JP2013138668A - ホタル由来ルシフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】スジグロボタル(Pristolycus sagulatus)に由来し、特定のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列からなり、野生型ルシフェラーゼと比べて同じかまたは高い発光強度を示す発光を誘起する活性を有し、かつ赤色発光を示す、ルシフェラーゼ。
【選択図】図3
Description
一方、様々な生物種由来の各種ルシフェラーゼが知られているが、野生型が赤色を呈するルシフェラーゼは殆ど存在しない。しかし、赤色の発光は光学的に重要であり、他の発光色と組み合わせたり、赤色でしか得られない光透過性を利用したりするというメリットが考えられる。これまで、様々な生物種のルシフェラーゼにおいて、発光基質の改変、補因子の添加、ペプチドや塩基配列等の改変など、試行錯誤しながら赤色の変異体を得る試みがあったものの、赤色の変異体は発光輝度が格段に低かった。
また、図7は、基質として、近赤外ルシフェリンアナログであるジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン(具体的には、アカルミネ(登録商標)、和光純薬社製)を使用した場合の各ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を示す。野生型ルシフェラーゼは、CBRルシフェラーゼの約3.1倍の発光強度を達成していることがわかる。
なお、図3及び7においては、それぞれ、基質として、D−ルシフェリン及びジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これら以外の他の基質を使用することもできる。例えば、WO2009/096197及びWO2010/106896に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンの誘導体及びD−ルシフェリンの誘導体である。
このような変異型ルシフェラーゼを使用した発光反応の観察により、細胞内の機能をより詳細に調べることが可能になる。例えば、野生型ルシフェラーゼと変異型ルシフェラーゼとを、それぞれ、異なる2つのタンパク質に融合させて同一細胞内で発現させ、発光色の差に基づき、その細胞内のそれぞれのタンパク質の挙動を識別することができる。この場合、発光色の異なる発光反応は、1種類の基質のみを使用することによって達成することができ、実験上の簡便さの点で有利である。また、異なる細胞内で目的のタンパク質を発現させ、それぞれの細胞において異なる発光色を示す発光を誘起する場合においても、使用する基質は1種類のみでよいことから、さらに、コストの観点からも有利である。
さらに、変異型スジグロボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、発光反応に関する性質を向上させる変異、例えば、最適pHを変更する変異、最適温度を変更する変異、分解安定性を向上させる変異等であってよい。
また、図7から、赤色発光ルシフェリンアナログを用いた場合の赤色変異体が誘起する発光は、CBRルシフェラーゼの約2.2倍の発光強度を示すことがわかる。
なお、図3及び7においては、それぞれ、基質として、D−ルシフェリン及びジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これら以外の他の基質を使用することもできる。例えば、WO2009/096197及びWO2010/106896に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンの誘導体及びD−ルシフェリンの誘導体である。
(1)配列番号1のアミノ酸配列の148番目のイソロイシンをバリンに置換する変異(I148V);
(2)配列番号1のアミノ酸配列の283番目のセリンをロイシンに置換する変異(S283L);
(3)配列番号1のアミノ酸配列の239番目のバリンをメチオニンに置換する変異(V239M);
(4)配列番号1のアミノ酸配列の313番目のセリンをトレオニンに置換する変異(S313T);
(5)配列番号1のアミノ酸配列の356番目のアスパラギン酸をチロシンに置換する変異(D356Y);
(6)配列番号1のアミノ酸配列の401番目のバリンをメチオニンに置換する変異(V401M);
(7)配列番号1のアミノ酸配列の464番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異(F464I);および
(8)配列番号1のアミノ酸配列の503番目のグリシンをアルギニンに置換する変異(G503R)。
(1)配列番号1のアミノ酸配列に、I148V、S283LおよびF464Iの3つの変異を有する変異体(配列番号36);
(2)配列番号1のアミノ酸配列に、I148V、S283L、V401M、F464IおよびG503Rの5つの変異を有する変異体(配列番号38);および
(3)配列番号1のアミノ酸配列に、I148V、S283L、V239M、S313T、D356YおよびF464Iの6つの変異を有する変異体(配列番号40)。
上記3タイプの改良型赤色変異体は、赤色発光を示すため、小動物のin vivoイメージングなど生体組織に適用した際に生体組織での透過率が高いという利点を有するとともに(図11参照)、元の赤色変異体(配列番号33)や既存の赤色発光のルシフェラーゼCBRに比べて格段に高い発光強度を示すという利点も有する(図10参照)。
1.材料
材料として東京都青梅市で採集したスジグロボタル(Pristolycus sagulatus)の幼虫を用いた。
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるLysing Matrix Dチューブ(MP−Biomedicals社)に、採取した発光器および1mLのトータルRNA抽出試薬TRIzol Reagent(インビトロジェン社)を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep 24(MP−Biomedicals社)またはFastPrep FP100A(MP−Biomedicals社)に装着し、振動速度6.5m/sおよび振動時間45秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、30分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
3−1.Rapid Amplification of cDNA End(RACE)法に用いるプライマーの作製
スジグロボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをPolymerase chain reaction(PCR)法によって行った。このPCRに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
flexLuc5−ATA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTA AT−3’:配列番号8)、
flexLuc5−ATG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT−3’:配列番号9)、
flexLuc5−ATT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTT AT−3’:配列番号10)、
flexLuc5−ACA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT−3’:配列番号11)、
flexLuc5−ACG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT−3’:配列番号12)、
flexLuc5−ACT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT−3’:配列番号13)、
flexLuc5−GTA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTA AT−3’:配列番号14)、
flexLuc5−GTG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTG AT−3’:配列番号15)、
flexLuc5−GTT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTT AT−3’:配列番号16)、
flexLuc5−GCA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTA AT−3’:配列番号17)、
flexLuc5−GCG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTG AT−3’:配列番号18)、
flexLuc5−GCT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTT AT−3’:配列番号19)。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
上述の通り作製したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーおよび5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’Primer(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’:配列番号20)およびGeneRacer5’Nested Primer(5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’:配列番号21)を用いて5’−RACE PCRを行った。GeneRacer5’ PrimerおよびGeneRacer5’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。5’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
5’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
4−1.3’Race PCRに用いるプライマーの設計
5’Race PCRの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の配列を基にして、3’RACEに用いるプライマー(配列番号27)およびNested PCRに用いるプライマー(配列番号28)を作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
上述の通り作成したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーJP−Sujiguro−Full−F1(CTTTATAACTTCGTGATTCAATAAAG):配列番号25)、GeneRacer3’ Primer(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’:配列番号27)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’:配列番号28)を用いて3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。3’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
3’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
ATGGATAACGATAAAAATATTGTATATGGTCCCGAGCCATTTTACCCTGTTGATAAAGGATCCGCAGGAGCACAAATACACAAATATTTGCATCAATACTCAAAACTTGGAGCAATCGCGTTTACCAACGCGCTTACTGGTGTTGATATTACTTACGCCGAATACTTTGATATAACTTGCCGTTTAGGAGAAGCAATGAAAAGATATGGTATTAAAGTAGATGGAAGAATTGCTTTATGCAGTGAAAACTGTGAAGAATTTTTTTATCCTGTAATTGCTGGACTTTACATAGGTGCAGGCGTTGCTCCCACAAACGAGATTTACACCTTACGCGAGTTAGTCCACAGTTTAGGTATCTCAAAACCAACAATTGTATTTAGCTCTAAAAAAGGTTTAGATAAAGTTTTGCACGTACAAAAAACAGTGACATGCATTAAAACGATTGTTATATTAGACAGCAAAGTGGATTATAAAGGATACGACTGTGTGGAAAGTTTTATAAAAAGATACAATCCGCCAGGTTTCcAAGCTGCGAGTTTCAAAACTGTAGAGGTTGACCGCAAAGAGCAAATTGCTCTCATTATGAACTCTTCCGGTTCTACCGGTTTACCAAAAGGTGTACAACTTACTCACGAATGCGCGGTTACTAGATTCTCTCATGCCAAGGATCCCATTTACGGCAACCAAGTTTCACCAGGCACAGCCGTTTTAACTGTTGTTCCATTCCATCATGGTTTTGGTATGTTTACCACTTTAGGATATTTAGCTTGTGGATTTCGCGTCGTTATGCTAACAAGATTTGACGAAGAGATATTTTTAAAAACTATACAAGACTATAAATGTACAAGTGTCATTCTTGTACCGACTTTGTTCGGAATCCTCTCTAAAAGTAAGTTATTGGACAAATACGATCTGTCGAATCTAGTTGAAATTGCGTCTGGCGGAGCTCCATTAGCAAAAGAAGTTAGCGAAGCCGTAGCCAGACGGTTCAACCTTCCCGGAGTCCGTCAAGGTTACGGTTTGACGGAAACAACGTCTGCTATTATTATCACTCCAGAAGGTGACGATAAACCGGGTGCATCTGGAAAAGTTGTACCGTTGTTCAAAGCAAAAGTTGTTGACCTTGACACCAAAAAAACGTTGGGTCCTAACCAACGAGGTGAAGTATGCGTTAAAGGCCCTATGCTTATGAAAGGATACGTAGATAATCCGGAAGCAACCAGAGAAATTATTGACGAAGATGGCTGGTTGCACACTGGGGATATTGGATATTACGATGAGGACCAACACTTCTTTATTGTTGATCGTTTGAAGTCGTTAATAAAATACAAGGGATACCAAGTACCACCTGCAGAATTAGAATCTGTTCTTTTGCAACATCCATACATATTTGATGCTGGAGTAGCTGGTGTTCCTGATGCTGAAGCTGGTGAACTTCCTGGAGCAGTTGTTGTACTTGAAAAAGGAAAGCACGTGACTGAAAAAGAAATAATGGATTACGTTGCTGGCCAAGTCTCAAATGCAAAACGTTTGCGTGCTGGTGTTCGTTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTTACTGGAAAAATTGATGGCAAAGCTATTAGAGAAATTCTTATGAAACCAAAATCTAAAATGTAA
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTIVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTVVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLKTIQDYKCTSVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYVDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIFDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVAGQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
1.野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、pRSET−Bベクター(インビトロジェン)に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子はBamHIおよびEcoRIの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」(羊土社、2001年発行、p.17−25)に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号3に示される塩基配列である。
ATGGATAACGATAAAAATATTGTATATGGTCCCGAGCCATTTTACCCTGTTGATAAAGGTTCCGCAGGAGCACAAATACACAAATATTTGCATCAATACTCAAAACTTGGAGCAATCGCGTTTACCAACGCGCTTACTGGTGTTGATATTACTTACGCCGAATACTTTGATATAACTTGCCGTTTAGGAGAAGCAATGAAAAGATATGGTATTAAAGTAGATGGAAGAATTGCTTTATGCAGTGAAAACTGTGAAGAATTTTTTTATCCTGTAATTGCTGGACTTTACATAGGTGCAGGCGTTGCTCCCACAAACGAGATTTACACCTTACGCGAGTTAGTCCACAGTTTAGGTATCTCAAAACCAACAATTGTATTTAGCTCTAAAAAAGGTTTAGATAAAGTTTTGCACGTACAAAAAACAGTGACATGCATTAAAACGATTGTTATATTAGACAGCAAAGTGGATTATAAAGGATACGACTGTGTGGAAAGTTTTATAAAAAGATACAATCCGCCAGGTTTCCAAGCTGCGAGTTTCAAAACTGTAGAGGTTGACCGCAAAGAGCAAATTGCTCTCATTATGAACTCTTCCGGTTCTACCGGTTTACCAAAAGGTGTACAACTTACTCACGAATGCGCGGTTACTAGATTCTCTCATGCCAAGGACCCCATTTACGGCAACCAAGTTTCACCAGGCACAGCCGTTTTAACTGTTGTTCCATTCCATCATGGTTTTGGTATGTTTACCACTTTAGGATATTTAGCTTGTGGATTTCGCGTCGTTATGCTAACAAGATTTGACGAAGAGATATTTTTAAAAACTATACAAGACTATAAATGTACAAGTGTCATTCTTGTACCGACTTTGTTCGGAATCCTCTCTAAAAGTAAGTTATTGGACAAATACGATCTGTCGAATCTAGTTGAAATTGCGTCTGGCGGAGCTCCATTAGCAAAAGAAGTTAGCGAAGCCGTAGCCAGACGGTTCAACCTTCCCGGAGTCCGTCAAGGTTACGGTTTGACGGAAACAACGTCTGCTATTATTATCACTCCAGAAGGTGACGATAAACCGGGTGCATCTGGAAAAGTTGTACCGTTGTTCAAAGCAAAAGTTGTTGACCTTGACACCAAAAAAACGTTGGGTCCTAACCAACGAGGTGAAGTATGCGTTAAAGGCCCTATGCTTATGAAAGGATACGTAGATAATCCGGAAGCAACCAGAGAAATTATTGACGAAGATGGCTGGTTGCACACTGGGGATATTGGATATTACGATGAGGACCAACACTTCTTTATTGTTGATCGTTTGAAGTCGTTAATAAAATACAAGGGATACCAAGTACCACCTGCAGAATTAGAATCTGTTCTTTTGCAACATCCATACATATTTGATGCTGGAGTAGCTGGTGTTCCTGATGCTGAAGCTGGTGAACTTCCTGGAGCAGTTGTTGTACTTGAAAAAGGAAAGCACGTGACTGAAAAAGAAATAATGGATTACGTTGCTGGCCAAGTCTCAAATGCAAAACGTTTGCGTGCTGGTGTTCGTTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTTACTGGAAAAATTGATGGCAAAGCTATTAGAGAAATTCTTATGAAACCAAAATCTAAAATGTAA
ルシフェラーゼ遺伝子を、pRSET−Bベクターの制限酵素サイトBamHI−EcoRI間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素BamHI認識配列GGATCCを含むプライマー(配列番号29)、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素EcoRI認識配列GAATTCを含むプライマー(配列番号30)を作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。PCRは、ポリメラーゼKOD−Plus−(東洋紡績株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
JM109(DE3)を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42℃で1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlアンピシリンを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、0.1M Tris−HCl溶液(pH8.0)に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離(15000rpm、10分)し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi−Agar懸濁液500μlと0.1M Tris−HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4℃の条件で行った。25mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6(ザルトリウス)で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50%グリセリン溶液とした。保存は−20℃で行った。
測定のための装置としてLumiFlSpectroCapture(ATTO)を用い、0.1Mクエン酸/0.1M Na2HPO4 buffer(pH6.0−8.0)に1mM D−ルシフェリン、2mM ATPおよび4mM MgCl2を含む溶液に、精製酵素を1μg/mlから10μg/mlの間の最終濃度で添加し、酵素添加後15秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図1に示す。
4−1.D−ルシフェリンおよびATPの濃度の決定
D−ルシフェリン溶液中のD−ルシフェリン濃度およびATP溶液中のATP濃度を以下の通りに決定した。
D−ルシフェリン:λmax 328nm、ε18200、pH5.0
ATP:λmax 259nm、ε15400、pH7.0。
様々なD−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、D−ルシフェリンに対するKm値を決定した。
様々なATP濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ATPに対するKm値を決定した。
1.変異型スジグロボタルルシフェラーゼの作製
下記のとおり、変異型スジグロボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
ATGGACAACGACAAGAACATCGTGTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCCGTGGATAAGGGATCTGCCGGCGCTCAGATCCACAAGTACCTGCACCAGTACAGCAAGCTGGGCGCCATTGCCTTCACCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGGCGAGGCCATGAAGAGATACGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCTACCCTGTGATCGCCGGCCTGTACATCGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGCATGTGCAGAAAACCGTGACCTGCATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAGGTGGACTACAAGGGCTACGACTGCGTGGAATCCTTCATCAAGCGGTACAACCCCCCAGGCTTCCAGGCCGCCAGCTTCAAGACCGTGGAAGTGGACCGGAAAGAGCAGATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACACACGAGTGCGCCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGAACCGCCGTGCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTATCTGGCCTGCGGCTTCAGAGTGGTCATGCTGACCCGCTTCGACGAGGAAATCTTCCTGAAAACCATCCAGGACTACAAGTGCACCTCTGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAGCAAGAGCAAGCTGCTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGGTGGAAATCGCCTCTGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGTCTGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCATCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACCAGCGGGGCGAAGTCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGAAGGGCTACGTGGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACACAGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACCAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTATAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGGGTGCCAGATGCTGAAGCAGGCGAACTGCCTGGGGCTGTCGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTGTCCAACGCCAAGAGACTGAGAGCCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGATGAAGCCCAAGAGCAAGATGTGA
S283L変異:(GACTACAAGTGCACCnnnGTGATCCTGGTGCCC:配列番号35)(nnnは、任意の塩基からなる配列を表す。)
このプライマーを用いて、283番目のアミノ酸に任意の改変を有し、高輝度の発光を誘起する活性を有し、かつ、発光色が長波長側にシフトした変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子を作成した。
赤色変異体1のアミノ酸配列は配列番号33に記載され、この赤色変異体1をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号34に記載される。
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTVVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTVVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLKTIQDYKCTLVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYVDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIFDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVAGQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
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次に、スジグロボタル野生型および赤色変異体1ルシフェラーゼによるHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ(プロメガ社のLuc2ルシフェラーゼ)およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBR(プロメガ社のCBRルシフェラーゼ)と比較した。
同様の手順に従って、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼおよびCBRルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸をpF9Aベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。
また、HeLa細胞で発現させた各種ルシフェラーゼ(スジグロボタル野生型、赤色変異体1およびCBR)の発光スペクトルを実施例2と同様に測定した。ルシフェリン濃度は2mMで、温度は25℃と37℃の2点で測定した。その結果を図4〜6に示す。図4は、野生型の測定結果、図5は赤色変異体1の測定結果、図6はCBRの測定結果を示す。
また、図5に示す赤色変異体1による発光スペクトルでは、温度が25℃から37℃に上昇しても、最大発光波長の明確なシフトはみられなかった。図4、5及び6により、HeLa細胞内において、赤色変異体1は、野生型とは異なる最大発光波長(616nm)を示し、この発光波長は、市販されている赤色発光ルシフェラーゼCBRの最大発光波長(620nm)と同程度であることが示された。さらに、図3により、このスジグロボタル赤色変異体1による発光強度は、CBRの3.42倍であることが示された。
実施例3にて作製したルシフェラーゼ遺伝子を含む4種類(スジグロボタル野生型、赤色変異体1、P.ピラリスおよびコメツキ由来CBR)のプラスミドを、実施例3と同様にHeLa細胞に導入し、近赤外発光ルシフェリンアナログ(ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン、和光社製、アカルミネ(登録商標))を発光基質として使用し、各々のルシフェラーゼによる発光スペクトルを測定した。近赤外発光ルシフェリンアナログの濃度は1mM、温度は37℃で測定した。図7および8は、それぞれ、測定した発光強度の比較および発光スペクトルを示す。
また、図7より、P.ピラリスに対して、スジグロボタル野生型では0.94倍、赤色変異体1では0.65倍の発光強度を示すことがわかる。一方で、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼ(CBR)に対しては、スジグロボタル野生型は3.13倍、赤色変異体1で2.16倍の発光強度を示すことがわかる
図9より、近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として使用した場合、D−ルシフェリンを基質として使用した場合に比べ、野生型スジグロボタルルシフェラーゼでは、最大発光波長が、609nmから664nmへと、赤色変異体1では、613nmから664nmへと、長波長側にシフトしていることが分かる。
1.改良型赤色変異体ルシフェラーゼの作製
下記のとおり、実施例3で作製された赤色変異体1に更なる変異を導入することにより、改良型赤色変異体ルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
実施例3で作製された赤色変異体1(配列番号33)をコードする遺伝子(配列番号34)に対し、配列番号33のアミノ酸配列の464番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異(F464I)を更に導入した。得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを赤色変異体2と称する。赤色変異体2は、I148V、S283LおよびF464Iの3つの変異を有する。この赤色変異体をコードする遺伝子は、更にKozak配列の付与による変異を有する。
また、実施例3で作製された赤色変異体(配列番号33)をコードする遺伝子(配列番号34)に対し、下記(a)〜(c)の変異を更に導入した:
(a)配列番号33のアミノ酸配列の401番目のバリンをメチオニンに置換する変異(V401M);
(b)配列番号33のアミノ酸配列の464番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異(F464I);および
(c)配列番号33のアミノ酸配列の503番目のグリシンをアルギニンに置換する変異(G503R)。
また、実施例3で作製された赤色変異体(配列番号33)をコードする遺伝子(配列番号34)に対し、下記(d)〜(g)の変異を更に導入した:
(d)配列番号33のアミノ酸配列の239番目のバリンをメチオニンに置換する変異(V239M);
(e)配列番号33のアミノ酸配列の313番目のセリンをトレオニンに置換する変異(S313T);
(f)配列番号33のアミノ酸配列の356番目のアスパラギン酸をチロシンに置換する変異(D356Y);および
(g)配列番号33のアミノ酸配列の464番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異(F464I)。
変異導入後、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌JM109(DE3)株に形質転換して寒天培地上にコロニーを形成させた。このコロニーに対して最終濃度2mMのD-Luciferinを噴霧後、CCDカメラDP-70(オリンパス)にて発光を撮像した。他のコロニーよりも明るく、赤い発光を呈するコロニーを拾い上げ、シーケンサーを用いて配列を確認した。
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次に、赤色変異体1〜4によるHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、Photinus pyralis由来のルシフェラーゼLuc2(プロメガ社より入手)およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBR(プロメガ社のCBRルシフェラーゼ)と比較した。
Claims (13)
- スジグロボタル(Pristolucus sagulatus)に由来するルシフェラーゼ。
- Photinus pyralisホタルルシフェラーゼが誘起する発光およびコメツキムシ赤色ルシフェラーゼが誘起する発光のうちの少なくとも一方に比べて高い発光強度を示す発光を誘起する活性を有する請求項1に記載のルシフェラーゼ。
- (a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼおよび
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むルシフェラーゼ
からなる群より選択される請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。 - 配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼにより誘起された発光の最大発光波長と同じかまたはそれよりも長い最大発光波長を有する発光を誘起する請求項1に記載のルシフェラーゼ。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼにより誘起された発光の最大発光波長と同じかまたはそれよりも長い最大発光波長を有する発光を誘起する請求項2に記載のルシフェラーゼ。
- 前記発光が、赤色発光を示す請求項4または5に記載のルシフェラーゼ。
- (a)配列番号33に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼ、
(b)配列番号33に示されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むルシフェラーゼおよび
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列の148番目のイソロイシンに対応するアミノ酸残基がバリンに置換された変異と配列番号1に示されるアミノ酸配列の283番目のセリンに対応するアミノ酸残基がロイシンに置換された変異とを含むルシフェラーゼ
からなる群より選択される請求項4乃至6のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ。 - 請求項1に記載のルシフェラーゼであって、配列番号1に示されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列からなり、前記野生型ルシフェラーゼと比べて同じかまたは高い発光強度を示す発光を誘起する活性を有し、かつ赤色発光を示す、ルシフェラーゼ。
- 請求項8に記載のルシフェラーゼであって、配列番号1に示されるアミノ酸配列において、I148V,S283L,V239M,S313T,D356Y,V401M,F464IおよびG503Rから選択される1以上のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列からなるルシフェラーゼ。
- 610nm付近の最大発光波長を有する発光を誘起する請求項8または9に記載のルシフェラーゼ。
- 配列番号36、配列番号38または配列番号40の何れかに示されるアミノ酸配列を含む請求項10に記載のルシフェラーゼ。
- 請求項1から11の何れか1項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号34、配列番号37、配列番号39または配列番号41に示される塩基配列を含む請求項12に記載の核酸。
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