JP2013081481A - 非構造組換えポリマーおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、非構造組換えポリマー(URP)および1種以上のURPを含むタンパク質を提供する。本発明は、マイクロプロテイン、トキシンおよび他の関連するタンパク質性実体、ならびにこれらの実体をディスプレイする遺伝子パッケージもまた提供する。本発明は、本発明のタンパク質性実体をコードする組換えポリペプチド含有ベクター、ならびにそれらのベクターを含む宿主細胞もまた提供する。本発明の組成物は、一定の範囲の薬学的適用を含む種々の有用性を有する。
【選択図】なし
Description
本願は、本明細書中に参考として援用される2006年3月6日に出願された米国仮特許出願第60/743,410号の利益を主張するものである。本願は、2006年9月27日に出願された第11/528,927号および第11/528,950号の、一部継続出願であり、第11/528,927号および第11/528,950号もまた2005年9月27日に出願された米国仮特許出願第60/721,270号、同第60/721,188号、および2006年3月21日に出願された同第60/743,622号に対する優先権を主張するものであり、これらは全て本明細書においてその全体が参考として援用される。
タンパク質の特性、特に、血漿クリアランスおよび免疫原性が、これらのタンパク質への親水性ポリマーの結合によって改善できることは十分に実証されてきた(非特許文献1)、(非特許文献1)、(非特許文献3)。患者の治療のためにFDAによって認可されているポリマー修飾タンパク質の例は、アダジェン(Adagen)、オンカスパー(Oncaspar)、PEG−イントロン(Intron)、ペガシス(Pegasys)、ソマバート(Somavert)、およびニューラスタ(Neulasta)である。より多くポリマー修飾した多くのタンパク質が臨床試験中である。これらのポリマーは、非修飾タンパク質と比較して、修飾タンパク質の流体力学半径(ストークス半径とも呼ばれる)を増加させることによってそれらの効果を発揮し、これは、腎臓濾過によるクリアランスの速度を減少する(非特許文献4)。加えて、ポリマー結合は、他のタンパク質、細胞、または表面との修飾タンパク質の相互作用を減少し得る。特に、ポリマー結合は、修飾タンパク質と、抗体および免疫系の他の成分との間の相互作用を減少し、従って、修飾タンパク質に対する宿主免疫応答の形成を減少し得る。特に関心が持たれるものは、PEG化による、すなわち、ポリエチレングリコールの直鎖状または分枝状ポリマーを結合することによる、タンパク質修飾である。PEG化の際の免疫原性の減少は、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(非特許文献5)、抗体(非特許文献6)、スタフィロキナーゼ(非特許文献7)、およびヘモグロビン(非特許文献8)について示された。典型的には、このようなポリマーは、非修飾タンパク質が精製された後で化学修飾工程を介して、目的のタンパク質とともに結合体化される。
本発明は、少なくとも40個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー(URF)を提供し、該URFは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、(a)URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている。関連する実施形態において、本発明は、少なくとも40個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー(URF)を提供し、該URFは約24時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、(a)URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている。対象のURPは非天然アミノ酸配列を含み得る。所望される場合、URPは異種タンパク質への取り込みのために選択され、異種タンパク質へのURPの取り込みの際に、該異種タンパク質は、前記URPが欠損している対応するタンパク質と比較して、より長い血清分泌半減期および/またはより高い溶解性を示す。半減期は、2倍、3倍、5倍、10倍またはそれ以上延長することができる。いくつかの態様において、異種タンパク質へのURPの取り込みにより、サイズ排除クロマトグラフィによって概算したときタンパク質の見かけの分子量の少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、URPは、−3.5未満(例えば、−4以下、−5以下)のTepitopeスコアを有する。いくつかの態様において、URPは、大部分が親水性である残基を含み得る。所望される場合、URPの少なくとも50%のアミノ酸が、Chou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている。URPに含まれるグリシン残基は、URPの全体のアミノ酸の少なくとも約50%を構成していてよい。いくつかの態様において、URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)からなる群より単独で選択される任意の1つの型のアミノ酸が、URPの全体のアミノ酸の約20%、30%、40%、50%、60%、またはそれ以上より多くを構成する。いくつかの態様において、URPは、約100個、150個、200個、またはそれ以上より多くの連続するアミノ酸を含む。
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に示されて参照により組み込まれるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
少なくとも40個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー(URP)であって、該URPは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
(a)該URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
ポリマー。
(項目2)
少なくとも40個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー(URP)であって、該URPは約24時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、
(a)該URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
ポリマー。
(項目3)
前記URPが非天然アミノ酸配列を含む、項目1または2に記載のURP。
(項目4)
前記URPが異種タンパク質への取り込みのために選択され、異種タンパク質への該URPの取り込みの際に、該異種タンパク質は、該URPが欠損している対応するタンパク質と比較して、より長い血清半減期および/またはより高い溶解性を示す、項目1または2に記載のURP。
(項目5)
異種タンパク質への前記URPの取り込みの際に、該異種タンパク質は、該URPが欠損している対応するタンパク質と比較して、少なくとも2倍長い血清分泌半減期を示す、項目1または2に記載のURP。
(項目6)
異種タンパク質への前記URPの取り込みにより、サイズ排除クロマトグラフィによって概算したとき見かけのタンパク質の分子量の少なくとも2倍の増加をもたらす、項目1または2に記載のURP。
(項目7)
−4未満のTエピトープスコアを有する、項目1または2に記載の前記URP。
(項目8)
アミノ酸は大部分が親水性残基である、項目1または2に記載のURP。
(項目9)
前記URPの少なくとも50%のアミノ酸が、Chou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、項目1または2に記載のURP。
(項目10)
前記URPに含まれるグリシン残基が、該URPの全体のアミノ酸の少なくとも約50%を構成する、項目1または2に記載のURP。
(項目11)
グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の1つの型が、該URPの全体のアミノ酸の約20%より多くを構成する、項目1または2に記載のURP。
(項目12)
グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の1つの型が、前記URPの全体のアミノ酸の約40%より多くを構成する、項目1または2に記載のURP。
(項目13)
前記URPが約100個より多くの連続するアミノ酸を含む、項目1または2に記載のURP。
(項目14)
前記URPが約200個より多くの連続するアミノ酸を含む、項目1または2に記載のURP。
(項目15)
反復配列を含む、項目1または2に記載のURP。
(項目16)
グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の1つの型が、前記URPの全体のアミノ酸の50%より多くを構成する、項目1または2に記載のURP。
(項目17)
前記1種以上のURPがタンパク質に関して異種である、項目1または2に記載の1種以上のURPを含むタンパク質。
(項目18)
エフェクターモジュールを含む、項目17に記載のタンパク質。
(項目19)
結合モジュールを含む、項目17に記載のタンパク質。
(項目20)
エフェクターモジュールおよび結合モジュールを含む、項目17に記載のタンパク質。
(項目21)
複数の結合モジュールを含み、個々の該結合モジュールが同じまたは異なる標的に対する結合特異性を示す、項目17に記載のタンパク質。
(項目22)
凝集体中のURPの全長が約150アミノ酸を超える、項目17に記載のタンパク質。
(項目23)
1個以上の結合モジュールを含み、該結合モジュールが、システインの骨格内対合によって形成されるジスルフィド含有骨格を含む、項目17に記載のタンパク質。
(項目24)
細胞傷害性であるエフェクターモジュールを含む、項目17に記載のタンパク質。
(項目25)
標的分子に特異的な結合モジュールを含み、該標的が、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される、項目17に記載のタンパク質。
(項目26)
標的分子に特異的な結合モジュールを含み、該標的がイオンチャネルである、項目17に記載のタンパク質。
(項目27)
前記URPが欠損している対応するタンパク質と比較して、少なくとも2倍長い血清分泌半減期を示す、項目17に記載のタンパク質。
(項目28)
少なくとも3反復単位のアミノ酸配列を含む非天然タンパク質であって、各反復単位が少なくとも6アミノ酸を含み、少なくとも3反復単位の約6個〜約15個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が1つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する、非天然タンパク質。
(項目29)
前記反復単位内に約9個〜約15個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が1つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する、項目28に記載のタンパク質。
(項目30)
前記タンパク質中に約6個〜約15個の連続するアミノ酸を含む各セグメントが少なくとも1つのネイティブヒトタンパク質中に存在する、項目28に記載のタンパク質。
(項目31)
前記タンパク質中に約9個〜約15個の連続するアミノ酸を含む各セグメントが少なくとも1つのネイティブヒトタンパク質中に存在する、項目28に記載のタンパク質。
(項目32)
前記少なくとも3つの反復単位が約80%より多くの配列同一性を共有する、項目28に記載のタンパク質。
(項目33)
前記各反復単位が約6個〜約15個の連続するアミノ酸を含む、項目28に記載のタンパク質。
(項目34)
前記各反復単位が約9個の連続するアミノ酸を含む、項目28に記載のタンパク質。
(項目35)
結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、C末端モジュール、およびN末端モジュールからなる群より選択される1つ以上のモジュールを含む、項目28に記載のタンパク質。
(項目36)
個々の反復単位が非構造組換えポリマー(URP)を含む、項目28に記載のタンパク質。
(項目37)
前記URPは少なくとも40個の連続するアミノ酸を含み、該URPは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
(a)該URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
項目36に記載のタンパク質。
(項目38)
前記URPは約24時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、
(a)該URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
項目36に記載のタンパク質。
(項目39)
項目1または2に記載のURPをコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
(項目40)
項目17に記載のタンパク質をコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
(項目41)
項目28に記載のタンパク質をコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
(項目42)
項目40に記載の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
(項目43)
項目41に記載の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
(項目44)
項目40に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目45)
項目41に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目46)
項目44に記載のベクターの1つより多くを含む発現ベクターの選択ライブラリー。
(項目47)
項目45に記載のベクターの1つより多くを含む発現ベクターの選択ライブラリー。
(項目48)
項目46に記載のライブラリーをディスプレイする遺伝子パッケージ。
(項目49)
項目47に記載のライブラリーをディスプレイする遺伝子パッケージ。
(項目50)
非構造組換えポリマー(URP)を含むタンパク質を産生する方法であって:
(i)該タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、該タンパク質は1つ以上のURPを含み、該URPは少なくとも40個の連続するアミノ酸を含み、該URPは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
(a)該URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、工程と;
(ii)該ポリヌクレオチドからの該タンパク質の発現をもたらすための条件下で、適切な培養培地中で該宿主細胞を培養する工程と
を包含する方法。
(項目51)
前記URPが約24時間よりも長いインビトロ血清分解半減期を有する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記宿主細胞が真核細胞である、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記宿主細胞が原核細胞である、項目50に記載の方法。
(項目55)
タンパク質の血清分泌半減期を増加させる方法であって:
該タンパク質を1つ以上の非構造組換えポリマー(URP)と融合させる工程であって、該URPは少なくとも約40個の連続するアミノ酸を含み、そして、
(a)該URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いており、該URPは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能である、工程
を包含する方法。
(項目56)
タンパク質の血清分泌半減期を少なくとも2倍延長する、項目55に記載の方法。
(項目57)
遺伝子パッケージ上にディスプレイされる、標的と外因性タンパク質との間の特異的相互作用の存在または不在を検出する方法であって、該タンパク質は、1つ以上の非構造組換えポリマー(URP)を含み、該方法は:
(a)1つ以上の非構造組換えポリマー(URP)を含むタンパク質をディスプレイする遺伝子パッケージを提供する工程;
(b)安定なタンパク質−標的複合体を産生するために適切な条件下で、遺伝子パッケージを該標的と接触させる工程;および
(c)該遺伝子パッケージ上での安定なタンパク質−標的複合体の形成を検出し、それによって、特異的相互作用の存在を検出する工程
を包含する方法。
(項目58)
前記外因性タンパク質をコードする前記遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を得る工程をさらに包含する、項目57に記載の方法。
(項目59)
前記特異的相互作用の存在または不在が、前記URPと血清タンパク質を含む標的との間である、項目57に記載の方法。
(項目60)
前記特異的相互作用の存在または不在が、前記URPと血清プロテアーゼを含む標的との間である、項目57に記載の方法。
(項目61)
前記標的または前記タンパク質が、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される、項目57に記載の方法。
(項目62)
前記遺伝子パッケージがファージである、項目57に記載の方法。
(項目63)
前記URPが少なくとも約40個の連続するアミノ酸を含み、該URPは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そしてさらに、
(a)URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、全体のアミノ酸の約80%より多くを構成し;ならびに/または
(b)少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
項目57に記載の方法。
(項目64)
前記URPが少なくとも約40個の連続するアミノ酸を含み、該URPが約24時間よりも長いインビトロ血清分解半減期を有する、項目57に記載の方法。
(項目65)
前記URPが非天然アミノ酸配列を含む、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目66)
前記URPが−4以下のTエピトープスコアを有する、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目67)
前記URPがChou−Fasmanアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目68)
前記URPに含まれるグリシン残基が、該URPの全体のアミノ酸の少なくとも約50%を構成する、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目69)
前記URPに含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の総和が、該URPの全体のアミノ酸の約60%より多くを構成する、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目70)
グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)からなる群より選択されるアミノ酸の1つの型が、前記URPの全体のアミノ酸の50%より多くを構成する、項目50または51に記載のURP。
(項目71)
前記URPが100個より多くの連続するアミノ酸を含む、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目72)
前記URPが反復配列を含む、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目73)
前記タンパク質が治療タンパク質である、項目50、55、または57に記載の方法。
(項目74)
前記タンパク質が、結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、C末端モジュール、およびN末端モジュールからなる群より選択される1つ以上のモジュールを含む、項目50、55、または57に記載の方法
本発明の好ましい実施形態は本明細書に示されかつ記載されているが、このような実施形態は例示のみのために提供されることが当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、多数の改変、変更、および置換が、ここで、当業者に明らかである。本明細書に記載される本発明の実施形態が、本発明を実施する際に利用され得ることが理解されるべきである。上記の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、およびこれらの等価物がそれによって網羅されることが意図される。
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えDNAの常套の技術を利用する。Sambrook,Fritsch and Maniatis,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版(1989);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubelら編(1987));METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor編(1995)),Harlow and Lane編(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL、およびANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編(1987))を参照のこと。
明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形(「単数の(a)」、「単数の(an)」および「その(the)」)は、状況が明確に他を示さない限り、複数形の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めて複数の細胞を含む。
Biol 104,59,#3233を参照のこと、これは、Hopp,TPら(1981)Proc Natl Acad Sci U S A 78,3824,#3232に列挙されている)によって開発された尺度である。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リジン、スレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に関心が持たれるものは、親水性アミノ酸である、アルギニン、グルタミン、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
「n6位」または「n7=4」という用語は、システイン間ループをいい、「n6」はC6とC7との間のループとして定義され;「n7=4」は、C7とC8との間のループが、システインを数えずに4アミノ酸長であることを意味する。
本発明の1つの態様は非構造組換えポリマー(URP)の設計である。対象URPは、治療的および/または診断的価値のある組換えタンパク質を生成するために特に有用である。対象URPは、1つ以上の以下の特徴を示す。
1つの実施形態において、対象のURPはグリシンリッチ配列(GRS)を含む。例えば、グリシンは、これが目的の配列中に存在する最も優勢な残基であるように、優勢に存在し得る。別の例において、URP配列は、グリシン残基が全体のアミノ酸の少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%を構成するように設計することができる。URPは100%グリシンもまた含み得る。なお別の実施形態において、URPは、少なくとも30%のグリシンを含み、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度は20%未満である。さらに別の例において、URPは、少なくとも40%のグリシンを含み、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度は10%未満である。さらになお別の例において、URPは、少なくとも50%のグリシンを含み、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度は5%未満である。
表1.グリシンリッチ配列を含むタンパク質の構造解析
これらのGRS中の非グリシン残基の配列は、URP、および従って、所望のURPを含むタンパク質の特性を最適化するために選択することができる。例えば、特定の細胞、特定の細胞型、または細胞系統について得られるタンパク質の選択性を増強するためにURPの配列を最適化することができる。例えば、遍在的には発現されていないが、むしろ、心臓、肝臓、前立腺、肺、腎臓、骨髄、血液、皮膚、膀胱、脳、筋肉、神経を含む身体組織、ならびに、感染疾患、自己免疫疾患、腎臓、神経細胞、心臓の障害および癌などの疾患に罹患している選択した組織の1つ以上において示差的に発現されるタンパク質配列を取り込むことができる。特定の発生の起源を表す配列、例えば、多細胞生物における外胚葉、内胚葉、または中胚葉形成の間に、胚または成体で発現される配列を利用することができる。細胞周期の調節、細胞の分化、アポトーシス、走化性(chemotaxsis)、細胞運動、および細胞骨格再構成を含むがこれらに限定されない、特定の生物学的プロセスに関与する配列もまた利用することができる。被覆小窩、ゴルジ装置、小胞体、エンドソーム、リソソーム、およびミトコンドリアを含むがこれらに限定されない、特定の細胞下の場所:細胞外マトリックス、核、細胞質、細胞骨格、原形質、および/または細胞内膜構造に、得られるタンパク質を方向付けるための他の遍在性ではないタンパク質配列を利用することもできる。
URPはヒト配列に由来し得る。ヒトゲノムは、1つの特定のアミノ酸が豊富である多くのサブ配列を含む。特に関心が持たれるものは、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはグリシンのような親水性アミノ酸が豊富であるようなアミノ酸配列である。特に関心が持たれるものは、疎水性アミノ酸をほとんど含まないようなサブ配列である。このようなサブ配列は、水溶液中で非構造かつ高度に溶解性であることが予測される。このようなヒトサブ配列は、それらの有用性をさらに改善するように修飾され得る。図17は、セリンが豊富であり、かつ対象URPとして単離され得る例示的なヒト配列を示す。例示的な象牙質シアロリンタンパク質は670アミノ酸のサブ配列を含み、ここで、64%の残基がセリンであり、多くの他の位置は、アスパラギン酸、アスパラギン、およびグルタミン酸などの親水性アミノ酸である。この配列は極度に反復性であり、そして結果として、これは少ない情報量を有する。このようなヒトタンパク質のサブ配列を直接使用することができる。所望される場合、その全体の特徴を保存するが、薬学的適用のためにより適切にする方法で、配列を修飾することができる。象牙質シアロリンタンパク質に関連する配列の例は、(SSD)n、(SSDSSN)n、(SSE)nであり、式中、nは約4から200までの間である。
URP配列は、ヒトT細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まないように設計することができる。例えば、変性した、非構造コンホメーションに有利であるアミノ酸組成物を用いて一連の半ランダム配列を合成でき、T細胞エピトープの存在について、およびこれらがヒト配列であるか否かを評価することができる。ヒトT細胞エピトープについてのアッセイは記載されてきた(Stickler,M.ら(2003)J Immunol Methods,281:95−108)。特に関心が持たれるものは、T細胞エピトープまたは非ヒト配列を生成することなくオリゴマー化できるペプチド配列である。これは、T細胞エピトープの存在について、およびヒトではない6〜15マー、特に9マーのサブ配列の存在について、これらの配列の直接反復を試験することによって達成することができる。代替法は、ヒト配列のアセンブリについて以前の節に記載したように、反復単位にアセンブルされ得る複数のペプチド配列を評価することである。別の代替法は、TEPITOPEのようなエピトープ予測アルゴリズムを使用して、低スコアを生じるURP配列を設計することである(Stumiolo,T.ら(1999)Nat Biotechnol,17:555−61)。T細胞エピトープを回避するための別のアプローチは、MHC上でのペプチドディスプレイの間にアンカー残基として働き得るアミノ酸、例えば、M、I、L、V、Fを回避することである。疎水性アミノ酸および正に荷電したアミノ酸は、頻繁に、アンカー残基として働くことができ、URP残基中でのそれらの残基を最小化することは、T細胞エピトープを生成し、従って、免疫反応を誘発する確率を減少する。選択したURPは、一般的に、少なくとも1種のヒトタンパク質において見出されるサブ配列を含み、そして、疎水性アミノ酸含量が低い。
上述のように、対象URPは、治療的価値のあるタンパク質の設計のためのモジュールとして特に有用である。従って、本発明は、1種以上の対象URPを含むタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、本明細書では、多価非構造組換えタンパク質(MURP)と呼ばれる。
薬学的に活性なタンパク質にURP配列を加えることは、そのタンパク質の多くの特性を改善し得る。特に、長いURP配列を加えることは、タンパク質の血清半減期を顕著に増大し得る。このようなURPは、典型的には、少なくとも約40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
流体力学半径の増加はまた、組織への浸透の減少に導くことができ、これは、薬学的に活性なタンパク質の副作用を最小化するために利用できる。親水性ポリマーが、増強浸透性および保持(EPR)効果によって引き起こされる、腫瘍組織中に選択的に蓄積する傾向を有することは十分に実証されている。EPR効果の根底にある原因は、腫瘍の血管構造の漏出性の性質(McDonald,D.M.ら(2002)Cancer Res,62:5381−5)および腫瘍組織におけるリンパ排液の欠如である。それゆえに、腫瘍組織についての薬学的に活性なタンパク質の選択性は、親水性ポリマーを加えることによって増強することができる。このようなものとして、所定の薬学的に活性なタンパク質の治療指数は、対象のURPSを取り込むことを介して増加することができる。
URP配列を加えることは、タンパク質のプロテアーゼ抵抗性を顕著に改善し得る。URP配列は、それら自体が、プロテアーゼ抵抗性であるように設計され得、そしてそれらをタンパク質に結合することによって、分解酵素の接近からタンパク質を遮断することができる。URP配列は、他の受容体または表面とのタンパク質の望ましくない相互作用を減少させるという目的で、薬学的に活性なタンパク質に加えることができる。これを達成するために、このような望ましくない接触を行うタンパク質の側の近傍に薬学的に活性なタンパク質にURP配列を加えることが有益であり得る。特に、本発明の生成物に対する免疫応答を妨害するために、免疫系の任意の成分とのそれらの相互作用を減少させるという目的で、薬学的に活性なタンパク質にURP配列を加えることができる。薬学的に活性なタンパク質にURP配列を加えることは、既存の抗体またはB細胞受容体との相互作用を減少し得る。さらに、URP配列を加えることは、抗原提示細胞による、本発明の生成物の取り込みおよびプロセシングを減少し得る。タンパク質に1種以上のURP配列を加えることは、その免疫原性を減少する好ましい方法である。なぜなら、これは、多くの種において免疫応答を抑制し、動物データに基づいて、患者における生成物の期待される免疫原性を予測することを可能にするからである。免疫原性のこのような種非依存性の試験は、ヒトT細胞エピトープの同定および除去、またはヒト配列との配列比較に基づくアプローチのためには不可能である。
URP配列は、T細胞エピトープを中断するためにタンパク質に導入することができる。このことは、複数の別々の機能モジュールを合わせるタンパク質のために特に有用である。T細胞エピトープの形成は、タンパク質抗原のペプチドフラグメントがMHCに結合することを必要とする。MHC分子は、提示されるペプチドの典型的には9個の連続する残基であるアミノ酸の短いセグメントと相互作用する。タンパク質分子中の異なる結合モジュールの直接融合は、2つの隣接するドメインに広がるT細胞エピトープに導き得る。図7に図示されるように、URPモジュールによって機能モジュールを分離することによって、このようなモジュールにわたるT細胞エピトープの生成が妨害される。機能モジュール間のURP配列の挿入はまた、抗原提示細胞におけるタンパク質分解性プロセシングと干渉し得、これは、免疫原性のさらなる減少に導く。免疫原性のリスクを減少するための別のアプローチは、生成物の機能モジュール中のT細胞エピトープを破壊することである。マイクロプロテインの場合において、1つのアプローチは、グリシンリッチであるいくつかのシステイン間ループ(標的結合に関与しないもの)を有することである。マイクロプロテインにおいて、それらの構造は少数のシステインに起因し、標的結合に関与しない残基の大部分またはすべてを、グリシン、セリン、グルタミン酸、スレオニンで実際に置き換えることができ、このようにして、標的への親和性に影響を与えることなく、免疫原性についての潜在性を減少する。例えば、このことは、各残基をグリシンによって置き換える、すべての残基の「グリシンスキャン」を実施すること、次いで、ファージディスプレイまたはスクリーニングを使用して、標的結合を保持するクローンを選択すること、次いで、許容されるグリシン置換のすべてを合わせることによって実行できる。一般的に、機能モジュールは、URPモジュールよりも、T細胞エピトープを含む可能性がはるかに高い。gly、ser、ala、glu、asp、asn、gln、thrのような小さな親水性残基で、決定的に重要ではないアミノ酸残基のすべてまたは多くを置き換えることによって、機能モジュール中のT細胞エピトープの頻度を減少することができる。置き換えを可能にする機能モジュール中の位置は、種々のランダムまたは構造ベースのタンパク質工学的アプローチを使用して同定することができる。
タンパク質の機能モジュールは限られた溶解性を有し得る。特に、結合モジュールは、それらの表面に疎水性残基を有する傾向があり、このことは、これらの溶解性を制限し得、かつ凝集に導き得る。URPモジュールを有するこのような機能モジュールと間隔をあけ、またはこれらに隣接することによって、得られる生成物の全体の溶解性を改善することができる。このことは、特に、顕著な割合の親水性残基または電荷を有する残基を有するURPモジュールについて真実である。可溶性URPモジュールを有する機能モジュールを分離することによって、これらの機能モジュール間の分子内相互作用を減少することができる。
URP配列は、過度の負電荷または正電荷を有するように設計することができる。結果として、これらは、酵素のpHプロフィールまたは結合相互作用をずらせるために利用できる任意の融合パートナーに静電場を付与する。さらに、電荷を有するURP配列の静電場は、タンパク質生成物の表面電荷のpKa値の均質性を増加することができ、このことは、リガンド相互作用のpHプロフィールを鋭くすること、および等電点電気泳動またはクロマトフォーカシングによって分離を鋭くすることに導く。
溶液中の各アミノ酸は、それ自体が、単一の固定されたpKaを有し、これは、その官能基が半分プロトン化されているpHである。典型的なタンパク質において、多くの型の残基があり、近接性およびタンパク質呼吸効果(protein breathing effect)に起因して、これらはまた、変動可能な方法で、互いの有効なpKaを変化させる。このために、広範なpH条件の範囲内で、典型的なタンパク質は、数百種類ものイオン化種をとることができ、各々が、荷電アミノ酸残基および中性アミノ酸残基の非常に多くの組み合わせに起因して、異なる分子量および正味の電荷を有する。これは広いイオン化スペクトルといわれ、このようなタンパク質の分析(すなわち、質量スペクトル)および精製をより困難にする。
薬学的に活性なタンパク質へのURP配列の付加は、得られる生成物の製剤および/または送達を顕著に単純化することができる。URP配列は、非常に親水性であるように設計することができ、結果として、これらは、他のヒトタンパク質に結合するために使用する疎水性パッチをしばしば含む、(例えば)ヒトタンパク質の溶解性を改善する。抗体のようなこのようなヒトタンパク質の製剤は困難な課題であり得、しばしば、それらの濃度および送達の選択肢を制限する。URPは生成物の沈殿および凝集を減少することができ、そしてこれは、溶液中で生成物を安定化することが典型的には必要とされる、より少ない成分を含むより単純な製剤を使用することを可能にする。URP配列含有生成物の溶解性の改善は、より高い濃度でこれらの生成物を製剤化することを可能にし、結果として、注射可能な生成物についての注射量を減少することができ、非常に少ない注射量に制限されている在宅での注射を可能にし得る。URP配列の付加はまた、得られる製剤化された生成物の保存を単純化し得る。URP配列は、それらの経口、肺、または鼻内の取り込みを容易にするために薬学的に活性なタンパク質に加えることができる。URP配列は、これらがより高い生成物濃度および生成物安定性の改善を可能にするので、種々の様式の送達を可能にし得る。さらなる改善は、膜浸透を容易にするURP配列を設計することによって達成することができる。
URP配列を付加することは、得られる生成物の製造のための顕著な利点を有し得る。多くの組換え生成物、とりわけ、ネイティブヒトタンパク質は、製造の間に凝集物を形成する傾向を有し、これらは溶解することが困難または不可能であり得、最終製品から取り出された場合でさえ、これらは再び発生し得る。これらは、通常、これらの(ネイティブヒト)タンパク質が他の(ネイティブヒト)タンパク質とそれによって接触される疎水性パッチに起因し、これらの残基を変異させることは、免疫原性のためのリスクがあると考えられている。しかし、URPは、このようなタンパク質の疎水性を増加することができ、ヒトタンパク質の配列を変異させることなく、それらの製剤を可能にする。URP配列は、そのネイティブ状態に達するために、タンパク質のフォールディングを容易にし得る。多くの薬学的に活性なタンパク質が、組換え方法によって、非ネイティブ凝集状態で製造されている。これらの生成物は変性される必要があり、引き続いて、これらは、タンパク質がそれらのネイティブな活性状態にフォールディングすることを可能にする条件下でインキュベートされる。再生の間の頻繁な副反応は凝集体の形成である。タンパク質へのURP配列の融合は、それが凝集体を形成する傾向を顕著に減少し、従って、これは、生成物の薬学的な活性成分のフォールディングを容易にする。URP含有生成物は、ポリマー修飾タンパク質と比較して、調製するのがはるかにより容易である。化学的ポリマー修飾は、活性タンパク質が精製された後で、余分な修飾および精製の段階を必要とする。対照的に、URP配列は、薬学的に活性なタンパク質と一緒に、組換えDNA法を使用して製造することができる。本発明の生成物はまた、ポリマー修飾生成物と比較して、特徴付けすることが顕著により容易である。組換え産生プロセスに起因して、規定された分子特性を有するより均質な生成物を得ることができる。URP配列はまた、生成物の精製を容易にし得る。例えば、URP配列は、アフィニティクロマトグラフィによって捕捉できるサブ配列を含むことができる。1つの例は、ヒスチジンが豊富な配列であり、これは、ニッケルのような固定化金属を用いて、樹脂上で捕捉することができる。URP配列はまた、過度の負または正に荷電したアミノ酸を有するように設計することができる。結果として、これらは、生成物の正味の電荷に顕著な影響を与えることができ、これは、イオン交換クロマトグラフィまたは調製用電気泳動による生成物の精製を容易にし得る。
本発明のMURPは1つ以上の結合モジュールを含み得る。結合モジュール(BM)とは、細胞−、組織−、または器官−標的化のためなどの1つ以上の治療標的またはアクセサリー標的であり得る、1つまたはいくつかの標的に特異的に結合し得るペプチドまたはタンパク質の配列をいう。BMは、直鎖状または環状のペプチド、システイン束縛ペプチド、マイクロプロテイン、骨格タンパク質(例えば、フィブロネクチン、アンキリン、クリスタリン、ストレプトアビジン、抗体フラグメント、ドメイン抗体)、ペプチドホルモン、増殖因子、サイトカイン、または任意の型のタンパク質ドメイン、ヒトまたは非ヒト、天然または非天然であり得、そしてこれらは、天然の骨格に基づいてもよく、または天然の骨格に基づかなくてもよく、または組み合わせに基づいてもよく、またはこれらは上記のいずれかのフラグメントであってもよい。選択的に、これらのBMは、結合特性、それらの安定性、または他の特性を増強するために、1つまたは複数のアミノ酸を付加、除去、または置き換えすることによって操作することができる。結合モジュールは、設計、またはファージディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、もしくは他のディスプレイ法を含む遺伝子パッケージディスプレイによって、天然のタンパク質から得ることができる。結合モジュールは、アビディティを生じる、同じ標的の同じコピーに結合し得、またはこれらは、同じ標的の異なるコピー(これは、例えば、細胞膜によって、これらのコピーが何らかの形で接続または連結される場合に、アビディティを生じ得る)に結合し得、またはこれらは、2つの関連しない標的(これは、例えば、膜によって、これらの標的が何らかの形で連結される場合に、アビディティを生じる)に結合し得る。結合モジュールは、ペプチドまたはタンパク質のランダムライブラリーをスクリーニングすること、またはさもなければ分析することによって同定することができる。
対象MURPはN末端モジュール(NM)を含み得、これは、例えば、MURPの産生を容易にする際に特に有用である。NMは、生成物が大腸菌細胞質中で発現されるときに、単一のメチオニン残基であり得る。典型的な生成物形式は、治療タンパク質に融合されたURPであり、これは、N末端がホルミル−メチオニンであるように、細菌細胞質中で発現される。ホルミル−メチオニンは、永続性、またはこれが生物学的または化学的プロセシングによって除去されるならば、一過性のいずれかであり得る。
MURPはC末端モジュールを含み得、これは、例えば、MURPの産生を容易にする際に特に有用である。例えば、C末端モジュールは、融合され、それゆえに、タンパク質発現を増加し、または精製を容易にする配列を除去するためのタンパク質分解性プロセシングをもたらすための切断部位を含み得る。特に、C末端モジュールはまた、Xa因子、トロンビン、TEVプロテアーゼ、またはエンテロキナーゼのような特異的プロテアーゼによって切断可能なプロセシング部位も含み得る。プロセシング部位はまた、化学的加水分解によって切断可能であるように設計することができる。1つの例は、酸性条件下で切断できるアミノ酸配列asp−proである。C末端モジュールはまた、MURPの精製を容易にすることを目的とした親和性タグであり得る。例えば、C末端モジュールは、固定化金属クロマトグラフィによる生成物捕捉を可能にする複数のhis残基を含むように設計することができる。C末端モジュールは、抗体によって特異的に捕捉または検出できるペプチド配列を含むことができる。タグの非限定的な例は、FLAG、HA、c−myc、またはHis−タグである。C末端モジュールはまた、得られるMURPのプロテアーゼ抵抗性を増強するように操作または選択することができる。
MURPは1つまたは複数のエフェクターモジュール(EM)を含み得るか、または全く含み得ない。エフェクターモジュールは、典型的には、標的化を提供しないが、しかし、これらは、細胞の殺傷のような治療効果のために必要とされる活性を提供する。EMは、薬学的に活性な小分子(すなわち、毒性薬物)、ペプチド、またはタンパク質であり得る。非限定的な例は、サイトカイン、抗体、酵素、増殖因子、ホルモン、受容体、受容体アゴニストまたはアンタゴニストであり、その全体またはフラグメントまたはドメインには関わらない。エフェクターモジュールはまた、合成または天然に関わらず、化学的に連結された小分子薬物を有するペプチド配列を含み得る。選択的に、これらのエフェクター分子は、毒性活性の放出に導く選択条件下で化学リンカーを介して切断されてもよく、または切断されなくてもよい、エフェクターモジュールに連結することができる。EMは、放射性同位元素およびそれらのキレート、ならびにPETおよびMRIのための種々の標識を含み得る。エフェクターモジュールはまた、細胞または組織に対して毒性であり得る。特に関心が持たれるものは、疾患組織または疾患細胞型に特異性を有する毒性エフェクターモジュールおよび結合モジュールを含むMURPである。このようなMURPは、疾患組織または疾患細胞型に特異的に蓄積し得、そして疾患組織または細胞型で優先的にそれらの毒性作用を発揮し得る。以下に列挙したものは、例示的なエフェクターモジュールである。
DR4/DR5アゴニスト−DR4およびDR5は死受容体であり、多くの腫瘍細胞で発現されている。これらの受容体は、細胞死および腫瘍の退行に導く三量体化によって誘発させることができる。DR4またはDR5についての特異性を有する結合ドメインは、ファージパニングまたは他のディスプレイ方法によって得ることができる。これらのDR4またはDR5特異的結合ドメインは、図12に図示されるように、リンカーとしてURPモジュールを使用して多量体化することができる。特に関心が持たれるものは、DR4またはDR5または両方についての特異性を有する3つ以上の結合モジュールを含むMURPである。図12に図示されるように、MURPは、腫瘍組織中で過剰発現される腫瘍抗原についての特異性を有するさらなる結合モジュールを含むことができる。このことは、腫瘍組織中に特異的に蓄積するMURPを構築すること、および細胞死を誘発することを可能にする。MURPは、DR4またはDR5のいずれかを結合するモジュールを含み得る。特に関心が持たれるものは、DR4およびDR5の両方を結合する結合モジュールを含むMURPである。
CD200、補体成分C1s、CD200R1、補体成分C2、CD229/SLAMF3、補体成分C3a、CD23/FcイプシロンRII、補体成分C3d、CD2F−10/SLAMF9、補体成分C5a、CD5L、カドヘリン−4/R−カドヘリン、CD69、カドヘリン−6、CDC2、カドヘリン−8、CDC25A、カドヘリン−11、CDC25B、カドヘリン−12、CDCP1、カドヘリン−13、CDO、カドヘリン−17、CDX4、E−カドヘリン、CEACAM−1/CD66a、N−カドヘリン、CEACAM−6、P−カドヘリン、セルベラス(Cerberus)1、VE−カドヘリン、CFTR、カルビンジンD、cGMP、カルシニューリンA、Chem R23、カルシニューリンB、ケメリン、カルレチキュリン(Calreticulin)−2、ケモカインサンプラーパック、CaMキナーゼII、キチナーゼ3様1、cAMP、キトトリオシダーゼ/CHIT1、カンナビノイドR1、Chkl、カンナビノイドR2/CB2/CNR2、Chk2、CAR/NR1I3、CHL−l/LlCAM−2、カルボニックアンヒドラーゼI、コリンアセチルトランスフェラーゼ/ChAT、カルボニックアンヒドラーゼII、コンドロレクチン、カルボニックアンヒドラーゼIII、コルジン(Chordin)、カルボニックアンヒドラーゼIV、コルジン様1、カルボニックアンヒドラーゼVA、コルジン様2、カルボニックアンヒドラーゼVB、CINC−1、カルボニックアンヒドラーゼVI、CINC−2、カルボニックアンヒドラーゼVII、CINC−3、カルボニックアンヒドラーゼVIII、クラスピン、カルボニックアンヒドラーゼIX、クラウジン(Claudin)−6、カルボニックアンヒドラーゼX、CLC、カルボニックアンヒドラーゼXII、CLEC−I、カルボニックアンヒドラーゼXIII、CLEC−2、カルボニックアンヒドラーゼXIV、CLECSF13/CLEC4F、カルボキシメチルリジン、CLECSF8、カルボキシペプチダーゼA1/CPA1、CLF−1、カルボキシペプチダーゼA2、CL−P1/COLEC12、カルボキシペプチダーゼA4、クラステリン、カルボキシペプチダーゼB1、クラステリン様1、カルボキシペプチダーゼE/CPE、CMG−2、カルボキシペプチダーゼXl、CMV UL146、カルジオトロピン−1、CMV UL147、カモシンジペプチダーゼ1、CNP、カロンテ(Caronte)、CNTF、CART、CNTF Rαa、カスパーゼ、凝固因子II/トロンピン、カスパーゼ−1、凝固因子Ill/組織因子、カスパーゼ−2、凝固因子VII、カスパーゼ−3、凝固因子X、カスパーゼ−4、凝固因子XI、カスパーゼ−6、凝固因子XIV/プロテインC、カスパーゼ−7、COCO、カスパーゼ−8、コヒーシン、カスパーゼ−9、コラーゲンI、カスパーゼ−10、コラーゲンII、カスパーゼ−12、コラーゲンIV、カスパーゼ−13、共通γ鎖/IL−2Rγ、カスパーゼペプチド阻害因子、COMP/トロンボスポンジン−5、カタラーゼ、補体成分C1rLP、βカテニン、補体成分C1qA、カテプシン1、補体成分C1qC、カテプシン3、補体因子D、カテプシン6、補体因子I、カテプシンA、補体MASP3、カテプシンB、コネキシン43、カテプシンC/DPPI、コンタクチン−1、カテプシンD、コンタクチン−2/TAG1、カテプシンE、コンタクチン−4、カテプシンF、コンタクチン−5、カテプシンH、コリン(Corin)、カテプシンL、コルヌリン(Cornulin)、カテプシンO、CORS26/C1qTNF、3、カテプシンS、ラット皮膚幹細胞、カテプシンV、コルチゾール、カテプシンX/Z/P、COUP−TF I/NR2F1、CBP、COUP−TF II/NR2F2、CCI、COX−I、CCK−A R、COX−2、CCL28、CRACC/SLAMF7、CCR1、C−反応性タンパク質、CCR2、クレアチンキナーゼ、筋肉/CKMM、CCR3、クレアチニン、CCR4、CREB、CCR5、CREG、CCR6、CRELDl、CCR7、CRELD2、CCR8、CRHBP、CCR9、CRHR−1、CCR10、CRIM1、CD155/PVR、クリプト(Cripto)、CD2、CRISP−2、CD3、CRISP−3、CD4、クロスベインレス(Crossveinless)−2、CD4+/45RA−、CRTAM、CD4+/45RO−、CRTH−2、CD4+/CD62L−/CD44、CRY1、CD4+/CD62L+/CD44、クリプティック(Cryptic)、CD5、CSB/ERCC6、CD6、CCL27/CTACK、CD8、CTGF/CCN2、CD8+/45RA−、CTLA−4、CD8+/45RO−、キュービリン(Cubilin)、CD9、CX3CR1、CD14、CXADR、CD27/TNFRSF7、CXCL16、CD27リガンド/TNFSF7、CXCR3、CD28、CXCR4、CD30/TNFRSF8、CXCR5、CD30リガンド/TNFSF8、CXCR6、CD31/PECAM−1、シクロフィリンA、CD34、Cyr61/CCN1、CD36/SR−B3、シスタチンA、CD38、シスタチンB、CD40/TNFRSF5、シスタチンC、CD40リガンド/TNFSF5、シスタチンD、CD43、シスタチンE/M、CD44、シスタチンF、CD45、シスタチンH、CD46、シスタチンH2、CD47、シスタチンS、CD48/SLAMF2、シスタチンSA、CD55/DAF、シスタチンSN、CD58/LFA−3、シトクロムc、CD59、アポシトクロムc、CD68、ホロシトクロムc、CD72、サイトケラチン8、CD74、サイトケラチン14、CD83、サイトケラチン19、CD84/SLAMF5、サイトニン、D6、DISP1、DAN、Dkk−1、DANCE、Dkk−2、DARPP−32、Dkk−3、DAX1/NR0B1、Dkk−4、DCC、DLEC、DCIR/CLEC4A、DLLI、DCAR、DLL4、DcR3/TNFRSF6B、d−ルシフェリン、DC−SIGN、DNAリガーゼIV、DC−SIGNR/CD299、DNAポリメラーゼβ、DcTRAIL R1/TNFRSF23、DNAM−1、DcTRAIL R2/TNFRSF22、DNA−PKcs、DDR1、DNER、DDR2、ドーパデカルボキシラーゼ/DDC、DEC−205、DPCR−1、デカペンタプレジック(Decapentaplegic)、DPP6、デコリン、DPPA4、デクチン−1/CLEC7A、DPPA5/ESG1、デクチン−2/CLEC6A、DPPII/QPP/DPP7、DEP−1/CD148、DPPIV/CD26、デザートヘッジホッグ(Desert Hedgehog)、DR3/TNFRSF25、デスミン、DR6/TNFRSF21、デスモグレイン−1、DSCAM、デスモグレイン−2、DSCAM−L1、デスモグレイン−3、DSPG3、ディスヘベルド(Dishevelled)−1、Dtk、ディスヘベルド−3、ダイナミン、EAR2/NR2F6、EphA5、ECE−1、EphA6、ECE−2、EphA7、ECF−L/CHI3L3、EphA8、ECM−1、EphB1、エコチン、EphB2、EDA、EphB3、EDA−A2、EphB4、EDAR、EphB6、EDG−1、エフリン、EDG−5、エフリン−A1、EDG−8、エフリン−A2、eEF−2、エフリン−A3、EGF、エフリン−A4、EGF R、エフリン−A5、EGR1、エフリン−B、EG−VEGF/PK1、
エフリン−B1、eIF2α、エフリン−B2、eIF4E、エフリン−B3、Elk−I、エピゲン(Epigen)、EMAP−II、エピモルフィン/シンタキシン2、EMMPRIN/CD147、エピレグリン、CXCL5/ENA、EPR−l/Xa受容体、エンドカン、ErbB2、エンドグリン/CD105、ErbB3、エンドグリカン、ErbB4、エンドヌクレアーゼIII、ERCCl、エンドヌクレアーゼIV、ERCC3、エンドヌクレアーゼV、ERK1/ERK2、エンドヌクレアーゼVIII、ERK1、エンドレセペリン/パーレカン、ERK2、エンドスタチン、ERK3、エンドセリン−1、ERK5/BMK1、エングレイルド−2、ERRα/NR3Bl、EN−RAGE、ERRβ/NR3B2、エンテロペプチダーゼ/エンテロキナーゼ、ERRγ/NR3B3、CCL111/エオタキシン、エリスロポエチン、CCL24/エオタキシン−2、エリスロポエチンR、CCL26/エオタキシン−3、ESAM、EpCAM/TROP−1、ERα/NR3A1、EPCR、ERβ/NR3A2、Eph、エキソヌクレアーゼIII、EphAl、エキソストシン様2/EXTL2、EphA2、エキソストシン様3/EXTL3、EphA3、FABP1、FGF−BP、FABP2、FGF R1−4、FABP3、FGF R1、FABP4、FGF R2、FABP5、FGF R3、FABP7、FGF R4、FABP9、FGF R5、補体因子B、Fgr、FADD、FHR5、FAM3A、フィブロネクチン、FAM3B、フィコリン−2、FAM3C、フィコリン−3、FAM3D、FITC、線維芽細胞活性化タンパク質α/FAP、FKBP38、Fas/TNFRSF6、Flap、Fasリガンド/TNFSF6、FLIP、FATP1、FLRG、FATP4、FLRT1、FATP5、FLRT2、FcγRI/CD64、FLRT3、FcγRIIB/CD32b、Flt−3、FcγRIIC/CD32c、Flt−3リガンド、FcγRIIA/CD32a、ホリスタチン、FcγRIII/CD16、ホリスタチン様1、FcRH1/IRTA5、FosB/G0S3、FcRH2/IRTA4、FoxD3、FcRH4/IRTA1、FoxJ1、FcRH5/IRTA2、FoxP3、Fc受容体様3/CD16−2、Fpg、FEN−I、FPR1、フェツインA、FPRLl、フェツインB、FPRL2、FGF酸性、CX3CL1/フラクタルキン、FGF塩基性、フリズルド−1、FGF−3、フリズルド−2、FGF−4、フリズルド−3、FGF−5、フリズルド−4、FGF−6、フリズルド−5、FGF−8、フリズルド−6、FGF−9、フリズルド−7、FGF−10、フリズルド−8、FGF−11、フリズルド−9、FGF−12、Frk、FGF−13、sFRP−1、FGF−16、sFRP−2、FGF−17、sFRP−3、FGF−19、sFRP−4、FGF−20、フューリン、FGF−21、FXR/NR1H4、FGF−22、Fyn、FGF−23、G9a/EHMT2、GFRα−3/GDNF Rα−3、GABA−A−Rα1、GFRα−4/GDNF Rα−4、GABA−A−Rα2、GITR/TNFRSF18、GABA−A−Rα4、GITRリガンド/TNFSF 18、GABA−A−Rα5、GLI−1、GABA−A−Rα6、GLI−2、GABA−A−Rβ1、GLP/EHMT1、GABA−A−Rβ2、GLP−I R、GABA−A−Rβ3、グルカゴン、GABA−A−Rγ2、グルコサミン(N−アセチル)−6−スルファターゼ/GNS、GABA−B−R2、GIuR1、GAD1/GAD67、GluR2/3、GAD2/GAD65、GluR2、GADD45α、GluR3、GADD45β、Glut1、GADD45γ、
Glut2、ガレクチン−1、Glut3、ガレクチン−2、Glut4、ガレクチン−3、Glut5、ガレクチン−3BP、グルタレドキシン1、ガレクチン−4、グリシンR、ガレクチン−7、グリコホリンA、ガレクチン−8、グリピカン2、ガレクチン−9、グリピカン3、GalNAc4S−6ST、グリピカン5、GAP−43、グリピカン6、GAPDH、GM−CSF、Gas1、GM−CSF Rα、Gas6、GMFβ、GASP−1/WFIKKNRP、gp130、GASP−2/WFIKKN、グリコーゲンホスホリラーゼBB/GPBB、GATA−I、GPR15、GATA−2、GPR39、GATA−3、GPVI、GATA−4、GR/NR3C1、GATA−5、Gr−1/Ly−6G、GATA−6、グラヌリシン、GBL、グランザイムA、GCNF/NR6A1、グランザイムB、CXCL6/GCP−2、グランザイムD、G−CSF、グランザイムG、G−CSF R、グランザイムH、GDF−1、GRASP、GDF−3 GRB2、GDF−5、グレムリン、GDF−6、GRO、GDF−7、CXCL1/GROα、GDF−8、CXCL2/GROβ、GDF−9、CXCL3/GROγ、GDF−11、成長ホルモン、GDF−15、成長ホルモンR、GDNF、GRP75/HSPA9B、GFAP、GSK−3α/β、GFI−1、GSK−3α、GFRα−1/GDNF Rα−1、GSK−3β、GFRα−2/GDNF Rα−2、EZFIT、H2AX、ヒスチジン、H60、HM74A、HAI−1、HMGA2、HAI−2、HMGB1、HAI−2A、TCF−2/HNF−1β、HAI−2B、HNF−3β/FoxA2、HAND1、HNF−4α/NR2A1、HAPLN1、HNF−4γ/NR2A2、気道トリプシン様プロテアーゼ/HAT、HO−1/HMOX1/HSP32、HB−EGF、HO−2/HMOX2、CCL14a/HCC−1、HPRG、CCL14b/HCC−3、Hrk、CCL16/HCC−4、HRP−I、αHCG、HS6ST2、Hck、HSD−I、HCR/CRAM−A/B、HSD−2、HDGF、HSP10/EPF、ヘモグロビン、HSP27、ヘパソシン、HSP60、HES−1、HSP70、HES−4、HSP90、HGF、HTRA/プロテアーゼDo、HGF活性化因子、HTRA1/PRSS11、HGF R、HTRA2/Omi、HIF−1α、HVEM/TNFRSF14、HIF−2α、ヒアルロナン、HIN−1/セクレトグロブリン3A1、4−ヒドロキシノネナール、Hip、CCL1/I−309/TCA−3、IL−10、cIAP(パン(pan))、IL−10Rα、cIAP−l/HIAP−2、IL−10Rβ、cIAP−2/HIAP−1、IL−11、IBSP/シアロタンパク質II、IL−11Rα、ICAM−1/CD54、IL−12、ICAM−2/CD102、IL−12/IL−23p40、ICAM−3/CD50、IL−12Rβ1、ICAM−5、IL−12Rβ2、ICAT、IL−13、ICOS、IL−13Rα1、イズロン酸2−スルファターゼ/IDS、IL−13Rα2、IFN、IL−15、IFN−α、IL−15Rα、IFN−α1、IL−16、IFN−α2、
IL−17、IFN−α4b、IL−17R、IFN−αA、IL−17RC、IFN−αB2、IL−17RD、IFN−αC、IL−17B、IFN−αD、IL−17B R、IFN−αF、IL−17C、IFN−αG、IL−17D、IFN−αH2、IL−17E、IFN−αI、IL−17F、IFN−αJ1、IL−18/IL−1F4、IFN−αK、IL−18BPa、IFN−αWA、IL−18BPc、IFN−α/β R1、IL−18BPd、IFN−α/β R2、IL−18Rα/IL−1R5、IFNβ、IL−18Rβ/IL−1R7、EFN−γ、IL−19、IFN−γRl、IL−20、IFN−γR2、IL−20Rα、IFN−ω、IL−20Rβ、IgE、IL−21、IGFBP−I、IL−21R、IGFBP−2、IL−22、IGFBP−3、IL−22R、IGFBP−4、IL−22BP、IGFBP−5、IL−23、IGFBP−6、IL−23R、IGFBP−L1、IL−24、IGFBP−rp1/IGFBP−7、IL−26/AK155、IGFBP−rP10、IL−27、IGF−I、IL−28A、IGF−I R、IL−28B、IGF−II、IL−29/IFN−λ1、IGF−II R、IL−31、IgG、IL−31RA、IgM、IL−32α、IGSF2、IL−33、IGSF4A/SynCAM、ILT2/CD85j、IGSF4B、ILT3/CD85k、IGSF8、ILT4/CD85d、IgY、ILT5/CD85a、IkBβ、ILT6/CD85e、IKKα、インディアンヘッジホッグ(Indian Hedgehog)、IKKイプシロン、INSRR、IKKγ、インスリン、IL−Iα/IL−lFl、インスリンR/CD220、IL−1β/IL−1F2、プロインスリン、IL−1ra/IL−lF3、インスリシン/IDE、IL−1F5/FIL1δ、インテグリンα2/CD49b、IL−1F6/FIL1ε、インテグリンα3/CD49c、IL−1F7/FIL1ζ、インテグリンα3βl/VLA−3、IL−1F8/FIL1η、インテグリンα4/CD49d、IL−1F9/IL−1Hl、インテグリンα5/CD49e、IL−1F10/IL−1HY2、インテグリンα5β1、IL−I RI5 インテグリンα6/CD49f、IL−I RII、インテグリンα7、IL−I R3/IL−1 R AcP、インテグリンα9、IL−I R4/ST2、インテグリンαE/CD103、IL−I R6/IL−1Rrp2、インテグリンαL/CD11a、IL−I R8、インテグリンαLβ2、IL−IR9、インテグリンαM/CD11b、IL−2、インテグリンαMβ2、IL−2Rα、インテグリンαV/CD51、IL−2Rβ、インテグリンαVβ5、IL−3、インテグリンαVβ3、IL−3Rα、インテグリンαVβ6、IL−3Rβ、インテグリンαX/CD11c、IL−4、インテグリンβ1/CD29、IL−4R、インテグリンβ2/CD18、IL−5、インテグリンβ3/CD61、IL−5Rα、インテグリンβ5、IL−6、インテグリンβ6、IL−6R、インテグリンβ7、IL−7、CXCL10/IP−10/CRG−2、IL−7Rα/CD127、IRAKI、CXCR1/IL−8RA、IRAK4、CXCR2/IL−8RB、IRS−I、CXCL8/IL−8、イスレット(Islet)−1、IL−9、CXCL11/I−TAC、IL−9R、ジャグド(Jagged)1、JAM−4/IGSF5、ジャグド2、JNK、JAM−A、JNK1/JNK2、JAM−B/VE−JAM、JNKl、JAM−C、JNK2、キニノーゲン、カリクレイン3/PSA、キニノスタチン、カリクレイン4、KIR/CD158、カリクレイン5、KIR2DL1、カリクレイン6/ニューロシン、KIR2DL3、カリクレイン7、KIR2DL4/CD158d、カリクレイン8/ニューロプシン、KIR2DS4、カリクレイン9、KIR3DL1、血漿カリクレイン/KLKBl、KIR3DL2、カリクレイン10、キレル(Kirrel)2、カリクレイン11、KLF4、カリクレイン12、KLF5、カリクレイン13、KLF6、カリクレイン14、クロト(Klotho)、カリクレイン15、クロトβ、KC、KOR、ケアプル(Keapl)、クレメン−1、ケル(Kell)、クレメン−2、KGF/FGF−7、LAG−3、LINGO−2、LAIRl、リピン2、LAIR2、リポカリン−1、ラミニンα4、リポカリン−2/NGAL、ラミニンγ1、5−リポキシゲナーゼ、ラミニンI、LXRα/NRlH3、ラミニンS、LXRβ/NRlH2、ラミニン−1、リビン(Livin)、ラミニン−5、LIX、
LAMP、LMER1/CD300A、ランゲリン、LMIR2/CD300c、LAR、LMIR3/CD300LF、ラテキシン(Latexin)、LMIR5/CD300LB、ライリン(Layilin)、LMIR6/CD300LE、LBP5LMO2、LDL R、LOX−1/SR−El、LECT2、LRH−1/NR5A2、LEDGF、LRIG1、レフティー(Lefty)、LRIG3、レフティー−1、LRP−I、レフティー−A、LRP−6、レグマイン(Legumain)、LSECtin/CLEC4G、レプチン、ルミカン、レプチンR、CXCL15/ラングキン(Lungkine)、ロイコトリエンB4、XCL1/リンホタクチン、ロイコトリエンB4 R1、リンホトキシン、LIF、リンホトキシンβ/TNFSF35LIF Rα、リンホトキシンβR/TNFRSF3、LIGHT/TNFSF14、Lyn、リミチン、Lyp、LIMPII/SR−B2、リシルオキシダーゼホモログ2、LIN−28、LYVE−1、LINGO−1、α2−マクログロブリン、CXCL9/MIG、MAD2L1、ミメカン、MAdCAM−I、ミンジン(Mindin)、MafB、鉱質コルチコイド(Mineralocorticoid)R/NR3C2、MafF、CCL3L1/MIP−1αアイソフォームLD78β、MafG、CCL3/MIP−1α、MafK、CCL4L1/LAG−1、MAG/シングレック(Siglec)−4a、CCL4/MIP−1β、MANF、CCL15/MIP−1δ、MAP2、CCL9/10/MIP−1γ、MAPK、MIP−2、マラプシン/パンクレアシン、CCL19/MIP−3β、MARCKS、CCL20/MIP−3α、MARCO、MIP−I、Mash1、MIP−II、マトリリン(Matrilin)−2、MIP−III、マトリリン−3、MIS/AMH、マトリリン−4、MIS RII、マトリプターゼ/ST14、MIXL1、MBL、MKK3/MKK6、MBL−2、MKK3、メラノコルチン3R/MC3R、MKK4、MCAM/CD146、MKK6、MCK−2、MKK7、Mcl−1、MKP−3、MCP−6、MLH−1、CCL2/MCP−1、MLK4α、MCP−11、MMP、CCL8/MCP−2、MMP−1、CCL7/MCP−3/MARC、MMP−2、CCL13/MCP−4、MMP−3、CCL12/MCP−5、MMP−7、M−CSF、MMP−8、M−CSF R、MMP−9、MCV−II型、MMP−10、MD−1、MMP−11、MD−2、MMP−12、CCL22/MDC、MMP−13、MDL−1/CLEC5A、MMP−14、MDM2、MMP−15、MEA−1、MMP−16/MT3−MMP、MEK1/MEK2、MMP−24/MT5−MMP、MEK1、MMP−25/MT6−MMP、MEK2、MMP−26、メルシン、MMR、MEPE、MOG、メプリンα、CCL23/MPIF−1、メプリンβ、M−Ras/R−Ras3、メール(Mer)、Mre11、メソテリン、MRP1メテオリン、MSK1/MSK2、メチオニンアミノペプチダーゼ1、MSKl、メチオニンアミノペプチダーゼ、MSK2、メチオニンアミノペプチダーゼ2、MSP、MFG−E8、MSP R/Ron、MFRP、Mug、MgcRacGAP、MULT−I、MGL2、ムサシ−1、MGMT、ムサシ−2、MIA、MuSK、MICA、MutY DNAグリコシダーゼ、MtCB、MyD88、MICL/CLEC12A、ミエロペルオキシダーゼ、β2マイクログロブリン、ミオカルジン、ミドカイン、ミオシリン(Myocilin)、MIF、ミオグロビン、NAIP NGFI−Bγ/NR4A3、ナノグ(Nanog)、NgR2/NgRHl、CXCL7/NAP−2、NgR3/NgRH2、Nbs1、ニドゲン(Nidogen)−1/エンタクチン、NCAM−l/CD56、ニドゲン−2、NCAM−Ll、一酸化窒素、ネクチン−1、ニトロチロシン、ネクチン−2/CD112、NKG2A、ネクチン−3、NKG2C、ネクチン−4、NKG2D、ネオゲニン、NKp30、ネプリリシン(Neprilysin)/CD10、NKp44、ネプリリシン−2/MMEL1/MMEL2、NKp46/NCR1、ネスチン、NKp80/KLRFl、NETO2、NKX2.5、ネトリン−1、NMDA R、NR1サブユニット、ネトリン−2、NMDA R、NR2Aサブユニット、ネトリン−4、NMDA R、NR2Bサブユニット、ネトリン−G1a、NMDA R、NR2Cサブユニット、ネトリン−G2a、N−Me−6,7−diOH−TIQ、ニューレグリン−1/NRG1、ノダール(Nodal)、ニューレグリン−3/NRG3、ノギン(Noggin)、ニューリチン(Neuritin)、ノゴ(Nogo)受容体、ニューロ(Neuro)D1、ノゴ−A、ニューロファシン(Neurofascin)、NOMO、ニューロゲニン−1、Nope、ニューロゲニン−2、ノリン(Norrin)、ニューロゲニン−3、eNOS、ニューロリシン(Neurolysin)、iNOS、ニューロフィシン(Neurophysin)II、nNOS、ニューロピリン−1、ノッチ(Notch)−1、ニューロピリン−2、ノッチ−2、ニューロポエチン、Notch−3、ニューロトリミン、ノッチ−4、ニューツリン(Neurturin)、NOV/CCN3、NFAMl、NRAGE、NF−H、NrCAM、NFkBl、NRL、NFkB2、NT−3、NF−L、NT−4、NF−M、NTB−A/SLAMF6、NG2/MCSP、NTHl、NGF R/TNFRSF16、ヌクレオステミン、β−NGF、ヌール(Nurr)−1/NR4A2、NGFI−Bα/NR4Al、OAS2、オレキシンB、OBCAM、OSCAR、OCAM、OSF−2/ペリオスチン、OCIL/CLEC2d、オンコスタチンM/OSM、OCILRP2/CLEC2i、OSM Rβ、Oct−3/4、オステオアクチビン/GPNMB、OGG1、オステオアドヘリン、オリグ(Olig)1、2,3,オステオカルシン、オリグ1、オステオクリン、オリグ2、オステオポンチン、オリグ3、オステオプロテゲリン/TNFRSF11B、オリゴデンドロサイトマーカーO1、Otx2、オリゴデンドロサイトマーカーO4、OV−6、OMgp、OX40/TNFRSF4、オプチシン、OX40リガンド/TNFSF4、オレキシンA、OAS2、オレキシンB、OBCAM、OSCAR、OCAM、OSF−2/ペリオスチン、OCIL/CLEC2d、オンコスタチンM/OSM、OCILRP2/CLEC2i、OSM Rβ、オクト−3/4、オステオアクチビン/GPNMB、OGG1、オステオアドヘリン、オリグ1、2、3、オステオカルシン、オリグ1、オステオクリン、オリグ2、オステオポンチン、オリグ3、オステオプロテゲリン(Osteoprotegerin)/TNFRSF11B、オリゴデンドロサイトマーカーO1、Otx2、オリゴデンドロサイトマーカーO4、OV−6、OMgp、OX40/TNFRSF4、オプチシン、OX40リガンド/TNFSF4、オレキシンA、RACK1、Ret、Rad1、REV−ERBα/NR1D1、Rad17、REV−ERBβ/NR1D2、Rad51、Rex−1、Rae−1、RGM−A、Rae−1α、RGM−B、Rae−1β、RGM−C、Rae−1δ、Rheb、Rae−1ε、リボソームタンパク質S6、Rae−1γ、RIP1、
Raf−1、ROBO1、RAGE、ROBO2、RalA/RalB、ROBO3、RalA、ROBO4、RalB、ROR/NR1F1−3(パン)、RANK/TNFRSF11A、RORα/NRIF1、CCL5/RANTES、RORγ/NRlF3、Rap1A/B、RTK様オーファン受容体1/RORl、RARα/NR1B1、RTK様オーファン受容体2/ROR2、RARβ/NR1B2、RP105、RARγ/NR1B3、RPA2、Ras、RSK(パン)、RBP4、RSK1/RSK2、RECK、RSK1、Reg2/PAP、RSK2、RegI、RSK3、RegII RSK4、RegIII、R−スポンジン1、Reg IIIa、R−スポンジン2、Reg IV、R−スポンジン3、リラキシン(Relaxin)−1、RUNX1/CBFA2、リラキシン−2、RUNX2/CBFA1、リラキシン−3、RUNX3/CBFA3、RELMα、RXRα/NR2B1、RELMβ、RXRβ/NR2B2、RELT/TNFRSF19L、RXRγ/NR2B3、レジスチン(Resistin)、S100A10、SLITRK5、S100A8、SLPI、S100A9、SMAC/Diablo、S100B、Smad1、S100P、Smad2、SALL1、Smad3、δ−サーコグリカン(Sarcoglycan)、Smad4、Sca−1/Ly6、Smad5、SCD−1、Smad7、SCF、Smad8、SCF R/c−kit、SMC1、SCGF、α−平滑筋アクチン、SCL/Tal1、SMUG1、SCP3/SYCP3、スネイル(Snai1)、CXCL12/SDF−1、ナトリウムカルシウム交換因子1、SDNSF/MCFD2、ソギー(Soggy)−1、α−セクレターゼ、ソニックヘッジホッグ、γ−セクレターゼ、SorCS1、β−セクレターゼ、SorCS3、E−セレクチン、ソーチリン(Sortilin)、L−セレクチン、SOST、P−セレクチン、SOX1、セマホリン3A、SOX2、セマホリン3C、SOX3、セマホリン3E、SOX7、セマホリン3F、SOX9、セマホリン6A、SOX10、セマホリン6B、SOX17、セマホリン6C、SOX21セマホリン6D、SPARC、セマホリン7A、SPARC様1、セパラーゼ(Separase)、SP−D、セリン/スレオニンホスファターゼ基質I、スピンネシン、セルピンA1、F−スポンジン、セルピンA3、SR−AI/MSR、セルピンA4/カリスタチン、Src、セルピンA5/プロテインC阻害剤、SREC−I/SR−F1、セルピンA8/アンジオテンシノーゲン、SREC−II、セルピンB5、SSEA−1、セルピンC1/抗トロンビン−III、SSEA−3、セルピンD1/ヘパリン補因子II、SSEA−4、セルピンE1/PAI−1、ST7/LRP12、セルピンE2、スタビリン−1、セルピンF1、スタビリン−2、セルピンF2、スタニオカルシン(Stanniocalcin)1、セルピンG1/C1阻害剤、スタニオカルシン2、セルピンI2、STAT1、血清アミロイドA1、STAT2、SF−1/NR5A1、STAT3、SGK、STAT4、SHBG、STAT5a/b、SHIP、STAT5a、SHP/NR0B2、STAT5b、SHP−I、STAT6、SHP−2、VE−スタチン、SIGIRR、ステラ(Stella)/Dppa3、シングレック(Siglec)−2/CD22、STRO−I、シングレック−3/CD33、サブスタンスP、シングレック−5、スルファミダーゼ、スルファミダーゼ/SGSH、シングレック−6、スルファターゼ修飾因子1/SUMF1、シングレック−7、スルファターゼ修飾因子2/SUMF2、シングレック−9、SUMO1、シングレック−10、SUMO2/3/4、シングレック−11、SUMO3、シングレック−F、スーパーオキシドジスムターゼ、SIGNR1/CD209、スーパーオキシドジスムターゼ−1/Cu−Zn SOD、SIGNR4、スーパーオキシドジスムターゼ−2/Mn−SOD、SIRPβ1、スーパーオキシドジスムターゼ−3/EC−SOD、SKI、サバイビン(Survivin)、SLAM/CD150、シナプシン(Synapsin)I、スリーピングビューティートランスポサーゼ(Sleeping Beauty Transposase)、シンデカン(Syndecan)−1/CD138、スリット3、シンデカン−2、SLITRK1、シンデカン−3、SLITRK2、シンデカン−4、SLITRK4、TACI/TNFRSF13B、TMEFF1/トモレグリン−1、TAO2、TMEFF2、TAPP1、TNF−α/TNFSF1A、CCL17/TARC、TNFβ/TNFSF1B、Ta
u、TNF RI/TNFRSFIA、TC21/R−Ras2、TNF RII/TNFRSFIB、TCAM−1、TOR、TCCR/WSX−1、TP−1、TC−PTP、TP63/TP73L、TDG、TR、CCJL25/TECK、TRα/NR1A1、テネイシンC、TRβ1/NR1A2、テネイシンR、TR2/NR2C1、TER−119、TR4/NR2C2、TERT、TRA−1−85、テスティカン(Testican)1/SPOCK1、TRADD、テスティカン2/SPOCK2、TRAF−1、テスティカン3/SPOCK3、TRAF−2、TFPI、TRAF−3、TFPI−2、TRAF−4、TGF−α、TRAF−6、TGFβ、TRAIL/TNFSF10、TGFβ1、TRAIL R1/TNFRSF10A、LAP(TGFβ1)、TRAIL R2/TNFRSF10B、ラテント(Latent)TGFβ1、TRAIL R3/TNFRSF10C、TGFβ1.2、TRAIL R4/TNFRSF10D、TGFβ2、TRANCE/TNFSF11、TGFβ3、TfR(トランスフェリンR)、TGFβ5、アポ−トランスフェリン、ラテントTGFβ bp1、ホロ−トランスフェリン、ラテントTGFβ bp2、トラッピン−2/エラフィン、ラテントTGFβ bp4、TREM−1、TGFβ RI/ALK−5、TREM−2、TGFβ RII、TREM−3、TGFβ RIIb、TREML1/TLT−1、TGFβ RIII、TRF−1、サーモリシン、TRF−2、チオレドキシン−1、TRH−分解外酵素/TRHDE、チオレドキシン−2、TRIM5、チオレドキシン−80、トリペプチジル−ペプチダーゼI、チオレドキシン様5/TRP14、TrkA、THOPl、TrkB、トロンボモジュリン/CD141、TrkC、トロンボポエチン、TROP−2、トロンボポエチンR、トロポニンIペプチド3、トロンボスポンジン−1、トロポニンT、トロンボスポンジン−2、TROY/TNFRSF19、トロンボスポンジン−4、トリプシン1、サイモポエチン、トリプシン2/PRSS2、サイマス(Thymus)ケモカイン−1、トリプシン3/PRSS3、タイ(Tie)−1、トリプターゼ−5/Prss32、Tie−2、トリプターゼα/TPSl、TIM−1/KIM−1/HAVCR、トリプターゼβ−l/MCPT−7、TIM−2、トリプターゼβ−2/TPSB2、TIM−3、トリプターゼε/BSSP−4、TIM−4、トリプターゼγ−1/TPSGl、TIM−5、トリプトファンヒドロキシラーゼ、TIM−6、TSC22、TIMP−1、TSG、TIMP−2、TSG−6、TIMP−3、TSK、TIMP−4、TSLP、TL1A/TNFSF15、TSLP R、TLR1、TSP50、TLR2、β−IIIチューブリン、TLR3、TWEAK/TNFSF12、TLR4、TWEAK R/TNFRSF12、TLR5、Tyk2、TLR6、ホスホ−チロシン、TLR9、チロシンヒドロキシラーゼ、TLX/NR2E1、チロシンホスファターゼ基質I、ユビキチン、UNC5H3、Ugi、UNC5H4、UGRP1、UNG、ULBP−1、uPA、ULBP−2、uPAR、ULBP−3、URB、UNC5H1、UVDE、UNC5H2、バニロイドR1、VEGF R、VASA、VEGF R1/Flt−1、バソヒビン、VEGF R2/KDR/Flk−1、バソリン、VEGF R3/Flt−4、バソスタチン、バーシカム(Versican)、Vav−1、VG5Q、VCAM−1、VHR、VDR/NR1I1、ビメンチン、VEGF、ビトロネクチン、VEGF−B、VLDLR、VEGF−C、vWF/A2、VEGF−D、シヌクレイン−α、Ku70、WASP、Wnt−7b、WIF−I、Wnt−8a WISP−1/CCN4、Wnt−8b、WNK1、Wnt−9a、Wnt−1、Wnt−9b、Wnt−3a、Wnt−10a、Wnt−4、Wnt−10b、Wnt−5a、Wnt−11、Wnt−5b、wnvNS3、Wnt7a、XCRl、XPE/DDB1、XEDAR、XPE/DDB2、Xg、XPF、XIAP、XPG、XPA、XPV、XPD、XRCC1、Yes、YY1、EphA4。
仮定のタンパク質FLJ14798、仮定のタンパク質FLJ14995、仮定のタンパク質FLJ16180、仮定のタンパク質FLJ16802、仮定のタンパク質FLJ32069、仮定のタンパク質FLJ37401、仮定のタンパク質FLJ38750、仮定のタンパク質FLJ40162、仮定のタンパク質FLJ41415、仮定のタンパク質FLJ90576、仮定のタンパク質FLJ90590、仮定のタンパク質FLJ90622、仮定のタンパク質KCTD15、仮定のタンパク質MGC15619、イノシトール1,4,5−三リン酸受容体1型、イノシトール1,4,5−三リン酸受容体2型、イノシトール1,4,5−三リン酸受容体3型、中間伝導性カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質4、内向き整流カリウムチャネル13、内向き整流カリウムチャネル16、内向き整流カリウムチャネル4、内向き整流K(+)チャネルネガティブ調節因子Kir2.2v、カイニン酸受容体サブユニットKA2a、KCNH5タンパク質、KCTD17タンパク質、KCTD2タンパク質、ケラチノサイト関連膜結合タンパク質1、Kvチャネル−相互作用タンパク質4、メラスタチン1、膜タンパク質MLC1、MGC15619タンパク質、ムコリピン−1、ムコリピン−2、ムコリピン−3、多剤耐性関連タンパク質4、N−メチル−D−アスパラギン酸受容体2Cサブユニット前駆体、NADPHオキシダーゼホモログ1、Nav1.5、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−10サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−2サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−3サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−4サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−5サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−6サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−7サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−9サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、β−2サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、β−3サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、β−4サブユニット前駆体、ニューロン電位依存性カルシウムチャネルα2Dサブユニット、P2Xプリノセプター1、P2Xプリノセプター2、P2Xプリノセプター3、P2Xプリノセプター4、P2Xプリノセプター5、P2Xプリノセプター6、P2Xプリノセプター7、膵臓カリウムチャネルTALK−1b、膵臓カリウムチャネルTALK−1c、膵臓カリウムチャネルTALK−1d、ホスホレマン(Phospholemman)前駆体、プラスモリピン、多嚢性腎疾患2関連タンパク質、多嚢性腎疾患2様1タンパク質、多嚢性腎疾患2様2タンパク質、多嚢性腎疾患およびエッグジェリー関連タンパク質前駆体のための受容体、ポリシスチン−2、カリウムチャネル調節因子、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー1、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー10、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー12、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー13、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー15、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー16、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー17、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー2、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー3、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー4、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー5、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー6、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー7、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー9、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有3、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質12、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質14、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質2、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質4、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質5、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有10、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質13、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー4、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー5、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー6、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーBメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーBメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーCメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーCメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーCメンバー4、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーDメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーDメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーDメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーEメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーEメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーEメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーEメンバー4、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーFメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーGメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーGメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーGメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーGメンバー4、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー4、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー5、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー6、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー7、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー8、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーKQTメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーKQTメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーKQTメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーKQTメンバー4、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーKQTメンバー5、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーSメンバー1、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーSメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーSメンバー3、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーVメンバー2、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーH、メンバー7、アイソフォーム2、カリウム/ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル1、カリウム/ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル2、カリウム/ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル3、カリウム/ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル4、可能なミトコンドリア移入受容体サブユニットTOM40ホモログ、プリン作動性受容体P2X5、アイソフォームA、推定の4反復電位依存性イオンチャネル、推定の塩素チャネルタンパク質7、推定のGluR6カイニン酸受容体、推定のイオンチャネルタンパク質CATSPER2変種1、推定のイオンチャネルタンパク質CATSPER2変種2、推定のイオンチャネルタンパク質CATSPER2変種3、推定のカリウムチャネルタンパク質の調節因子変種1、推定のチロシン−タンパク質ホスファターゼTPTE、リアノジン受容体1、リアノジン受容体2、リアノジン受容体3、SH3KBP1結合タンパク質1、短期(Short)一過性受容体潜在的チャネル1、短期一過性受容体潜在的チャネル4、短期一過性受容体潜在的チャネル5、
短期一過性受容体潜在的チャネル6、短期一過性受容体潜在的チャネル7、低伝導度(Small conductance)カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質1、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質2、アイソフォームb、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質3、アイソフォームb、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルSK2、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルSK3、ナトリウムチャネル、ナトリウムチャネルβ−1サブユニット前駆体、ナトリウムチャネルタンパク質IIα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質IIIα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質IVα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質IXα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Vα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質VIIα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質VIIIα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Xα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質XIα型サブユニット、ナトリウム−および塩素−活性化ATP−感受性カリウムチャネル、ナトリウム/カリウム−輸送ATPアーゼγ鎖、精子関連カチオンチャネル1、精子関連カチオンチャネル2、アイソフォーム4、シンタキシン−1B1、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーAメンバー1、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーMメンバー2、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーMメンバー3、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーMメンバー6、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーMメンバー7、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーVメンバー1、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーVメンバー2、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーVメンバー3、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーVメンバー4、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーVメンバー5、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーVメンバー6、一過性受容体潜在的チャネル4εスプライシング変種、一過性受容体潜在的チャネル4ζスプライシング変種、一過性受容体潜在的チャネル7γスプライシング変種、腫瘍壊死因子α−誘導性タンパク質1、内皮、
2ポアカルシウムチャネルタンパク質2、VDAC4タンパク質、電位依存性カリウムチャネルKv3.2b、電位依存性ナトリウムチャネルβ1Bサブユニット、電位依存性アニオンチャネル、電位依存性アニオンチャネル2、電位依存性アニオン選択性チャネルタンパク質1、電位依存性アニオン選択性チャネルタンパク質2、電位依存性アニオン選択性チャネルタンパク質3、電位依存性カルシウムチャネルγ−1サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−2サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−3サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−4サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−5サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−6サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−7サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−8サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルα−1Cサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルα−IDサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルα−lSサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ−1サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ−2サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ−3サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ−4サブユニット、電位依存性N型カルシウムチャネルα−1Bサブユニット、電位依存性P/Q型カルシウムチャネルα−1Aサブユニット、電位依存性R型カルシウムチャネルα−1Eサブユニット、電位依存性T型カルシウムチャネルα−1Gサブユニット、電位依存性T型カルシウムチャネルα−1Hサブユニット、電位依存性T型カルシウムチャネルα−1Iサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルα−1サブユニット電位依存性カリウムチャネルβ−1サブユニット、電位依存性カリウムチャネルβ−2サブユニット、電位依存性カリウムチャネルβ−3サブユニット、電位依存性カリウムチャネルKCNA7。
N末端−S1−E1−S2−X1−S3−E2−S4−X2−S5−E3−S6−C末端。
(a)マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、異なるチャネルのファミリーに結合する;(b)マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルファミリーの異なるサブファミリーに結合する;(c)マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じサブファミリーの異なる種に結合する;(d)マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネル上の異なる部位に結合する;(e)マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合するが、異なる生物学的効果を生じる;および/または(f)マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合して、同じ生物学的効果を生じる。所望される場合、マイクロプロテインドメインは、天然または非天然配列を含み得る。個々のドメインは、異種リンカーを介して一緒に連結することができる。個々のマイクロプロテインドメインは、同じまたは異なるチャネルファミリー、同じまたは異なるチャネルサブファミリー、同じサブファミリーの同じまたは異なる種、同じチャネルの同じまたは異なる部位に結合し得る。
ヒトゲノムデータベースを、グリシンが豊富な配列について検索した。表Xに示されるように、適切なドナー配列として、3つの配列を同定した。
グリシンリッチ配列は、配列
GPGGGGGPGGGGGPGGGGPGGGGGGGPGGGGGGPGGG
に基づいて設計し、これは、アクセッション番号NP_006228を有するヒトクラス4POUドメインのアミノ酸142〜182を表す。図6は、配列GGGGGPGGGGPを有するペプチドBのオリゴマーがGRSとして使用され得ることを図示する。配列(GGGGGPGGGGP)nを有するペプチドに含まれるすべての9マーサブ配列もまた、POUドメインの配列に含まれる。従って、このようなオリゴマー配列は、T細胞エピトープを含まない。
グリシンリッチ配列は、リボソームタンパク質S6キナーゼ(アクセッション番号BAD92170)の一部であるサブ配列GAGGEGGGGEGGGPGGに基づいて設計することができる。例えば、配列GGGGEを有するペプチドCのオリゴマーは、大部分の9マーサブ配列がリボソームタンパク質S6キナーゼの配列に含まれる配列を形成する。従って、一般構造(GGGGE)nのオリゴマー性GRSは、T細胞エピトープを含むリスクが非常に低い。
グリシン残基が豊富であるサブ配列について、ヒトタンパク質のデータベースを検索した。これらのサブ配列は、少なくとも50%グリシンを含んだ。以下の非グリシン残基:ADEHKPRSTのみがGRSに存在することが許された。最小20アミノ酸の長さを有した70個のサブ配列を同定した。これらのサブ配列を付録Aに列挙した。これらは、ヒトにおける低い免疫原性の潜在性を有するGRSを構築するために利用できる。
以下の実施例は、288アミノ酸配列および配列(GSGGEG)48を有するURP配列をコードするコドン最適化遺伝子の構築を記載する。最初に、本発明者らは、図40に図示されるように、スタッファーベクターpCW0051を構築した。pCW0051における発現カセットの配列は、図42に示される。スタッファーベクターはpETベクターに基づき、T7プロモーターを含む。このベクターはFlag配列をコードし、BsaI、BbsI、およびKpnI部位に隣接するスタッファー配列が続く。BsaIおよびBbsI部位は、図42に図示されるように、これらが消化後に適合可能な突出を生じるように挿入した。スタッファー配列にはHis6タグおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子が続く。スタッファー配列は終止コドンを含み、従って、大腸菌細胞は、非蛍光コロニーを形成するスタッファープラスミドpCW0051を有する。スタッファーベクターpCW0051は、BsaIおよびKpnIで消化した。36アミノ酸長のURP配列をコードするコドンライブラリーは図41に示されるように構築した。URP配列は、rPEG_J36と名付け、アミノ酸配列(GSGGEG)6を有した。挿入物は、アミノ酸配列GSGGEGGSGGEGをコードする合成オリゴヌクレオチド対、ならびにKpnI部位へのアダプターをコードするオリゴヌクレオチドの対をアニーリングすることによって得た。以下のオリゴヌクレオチドを使用した:pr_LCW0057:AGGTAGTGGWGGWGARGGWGGWTCYGGWGGAGAAGG、pr_LCW0057rev:ACCTCCTTCTCCWCCRGAWCCWCCYTCWCCWCCACT、pr_3KpnIstopper:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC、pr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGA。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対はライゲーションし、これは、様々な数のrPEG_J12反復を表す様々な長さを有する生成物の混合物を生じる。rPEG_J36の長さに対応する生成物は、アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、BsaI/KpnI消化したスタッファーベクターpCW0051にライゲーションした。LCW0057と名付けた得られるライブラリー中の大部分のクローンは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、rPEG_J36の配列がGFP遺伝子とインフレームでライゲーションされたことを示す。スクリーニングおよびrPEG_J36配列の反復多量体化のプロセスは図14に図示されている。本発明者らは、高レベルの蛍光についてライブラリーLCW0057からの288個の単離物をスクリーニングした。強力な蛍光を伴う48個の単離物をPCRによって分析し、rPEG_Jセグメントの長さを確認し、そしてrPEG_J36の予想長さを有した16個のクローンを同定した。このプロセスは、rPEG_J36の16個の単離物のコレクションを生じ、これは、高い発現を示し、それらのコドン使用頻度が異なっている。これらの単離物をプールし、図40に概略されるプロセスを使用して二量体化した。プラスミド混合物は、BsaI/NcoIで消化し、rPEG_J36配列を含むフラグメントおよびGFPの一部を単離した。同じプラスミドは、BbsI/NcoIでもまた消化し、rPEG_J36を含むベクターフラグメント、プラスミドベクターの大部分、および残りのGFP遺伝子を単離した。両方のフラグメントを混合し、ライゲーションし、そしてBL21に形質転換し、単離物を蛍光についてスクリーニングした。この二量体のプロセスは、図14に概略されているように、2回より多くラウンド反復した。各ラウンドの間、本発明者らは、rPEG_J遺伝子の長さを倍加し、最終的には、rPEG_J288をコードする遺伝子のコレクションを得た。rPEG_J288のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を図15に示す。rPEG_J288モジュールが、同一のアミノ酸配列を有するのにも関わらず、それらのヌクレオチド配列が異なるrPEG_J36のセグメントを含むことを見ることができる。従って、本発明者らは、遺伝子の内部の相同性を最小化し、結果として、本発明者らは、自発的組換えのリスクを減少した。本発明者らは、少なくとも20回の倍加の間、rPEG_J288をコードするプラスミドを有する大腸菌BL21を培養し、そして自発的組換えは観察されなかった。
rPEG_H288と名付けた288アミノ酸URPをコードする遺伝子のライブラリーは、rPEG_J288を構築するために使用したのと同じ手順を使用して構築した。rPEG_H288はアミノ酸配列(GSGGEGGSGGSG)24を有する。構築プロセスのフローチャートは図14に示される。rPEG_H288の1つの単離物の完全なアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列は図16に示される通りである。
N末端Flagタグおよび緑色蛍光タンパク質のN末端に融合されたURP配列rPEG_J288を含む融合タンパク質は、37℃で3日間、50%マウス血清中でインキュベートした。サンプルは様々な時点で取り出し、SDS PAGEによって分析し、続いてウェスタン分析を用いる検出を行った。N末端Flagタグに対する抗体はウェスタン検出のために使用した。結果は図28に示し、これは、288アミノ酸のURP配列が少なくとも3日間、血清中で完全に安定であり得ることを示す。
URPに対する抗体の存在は、このグリシンリッチ配列に対する潜在的な免疫原性応答の指標である。血清中での既存の抗体の存在について試験するために、URP−GFP融合物は、支持体上にURP−GFPを固定することによってELISAに供し、続いて、30%血清とともにインキュベートした。URP−GFPに結合した抗体の存在は、抗IgG西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体および基質を使用して検出した。データは図29に示す。このデータは、融合タンパク質が、GFPまたはFlagに対する抗体によって検出できるが、マウス血清によってはできないことを示す。これは、マウス血清がURP配列を含む抗体を含まないことを示す。
本発明者らは、構造Flag−rPEG_J288−H6−GFPを有するタンパク質を精製した。このタンパク質は、SB培地中で大腸菌BL21中で発現させた。培養は、18℃で一晩、0.5mM IPTGで誘導した。細胞は遠心分離によって収集した。ペレットは、ベンゾナーゼおよび市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むTBS緩衝剤に再懸濁した。懸濁液はウォーターバス中で75℃、10分間加熱し、細胞を溶解した。不溶性物質を遠心分離によって除去した。上清を、固定化金属イオン特異性(IMAC)を使用して精製し、続いて、固定化抗Flag抗体を使用してカラム精製した。図43は、精製プロセスのPAGE分析を示す。該プロセスは、少なくとも90%純度を有するタンパク質を生じた。
ヒトインターフェロンαをコードする遺伝子は大腸菌発現のためのコドン最適化を使用して設計した。合成遺伝子は、rPEG_J288をコードする遺伝子と融合した。His6タグは融合タンパク質の検出および精製を容易にするためにN末端に配置した。融合タンパク質のアミノ酸配列は図44に示す。
ヒトG−CSFをコードする遺伝子は、大腸菌発現のためにコドン最適化を使用して設計した。合成遺伝子は、rPEG_J288をコードする遺伝子と融合した。His6タグは融合タンパク質の検出および精製を容易にするためにN末端に配置した。融合タンパク質のアミノ酸配列は図44に示す。
ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子は、大腸菌発現のためにコドン最適化を使用して設計した。合成遺伝子は、rPEG_J288をコードする遺伝子と融合した。His6タグは融合タンパク質の検出および精製を容易にするためにN末端に配置した。融合タンパク質のアミノ酸配列は図44に示す。
rPEG_J288と2種のヒトタンパク質、インターフェロンαおよび成長ホルモンとの間の融合タンパク質を、T7発現ベクターにクローニングし、そして大腸菌BL21に形質転換した。0.5ODの光学密度まで、37℃で細胞を増殖させた。続いて、細胞を18℃で30分間培養した。次いで、0.5mM IPTGを加え、培養物を振盪インキュベーターで18℃にて一晩インキュベートした。細胞は遠心分離によって収集し、可溶性タンパク質はBugBuster(Novagen)を使用して遊離させた。不溶性タンパク質および可溶性タンパク質の両方の画分をSDS−PAGEによって分離し、融合タンパク質は、検出のためにN末端His6タグに対する抗体を使用して、ウェスタンによって検出した。図45は、2種の融合タンパク質、ならびに対照としてのrPEG_J288−GFPのウェスタン分析を示す。すべての融合タンパク質が発現され、タンパク質の大部分は可溶性画分に存在した。これは、rPEG_J288の高い溶解性の証拠である。なぜなら、文献の中で報告されていた大腸菌の細胞質中のインターフェロンαおよびヒト成長ホルモンの発現の多くの試みは、不溶性の封入体の形成を生じたからである。図45は、融合タンパク質の大多数が全長タンパク質として発現され、すなわち、不完全な合成または部分的なタンパク質分解を示唆するフラグメントが検出されなかったことを示す。
システイン束縛ペプチドのライブラリーは、公表されているように構築した[Scholle,M.D.ら(2005)Comb Chem High Throughput
Screen,8:545−51]。これらのライブラリーはヒトVEGFに対してパンし、そしてアミノ酸配列FTCTNHWCPSまたはFQCTRHWCPIからなる2つの結合モジュールを同定した。アミノ酸配列FTCTNHWCPSをコードするオリゴヌクレオチドは、配列(GGS)12を有するURP配列rPEG_A36をコードするヌクレオチド配列にライゲーションした。続いて、融合配列は、GFPに融合したrPEG_A36によって分けられた4コピーのVEGF結合モジュールを含む分子を構築するために、制限酵素およびライゲーション工程を使用して二量体化した。0個と4個との間のVEGF−結合単位を含む融合タンパク質のVEGF結合親和性は、図30において比較した。GFPに融合されたrPEG_A36のみを含む融合タンパク質はVEGFに対する親和性を示さない。増加数のVEGF結合モジュールを加えることは、得られる融合タンパク質の親和性を増加する。
ランダムペプチドライブラリーは、Scholleら[Scholle,M.D.ら(2005)Comb Chem High Throughput Screen,8:545−51]に従って生成した。未処理のペプチドライブラリーは、4〜10個のランダム残基によって間隔が空いているシステインを有する、システイン束縛ペプチドを示した。ライブラリー設計は表に例証する。
抗EpCAMペプチドは、Scholleら[Scholle,M.D.ら(2005)Comb Chem High Throughput Screen,8:545−51]に従って生成したランダムペプチドライブラリーから単離した。未処理ペプチドライブラリーは、4〜10個のランダム残基で間隔が空いているシステインを有するシステイン束縛ペプチドをディスプレイした。上記のライブラリーを用いる3ラウンドの親和性選択後、いくつかのEpCAM特異的ペプチドリガンド(EpCam1)を単離した(表X)。EpCam1単離物は、4アミノ酸の保存性システイン間隔(CXXXXC)を有する。次いで、EpCam1ペプチドリガンドは、3〜9残基をコードするコドンで静かにランダム化し(システインの位置以外)、ファージミドベクターに移した。プラスミドライブラリーは、引き続いて、EpCAMに対して親和性選択され、結合のために最適化されたペプチドリガンドを単離した(表X、EpCam2)。EpCam2リガンドは、保存性CXXXXCシステイン間隔を含む。加えて、抗EpCam配列の大部分はリジン残基を含まず、これは、結合配列の外側の遊離のアミン基への結合体化を可能にする。さらに、抗EpCamペプチドリガンドは、(任意の長さの)URP配列に遺伝的に融合し、反復二量体化を使用して多量体化することができる。得られるEpCAM MURPは、単量体配列を超えた親和性の増加を有するEpCAMを特異的に標的化するために使用することができる。四量体EpCAM−URPアミノ酸配列の1つの例は図31に示される。この配列は、N末端Flag−タグ中に局在する2つのみのリジン残基を含む。これらのリジン残基の側鎖は、薬物結合体化のために特に適切である。
結合モジュールは、結合配列のN末端、C末端、またはN末端およびC末端の両方へのURP様リンカーおよびランダム配列の付加によって、親和性成熟されまたは長くされ得る。図32は、抗EpCAM結合モジュールへの未処理のシステイン束縛配列の付加を示す。ランダム配列付加のライブラリーは、一本鎖または二本鎖のDNAクローニングアプローチを使用して生成することができる。一旦生成されると、ライブラリーは、最初の標的タンパク質または第2のタンパク質に対して親和性選択することができる。例えば、抗EpCAM結合モジュールを含む付加ライブラリーは、標的タンパク質への結合部位を2つ以上含む配列を選択するために使用することができる。
一連のオリゴヌクレオチドを、VEGF結合1SSペプチドFTCTNHWCPSに基づいてライブラリーを構築するために設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、隣接する配列のシステイン間隔のパターンのバリエーションを組み込み、一方VEGF結合ペプチド配列は固定されて維持された。
LMS70−1
PCRアセンブリ
10.0μl鋳型オリゴ(5μM)、10.0μl 10×緩衝剤、2.0 dNTP(10mM)、1.0μl cDNAポリメラーゼ(Clonetech)、77μl DS H2O。PCRプログラム:95℃ 1分間(95℃ 15秒間、54℃ 30秒間、68℃ 15秒間)×5、68℃ 1分間。
PCR増幅
プライマー、10.0μl アセンブル緩衝剤、10.0μl 10×緩衝剤、2.0dNTPs(10mM)、10.0μl LIBPTF(5μM)、10.0μl LIBPTR(5μM)、1.0μl cDNAポリメラーゼ(Clonetech)、57μl DS H2O。PCRプログラム:95℃ 1分間(95℃ 15秒間、54℃ 30秒間、68℃ 15秒間)×25、68℃ 1分間。産物をAmiconカラム(colum)Y10によって精製した。アセンブルされた産物はSfiIおよびBstXIで消化し、ファージミドベクターpMP003にライゲーションした。ライゲーションは、MJ PCRマシンで16℃にて一晩実施した。次いで、ライゲーションをEtOH沈殿によって精製した。エレクトロポレーションによって、新鮮なコンピテントER2738細胞に形質転換を行った。
第1ラウンドのパニング:
1)第1ラウンド、スクリーニングされるライブラリーあたり4ウェルをコートする。Costar 96ウェルELISAプレートのウェルを、25μl PBS中の0.25μg VEGF121抗原でコートする。プレートシーラーでプレートを覆う。コーティングは4℃で一晩、または37℃で1時間実施することができる。
第2ラウンド、スクリーニングされるライブラリーあたり2ウェルをコートする。Costar96ウェルELISAプレートのウェルを、25μl PBS中の0.25μg
VEGF121抗原でコートする。プレートシーラーでプレートを覆う。コーティングは4℃で一晩、または37℃で1時間実施することができる。
第3ラウンド、スクリーニングされるライブラリーあたり1ウェルをコートする。Costar 96ウェルELISAプレートのウェルを、25μl PBS中の0.25μg VEGF121抗原でコートする。プレートシーラーでプレートを覆う。コーティングは4℃で一晩、または37℃で1時間実施することができる。
1.製造業者に従って標的タンパク質をビオチン化する。
1)96ディープウェルプレートに、50μg/mlカルベニシリンを含む0.5ml
SBを加える。1つのコロニーを拾い上げ、ウェルに接種する。
ジスルフィド結合したシステイン間の4、5、6、7、8、9、10、11、および12個のランダム化または部分的ランダム化アミノ酸、および、ある場合において、システイン対の外側のさらなるランダム化アミノ酸を有する、10e9〜10e11個の環状ペプチドのファージディスプレイしたライブラリーを、標準的な方法によって作製した。ヒトVEGFを含む、多数の標的に対するこれらの環状ペプチドライブラリーのパニングは、hVEGFに特異的に結合し、BSA、オボアルブミン、またはIgGには結合しないペプチドを高い信頼性で生じる。
プレキシン骨格に基づいて2つのライブラリーを設計した。Pfamタンパク質データベースは、図35に示されるように、天然に存在するプレキシンドメインの系統発生学的アラインメントのために使用した。プレキシン骨格の中央部分(Cys24−Gly25−Trp26−Cys27)は、両方のライブラリー設計で保存され、N−およびC−ライブラリー生成のためのクロスオーバー領域として働く。両方のプレキシンライブラリーのランダム化スキームは、図36に示される。これらの2つのライブラリーは、クロスオーバー領域において2つのライブラリーがコードするオリゴを重複させること、およびプル−スルPCR、続いて制限クローニング(SfiI/BstXI)を使用すること、およびファージミドベクターpMP003にクローニングすることによって生成した。得られるプレキシンライブラリーは、LMP031(N末端ライブラリー)およびLMP032(C末端ライブラリー)と名付け、各々は、約5×108個の独立した形質転換体の複雑さによって表現された。確証のために、各非選択のライブラリーからのおよそ24個のCarb耐性クローンをPCRによって分析した。正確なサイズのフラグメント(375bp)を与えたクローンは、DNA配列決定によってさらに分析した。正確な全長プレキシン配列は、それぞれ、LMP031およびLMP032ライブラリー由来のクローンの50%および67%について得られた。
フィンガーチップ1の部分的にランダム化されたアミノ酸、およびフィンガー2またはフィンガーチップ3の下の部分、およびフィンガー2の上の部分を用いる3フィンガートキシン(3FT)骨格の10e8〜10e10のファージディスプレイされたライブラリーを、標準的な方法によって作製した。
ここでの目的は、3SSプラス標的特異的結合因子を生成するために、目的の標的に特異的であることが同定されたペプチドを使用することである。このストラテジーは、3FT骨格のフィンガーチップ1へのVEGF特異的ペプチドの移動を使用すること、および高親和性VEGF結合因子を生成するために標的特異的配列から密接な近傍にあるフィンガー2のAA残基を修飾することによって例証されている。フィンガーチップ1のVEGF特異的配列、およびフィンガー2の部分的にランダム化された下の部分を有する10e8〜10e10の3フィンガートキシン(3FT)骨格のファージディスプレイライブラリーは、2つのランダムフィンガー1フォワードプライマーが、以下の配列:P S G
P S C H T T N H W P I S A V T C P PをコードするF1−VEGF特異的フォワードプライマーによって置き換えられたことを例外として、上記の実施例に記載されたように標準的な方法によって作製した。
MURPの血漿半減期は、本質的に[Pepinsky,R.B.ら(2001)J Pharmacol Exp Ther,297:1059−66]によって記載されるように、カテーテル処置したラットへのMURPの静脈内または腹腔内注射後に測定することができる。血液サンプルは、種々の時点(5分、15分、30分、1時間、3時間、5時間、1日、2日、3日)に取り出すことができ、そしてMURPの血漿濃度はELISAを使用して測定することができる。薬理学的パラメーターは、WinNonlinバージョン2.0(Scientific Consulting Inc.,Apex,NC)を使用して計算することができる。URPモジュールの効果を分析するために、URPモジュールを含むタンパク質の血漿半減期を、URPモジュールを欠く同じタンパク質の血漿半減期と比較できる。
MURPの溶解性は、リン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的緩衝剤中でMURPの精製サンプルを、0.01mg/ml〜10mg/mlの範囲にある種々の濃度まで濃縮することによって決定することができる。サンプルは、数週間までインキュベート可能である。濃度がMURPの溶解度を超えるサンプルは、濁度によって示されるような沈殿を示し、これは、吸収リーダーで測定できる。遠心分離または濾過によって沈殿物質を除去し、そして280nmの吸収を測定することによる、Bradfordアッセイのようなタンパク質アッセイを使用して、上清中の残存タンパク質の濃度を測定することができる。溶解性研究は、サンプルを−20℃に凍結し、続いて融解することによって加速することができる。このプロセスは、乏しい溶解性タンパク質の沈殿をもたらす。
目的のMURPをマイクロタイタープレートにコートし、そして対照タンパク質をプレートの他のウェルにコートすることができる。続いて、目的の血清サンプルを1時間ウェルに加えることができる。続いて、ウェルをプレートウォッシャーで洗浄することができる。結合した血清タンパク質は、検出のための西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素と結合体化した血清タンパク質に対する抗体を加えることによって、検出できる。MURPへの血清の結合を検出する(detec)ための別の方法は、結合を可能にするために約1時間、目的のMURPを血清に加えることである。続いて、MURP配列中のエピトープに対する抗体を使用して、MURPを免疫沈殿させることができる。沈殿したサンプルは、PAGEによって、および選択的に、ウェスタンによって分析し、MURPと共沈殿した任意のタンパク質を検出することができる。共沈殿を示す血清タンパク質を質量スペクトル測定によって同定することができる。
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