A9647）封闭2小时后，该孔可以用MB缓冲液（10mM HEPES,pH7.4、140mM NaCl、220mM CaCl2和1mM MgCl2）洗涤3次，然后在不存在或存在各种浓度的候选抑制剂的情况下用标记的配体（例如碘化的）孵育。在孵育（例如在4℃下整夜）和用MB缓冲液洗涤后，通过添加10%SDS释放结合的放射性。可以测定示踪剂与仅用牛血清白蛋白包被的孔的非特异性结合并从在结合实验中测得的值中减去。可以使用来自GraphPad的Prism软件，版本4将结合数据点拟合为结合方程式。同样地，可以标记拮抗剂并直接测量与固定的受体的结合。在另一设置中，可以将受体、配体或拮抗剂固定在闪烁珠上并在邻近闪烁分析法中测量结合，其中已使用放射性标记受体结合分子。 

因此本发明还涉及用于识别破坏GFRα1和/或GDNF与SorLA的相互作用的试剂的体外检测法，包括步骤 

a)将GFRα1和/或SorLA固定在生物传感器芯片中 

b)施加试剂，和 

c)将这种信号与标准进行比较 

或 

a)将该试剂、GFRα1、GDNF或SorLA固定在固相上， 

b)在不存在或存在各种浓度的所述试剂的情况下用标记的配对物（例如碘化的试剂、GFRα1、GDNF和/或SorLA）孵育这些物质，和 

c)计数或测量该结合。 

进一步实施方案 

1.通过调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用来提高神经元，如多巴胺能神经元的存活的方法。 

2.根据实施方案2的方法，其中所述GDNF-家族配体受体选自GFRα1、2、3、和/或4。 

3.根据实施方案1或2的方法，其中用于调节SorLA与GDNF-家族配体受体之间的相互作用的试剂选自蛋白质、肽、抗体或小有机化合物。 

4.根据实施方案3的方法，其中所述试剂是SorLA的胞外域（SEQ ID NO1）、其同种型或其片段。 

5.根据实施方案4的方法，其中所述片段包含或是来自SorLA的N-末端Vps10p-结构域的片段（SEQ ID NO3）。 

6.根据实施方案3的方法，其中所述试剂是SorLA前肽（SEQ ID NO2）或其片段。 

7.根据实施方案2至5任一项的方法，其具有与SEQ ID NO1、2或3至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO1、2或3至少85%、90%、95%或98%序列同一性。 

8.根据实施方案3的方法，其中所述试剂选自GFRα1-4受体的胞外域、其同种型或其片段。 

9.根据实施方案8的方法，其中所述GFRα受体包含如SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12中定义的序列或其片段。 

10.根据实施方案8的方法，其具有与SEQ ID4、5、6、7、7、8、9、10、11或12至少80%序列同一性，如与SEQ ID4、5、6、7、8、9、10、11或12的至少85%、90%、95%或98%序列同一性。 

11.根据实施方案3的方法，其中所述蛋白质包含神经降压素（SEQ ID13）或例如如SEQ ID14或15中定义的其片段，或由神经降压素（SEQ ID13）或例如如SEQ ID14或15中定义的其片段构成。 

12.根据实施方案3的方法，其中所述蛋白质是GDNF、其片段或其同种型。 

13.根据实施方案12的方法，其中所述GDNF包含序列SEQ ID NO16或18，或由序列SEQ ID NO16或18构成。 

14.根据实施方案13的方法，其具有与SEQ ID NO16或18至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO16或18至少85%、90%、95%或98%序列同一性。 

15.根据实施方案3的方法，其中所述蛋白质包含或由如SEQ ID NO17中定义的GDNF的前肽构成。 

16.根据实施方案15的方法，其具有与SEQ ID NO17至少80%序列同一性，如与SEQ ID NO17至少85%、90%、95%或98%序列同一性。 

17.根据实施方案3的方法，其中所述抗体具有在GFRα1、2、3或4的胞外域上的表位。 

18.根据实施方案17的抗体，其是单克隆或多克隆的并具有在如实施方案8、9或10任一项中定义的任何序列内的表位。 

19.根据实施方案3的方法，其中所述抗体具有在SorLA的胞外域上的表位。 

20.根据实施方案19的方法，其是单克隆或多克隆的并具有在如实施方案4、5、6或7任一项中定义的任何序列内的表位。 

21.包含如实施方案1-16任一项中定义的试剂以及一种或多种可药用载体或稀释剂的药物组合物。 

22.包含如实施方案17-20任一项中定义的抗体和佐剂的药物组合物。 

23.如实施方案1至20任一项中定义的试剂或根据实施方案21和22任一项的药物组合物用于提高神经元，如多巴胺能神经元的存活的用途。 

24.如实施方案1至20任一项中定义的试剂或根据实施方案21和22任一项的药物组合物用于治疗与神经元，如多巴胺能神经元的损失相关和/或需要神经元，如多巴胺能神经元的存活的疾病。 

25.根据实施方案24的用途，其中所述疾病选自损伤诱导的神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和/或双相障碍（躁郁症）。 

26.通过施用有效量的如实施方案1至20任一项中定义的试剂或根据实施方案21或22任一项的药物组合物来治疗与神经元，如多巴胺能神经元的损失相关和/或需要神经元，如多巴胺能神经元的存活的疾病的方法。 

27.根据实施方案26的方法，其用于治疗根据实施方案25的疾病。 

28.根据实施方案1至20任一项的化合物或根据实施方案21和22任一项的药物组合物用于制备根据实施方案24或25任一项的疾病响应的治疗药剂的用途。 

29.用于识别能够调节SorLA与GDNF-家族配体受体，如GFRα1、2、3或4之间的相互作用的结合伴侣的体外或体内检测法，其包含SorLA和/或GDNF-家族配体受体。 

参考资料 

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实施例

实施例1:SorLA:GFRα1复合物的证实 

用编码SorLA和GFRα1的质粒稳定转染的HEK293细胞与DSP（Pierce）交联，随后细胞溶解。用结合到Gammabind珠粒（GE Healthcare）上的SorLA或GFRα1的抗体（R&D Systems）孵育细胞溶解产物。用SDS上样缓冲液从洗过的珠粒中洗脱沉淀的复合物。免疫印迹分析表明存在SorLA:GFRα1复合物（图5A）。也使用表面等离子体共振（Biacore,Sweden）使用CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM EGTA，0.005%Tween-20）证实SorLA的胞外域与GFRα1的直接相互作用。使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被（图5C）。 

实施例2:SorLA:GFRα2复合物的证实 

用编码SorLA和GFRα2的质粒稳定转染的HEK293细胞与DSP（Pierce）交联，随后细胞溶解。用结合到Gammabind珠粒（GE Healthcare）上的GFRα2的抗体（R&D Systems）孵育细胞溶解产物。用SDS上样缓冲液从洗过的珠粒中洗脱沉淀的复合物。免疫印迹分析表明存在SorLA:GFRα2复合物（图11A）。也使用表面等离子体共振（Biacore,Sweden）使用CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM EGTA，0.005%Tween-20）证实SorLA的胞外域与GFRα2的直接相互作用。使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被。 

实施例3:SorLA:GFRα3复合物的证实 

用编码SorLA和GFRα3的质粒稳定转染的HEK293细胞与DSP（Pierce）交联，随后细胞溶解。用结合到Gammabind珠粒（GE Healthcare）上的GFRα3的抗体（R&D Systems）孵育细胞溶解产物。用SDS上样缓冲液从洗过的珠粒中洗脱沉淀的复合物。免疫印迹分析表明存在SorLA:GFRα3复合物（图11A）。也使用表面等离子体共振（Biacore,Sweden）使用CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM EGTA，0.005%Tween-20）证实SorLA的胞外域与GFRα3的直接相互作用。使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被。 

实施例4:SorLA:GFRα4复合物的证实 

用编码SorLA和GFRα4的质粒稳定转染的HEK293细胞与DSP（Pierce）交联，随后细胞溶解。用结合到Gammabind珠粒（GE Healthcare）上的GFRα4的抗体（R&D Systems）孵育细胞溶解产物。用SDS上样缓冲液从洗过的珠粒中洗脱沉淀的复合物。免疫印迹分析表明存在SorLA:GFRα4复合物（图11A）。也使用表面等离子体共振（Biacore,Sweden）使用CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM EGTA，0.005%Tween-20）证实SorLA的胞外域与GFRα4的直接相互作用。使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被。 

实施例5:SorLA:GDNF复合物的证实 

使用表面等离子体共振（Biacore,Sweden）使用CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM EGTA，0.005%Tween-20）证实SorLA 的胞外域与GDNF的直接相互作用。使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被（图3）。 

实施例6:调节包含SorLA和GFRα1的复合物的用于识别受体拮抗剂/激动剂的基于细胞的筛选法 

可以在细胞系统中测定通过Vps10p结构域受体家族的成员结合、内化或信号传导。用候选试剂（抑制剂/拮抗剂）化合物孵育例如用分别编码所有三种受体的质粒转染后的表达SorLA和GFRα1和GDNF的细胞。所述试剂可例如代表受体SorLA和GFRα1任一的抗体，结合配体，如SorLA前肽或各受体的片段。在孵育后，洗涤细胞，蛋白质复合物与二硫代双[琥珀酰亚氨基丙酸酯](DSP,Pierce)交联，随后在含有蛋白酶抑制剂(完全,Roche Applied Science,Switzerland)的TNE缓冲液（10mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1%nonides P-40,pH.8）中细胞溶解。用结合在琼脂糖珠（GE Healthcare）上的SorLA或GFRα1的抗体（R&D Systems）孵育该细胞溶解产物。从洗过的珠粒上洗脱沉淀的复合物（酸性缓冲液和随后中和）。洗脱液中的SorLA和GFRα1的免疫印迹分析揭示候选化合物是否能够抑制SorLA:GFRα1复合物形成。 

实施例7:用于识别破坏GFRα1和/或GDNF与SorLA的相互作用的试剂的体外检测法 

可以通过例如表面等离子体共振分析（Biacore,Sweden）使用例如CaHBS作为标准运行缓冲液（10mM HEPES,pH7.4，140mM NaCl、2mM CaCl₂、1mM EGTA和0.005%Tween-20）进行配体，如小有机分子、肽或可溶受体（包括但不限于SorLA、GFRα1和GDNF）直接结合到固定的蛋白质上的测定。这种试剂可衍生自成熟GDNF的N-末端（图17）或GFRα1结构域1（图16）。使用NHS/EDC方法如供应商所述活化来自Biacore的生物传感器芯片（CM5,目录号BR-1000-14），接着用SorLA包被。可以采用几种不同的方法：可以通过将结合信号（响应单位）与用受体之一固定化的芯片进行比较和将这一信号与空流细胞进行比较来识别候选试剂。在另一方法中，可以在不存在或存在推定抑制剂的情况下监测已确定的配体的抑制。信号差描绘拮抗剂的抑制潜力。通过使用Biaevaluation3.1版程序就亲和力评估和抑制潜力拟合传感图来分析收集的数据。表面等离子体共振检测法容易转化成其它检测法，其中将Vps10p-结构域受体、该配体或推定抑制剂固定在固相上。例如，通过在50mM NaHCO₃,pH9.6中在4℃下孵育16小时来将受体固定在例如来自Nunc的Maxisorp微滴定孔（目录号439454）中。在室温下使用5%牛血清白蛋白（Sigma,目录号A9647）封闭2小时后，该孔用MB缓冲液（10mM HEPES,pH7.4、140mM NaCl、220 mM CaCl₂和1mM MgCl₂）洗涤3次，然后在不存在或存在各种浓度的候选抑制剂的情况下用标记的配体（例如碘化的）孵育。在孵育（例如在4℃下整夜）和用MB缓冲液洗涤后，通过添加10%SDS释放结合的放射性。测定示踪剂与仅用牛血清白蛋白包被的孔的非特异性结合并从在结合实验中测得的值中减去。可以使用来自GraphPad的Prism软件，版本4将结合数据点拟合为结合方程式。同样地，可以标记拮抗剂并直接测量与固定的受体的结合。在另一设置中，可以将受体、配体或拮抗剂固定在闪烁珠上并在邻近闪烁分析法中测量结合，其中已使用放射性标记受体结合分子。 

实施例8:用于识别能够抑制SorLA的试剂的基于细胞的筛选法 

针对SorLA:GFRα1:GDNF受体复合体实体的拮抗剂可充当该整个复合物的抑制剂。因此其与筛选能够结合例如Vps10p-结构域受体实体的试剂相关。在本实施例中描述了这种方法。可以在细胞系统中测定通过Vps10p结构域受体家族的成员结合、内化或信号传导。在分别不存在和存在候选抑制剂/拮抗剂化合物的情况下用放射性标记的配体孵育内源性地或例如用含有该受体的cDNA的质粒转染后表达受体之一的细胞。在孵育后，洗涤细胞以除去非特异性结合，随后收获。使用本领域技术人员公知的常规放射性配体检测法测定候选拮抗剂/抑制剂与受体的结合程度。参见例如Bylund和Toews(1993)Am J Physiol.265(5Pt1):L421-9，名为“Radioligand binding methods:practical guide and tips”。也可以如Nykjaer等人(1992)FEBS300:13-和Nielsen等人(2001)EMBO J中所述测定胞吞作用/内化。 

实施例9:用于识别能够调节通过SorLA逆行分选GFRα受体的试剂的基于细胞的筛选法 

在表达SorLA和GFRα受体的细胞中通过荧光标签或荧光抗体标记表面局域化的GFRα受体，并用SorLA激动剂/拮抗剂孵育30分钟。随后如图6和图11中所示使用共焦显微术评估内化的GFRα受体量。 

实施例10:用于识别能够提高Ret磷酸化的试剂的基于细胞的筛选法 

在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下用浓度递增的GDNF刺激SY5Y成神经细胞瘤细胞一段指定时间。溶解细胞并用结合到Gammabind珠粒（GE Healthcare）上的抗Ret抗体（R&D Systems）孵育该细胞溶解产物。从洗过的珠粒中洗脱沉淀的蛋白质（酸性缓冲液，随后中和）并使用抗-磷酸酪氨酸(Milipore)通过免疫印迹法目测磷酸化Ret（如图9中所示）。 

实施例11:用于识别能够提高细胞存活的试剂的基于细胞的筛选法 

通过胰蛋白酶-EDTA处理收获SY5Y成神经细胞瘤细胞，此后再悬浮在含有1%glutamax和 1%P/S（青霉素和链霉素）的无酚红（LONZA）的DMEM中。随后将细胞铺板：在96孔板中，20.000细胞/孔，最终体积50微升。第二天，在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下用浓度递增的GDNF刺激细胞。添加GDNF等后的最终体积为100微升。每种样品一式四份制造。细胞在它们的正常孵育器中孵育72小时。在72小时后，制备MultiTox-Fluor Multiplex细胞毒性检测试剂（Promega）并如制造商的技术支持文件所示添加到细胞中。简言之，对各样品而言，混合100微升测定缓冲液、0.1微升GF-AFC底物和0.1微升bis-AAF-R110底物并添加到孔中。在定轨振荡器(

KS260Basic)上以240rpm混合1分钟后，该板在37℃下孵育30分钟。此后用Wallac VICTOR3TM1420多重标记计数器(Perkin ElmerTM Lifesciences)测量荧光。在400nmEx/505nmEm下测量存活力。信号与存活成正比。 

测试存活的另一方式是在盖玻片而非96孔板上孵育细胞。在72小时后，可以在室温下在PBS中的4%低聚甲醛（PFA）中固定细胞30分钟并使用含有DAPI的封片剂封固到载玻片上。可以在荧光显微镜中直接计数DAPI染色的细胞。 

（如图9D中所示）。 

实施例12:通过SorLA拮抗剂/激动剂调节原代神经元细胞培养物中的GDNF家族配体活性 

由野生型小鼠大脑制备原代神经元培养物。 

在出生后0-2天，切出大脑，离解细胞并在例如10ng/ml GDNF存在下和在存在或不存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下铺板。在培养物体外成熟1-2周后，计数存活的神经元数。 

实施例13:通过SorLA拮抗剂/激动剂调节原代多巴胺能神经元中的GDNF活性 

由P0-P2大鼠的腹侧被盖区制备原代多巴胺能神经元。将大鼠幼畜断头，分离大脑并置于冷PBS中。大脑腹侧向下放置。最初刀口穿过整个大脑尾部至中脑曲，第二刀位于该曲喙突端，将切片平放。切片的腹侧缘沿下丘脑的顶部切割，下一刀是切片的腹侧缘与脑室孔之间的大致中间处。将组织切成更小的片段并置于冷L15培养基（Gibco,Invitrogen）中。组织用温木瓜酶溶液（L15培养基，2mM EDTA,20单位/毫升木瓜酶(TMWorthington,Medinova),0.5mM犬尿喹啉酸和NaOH（以将pH调节至大约7）在37℃下孵育30分钟。除去培养基，在神经元培养基（NeurobasalTM培养基，无L-谷氨酰胺(Gibco,Invitrogen)、FBS、B-27(Invitrogen)、glutamax(Invitrogen)、primocin(Amaxa)、5-氟脱氧尿苷(Sigma)和尿苷(Sigma)）中通过温和研磨分解组织。将神经元旋转沉淀（800rpm,5min），在神经元培养基 中稀释该小粒，并在10ng/ml GDNF存在下和在存在或不存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下在皮质神经胶质细胞层上铺板。神经元在37℃下体外孵育1周，此后它们在室温下用在PBS中的4%低聚甲醛（PFA）固定30分钟。此后它们在含有0.1%Triton X-100的PBS中洗涤两次15分钟，接着用在PBS中的10%FBS孵育20分钟。此后在4℃下用抗-酪氨酸羟化酶抗体（Pel freeze,1:1000）在PBS中的10%FBS中孵育盖玻片整夜。第二天，盖玻片在含有0.1%Triton X-100的PBS中洗涤三次，并在4℃下用

488羊抗兔IgG（Invitrogen,1:1000）在PBS中的10%FBS中孵育整夜。盖玻片此后在PBS中的0.1%Triton X-100中洗涤2x15min、在PBS中洗涤1x15min和在水中洗涤1x15min。该盖玻片用Dako荧光封片剂(Dako,Denmark)封固到载玻片上。通过计数酪氨酸羟化酶阳性神经元的数量来将存活神经元数计分（如图12中所示）。 

实施例14:SorLA拮抗剂/激动剂对安非他明诱发的过度活跃的作用 

小鼠用SorLA拮抗剂或激动剂预处理1-30天，并在由(40x40x35cm)透明Plexiglas台构成的旷场试验中测试安非他明诱发的过度活跃。将该台安装在连接至计算机的摄像机下的在Any-maze跟踪系统控制下的昏暗房间中。将小鼠置于该台子的角落中，并如图13中所示在40分钟期间内记录它们的活动。腹腔内或静脉给予安非他明（0.1-10mg/kg）。 

实施例15:SorLA拮抗剂/激动剂对焦虑相关行为的作用 

在高架十字迷宫中测试野生型和SorLA转基因小鼠的焦虑相关行为。使用高架十字迷宫作为抑郁、躁狂和焦虑相关行为的实验模型。用抗抑郁或抗焦虑药处理小鼠通常提高游走距离、线路交叉数和进入数和在开臂中度过的时间。高架十字迷宫升至地板上方40厘米，并由两个具有15厘米高的不透明壁的相反封闭臂和两个相同尺寸的相反开臂（35x5cm）构成。将该高架十字迷宫安装在Any-maze跟踪系统控制下连接至计算机的摄像机下的暗光房间中。对各小鼠进行10分钟测试期并如图14中所述测量进入数和在开臂中度过的时间。进行类似实验，其中小鼠用SorLA拮抗剂或激动剂预处理1-30天。 

实施例16:SorLA拮抗剂/激动剂对安非他明诱发的敏感的作用 

成年小鼠用4mg/kg安非他明或盐水预处理，每隔一天一次，5天，同时也用SorLA拮抗剂或激动剂处理，并在旷场中测试自主活动。在最后一次安非他明预处理后继续用SorLA拮抗剂/激动剂处理1周。在第16天，进行敏感试验，其中所有小鼠接受安非他明（2mg/kg）的致敏注射并在旷场中测试自主活动。 

实施例17:SorLA拮抗剂/激动剂对小鼠中的MPTP-诱发的神经毒性的保护作用 

用20mg/kg MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶，对多巴胺能神经元有选择性毒性的试 剂）每天注射成年小鼠，持续4天，含或不含SorLA拮抗剂/激动剂。在注射前1天和在停止注射后2天，在由(40x40x35cm)透明Plexiglas台构成的旷场试验中记录运动活动。将该台安装在Any-maze跟踪系统控制下的连接至计算机的摄像机下的昏暗房间中。将小鼠置于该台子的角落中，并在60分钟期间内记录它们的活动。最后，用4%低聚甲醛灌注小鼠以使用免疫组织化学评估各种形态标记，如酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体。 

实施例18:用于识别能够提高细胞分化的试剂的基于细胞的筛选法 

用胰蛋白酶-EDTA处理收获成神经细胞瘤细胞。将细胞再悬浮在含有10%FBS和1%P/S（青霉素和链霉素）的DMEM-F12培养基中并接种在6孔板中。第二天，除去培养基并用新鲜培养基和浓度递增的GDNF在不存在或存在SorLA拮抗剂或激动剂的情况下孵育细胞。细胞在它们的正常孵育器中孵育72小时，此后用连接至照相机的立体显微镜（Leica DC300）目测细胞。通过将神经突定义为是细胞直径的两倍长的突起，对神经突增生计分。 

实施例19:处理方法 

将具有肽/多肽性质的所得开发出的活性剂（可能基于抗体）冻干以在使用前溶解或作为即用型溶液，以使其可用于肠胃外给药途径（例如静脉（I.V.）、肌肉内（I.M.）或皮下（S.C.）。固体剂型的粘膜施用也代表这种情况中的一种可能性。如果所得开发出的活性剂具有化学性质，制备用于口服以及潜在途径，例如用于S.C.或I.M.用途的制剂。开发出的药剂用于预防用途或慢性给药以用于长期治疗。在这种情况下，活性剂干扰并由此阻碍会造成精神和行为障碍的症状的分子事件的进程发生。如果此时开发基因试验以诊断倾向于产生精神和行为障碍的个体，应使用可能与这种诊断学相关的药剂。如果已经产生精神和行为障碍；用该药剂进行慢性治疗代表另一可能性。该原理始终能抑制造成该疾病的症状的分子事件。最后，可以与用于神经或精神和行为障碍的常规疗法，例如与抗精神病药、抗抑郁药或锂一起共同给予该药剂。 

实施例20:用于识别能够通过SorLA调节GDNF家族配体(GFL)内化和退化的试剂的基于细胞的筛选法 

GDNF或另一GFL在存在或不存在SorLA激动剂/拮抗剂（例如抗体）的情况下与表达SorLA和GFRα受体的细胞孵育2-120分钟。通过荧光标签或荧光抗体标记GDNF或其它GFL。随后如图6和图11和图21中所示使用共焦显微术评估内化的GDNF或GFL的量。 

序列表 

SEQ ID NO1:人SorLA多肽 

MATRSSRRESRLPFLFTLVALLPPGALCEVWTQRLHGGSAPLPQDRGFLVVQGDPRELRL WARGDARGASRADEKPLRRKRSAALQPEPIKVYGQVSLNDSHNQMVVHWAGEKSNVIVAL ARDSLALARPKSSDVYVSYDYGKSFKKISDKLNFGLGNRSEAVIAQFYHSPADNKRYIFA DAYAQYLWITFDFCNTLQGFSIPFRAADLLLHSKASNLLLGFDRSHPNKQLWKSDDFGQT WIMIQEHVKSFSWGIDPYDKPNTIYIERHEPSGYSTVFRSTDFFQSRENQEVILEEVRDF QLRDKYMFATKVVHLLGSEQQSSVQLWVSFGRKPMRAAQFVTRHPINEYYIADASEDQVF VCVSHSNNRTNLYISEAEGLKFSLSLENVLYYSPGGAGSDTLVRYFANEPFADFHRVEGL QGVYIATLINGSMNEENMRSVITFDKGGTWEFLQAPAFTGYGEKINCELSQGCSLHLAQR LSQLLNLQLRRMPILSKESAPGLIIATGSVGKNLASKTNVYISSSAGARWREALPGPHYY TWGDHGGIITAIAQGMETNELKYSTNEGETWKTFIFSEKPVFVYGLLTEPGEKSTVFTIF GSNKENVHSWLILQVNATDALGVPCTENDYKLWSPSDERGNECLLGHKTVFKRRTPHATC FNGEDFDRPVVVSNCSCTREDYECDFGFKMSEDLSLEVCVPDPEFSGKSYSPPVPCPVGS TYRRTRGYRKISGDTCSGGDVEARLEGELVPCPLAEENEFILYAVRKSIYRYDLASGATE QLPLTGLRAAVALDFDYEHNCLYWSDLALDVIQRLCLNGSTGQEVIINSGLETVEALAFE PLSQLLYWVDAGFKKIEVANPDGDFRLTIVNSSVLDRPRALVLVPQEGVMFWTDWGDLKP GIYRSNMDGSAAYHLVSEDVKWPNGISVDDQWIYWTDAYLECIERITFSGQQRSVILDNL PHPYAIAVFKNEIYWDDWSQLSIFRASKYSGSQMEILANQLTGLMDMKIFYKGKNTGSNA CVPRPCSLLCLPKANNSRSCRCPEDVSSSVLPSGDLMCDCPQGYQLKNNTCVKQENTCLR NQYRCSNGNCINSIWWCDFDNDCGDMSDERNCPTTICDLDTQFRCQESGTCIPLSYKCDL EDDCGDNSDESHCEMHQCRSDEYNCSSGMCIRSSWVCDGDNDCRDWSDEANCTAIYHTCE ASNFQCRNGHCIPQRWACDGDTDCQDGSDEDPVNCEKKCNGFRCPNGTCIPSSKHCDGLR DCSDGSDEQHCEPLCTHFMDFVCKNRQQCLFHSMVCDGIIQCRDGSDEDAAFAGCSQDPE FHKVCDEFGFQCQNGVCISLIWKCDGMDDCGDYSDEANCENPTEAPNCSRYFQFRCENGH CIPNRWKCDRENDCGDWSDEKDCGDSHILPFSTPGPSTCLPNYYRCSSGTCVMDTWVCDG YRDCADGSDEEACPLLANVTAASTPTQLGRCDRFEFECHQPKTCIPNWKRCDGHQDCQDG RDEANCPTHSTLTCMSREFQCEDGEACIVLSERCDGFLDCSDESDEKACSDELTVYKVQN LQWTADFSGDVTLTWMRPKKMPSASCVYNVYYRVVGESIWKTLETHSNKTNTVLKVLKPD TTYQVKVQVQCLSKAHNTNDFVTLRTPEGLPDAPRNLQLSLPREAEGVIVGHWAPPIHTH GLIREYIVEYSRSGSKMWASQRAASNFTEIKNLLVNTLYTVRVAAVTSRGIGNWSDSKSI TTIKGKVIPPPDIHIDSYGENYLSFTLTMESDIKVNGYVVNLFWAFDTHKQERRTLNFRG SILSHKVGNLTAHTSYEISAWAKTDLGDSPLAFEHVMTRGVRPPAPSLKAKAINQTAVEC TWTGPRNVVYGIFYATSFLDLYRNPKSLTTSLHNKTVIVSKDEQYLFLVRVVVPYQGPSS DYVVVKMIPDSRLPPRHLHVVHTGKTSVVIKWESPYDSPDQDLLYAVAVKDLIRKTDRSY KVKSRNSTVEYTLNKLEPGGKYHIIVQLGNMSKDSSIKITTVSLSAPDALKIITENDHVL  LFWKSLALKEKHFNESRGYEIHMFDSAMNITAYLGNTTDNFFKISNLKMGHNYTFTVQAR CLFGNQICGEPAILLYDELGSGADASATQAARSTDVAAVVVPILFLILLSLGVGFAILYT KHRRLQSSFTAFANSHYSSRLGSAIFSSGDDLGEDDEDAPMITGFSDDVPMVIA 

SEQ ID NO2:人SorLA前肽 

EVWTQRLHGGSAPLPQDRGFLVVQGDPRELRLWARGDARGASRADEKPLRRKR 

SEQ ID NO3:人SorLA Vps10p-结构域 

SAALQPEPIKVYGQVSLNDSHNQMVVHWAGEKSNVIVALARDSLALARPKSSDVY VSYDYGKSFKKISDKLNFGLGNRSEAVIAQFYHSPADNKRYIFADAYAQYLWITF DFCNTLQGFSIPFRAADLLLHSKASNLLLGFDRSHPNKQLWKSDDFGQTWIMIQE HVKSFSWGIDPYDKPNTIYIERHEPSGYSTVFRSTDFFQSRENQEVILEEVRDFQ LRDKYMFATKVVHLLGSEQQSSVQLWVSFGRKPMRAAQFVTRHPINEYYIADASE DQVFVCVSHSNNRTNLYISEAEGLKFSLSLENVLYYSPGGAGSDTLVRYFANEPF ADFHRVEGLQGVYIATLINGSMNEENMRSVITFDKGGTWEFLQAPAFTGYGEKIN CELSQGCSLHLAQRLSQLLNLQLRRMPILSKESAPGLIIATGSVGKNLASKTNVY ISSSAGARWREALPGPHYYTWGDHGGIITAIAQGMETNELKYSTNEGETWKTFIF SEKPVFVYGLLTEPGEKSTVFTIFGSNKENVHSWLILQVNATDALGVPCTENDYK LWSPSDERGNECLLGHKTVFKRRTPHATCFNGEDFDRPVVVSNCSCTREDYECDF GFKMSEDLSLEVCVPDPEFSGKSYSPPVPCPVGSTYRRTRGYRKISGDTCSGGDV EARLEGELVPCPLAEE 

SEQ ID NO4:人GFRα1多肽同种型a 

MFLATLYFALPLLDLLLSAEVSGGDRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNF SLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSP YEPVNSRLSDIFRVVPFISDVFQQVEHIPKGNNCLDAAKACNLDDICKKYRSAYITPCTT SVSNDVCNRRKCHKALRQFFDKVPAKHSYGMLFCSCRDIACTERRRQTIVPVCSYEEREK PNCLNLQDSCKTNYICRSRLADFFTNCQPESRSVSSCLKENYADCLLAYSGLIGTVMTPN YIDSSSLSVAPWCDCSNSGNDLEECLKFLNFFKDNTCLKNAIQAFGNGSDVTVWQPAFPV QTTTATTTTALRVKNKPLGPAGSENEIPTHVLPPCANLQAQKLKSNVSGNTHLCISNGNY EKEGLGASSHITTKSMAAPPSCGLSPLLVLVVTALSTLLSLTETS 

SEQ ID NO5:人GFRα1多肽同种型a,与SorLA的理论结合位点 

DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLY NCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSPYEPVNSRLSDIFRVVPFISDVFQQ 

SEQ ID NO6:人GFRα1多肽同种型b 

MFLATLYFALPLLDLLLSAEVSGGDRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNF  SLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSP YEPVNSRLSDIFRVVPFISVEHIPKGNNCLDAAKACNLDDICKKYRSAYITPCTTSVSND VCNRRKCHKALRQFFDKVPAKHSYGMLFCSCRDIACTERRRQTIVPVCSYEEREKPNCLN LQDSCKTNYICRSRLADFFTNCQPESRSVSSCLKENYADCLLAYSGLIGTVMTPNYIDSS SLSVAPWCDCSNSGNDLEECLKFLNFFKDNTCLKNAIQAFGNGSDVTVWQPAFPVQTTTA TTTTALRVKNKPLGPAGSENEIPTHVLPPCANLQAQKLKSNVSGNTHLCISNGNYEKEGL GASSHITTKSMAAPPSCGLSPLLVLVVTALSTLLSLTETS 

SEQ ID NO7:人GFRα1多肽同种型b,与SorLA的理论结合位点 

DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALKQK SLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSPYEPVNSRLSDIFRVVPFIS 

SEQ ID NO8:人GFRα2多肽 

MILANVFCLFFFLDETLRSLASPSSLQGPELHGWRPPVDCVRANELCAAESNCSSRYRTL RQCLAGRDRNTMLANKECQAALEVLQESPLYDCRCKRGMKKELQCLQIYWSIHLGLTEGE EFYEASPYEPVTSRLSDIFRLASIFSGTGADPVVSAKSNHCLDAAKACNLNDNCKKLRSS YISICNREISPTERCNRRKCHKALRQFFDRVPSEYTYRMLFCSCQDQACAERRRQTILPS CSYEDKEKPNCLDLRGVCRTDHLCRSRLADFHANCRASYQTVTSCPADNYQACLGSYAGM IGFDMTPNYVDSSPTGIVVSPWCSCRGSGNMEEECEKFLRDFTENPCLRNAIQAFGNGTD VNVSPKGPSFQATQAPRVEKTPSLPDDLSDSTSLGTSVITTCTSVQEQGLKANNSKELSM CFTELTTNIIPGSNKVIKPNSGPSRARPSAALTVLSVLMLKLAL 

SEQ ID NO9:人GFRα2多肽,短同种型 

MILANVFCLFFFLGTGADPVVSAKSNHCLDAAKACNLNDNCKKLRSSYISICNREISPTE RCNRRKCHKALRQFFDRVPSEYTYRMLFCSCQDQACAERRRQTILPSCSYEDKEKPNCLD LRGVCRTDHLCRSRLADFHANCRASYQTVTSCPADNYQACLGSYAGMIGFDMTPNYVDSS PTGIVVSPWCSCRGSGNMEEECEKFLRDFTENPCLRNAIQAFGNGTDVNVSPKGPSFQAT QAPRVEKTPSLPDDLSDSTSLGTSVITTCTSVQEQGLKANNSKELSMCFTELTTNIIPGS NKVIKPNSGPSRARPSAALTVLSVLMLKLAL 

SEQ ID NO10:人GFRα3多肽 

MVRPLNPRPLPPVVLMLLLLLPPSPLPLAAGDPLPTESRLMNSCLQARRKCQADPTCSAA YHHLDSCTSSISTPLPSEEPSVPADCLEAAQQLRNSSLIGCMCHRRMKNQVACLDIYWTV HRARSLGNYELDVSPYEDTVTSKPWKMNLSKLNMLKPDSDLCLKFAMLCTLNDKCDRLRK AYGEACSGPHCQRHVCLRQLLTFFEKAAEPHAQGLLLCPCAPNDRGCGERRRNTIAPNCA LPPVAPNCLELRRLCFSDPLCRSRLVDFQTHCHPMDILGTCATEQSRCLRAYLGLIGTAM  TPNFVSNVNTSVALSCTCRGSGNLQEECEMLEGFFSHNPCLTEAIAAKMRFHSQLFSQDW PHPTFAVMAHQNENPAVRPQPWVPSLFSCTLPLILLLSLW 

SEQ ID NO11:人GFRα3多肽,同种型2 

MVRPLNPRPLPPVVLMLLLLLPPSPLPLAAGDPLPTESRLMNSCLQARRKCQADPTCSAA YHHLDSCTSSISTPLPSEEPSVPADCLEAAQQLRNSSLIGCMCHRRMKNQVACLDIYWTV HRARSLDSDLCLKFAMLCTLNDKCDRLRKAYGEACSGPHCQRHVCLRQLLTFFEKAAEPH AQGLLLCPCAPNDRGCGERRRNTIAPNCALPPVAPNCLELRRLCFSDPLCRSRLVDFQTH CHPMDILGTCATEQSRCLRAYLGLIGTAMTPNFVSNVNTSVALSCTCRGSGNLQEECEML EGFFSHNPCLTEAIAAKMRFHSQLFSQDWPHPTFAVMAHQNENPAVRPQPWVPSLFSCTL PLILLLSLW 

SEQ ID NO12:人GFRα4多肽 

MVRCLGPALLLLLLLGSASSVGGNRCVDAAEACTADARCQRLRSEYVAQCLGRAAQGGCP RARCRRALRRFFARGPPALTHALLFCPCAGPACAERRRQTFVPSCAFSGPGPAPPSCLEP LNFCERSRVCRCARAAAGPWRGWGRGLSPAHRPPAAQASPPGLSGLVHPSAQRPRRLPAG PGRPLPARLRGPRGVPAGTAVTPNYVDNVSARVAPWCDCGASGNRREDCEAFRGLFTRNR CLDGAIQAFASGWPPVLLDQLNPQGDPEHSLLQVSSTGRALERRSLLSILPVLALPALL 

SEQ ID NO13:人神经降压素多肽 

QLYENKPRRPYIL 

SEQ ID NO14:人神经降压素多肽理论结合位点 

YIL 

SEQ ID NO15:人神经降压素多肽理论结合位点 

PYIL 

SEQ ID NO16:人GDNF多肽 

MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMD FIQA 

TIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYET KEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRK HSAKRCGCI 

SEQ ID NO17:人GDNF多肽,前肽 

FPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKR 

SEQ ID NO18:人GDNF多肽,结合位点 

SPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKN 

Claims (18)

1.通过调节或抑制 SorLA与GFRα1之间的相互作用来提高需要其的患者脑中的GDNF的细胞外水平的方法。

2.根据权利要求1的方法，其中抑制GDNF的内化和/或退化。

3.通过调节SorLA与GFRα1之间的相互作用来提高神经元，如多巴胺能神经元的存活的方法。

4.根据前述权利要求任一项的方法，其用于治疗选自以下的疾病：损伤诱导的神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和/或双相障碍（躁郁症）。

5.根据前述权利要求任一项的方法，其中用于调节和/或抑制SorLA与GFRα1之间的相互作用的试剂是抗SorLA或GFRα1的抗体。

6.根据权利要求5的方法，其中所述抗体结合SorLA或GFRα1的胞外域上的一个或多个结合位点。

7.根据权利要求6的方法，其中所述结合位点包括SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6 和/或SEQ ID NO: 7或与SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6 和/或SEQ ID NO: 7具有至少80%，如至少85%、90%、95%或98%序列同一性。

8.根据权利要求5的方法，其中所述抗体是多克隆或单克隆的。

9.根据权利要求5的方法，其中所述抗体是分离的或重组的。

10.根据权利要求5的方法，其中所述抗体是人源化、嵌合或单链抗体。

11.包含根据权利要求5-10任一项的抗体和载体的药物组合物。

12.通过施用有效量的如权利要求5-10任一项中所述的抗体或根据权利要求11的药物组合物来治疗与神经元，如多巴胺能神经元的损失相关的疾病和/或用于使神经元，如多巴胺能神经元存活或受保护的方法。

13.根据权利要求12的方法，其用于治疗选自以下的疾病：损伤诱导的神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和/或双相障碍（躁郁症）。

14.根据权利要求5-10任一项的抗体或根据权利要求11的药物组合物，其用于通过调节SorLA与GFRα1之间的相互作用来提高患者脑中的GDNF的细胞外水平。

15.根据权利要求14的抗体或药物组合物，其中抑制GDNF的内化和/或退化。

16.根据权利要求5-10任一项的抗体或根据权利要求11的药物组合物，其用于治疗与神经元，如多巴胺能神经元的损失相关的疾病，和/或用于使神经元，如多巴胺能神经元存活或受保护。

17.根据权利要求14-16的抗体或药物组合物，其用于治疗选自以下的疾病：损伤诱导的神经细胞死亡、脊髓损伤、周围神经损伤、脑缺血、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、神经性疼痛、癫痫、癌症、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、注意力缺陷和多动症（ADHD）、药物滥用、焦虑障碍和/或双相障碍（躁郁症）。

18.根据权利要求5-10任一项的抗体或根据权利要求11的药物组合物用于制备根据权利要求14-17任一项的疾病的治疗药剂的用途。

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