JP2013167614A - 糖鎖アレイの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 グリッドマーカーとしてのローダミンなどの蛍光色素をグリッドマーカーとして用いる糖鎖アレイの製造方法であって、蛍光色素による汚染を除去することが可能な製造方法を提供すること。
【解決手段】 アニオン性界面活性剤を含む溶液で基板上の糖鎖を洗浄することにより、蛍光色素とグリコサミノグリカンとの結合によるこのような汚染を効果的に除去することが可能であることを見出した。
【選択図】 なし

Description

本発明は、カチオン性蛍光色素をグリッドマーカーとして用い、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖をプローブとして用いる糖鎖アレイの製造方法に関する。

生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。糖鎖分子については、特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などとの関係について研究がなされており、その研究成果を基に新たな医薬や医療材料の開発が試みられている。しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。

このような状況の下、糖鎖分析の効率化を図るために、複数の糖鎖が基板上に固定化されている糖鎖アレイの開発が行われている（例えば、特許文献１）。

糖鎖アレイを用いて、基板上に固定化された糖鎖と検出対象物質との結合を検出する場合、基板上の複数の糖鎖の中から、検出対象物質との結合が検出された糖鎖を特定する必要がある。この目的のため、各糖鎖のグリッド位置を特定する指標となるマーカー物質を基板上に固定化することが行われている（例えば、特許文献２）。そして、この目的で使用されるマーカー物質はグリッドマーカーと呼ばれている。

特開２０１１−１９１２８６号公報 特開２０００−２７０８９６号公報

DNAアレイなどにおけるグリッドマーカーとしては、これまでローダミンなどのカチオン性蛍光色素が好適に利用されてきた。そこで、本発明者らは、グリッドマーカーとしてローダミンを用いて、種々の糖鎖が固定化された糖鎖アレイの製造を試みた。しかしながら、作製した糖鎖アレイにおけるローダミンによる汚染について確認したところ、固定化された糖鎖の中でグリコサミノグリカンについては、ローダミンの結合による汚染が生じることが判明した（後述の比較例を参照のこと）。

本発明は、このような新規な技術的課題の認識に起因してなされたものであり、その目的は、ローダミンなどの蛍光色素をグリッドマーカーとして用い、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖をプローブとして用いる糖鎖アレイの製造方法であって、このような蛍光色素による汚染を除去することが可能な製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アニオン性界面活性剤を含む溶液で基板上の糖鎖を洗浄することにより、蛍光色素とグリコサミノグリカンとの結合によるこのような汚染を効果的に除去することが可能であることを見出した。

すなわち、本発明は、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素が固定化された糖鎖アレイの製造方法であって、（ａ）グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素を基板上に固定化する工程、および（ｂ）アニオン性界面活性剤を含む溶液で基板上の糖鎖を洗浄する工程、を含む方法を提供するものである。

本発明の方法の一つの好ましい態様は、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素を固定化する基板が、糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆された基板であり、工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、基板を被覆している高分子化合物における余剰官能基をキャッピングする工程を含む方法である。

本発明の方法の他の好ましい態様は、カチオン性蛍光色素がローダミンである、前記方法である。

本発明の方法の他の好ましい態様は、アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、前記方法である。

本発明によれば、グリッドマーカーとしてカチオン性蛍光色素を用いた場合でも、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖が固定化された糖鎖アレイを、高品質で、すなわち、蛍光色素による汚染が除去された状態で、製造することが可能となる。

本発明は、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素が固定化された糖鎖アレイの製造方法を提供する。

本発明において「糖鎖アレイ」とは、複数の糖鎖を基板上に配置した器具を意味する。

本発明の糖鎖アレイの製造方法においては、まず、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素を基板上に固定化する（工程（ａ））。

本発明において「グリコサミノグリカン」とは、硫酸基が付加した二糖の繰り返し構造からなる多糖を意味する。本発明におけるグリコサミノグリカンとしては、例えば、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケタラン硫酸などが挙げられるが、これらに制限されない。

本発明において「グリッドマーカー」とは、基板上に固定化された各糖鎖のグリッド位置を特定する指標となるマーカー物質を示す。

本発明においては、グリッドマーカーとして「カチオン性蛍光色素」を用いる。カチオン性蛍光色素としては、基板上に固定化された状態で検出可能な蛍光を発するものであり、かつ、プラスに帯電しているものであれば特に制限はないが、例えば、ローダミン（テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン６Ｇエキストラ、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン１１６、ローダミン３Ｂ、ローダミン１９、スルホローダミン、アクリジンレッド、アシッドレッド５２、ピロニンＧ、ローダミンＳ、ローダミンＧ、エチルローダミンＢ、ローダミン４Ｇ、Ｃ．Ｉ．アシッドレッド２８９、ローダミン３ＧＯ、Ｃ．Ｉ．アシッドレッド３８８、スルホローダミンＧ、及びこれらの混合物）、Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−［５−（Ｎ”−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｅｎｔｙｌ］ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ
ｃｈｌｏｒｉｄｅなどが挙げられる。

本発明における「基板」としては、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素を固定化しうるものであれば特に制限はないが、好ましくは、糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆された基板である。

本発明において基板上に被覆する「糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物」としては、特に制限はないが、一級アミノ基を有するユニットを含む高分子化合物が好ましい。当該高分子化合物は、さらに、親水性を保持するためのユニットおよび疎水性基を有するユニットを含むことが好ましい。この形態の基板においては、親水性を保持するためのユニットが検出対象物質の基板への物理的吸着（非特異的吸着）を抑制する役割を、疎水性基を有するユニットが高分子化合物を基板に結合させる役割を、それぞれ果たす。

本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、下記一般式〔１〕の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル残基とオキシルアミノ残基を含むスペーサーＹを解した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを、セミカルバジド基の場合、ＺはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨを、チオセミカルバジドの場合、ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として標記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式〔２〕または〔３〕であることが好ましく、より好ましくは〔２〕である。

本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットの組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｎの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜４０％である。組成値が下限地を下回ると糖鎖を十分量固定化できなくなる。また、上限値を上回ると非特異吸着が増加する。

高分子化合物に含まれる親水性のユニットはホスホリルコリン基に代表されるもので、特に構造を限定するものではないが、前記一般式〔１〕のユニットは、構成単位の左部の構成単位で示されように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。中でもＸはエチレンオキシ基であることが最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基の繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。

高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全ユニットに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは１０〜８０％である。組成比が下限値を下回ると親水性が弱くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。

本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、前記一般式［１］の構成単位の中央部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基が炭素数２〜１０のアルキル基である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。高分子化合物に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチックなど、疎水性の基板に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。式中、ｍは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。

高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは２０〜８０％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。

本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくとも一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマー、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくとも一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマー、ホスホリルコリン基を有するモノマー、および疎水性基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。

一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［４］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子またはＮＨ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。

保護基Ｗとしてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。中でもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）などが好適に用いられる。

具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。

脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。

ホスホリルコリン基を有するモノマーとしては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリンなどが挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。

疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ブチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。

一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基などが好適である。

具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。

本発明の高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれのモノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールなどアルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテルなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。

本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。

脱保護は前述のトリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができるが、脱保護の時期に関しては、以下の通りである。

通常は重合が完了し、高分子化合物が作製できた段階で行うことが一般的であり、重合終了後に脱保護を行うことで該高分子化合物を得ることができる。

一方、本発明においては、基板表面に該高分子化合物を被覆することにより糖鎖の非特異的吸着を抑制する性質、及び糖鎖を固定化する性質を容易に付与することが可能である。

この場合、脱保護を行った一級アミノ基を持つ高分子化合物を被覆することも可能であるが、反応性の高い一級アミノ基を持つ高分子材料を溶液にして被覆することは、場合によっては作業中に一級アミノ基が反応して不活化することも考えられる。

従って、脱保護する直前で高分子化合物を精製し、基板表面を被覆した後に、脱保護の反応を行い、基板表面上に一級アミノ基が存在する状態を形成することが望ましい。

基板表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけなどの公知の方法で基板表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。

有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノールなどアルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノンなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールシクロヘキサノールなどアルコール類がプラスチック基板を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。

本発明に用いる「基板」としては、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えば、プラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などを用いることができる。プラスチック製基板の具体例としては、ポリスチレン、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサルフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などが挙げられる。

特に、蛍光観察に用いる基板としては、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマーが有用である。前記基板を用いる場合においては、前記高分子化合物の疎水基が、シクロヘキシル基であると、基板との相互作用が良好で、同じ組成比の高分子材料を他の基板（例えばポリスチレンやガラス基板）に塗布した場合に比べ、吸着量が高くバックグランド値が低い良好な結果となる。

また、環状ポリオレフィンポリマーに、前記高分子化合物を塗布する場合、アミノオキシモノマー１００ｍｏｌ％の高分子化合物に関しては、塗布することができない。一方、ポリスチレンポリマーには塗布可能であるが、夾雑物の非特異的吸着は抑制されず汎用性に乏しい。

糖鎖の基板への固定化方法としては、スポッターを使用して糖鎖が溶解した溶液を点着する方法、糖鎖が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。

糖鎖を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎe−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝剤などが用いられる。

糖鎖を溶解する場合、溶液のｐＨとしては、２〜８であることが好ましい。糖鎖の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。糖鎖の溶液を固定化する温度としては０℃から１００℃が好ましい。

グリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素の基板への固定化方法も、上記糖鎖の場合と同様にして行うことができる。

本発明の製造方法における「基板」として、例えば、糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆された基板を用いる場合には、上記工程（ａ）と後述の工程（ｂ）の間に、基板を被覆している高分子化合物における余剰官能基をキャッピングする工程を含むことができる。

本発明において「余剰官能基」とは、工程（ａ）において、糖鎖が捕捉されなかった官能基を意味する。余剰官能基のキャッピングは、例えば、酸無水物との反応やオキソ酸との縮合により行うことができる。酸無水物は特に限定されないが、反応性からカルボン酸無水物が好ましい。カルボン酸無水物の例としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水安息香酸などが挙げられるが、中でも無水酢酸、無水コハク酸がより好ましい。具体的には、１〜３０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸または無水酢酸水溶液に１０分〜一晩浸漬する。また、オキソ酸も特に限定されないが、反応性からカルボン酸が好ましい。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸などが挙げられるが、中でもギ酸、酢酸が好ましい。この場合、弱酸性条件下、水溶性カルボジイミドを用いて縮合するのが簡便である。

本発明の製造方法においては、次いで、アニオン性界面活性剤を含む溶液で基板上の糖鎖を洗浄する（工程（ｂ））。

洗浄に用いる「アニオン性界面活性剤」としては、具体的には、混合脂肪酸ナトリウム石けん、半硬化牛脂脂肪酸ナトリウム石けん、ステアリン酸ナトリウム石けん、オレイン酸カリウム石けん、ヒマシ油カリウム石けんなどの脂肪酸塩；ドデシル硫酸ナトリウム、高級アルコール硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミンなどのアルキル硫酸エステル塩；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルベンゼンスルホン酸塩；アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルナフタレンスルホン酸塩；ジアルキルスルホコハク酸ナトリウムなどのアルキルスルホコハク酸塩；アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウムなどのアルキルジフェニルエーテルジスルホン酸塩；アルキルリン酸カリウムなどのアルキルリン酸塩；ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウムなどのポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルアリル）硫酸エステル塩；特殊反応型アニオン界面活性剤；特殊カルボン酸型界面活性剤；β−ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物のナトリウム塩、特殊芳香族スルホン酸ホルマリン縮合物のナトリウム塩などのナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物；特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルリン酸エステル；などが挙げられるが、これらに制限されない。中でもアルキル硫酸エステル塩は、洗浄の効果および洗浄後の除去のしやすさといった点で好適に用いられる。とりわけ、ドデシル硫酸ナトリウムは洗浄効果が高く好適である。「アニオン性界面活性剤を含む溶液」としては、該界面活性剤を０．００１〜１％を含有するバッファまたは水溶液であればよく、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いる場合、０．００１〜１％を含有するバッファまたは水溶液、より好ましくは０．０１〜０．５％を含有するバッファまたは水溶液、最も好ましくは０．０５〜０．３％を含有するバッファまたは水溶液である。

アニオン性界面活性剤を含む溶液での洗浄は、必要に応じて複数回（例えば、２回、３回）行ってもよい。また、本発明においては、さらに、水洗いを行い、基板を乾燥させる工程を含んでもよい。

このようにして糖鎖アレイを製造することにより、バックグラウンドの原因となる、グリコサミノグリカンへのカチオン性蛍光色素の結合による汚染を効果的に除去することができる。

以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜実施例＞
(糖鎖固定化マイクロアレイの作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。

２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−Ｎ−[２−[２−[２−(t−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ]エトキシ]エチル]−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。

塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、１６時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。

（糖鎖およびグリッドマーカー（ローダミン）の固定化）
３種類のＮ−グリカン（Ｍ９、ＮＡ２、Ａ２、Ｄｅｘｔｒａ社製）、３種類のＧＡＧ（Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｄｅ２Ｓ Ｈｅｐ、Ｄｅ６Ｓ Ｈｅｐ、Ｉｄｕｒｏｎ社製）およびグリッドマーカーとしてＴＥＴＲＡＭＥＴＨＹＬＲＨＯＤＡＭＩＮＥ ＩＳＯＴＨＩＯＣＹＡＮＡＴＥ ＭＩＸＥＤ ＩＳＯＭＥＲＳ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、８７９１８、以下ローダミンと記載）を下記溶液でそれぞれＮ−グリカンは０．２ｍＭ、ＧＡＧは０．５ｍｇ／ｍＬ、ローダミンは０．２μＭに調製し、基板上にスポットした。その後８０℃で１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。

溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００））
（官能基のキャッピング）
基板を水洗した後、１０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸（和光純薬工業製、１９８−０４３５５）水溶液に浸漬し、室温にて１時間静置した。その後、水洗を１回、０．１％
ＳＤＳ水溶液での洗浄を３回、水洗を２回実施し、基板を乾燥させた。

（ＰＡＳ法によるマイクロアレイ上の糖鎖検出）
糖鎖を固定化後キャッピングおよび洗浄を施したマイクロアレイを、１０ｍｇ／ｍＬに調整した過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬、１９７−０２４０２）水溶液に浸漬し、３７℃で３０分反応させて固定化糖鎖を酸化した。次にマイクロアレイを純水で洗浄後、０．１ｍｇ／ｍＬに調整した６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）の３００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）溶液に浸漬し、３７℃で３０分反応させて糖鎖をビオチン化した。１０ｍＭ ＨＣｌ水溶液で２回、純水で２回洗浄後、このマイクロアレイを０．５μｇ／ｍＬに調整したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３（アマシャム バイオサイエンス、ＰＡ４３００１）の１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファー溶液に浸漬し、遮光下室温にて１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファーで洗浄後、基板を蛍光スキャナーで測定を行った。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝５０）。その結果、固定化したいずれの糖からも、有意なシグナルが得られ、基板に固定化された糖が洗浄工程で脱離していないことが確認できた。

＜比較例＞
実施例と同様に糖鎖のスポット、固定化、無水コハク酸水溶液への浸漬を行った後、水洗を２回実施し、基板を乾燥させた。

基板がローダミンによって汚染されていないことを確認するため、作製した基板を蛍光スキャナーで測定を行った。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝１００）。結果を表１に示す。

３種類のＮ−グリカンについては、実施例、比較例に差はなく、ほぼバックグラウンドと同じであった。しかし、３種類のグリコサミノグリカンについては、実施例ではほぼバックグラウンドと差がなかったが、比較例ではバックグラウンドよりも高い値となった。Ｎ−グリカンに関しては、キャッピング工程において固定化されていないローダミンがスポット部分から流出しても、結合することはないため、洗浄の差によるシグナルの違いが出なかったと考えられる。一方、グリコサミノグリカンに関してはキャッピング工程において、流出したローダミンがグリコサミノグリカンと結合、実施例では、ＳＤＳで洗浄することによりグリコサミノグリカンからローダミンが除去されたのに対し、比較例では、洗浄されずに残存したためと考えられる。

本発明によれば、カチオン性蛍光色素をグリッドマーカーとして用い、グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖をプローブとして用いる糖鎖アレイを、高品質で製造することができる。本発明の方法により製造された糖鎖アレイは、糖鎖の研究や糖鎖が関連する疾患の診断法や治療法の開発に大きく貢献しうるものである。

Claims (4)

1. グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素が固定化された糖鎖アレイの製造方法であって、
   （ａ）グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素を基板上に固定化する工程、および
   （ｂ）アニオン性界面活性剤を含む溶液で基板上の糖鎖を洗浄する工程、
   を含む方法。
2. グリコサミノグリカンを含む複数の糖鎖およびグリッドマーカーとしてのカチオン性蛍光色素を固定化する基板が、糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆された基板であり、工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、基板を被覆している高分子化合物における余剰官能基をキャッピングする工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. カチオン性蛍光色素がローダミンである、請求項１または２に記載の方法。
4. アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。